KR20150056741A

KR20150056741A - 식물성장조절물질을 함유하는 미세조류 클라미도모나스의 배양 배지 및 이를 활용한 배양방법

Info

Publication number: KR20150056741A
Application number: KR1020130139477A
Authority: KR
Inventors: 구정모; 김학응; 박동준
Original assignee: 박복희
Priority date: 2013-11-16
Filing date: 2013-11-16
Publication date: 2015-05-27

Abstract

본 발명은 미세조류인 클라미도모나스 배지조성에 관한 것으로서, 더욱 정확하게는 식물성장조절물질인 제아틴(zeatin)을 함유하는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 배양 배지 및 상기 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는 미세조류 클라미도모나스의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 클라미도모나스의 고농도 세포 및 생리활성물질 등을 확보할 수 있다. 이러한 효과를 바탕으로 의약용 재조합 단백질 및 바이오에너지원료인 지방산 생산에 적용이 가능할 것으로 판단된다.

Description

식물성장조절물질을 함유하는 미세조류 클라미도모나스의 배양 배지 및 이를 활용한 배양방법{Culture media of Chlamydomonas containing plant growth regulator, and the method for cultrue using the same}

본 발명은 미세녹조류인 클라미도모나스 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 정확하게는 식물성장조절물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 배양배지 및 상기 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는 미세조류 클라미도모나스 배양 방법에 관한 것이다.

식물성장조절물질은 식물체 내에서 생성되어 체내를 이행하면서 다른 조직이나 기관에 대하여 미량으로도 형태적, 생리적인 특수한 변화를 일으키는 화학물질을 말하며, 식물호르몬이라고도 한다. 대표적인 식물 호르몬으로는 옥신, 지베렐린, 시토키닌, 플로리겐 등이 있다.

옥신 (Auxin)은 식물호르몬의 일종. 생장소라고도 한다. 인돌아세트산과 같은 생리작용을 가진 유기화합물의 총칭으로, 특히 저농도에서 줄기의 세포신장을 촉진한다. 천연옥신인 인돌아세트산 외에, 2, 4-디클로로페녹시아세트산, α-나프탈렌아세트산, β-나프톡시아세트산, 2, 4, 6-트리클로로벤조산 등의 합성옥신이 있다. 식물호르몬의 일종. 생장소라고도 한다. 인돌아세트산과 같은 생리작용을 가진 유기화합물의 총칭으로, 특히 저농도에서 줄기의 세포신장을 촉진한다. 천연옥신인 인돌아세트산 외에, 2, 4-디클로로페녹시아세트산(2, 4-D), α-나프탈렌아세트산, β-나프톡시아세트산, 2, 4, 6-트리클로로벤조산 등의 합성옥신이 있다. 식물체내에 존재하며 강한 활성을 갖는 대표적인 천연옥신 (naturally occuring auxins)은 indoleacetic acid이다. 그러나 IAA외에도 옥신의 활성을 갖는 물질로서 4-chloro-IAA, indole-3-ethnol등이 알려져 있는데 이들은 모두 indole 기를 갖춘 IAA의 유연화합물이다. 인돌초산과 기본 골격구조는 다르나 옥신의 활성을 가진 합성화합물이 많이 알려져 있으며 이들은 합성옥신(synthetic auxin)으로 불리워 진다.

시토키닌(Cytokinin)은 아데닌 고리의 N6 위치에 부착된 치환기를 가지는 아데닌 유도체인 purine으로 특정 지울 수 있다. 초기 연구에 의하면 시토키닌 합성은 분명히 이들 N6 치환 아데닌에 한정되어 있다고 하였다. 치환 아데닌 물질만이 시토키닌 활성을 가지고 있다는 것을 발견하였다. 그러나 이들물질의 활성은 길이, 불포화정도, 측쇄에 대한 치환정도에 따라 상당한 차이가 있다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어 8번위치에 C대신 N을 치환하는 것과 같이 아데닌의 일부분을 변경시킨물질을 담배캘루스를 이용하여 생장측정해 본 결과 95%정도 활성이 감소됨을 알 수 있었다. 아데닌에 경미한 치환이 일어나더라도 활성은 감소한다. 보통 아데닌에 경미한 치환을 하더라도 활성은 감소된다. Purine 고리의 1번 혹은 3번 위치에 2차적 치환기는 시토키닌활성을 거의 대부분 제거한다. 그러나 N6, N7 혹은 N9 위치에서 2차적 치환기는 시토키닌의 활성소멸 효과가 비교적 적다. N9 치환기는 물질대사적으로 불안정 하다. N6 치환 아데노신은 매우 높은 시토키닌 활성을 가지고 있는데 경우에 따라서는 아데닌 보다 활성이 조금 낮다. 그러나 riboside와 ribotide 그 자체가 활성이 있는지 혹은 유리염기로 전환되는 동시에 시토키닌활성을 획득하게 되는지에 대해서는 해결되어야 할 문제로 남아 있다. 옥신, 지베렐린 및 다른 식물호르몬과 마찬가지로 시토키닌은 종자식물에 대해서 다양한 생리적 효과를 가지고 있다. 이러한 다양한 생리적 효과가 호르몬의 분자적 작용기작을 밝히는데 장애요인으로 작용한다. 그러나 효과의 다양성은 사실 식물에 있어서 생장의 조절과 발달은 동시적으로 작용하는 여러 가지 형태의 호르몬에 의해서 이루어진다는 것을 이해하게 되면 매우 자연스럽고 논리적일 수 있다. 그러므로 시토키닌이 종자식물의 개체발생 전과정을 통하여 생장을 조절하는데 관련되어 있다.

지베렐린(Gibberellin)은 식물호르몬의 일종이며, 널리 식물계에 분포하였고, 식물의 갖가지 생리현상의 발현과 제어에서 큰 역할을 수행하고 있을 뿐만 아니라 식물화학조절제로서도 이용되고 있는 물질이다. 진균류 중 자낭균류의 일종인 벼키다리병균 Gibberella fujikuroi가 대사물질 속에서 발견되었다. 이 균류는 벼에 감염하여 줄기나 잎을 비정상적으로 웃자라게 한다. 1938년에는 벼키다리병균의 배양액 중에서 병원물질을 결정체로 분리하여 지베렐린 A라고 명명했다. 그 후 지베렐린 A는 A1, A2, A3 및 A4의 혼합결정이라는 것이 밝혀졌다. 또 54년 B.E. 크로스가 벼키다리병균 배양액의 여과액으로부터 화학적으로 순수한 물질을 최초로 분리하여 지베렐린산(현재 GA3으로 알려짐)이라 했다. 지베렐린계 물질은 고등식물에 광범위하게 분포되어 있는데, 채 성숙되지 않은 종자에 특히 많이 들어 있다. 고등식물에서 최초로 발견된 지베렐린은 GA1으로서 60년 J. 맥밀런이 미성숙 콩종자에서 분리했다. 현재까지 약 53종의 지베렐린이 발견되었는데, 이들 중 8종은 벼키다리병균에 분포하고 32종은 고등식물에, 그리고 약 13종의 지베렐린이 양쪽에서 다 발견되었다. 지베렐린은 4개의 고리구조로 된 디테르펜계 물질이다. 기본골격은 20개의 탄소원자로 구성되어 있고, 종류에 따라 GA1, GA2, GA3, …, GAn으로 표시한다. 벼키다리병균에서 지베렐린 A 외에 B, C도 얻을 수 있지만, 그 생물학적 활성은 A보다 매우 낮다. GA 중에서의 활성은 GA3＞GA1＞GA4＞GA2(GA1 과 GA4는 거의 차이가 없다)순이다. 지베렐린은 고등식물의 성장을 촉진하고, 때때로 도장을 일으키지만, 그 생장촉진은 세포분열의 촉진에 의한 것이 아니라 오히려 세포의 신장비대가 원인이다. 지베렐린의 이같은 효과는, 본래 생장촉진인자의 생산이 적거나, 이에 대한 감수성이 약하다고 생각되는 왜성종에서 특히 뚜렷하다. 지베렐린에는 이 밖에도 꽃눈형성이나 개화를 촉진하는 작용이 있고, 춘화처리·장일처리의 대행 기능을 한다. GA1, GA3는 특히 이 작용이 강한데, 개화 때까지 오랜 시간을 요구하는 식물에 작용하여 개화를 빠르게 하거나 종자의 발아를 촉진시킨다. 또 착과의 증가작용, 식물의 생장촉진작용 등을 한다.

본 발명에서는 식물생장에 도움이 되는 식물호르몬을 미세조류 클라미도모나스 배지에 첨가하여 생장을 촉진하고자 한다.

클라미도모나스는 클라미도모나스과에 속하는 클라미도모나스속 미세녹조류의 총칭이다. 단세포로 크기는 10~30 마이크로미터이고, 공 또믄 계란 모양 유선형을 하고 있다. 세포막은 엷고 색소입자가는 모양의 변화가 많다. 클라미도모나스는 광합성을 하기도 하고 세포표면을 통해 영양소를 흡수하기도 한다. 주로 민물에서 발견되며 바닷물이나 얼음 또는 눈속에서도 발견되는 등 분포 범위가 넓다. 일부는 토양이나 오염된 시궁창 등에서 물이 녹색으로 보이게도 한다. 단순한 단세포로 되어 있고 두개의 편모를 가지고 있는 미세녹조류인 클라미도모나스는 "녹색효모"라고도 하는데, 이는 photosysnthesis, phototaxis, 그리고 편모 조립과 기능등의 분자 유전학적 분석에 있어서 최고의 모델 생물체라는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 게다가 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)는 게놈프로젝트가 진행되었고, 선발마커가 사용될 수 있기 때문이다. 그리고 클라미도모나스 레인하티는 미국 FDA에서 규정한 GRAS 생물 1등급으로서 안정성이 확보되어 이 미세조류에서 생산되는 천연 단백질 및 분자생물학적으로 재조합한 단백질을 인체 및 동물에 사용할 수 있다. 이렇게 유용한 미세졸류인 클라미도모나스의 세포 농도 및 대사산물의 양을 개선하기 위해서 식물성장조절물질을 함유하는 클라미도모나스배양 배지 및 배양 방법을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 클라미도모나스의 세포 농도 및 생리활성물질 생산 향상을 위한 배양 배지를 제공하는데 있다. 본 발명에서 미세조류 배양 배지는 제아틴(zeatin) 농도가 5 ppm 인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 상기 미세조류는 클라미도모나스인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 식물성장조절물질이 함유되는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스의 배양배지 및 이를 이용한 배양 방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 클라미도모나스의 세포 농도를 증가시키고, 클라미도모나스의 유용한 생리활성물질 생산성을 증가시킬 수 있다. 본 발명에 따른 배양 배지로 배양한 결과 5ppm의 제아틴(zeatin) 함유 배지가 무첨가 배지 보다 세포농도는 약 2배, 단백질 함량은 3 배, 엽록소 a 함량은 약 2배가 증가하는 효과를 얻었다. 따라서 본 발명에서 제시한 배지로 클라미도모나스를 배양하면 고농도의 세포 및 생리활성물질을 확보할 것으로 기대된다. 이러한 효과를 바탕으로 의약용 재조합 단백질 및 바이오에너지원료인 지방산 생산에 적용이 가능할 것으로 판단된다.

제 1도는 각각의 식물성장조절물질에 따른 클라미도모나스의 성장 효과
제 2도는 각각의 식물성장조절물질에 따른 클라미도모나스의 총단백질 함량 변화
제 3도는 각각의 식물성장조절물질에 따른 클라미도모나스의 엽록소 a 함량 변화

(1) 클라미도모나스 배양 조건

미세조류 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)는 TAP meium(Tris-acetate-phosphate)에 25℃, 5000 lux, 110rpm 조건에서 4일 동안 진탕배양하였다. 또한 세균의 오염을 방지하기 위해서 항생제 cefotaxim 200mg/L을 첨가하였다.

(2) 식물성장조절물질 준비

각각 식물성장조절물질의 저장용액 농도는 1000ppm로 하여 제조하였다. 옥신류 indole-3-acetic acid(이하 IAA)는 에탄올에 용해했으며, 1-naphthaleneacetic acid(이하 NAA)는 증류수에 용해하고 여과 멸균하여 준비하였다. 시토키닌류 N,N'-diphenylurea(이하 DPU) 및 zeatin(이하 ZT)는 에탄올에 용해하고 여과멸균하여 준비하였다. 제베렐린 (이하 GA3)는 증류수에 용해하고 여과멸균하여 준비하였다.

(1) 식물성장조절물질의 농도에 따른 클라미도모나스 생육

5종의 물질을 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ppm의 농도로 TAP 배지 첨가하여 4일동안 실시 예1과 같은 방법으로 배양하였다. 배양 종료 후 흡광도 750nm에서 OD값을 측정하였다. 그 결과 도 1과 같다. 시토키닌 계열중에서 urea-type인 DPU경우, 0.1ppm 에서는 1.01, 0.5ppm에서는 1.12, 1ppm에서는 0.99, 5ppm에서는 0.88, 10ppm에서는 0.84로 확인되었다. 시토키닌 계열중에서 adenine-type인 ZT경우, 0.1ppm 에서는 1.14, 0.5ppm에서는 1.23, 1ppm에서는 1.16 5ppm에서는 1.00, 10ppm에서는 0.91로 확인되었다. 옥신 계열 IAA경우, 0.1ppm 에서는 0.87, 0.5ppm에서는 0.98, 1ppm에서는 1.08, 5ppm에서는 1.15, 10ppm에서는 1.05로 확인되었다. 옥신 계열 NAA경우, 0.1ppm 에서는 0.91, 0.5ppm에서는 0.96, 1ppm에서는 1.09, 5ppm에서는 1.16, 10ppm에서는 1.08로 확인되었다. 지베렐린 GA3 경우 0.1ppm 에서는 0.94, 0.5ppm에서는 1.1, 1ppm에서는 1.21, 5ppm에서는 1.04, 10ppm에서는 0.91로 확인되었다. 무첨가구인 TAP 배지 경우 0.77로 확인되었다.

각각의 식물성장조물질중에 세포농도가 높았던 구간은 DPU 0.5ppm, ZT 0.5ppm, IAA 5ppm, NAA 5ppm, GA3 1ppm으로 최종 확인되었다.

(1) 총단백질 함량 변화

각각의 식물성장조절물질 중에서 세포농도가 가장 높았던 첨가농도를 선택하여 클라미도모나스 총단백질 함량을 측정하였다. 배양은 실시예 1과 같이 실시하였다. 배양 초기 농도 OD값 0.1이 되도록 클라미도모나스 접종하였고 각각의 식물성장조절물질 DPU 0.5ppm, ZT 0.5ppm, IAA 5ppm, NAA 5ppm, GA3 1ppm 함유된 10 ml TAP 배지에 접종하여 4일 동안 배양하였다. 배양 종료된 배양액을 8,000 rpm, 10분 동안 원심분리 하여 균체를 회수하였다. 회수된 세포에 1 ml PBS 용액을 첨가하여 8,000 rpm, 10분동안 원심분리 하여 세포를 세척하였다. 이 세척 과정을 3회 수행하였다. 1 ml total protein extraction buffer(50mM Hepes, 250mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5mM phenylmethylsulfonyl fluride)로 현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 sonication (30W, 10min)으로 세포를 파쇄한 후 10,000 rpm 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액을 bradford assay법으로 단백질 함량을 측정하였다. 단백질 표준곡선은 bovine serum albumin을 사용하였다. 그 결과는 도 2와 같다. 총단백질 함량 측정은 배양종료 4일차에서 측정을 하였으며, 3반복 실험을 수행하였다.

무첨가구에서는 11.0 ㎍/mL, DPU에서는 18.4 ㎍/mL, ZT에서는 38.8 ㎍/mL, IAA에서는 26.5 ㎍/mL, NAA에서는 23.7 ㎍/mL, GA3 에서는 36.4 ㎍/mL의 총단백질 함량이 측정되었다. 결과적으로 식물성장조절물질 첨가구가 무첨가구에 비해서 약 2 ~ 3배의 총단백질 함량이 증가한 것으로 확인되었다. 세포 자체의 대사작용에서 단백질을 생산하는 것 보다 질소원을 추가해 주는 것이 총단백질 생산이 증가하는 것으로 확인되었기 때문에, 미세조류에서 재조합 단백질 및 기타 생리활성 물질 생산량 개선 효과가 있을 것으로 예상된다.

(1) 엽록소a 함량 변환

실시예 3에서와 같이 동일한 조건으로 클라미도모나스를 배양하고, 원심분리하여 상등액을 버리고 회수한 세포 펠렛을 활용하여 엽록소 a 함량을 측정하였다. 회수된 펠렛에 1 ml 메탄올(95%, 60 ℃)을 첨가하여 완전히 탈색시킨 후, 10,000 rpm 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액을 분광광도계로 흡광도를 측정하고 다음의 계산식에 대입하여 엽록소 a 함량을 산출했다.

Chlorophyll a (㎍/mL) = 16.29 × OD665 - 8.54 × OD652

그 결과는 도 3과 같다. 엽록소 a 함량 측정은 배양종료 96시간에서 측정을 하였으며, 3반복 실험을 수행하였다.

무첨가구에서는 0.91 ㎍/mL, DPU에서는 1.53 ㎍/mL, ZT에서는 2.4 ㎍/mL, IAA에서는 1.87 ㎍/mL, NAA에서는 1.83 ㎍/mL, GA3 에서는 2.0 ㎍/mL의 엽록소a 함량이 측정되었다. 결과적으로 식물성장조절물질 첨가구가 무첨가구에 비해서 약 1.5 ~ 2.5 배의 엽록소 a 함량이 증가한 것으로 확인되었다.

상기의 결과를 바탕으로 식물성장조절물질이 첨가가 미세조류 클라미도모나스 배지인 TAP 배지에 첨가하는 것이 대사산물 생산성 향상에 적합한 것으로 확인되었다. 또한 식물성장조절물질 첨가에 있어서 ZT > GA3 > IAA > NAA > DPU 순으로 총단백질 및 엽록소 a 생산량이 우수한 것으로 확인되었다. 이로써 미세조류를 활용한 재조합 단백질, 지방산, 기타 생리활성물질 등 생산에 식물성장조절물질을 첨가하는 것이 목적하는 재조합 단백질 및 생리활성물질 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다.

㎍/mL ; 세포배양액 1mL당 물질 함량

Claims

식물성장조절물질인 시토키닌이 함유하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양 배지
청구항 1항에 있어서, 식물성장조절물질이 시토키닌이 제아틴(zeatin)인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양 배지
청구항 2항에 있어서, 제아틴의 농도가 0.1 ~ 1ppm인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양 배지
청구항 3항에 있어서, 미세조류는 클라미도모나스인 것을 특징으로 하는 배양 방법
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 배양배지를 이용하여 미세조류 클라미도모나스에서 생산하는 인체 및 동물 의약용 재조합 단백질