DE69026584T2 - Methode zur Produktion von Brassinosteroiden - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Brassinosteroiden durch Züchtung von Pflanzenzellen.
- Bei Brassinosteroiden handelt es sich um Steroid-Pflanzenwachstumshormone, die bei einer großen Gruppe höherer Pflanzen auftreten. Bisher wurden Brassinosteroide aus unterschiedlichen Pflanzenteilen isoliert, beispielsweise aus dem Pollen, den Samen, unreifen Samen, Früchten, Stielen, Blättern, Sprossen und Blüten verschiedener Pflanzenarten wie Brassica napus, Castanea crenata, Thea sinensis, Dystylium racemosum, Dolichos lablab, Phaseolus vulgaris, Oryza sativa und Zea mays.
- Mit dem Sammelbegriff "Brassinosteroid" werden das Brassinolid und dessen Homologe bezeichnet. Gegenwärtig unterscheidet man 22 Arten von Brassinosteroiden, sowohl die natürlich vorkommenden als auch die synthetischen wie 25-Methylcastasteron, Homobrassinolid und 25-Methylbrassinolid.
- Es wurden zahlreiche Untersuchungen zur physiologischen Wirkung von Brassinosteroiden auflandwirtschaftliche Produkte vorgenommen. Kürzlich wurde festgestellt, daß die Brassinosteroide eine wachstumsfördernde Wirkung auf Weizen, Mais, die Salatgurke und Erbsen ausüben und die Kältebeständigkeit von Reis, Salatgurken sowie Auberginen, die Krankheitsresistenz von Chinakohl sowie die Chemikalien- und Salzverträglichkeit verschiedener Pflanzen verbessern ("Chemistry and Biology", 23, 717 (1985).
- Es wurden zudem umfangreiche Untersuchungen zur chemischen Synthese von Brassinosteroiden vorgenommen. Die bekannten Methoden sind kompliziert und erfordern ausgereifte Techniken, sie liefern jedoch nicht die gewünschten Produkte mit zufriedenstellender Ausbeute und Reinheit.
- Ein bekanntes biologisches Verfahren zur Gewinnung von Brassinosteroiden umfaßt einen Schritt der Züchtung von Wurzelkropfzellen eines Zweikeimblättrigen sowie einen Schritt der Isolierung des gewünschten Brassinosteroids bzw. der gewünschten Brassinosteroide aus der Kultur (japanische offengelegte ungeprüfte Patentanmeldung Nr. Hei-1-269500). Bei diesem Verfahren liegt die Ausbeute an den gewünschten Brassinosteroiden jeoch nur im Bereich 1 - 100 µg je kg Zellenfrischmasse.
- In US-A-3,628,287 wird ein Verfahren zur Gewinnung von Steroiddiosgenin offenbart, bei dem aus Kallusgewebe abgeleitete undiffenrenzierte Pflanzenzellen in Gegenwart von Cholesterol und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure gezüchtet werden.
- Die vorliegende Erfindung wurde unter Berücksichtigung der oben beschriebenen Schwierigkeiten bei den herkömmlichen Verfahren der Gewinnung gemacht.
- Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Gewinnung von Brassinosteroid zur Verfügung gestellt, bei dem Wurzelkropfzellen, die Brassinosteroid erzeugen können, in einem Nährboden gezüchtet werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Züchtung der Kultur in Gegenwart eines Kulturhilfsstoffes erfolgt, der unter Auxinen, Sterolen, Squalen, Casaminosäure und Gemischen davon ausgewählt wird.
- Im folgenden soll die Erfindung ausführlich beschrieben werden.
- Die zur erfindungsgemäßen Verwendung vorgesehenen Wurzelkropfzellen können nach einem beliebigen Verfahren gewonnen werden. Typisches Beispiel für die Gewinnung von Wurzelkropfzellen ist das Infizieren von Pflanzenzellen, die das gewünschte Brassinosteroid erzeugen können, mit einem pflanzentumorinduzierenden Bakterium, wodurch die Pflanzenzellen mit einem Teil von Plasmiden des Bakteriums beimpft werden und durch diese eine Transformation der Pflanzenzellen erfolgt. Als geeignete pflanzentumorinduzierende Bakterien seien diejenigen genannt, die zur Gruppe Agrobaktenum gehören. Zu den Beispielen für geeignete Pflanzenzellen, die einer Transformation unterzogen werden können, zählen Zweikeimblättrige wie Catharanthus roseus, Nicotiana tabacum, Helianthus tuberosus, Helianthus annuus, Brassica rada, Bellis perennis und Kalanchoe daigremontiana sowie bestimmte Einkeimblättrige wie Lilien- und Aronstabgewächse sowie Gräser.
- Der Transformand (Wurzelkropfzellen) wird in einem Nährboden in Gegenwart eines Kulturhilfsstoffes zur Ingangsetzung der Erzeugung von Brassinosteroiden gezüchtet.
- Als Kulturhilfsstoff werden ein Auxin, Sterol, Squalen oder Casaminosäure bzw. ein Gemisch daraus verwendet. Zu den geeigneten Auxinen gehören 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Indol-3-essigsäure, 1-Naphthalenessigsäure, 4-Chlorindol-3-essigsäure, Phenylessigsäure, 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, 2,3,6-Trichlorbenzoesäure und 2- Naphthoxyessigsäure. Beispiele für geeignete Sterole (Steroidalkohole) sind Cholesterol, Desmosterol, Zymosterol und Lanosterol.
- Es ist bereits bekannt, daß Wurzelkropfzellen selbst dazu in der Lage sind, Auxine und Cytokinine zu produzieren, die für ihre Gewebevermehrung erforderlich sind. Aus diesem Grunde war man der Meinung, daß die Zugabe eines Pflanzenwachstumshormons zum Nährboden, in dem die Wurzelkropfzellen angezüchtet werden sollen, unnötig ist. Es wird demnach nicht damit gerechnet, daß durch Zugabe des oben genannten Kulturhilfsstoffes zum Nährboden, in dem die Wurzelkropfzellen angezüchtet werden, die Produktion von Brassinosteroiden wesentlich beschleunigt wird.
- Als Nährboden können beispielsweise der Murashige-Skoog-Nährboden (MS-Nährboden), der Gamborg-Nährboden, der Nitsch- und Nitsch-Nährboden sowie der Heller- Nährboden eingesetzt werden.
- Der Kulturhilfsstoff wird in einer Menge verwendet, durch die die Produktion von Brassinosteroiden wirksam unterstützt wird. Die Menge an Kulturhilfsstoff ist in Abhängigkeit von der jeweiligen Art unterschiedlich. Die Menge der im allgemeinen zugesetzten Auxine beträgt beispielsweise 0,01 bis 100 mg, vorzugsweise 0,1 bis 10 mg pro Liter Nährboden. Sterole und Squalen werden in der Regel in einer Menge von 0,1 bis 1000 mg, vorzugsweise 1 bis 100 mg pro Liter Nährboden verwendet. Üblicherweise wird Casaminosäure in einer Menge von 0,1 bis 100 g, vorzugsweise 0,1 bis 10 g pro Liter Nährboden zugesetzt.
- Der Kulturhilfsstoff kann zu Beginn der Züchtung von Wurzelkropfzellen bzw. in einem späteren Stadium der Züchtung in den Nährboden gegeben werden. Der Kulturhilfsstoff sollte vorzugsweise dann dem Nährboden zugesetzt werden, wenn das Zellwachstum die logarithmische Phase erreicht hat. Wird beobachtet, daß der Kulturhilfsstoff das anfängliche Wachstum der Wurzelkropfzellen zu hemmen beginnt, so empfiehlt es sich, den Kulturhilfsstoff erst zuzugeben, nachdem das Zellwachstum die logarithmische Phase erreicht hat.
- Die Züchtung von Wurzelkropfzellen kann unter den für die Züchtung von Pflanzenzellen üblichen Bedingungen erfolgen. Im allgemeinen geschieht dies unter Schütteln bei einer Temperatur von 24 bis 34 ºC über einen Zeitraum, der für die Gewebevermehrung der Zellen bis zu einem gewünschten Grad ausreichend ist.
- Zur Erhöhung der Ausbeute an Brassinosteroiden wird die Zichtung von Wurzelkropfzeilen vorzugsweise unter Einwirkung von rotem oder gelbem Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 580 nm auf den Nährboden vorgenommen. In der Regel sollte die Einwirkung eines Lichts mit einer Wellenlänge von 560 nm oder darunter, inbesondere 500 nm oder darunter, ausgeschlossen werden, obwohl ein Licht mit einer Wellenlänge von mehr als 900 nm die Erzeugung von Brassinosteroiden nicht negativ beeinflußt. Somit ist die Einwirkung eines weißen Lichts bei Schutz gegen ein Licht mit einer Wellenlänge von 500 nm oder darunter, insbesondere 560 nm oder darunter, mittels Maskierfolie zu empfehlen. Es sollte günstigerweise rotes, orangefarbenes oder gelbes Licht genutzt werden.
- Nach der Zucht werden das Brassinosteroid oder die Brassinosteroide nach einem der bekannten Verfahren aus der Kultur gewonnen. Die Kultur kann zur mechanischen Aufschließung der Zeilen beispielweise homogenisiert werden. Das entstehende Gemisch wird dann mit einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Chloroform, ausgezogen, der Auszug wird anschließend getrennt und gereinigt, z.B. mittels Chromatographie.
- Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele noch ausführlicher erläutert werden.
- Ein Stamm Agrobacterium tumefaciens A 208¹ wurde zur Bildung von Kolonien 16 Stunden auf einem Agar-Nährboden Inkubiert. Diese Kolonien wurden entnommen, und es wurden Abschnitte von Stielen von Keimpflanzen des Catharanthus roseus (mit einer Stiellänge von 15 bis 20 cm) mit ihnen beimpft, wobei die Abschnitte der Stiele mit einem Chirurgenmesser angeritzt wurden. Die Keimpflanzen wurden daraufhin für 1 Monat in ein Gewächshaus mit 27 - 28 ºC umgesetzt, wo sie sich weiter entwickeln konnten. Im Ergebnis bildeten sich an den beimpften Stellen Tumore (Wurzelkröpfe) mit einem Durchmesser von etwa 1 cm. Nach Entnahme der Wurzelkröpfe wurden ihre Außenflächen mit einer 10 %igen Bleichlösung sterilisiert. Aus dem Inneren eines jeden Wurzelkropfes wurde ein Würfel mit einer Seitenlänge von 3 mm herausgeschnitten und als Schüttelkultur, bei einer Drehzahl von 100 min&supmin;¹, bei Dunkelheit und bei 26 ºC im folgenden flüssigen MS-Nährboden angesetzt, dem Antibiotika (200 mg pro Liter Carbenicillin and 100 mg pro Liter Vancomycin) zugesetzt waren: ¹ Stämme von A. tumefaciens A 208 können von der University of Washington, Seattle, USA, bezogen werden. Zusammensetzung des MS-Nährbodens Bestandteil Gehalt (mg pro l) Saccharose Myo-Inositol Nikotinsäure Pyrodixinhydrochlorid Thiaminhydrochlorid Glycin
- Die proliferierten Zellen wurden anschließend in einen aseptischen flüssigen Nährboden übertragen. Dieser wurde daraufhin in einen aus dem oben beschriebenen MS-Nährboden und 2 % Agar bestehenden MS-Agarnährboden umgesetzt. In diesem Nährboden kam es zu einem schnellen Wachstum der Zellen V208. Es folgten mehrere Vermehrungsstufen der Zellen V208 unter Nutzung des gleichen Agar-Nährbodens alle 20 Tage. Die dabei entstehenden Zeilen V208 wurden anschließend in den flüssige MS-Nährboden übertragen, und es folgten wiederum unter Schütteln Vermehrungsstufen der Passagekultur in wöchentlichen Abständen, so daß suspendierte Zeilen V208 (im folgenden als VNC'-Zeilen bezeichnet) gewonnen wurden. Es wurde festgestellt, daß diese VNC'-Zeilen konstant Brassinosteroide (hauptsächlich Brassinolid und Castasteron) bilden, und die Produktion dieser Zellen blieb im Verlaufe der Vermehrungsstufen der Passagekultur über den Zeitraum von 1 Jahr erhalten.
- Die gemäß dem Vergleichsbeispiel gewonnenen Wurzelkropfzellinien VNC' von Catharanthus roseus wurden 14 Tage lang bei Dunkelheit in sieben 500-ml-Erlenmeyerkolben, die jeweils 150 ml MS-Nährboden (pH-Wert: 6,7) sowie 0,0,1, 0,5, 1,5, 10 und 50 mg 2,4-Dichlor-phenoxyessigsäure (im folgenden als 2,4-D bezeichnet) je 1 l Nährboden enthielten, in einem Reziprokschüttler (100 min&supmin;¹) bei 27 ºC gehalten. Dann wurde die Kultur eines jeden Erlenmeyerkolbens filtriert und in eine Zellfraktion (C) und ein Filtrat (F) getrennt.
- Die so gewonnenen Zeilen (C) (etwa 50 g) wurden mit 200 ml Methanol homogenisiert, und das homogenisierte Gemisch wurde durch ein Glasfilter filtriert. Der oben beschriebene Homogenisierungs- und Extraktionsschritt wurde insgesamt dreimal wiederholt, und es entstand ein Methanolauszug. Dieser Methanolauszug wurde im Vakuum konzentriert, dabei wurden etwa 40 ml eines wäßrigen Konzentrats erhalten, das durch Zugabe von 0,3 g Natriumhydrogencarbonat alkalisch gemacht wurde. Aus diesem Konzentrat wurde mit 40 ml Ethylacetat dreimal hintereinander ein Auszug gewonnen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurde der Ethylacetatauszug im Vakuum konzentriert, wobei eine neutrale Ethylacetatfraktion (NEc) aus den Zellen (C) entstand.
- Das Filtrat (F), das aus der Kultur abgetrennt wurde (etwa 100 ml), wurde durch Zugabe von 0,5 g Natriumhydrogencarbonat alkalisch gemacht, und es wurde dreimal hintereinander ein Auszug mit Ethylacetat hergestellt. Der Auszug wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert, wobei eine neutrale Ethylacetatfraktion (NEf) aus dem Filtrat (F) entstand.
- Beide Fraktionen (NEc) und (NEf) wurden einem Reis- Laminaneigungstest zur Bestimmung des Brassinosteroidgehalts (BS-Gehalt) unterzogen. Der BS-Gehalt wird durch Vergleich der Aktivität der Proben mit einer als Standard verwendeten Brassinolidprobe (BL) bestimmt. Tabelle 1 enthält die Ergebnisse dieses Tests. Durch die GC-MS-Analyse wird nachgewiesen, daß die gemäß Beispiel 1 gewonnenen Brassinosteroide Brassinolid und Castasteron enthalten. Tabelle 1 Menge an 2,4-D Zellenfrischmasse (g/Kolben) BS-Gehalt an NEc (ng BL-Äquivalent/Frischmasse) BS-Gehalt an NEf (ng BL-Äquivalent/Kolben)
- Beispiel 1 wurde in der beschriebenen Weise wiederholt, allerdings wurde anfangs kein 2,4-D zugegeben. Es wurden somit die gemäß dem Vergleichsbeispiel erhaltenen Wurzelkropfzellinien VNC' von Catharanthus roseus bei Dunkelheit in sieben 500-ml- Erlenmeyerkolben, die jeweils 150 ml MS-Nährboden (pH-Wert: 6,7) enthielten, in einem Reziprokschüttler bei 27 ºC gehalten. 10 Tage nach Anlegen der Kultur wurden wäßrige Lösungen von 2,4-D den jeweiligen Kolben in einer solchen Menge zugesetzt, daß sich 2,4-D-Konzentrationen von 0,1, 0,5, 1,5, 10 und 50 mg pro 1 Liter Nährboden ergaben, und die Kultivierung wurde 4 Tage lang weitergeführt. Der BS-Gehalt in NEc und NEf ist in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Menge an 2,4-D Zellenfrischmasse (g/Kolben) BS-Gehalt and NEc (ng BL-Äquivalent/Frischmasse) BS-Gehalt an NEf (ng BL-Äquivalent/Kolben)
- Die Ergebnisse von Tabelle 1 und 2 lassen erkennen, daß durch die Zugabe von 2,4-D die Produktion von BS begünstigt wird. Diese Wirkung ist insbesondere dann ausgeprägt, wenn 2,4-D nach der Proliferation der Zellen zugegeben wird. Gleiche Ergebnisse werden erzielt, wenn anstelle von 2,4-D 3-Indolylessigsäure oder 1-Naphthyl-essigsäure verwendet werden.
- Beispiel 2 wurde in der beschriebenen Weise wiederholt, nur daß anstelle von 2,4-D Cholesterol in einer Menge von 100 mg pro 1 Liter des Nährbodens zugegeben wurde.
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3 Menge an Cholesterol Zellenfrischmasse (g/Kolben) BS-Gehalt an NEc (ng BL-Äquivalent/Frischmasse) BS-Gehalt an NEf (ng BL-Äquivalent/Kolben)
- Beispiel 2 wurde in der beschriebenen Weise wiederholt, wobei allerdings anstelle von 2,4-D Squalen verwendet und in einer Menge von 100 mg pro 1 Liter Nährboden zugesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4 Menge an Squalen Zellenfrischmasse (g/Kolben) BS-Gehalt an NEc (ng BL-Äquivalent/Frischmasse) BS-Gehalt an NEf (ng BL-Äquivalent/Kolben)
- Beispiel 1 wurde in der beschriebenen Weise wiederholt, allerdings wurde anstelle von 2,4-D Casaminosäure in einer Menge von 0,07, 0,7 und 7 g pro 1 Liter Nährboden zugegeben. Tabelle 5 enthält den BS-Gehalt in NEc und NEf. Tabelle 5 Menge an Casaminosäure Zellenfrischmasse (g/Kolben) BS-Gehalt an NEc (ng BL-Äquivalent/Frischmasse) BS-Gehalt an NEf (ng BL-Äquivalent/Kolben)
- Die gemäß dem Vergleichsbeispiel gewonnenen Wurzelkropfzellinien VNC' von Catharanthus roseus wurden 14 Tage lang in fünf 500-ml-Erlenmeyerkolben mit je 150 ml MS-Nährboden (pH-Wert: 6,7) in einem Reziprokschüttler (100 min&supmin;¹) bei einer Temperatur von 27 ºC gehalten, wobei die Kolben weißem Licht mit etwa 16 000 lux ausgesetzt wurden. Einer der Kolben wurde mit Aluminiumfolie als Lichtschutz, ein anderer nicht umhüllt. Die restlichen drei Kolben wurden mit transparenten rot-, gelb- bzw. blaugefärbten Zellglasfolien umhüllt. Nach 14tägiger Kultivierung wurde die Kultur eines jeden Kolbens filtriert und in eine Zellenfraktion (C) und in ein Filtrat (F) getrennt. Der BS-Gehalt in NEc und NEf ist der Tabelle 6 zu entnehmen. Tabelle 6 Einwirkung von Licht dunkel rotes Licht gelbes Licht blaues Licht weißes Licht Zellenfrischmasse (g/Kolben) BS-Gehalt an NEc (ng BL-Äquivalent/Frischmasse) BS-Gehalt an NEf (ng BL-Äquivalent/Kolben)
- Es ist allgemein bekannt, daß durch Einwirkung von Licht das Zellwachstum gebremst wird. Aus den Ergebnisse geht allerdings hervor, daß durch rotes und gelbes Licht deutlich die BS-Produktion von Wurzelkropfzellen verbessert wird.
Claims (4)
1. Verfahren zur Gewinnung eines Brassinosteroids, wobei
Wurzelkropfzellen, die Brassinosteroid erzeugen können, auf einem
Nährboden angezüchtet werden, dadurch gekennzeichnet, daß die
Züchtung in Gegenwart eines unter Auxinen, Sterolen, Squalen,
Casaminosäure und deren Gemischen ausgewählten Kulturhilfsstoffes
erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem
Kulturhilfsstoff um mindestens ein unter 2,4-
Dichlorphenoxyessigsäure, Indol-3-essigsäure und 1-
Naphthalenessigsäure ausgewähltes Auxin handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kulturhilfsstoff dem
Nährboden zugesetzt wird, nachdem die Zellen die logarithmische
Wachstumsphase erreicht haben.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Züchtung unter Einwirkung
von rotem oder gelbem Licht mit einer Wellenlänge von mindestens
580 nm erfolgt.
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