JPH012591A

JPH012591A - アルカロイドの製造方法

Info

Publication number: JPH012591A
Application number: JP63-64650A
Authority: JP
Inventors: 鎌田　博; 嵯峨　均
Original assignee: ライオン株式会社
Priority date: 1987-03-20
Filing date: 1988-03-17
Publication date: 1989-01-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はナス科植物が生合成する生理活性物質及び薬用
成分でもあるアルカロイド、特にトロパンアルカロイド
を、ナス科植物の毛状根を培養して連続的に製造する方
法に関するものである。

〔従来の技術〕

植物の細胞・組織培養法による植物の二次代謝物の工業
的生産法として、植物に毛根病菌アグロバクテリウム・
リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍｒｈｉｚ
ｏｇｅｎｅｓ　）を接種し、生えてきた毛状根を培養す
る方法が知られている。この方法は、次の原理に基づく
ものである。すなわち、アグロバクテリウム・リゾジェ
ネスを植物の茎・葉・根などに接種すると、感染部位か
ら毛状根と呼ばれる根が発生する。この根は、リゾジェ
ネス中に存在する巨大プラスミド（Ｒｉプラスミド）の
遺伝子の一部が植物の遺伝子に組み込まれることにより
発生し、通常の根に比べて生育が非常に速く又二次代謝
物の生産量が同等以上であることが知られている。

従って、この方法は、上記性質を利用して、根に有用物
質を含む植物にアグロバクテリウム・リゾジェネスを接
種し、発生した毛状根を切り出してタンクなどの装置で
培養し、増殖させた毛状根を破壊して有用物質を取り出
す方法である。

しかしながら、この毛根病菌を用いる方法によれば、細
胞を破壊して細胞中に蓄積された目的物質を取り出して
いるため、細胞成分と目的物質との分離が煩雑であり、
コストアップになるという欠点があり、又増殖する植物
器官を連続的に取り出すことが困難であるために、バッ
チ方式による生産しか行うことができないという欠点が
ある。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明者らは、上記問題点のない製造方法として
、特定の植物に上記毛根病菌を接種し、生えてきた毛状
根を培養し、該毛状根が培地中に分泌するアルカロイド
を抽出する方法を開発し、特願昭６１−４７０４６号と
して特許出願し、さらに、特定の元素を含有しないか又
は特定量含有する液体培地を用いた特許出願を行った（
特願昭６１−１８１５３２号、特願昭６１−１８１５３
３号）。

しかしながら、分泌されたアルカロイドを培地中に存在
させたまま培養を続けるバッチ方式で毛状根を培養する
と、毛状根の生育速度及び毛状根のアルカロイドの含有
率と培地への分泌量が、未だ十分でないという問題が生
じた。

従って、本発明は、Ｒｉプラスミドにより形質転換して
生じた毛状根の生育とアルカロイドの生産に適した培養
方法を開発し、毛状根の生育速度を速めるとともに、ア
ルカロイドの生産効率の高い方法を提供することを目的
とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、ナス科植物の毛状根が培地中に分泌するアル
カロイドが、毛状根の生育やアルカロイドの生産を阻害
するので、これを培養中に培地から連続的に回収するこ
とにより、上記課題を解決できるとの知見に基づいてな
されたものである。

すなわち、本発明は、ナス科植物細胞をアグロバクテリ
ウム・リゾジェネスが保持するＲｉプラスミドにより形
質転換し、生じた毛状根を培養して、該毛状根が培地中
に分泌するアルカロイドを培養中に培地から連続的に回
収することを特徴とするアルカロイドの製造方法を提供
する。

本発明で処理の対象とされるのは、ナス科植物であり、
本発明では処理対象をこのように限定したことが特に重
要である。すなわち、ナス科植物の毛状根によればアル
カロイドが培地中に分泌されるからである。本発明では
任意のナス科植物が用いられるが、アトローパ属植物、
ダツラ属植物、ヒヨスチアムス属植物、ズボイシア属植
物の群から選ばれるものを用いるのが好ましい。

これらの植物に毛状根を作らせるために利用できるアグ
ロバクテリウム・リゾジェネス菌としては、アグロバクテリウム・リゾジェネス　２５８１８（ＡＴ
ＣＣ２５８１８＞アグロバクテリウム・リゾジェネス　１５８３４（ＡＴ
ＣＣ１５８３４）アグロバクテリウム・リゾジェネス　　８１９６アグロ
バクテリウム・リゾジェネス　　Ａ４（ＡＴＣＣ４３０
５７）などがあげられる。また大腸菌などの他の菌にＲｉプラ
スミドまたはその一部のＴ−ＤＮＡを遺伝子導入した菌
も使用できる。

本発明により植物をアグロバクテリウム・リゾジェネス
菌で処理すると、リゾジェネス菌中のＲ１プラスミドの
一部（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞の核ＤＮＡの中に導入（
形質転換）される。

前記ナス科植物の茎・根・葉などにＲｉプラスミミド−
ＤＮＡを導入し形質転換させた毛状根を得る方法として
は、例えば、次の方法があげられる。

１、植物個体への直接接種法２、葉片を用いたリーフディスク法（Ｒ６Ｂ、Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　５ＣＩＥＮ
ＣＥ　　　２２　？　。

３、植物体のプロトプラストを利用した共存培養法（Ｚ
ｌＭ、Ｗｅｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ
　Ｒｅｐ、。

５　：９３−９６　（１９８６））４、植物体のプロトプラストとアグロバクテリウム・リ
ゾジェネスのスフェロプラスト法（Ｒ，Ｈａｉｎｅｔ　
ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、、　３．６
０（１９８４））５、アグロバクテリウム・リゾジェネ
ス菌のＲｉプラスミドまたはその一部のＴ−ＤＮＡをマ
イクロインジェクションなどの方法で直接細胞内に注入
する方法Ｒｉプラスミドを上記１〜４の方法で導入した場合は、
その後アグロバクテリウム・リゾジェネス菌の除菌処理
が必要で、その方法としては下記のものがある。

○　高温処理（４０℃）Ｏ抗生物質処理 ○　毛状根先端部の早いサイクルでの植え継ぎ以上の方
法により得られた毛状根の培養方法としては下記のもの
が有効である。

本発明では、例えば、従来植物の組織培養に用いられて
いる培地、つまり、無機成分台よび炭素源を必須成分と
し、これに植物成長調節物質、ビタミン類およびアミノ
酸類から選ばれる少なくとも１種類以上の成分を添加し
必要に応じてその他の成分も添加されている培地を用い
ることができる。

上記培地中の無機成分としては、窒素、亜鉛、鉄、銅、
モリブデン、ホウ素、リン、コバルト、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、塩素、ナト
リウム、ヨウ素等があり、具体的には、硝酸アンモニウ
ム、リン酸２水素アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝
酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、１ナ
トリウムエチレンジアミン４酢酸第２鉄、硫酸鋼、モリ
ブデン酸、モリブデン酸ナトリウム、ホウ酸、リン酸、
リン酸１ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２ナト
リウム、リン酸３ナトリウム、塩化コバルト、塩化カリ
ウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリ
ウム、硫酸マンガン、ヨウ化カリウムなどが例示される
。

また炭素源には、ショ糖及び、他の炭水化物、その誘導
体、脂肪酸等の有機酸、エタノール等の１級アルコール
などが例示される。

植物成長調節物質には、インドール酢酸（ＩＡＡ）ナフ
タレン酢酸（ＮＡＡ）、ｐ−クロロフェノキシイソ酪酸
、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）など
のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼア
チン等のサイトカイニン類が例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢυピ
リドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、アスコル
ビン酸くビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン酸など
が例示される。

アミノ酸類には、グリシン、アラニン、グルタミン、シ
スティンなどが例示される。

本発明では、上記成分を含有する種々の培地を用いるこ
とができるが、液体培地を用いるのが好ましい。尚、液
体培地中の成分の濃度は、広い範囲で変えることができ
る。通常は、無機成分を約０．１μＭ〜約１０００　ｍ
Ｍ程度、炭素源を約１ｇ／ｌ〜約１２０ｇ／ｊ！程度、
さらに植物成長調節物質を約０，０１μＭ〜約１０μＭ
程度、ビタミン類およびアミノ酸類を、それぞれ約０，
１ｍｇ／Ｉｌ〜約１００ｍｇ／ｌ程度とすることができ
る。

本発明では、液体培地中の毛状根の初期植え付は量を広
い範囲で変えることができる。通常は液体培地５０−に
対して、毛状根を約１０ｍｇ〜約１ｇ（新鮮重量）程度
植え付けすることが望ましい。

本発明の毛状根の培養にふいて、光は必ずしも必要では
なく、かえって暗所での培養がアルカロイドの生合成に
望ましく、培養温度は約り０℃〜約３５℃、特に約り３
℃〜約２８℃が好適である。

つまり、約１０℃未満では毛状根の増殖速度が小さく、
約３５℃を越えても同様に毛状根の増殖速度が小さくな
るからである。

以上の方法により培養を行いながら、毛状根が培地中に
分泌するアルカロイドを連続的に回収する方法としては
下記のものが有効である。尚、ここで連続的にとは、一
定の時間をあけて継続的に行うことも含む。

バッチ方式で培養を行う場合には、培養容器内にアルカ
ロイドを吸着する物質を入れておき、培地中に分泌され
るアルカロイドを連続的に吸着させて回収することがで
きる。このような物質としては、次のようなものが例示
される。シリカゲル、アルミナ、活性炭、アンバーライ
ト（オルガノ株式会社製）、セパビーズ（三菱化成工業
株式会社製）等の吸着剤があげられる。

尚、アルカロイドが吸着剤に連続的に吸着されるように
培養中、培地を攪拌又は振とうするのがよい。

上記吸着剤の代りに、培地には溶解せず、かつアルカロ
イドを溶解する有機溶媒（抽出剤）を用いることもでき
る。このような有機溶媒としては、流動パラフィン、ヘ
プクメチルノナン、ミリスチン酸メチル等があげられる
。この溶媒を用いる場合にも、培地、中に分泌されたア
ルカロイドが連続的に培地から取り除かれるようにする
ために、培地を攪拌又は振とうするのがよい。

上記吸着剤や溶媒は、培地重量の０．００００１〜１０
倍、好ましくは０．００１〜１倍の量で用いるのがよい
。

また、培地を循環させ、その途中にアルカロイドを回収
する装置を設置し、回収後の培地を、再び培養容器中に
戻す方法がある。回収装置としては、ガラスカラム等の
中に上記のような吸着剤または有機溶媒を封入しその中
をアルカロイドを含む培地を通すもの等が例示される。

また新らしい培地を連続的に供給し、一方古い培地を連
続的に取り出し、取り出した培地からアルカロイドを回
収することができる。更新は、連続的に行ってもよいし
、時々培地の一部または全部を交換してもよい。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ナス科植物細胞からアルカロイドを効
率的に製造することができるので、本発明の方法は工業
的なアルカロイドの製造方法として極めて好適である。

次に本発明を実施例により説明する。

〔実施例〕

実施例１ケチョウセゾアサガオ（Ｄａｔｕｒａ　１ｎｎｏｘｉａ
　Ｍｉｌｌ）の種子を次亜塩素酸す）　＋Ｊウム溶液な
どの殺菌剤で滅菌したのち、シュークロースを３％含有
するムラシゲ・スクーグ（ＭＳ−３と略す；組成を表−
１に示す）の固型培地上に播種し、発芽した無菌植物の
茎・葉部などにＲ１プラスミドを保持する、アグロバク
テリウム・リゾジェネス（ＡＴＣＣ１５８３４）菌を接
種した。

２〜５週間後に接種部位から発生した毛状根を切り取り
、カルベニシリン１　ｇ／Ｉｌを含むＭＳ−３の固型培
地上に移植し、１〜２週間で同じ組成の新しい培地に移
植した。２〜３回この操作を繰り返して、除菌された毛
状根を得た。

１００−のエーレンマイヤーフラスコにＭＳ−３の液体
培地５０ｒｎｌを入れ、１２゛０℃で１５分間滅菌した
。

この液体培地に上記の毛状根約１００ｍｇ（新鮮重量）
を植え付け２５℃で１５日間、暗黒下で振とう培養（旋
回回転数１００回／分、振幅３０ｍ）し、１６日目に新
しいＭＳ−３の液体培地５０ｒｎｌにアンバーライトＸ
ＡＤ−２，４，７およびセパビーズＨＰ−２０を表−２
に示した量だけ加え、同様な条件で滅菌した容器に毛状
根を移し、さらに１５日間培養した。

培養後のケチョウセンアサガオの毛状根をろ過に、より
採取し、秤量したのち凍結乾燥した。乾燥後も秤量を行
ってから、乳鉢ですりつぶし粉末にした。次に粉末をク
ロロホルム：メタノール：アンモニア＝１５：５：１の
混合液で抽出し、ろ過して抽出液を得た。これを硫酸酸
性（ｐＨ２）でクロロホルム抽出を行い水層を分取し、
次にアンモニアアルカリ性（ｐｔｌ　１０　＞にしてか
らクロロホルム抽出を行った。そしてクロロホルムを無
水硫酸ナトリウムで脱水処理したのち、減圧下で蒸発乾
固させアルカロイド画分を得た。

また培地は、重量を測定したのち、硫酸酸性（ｐ）ｌ　
２　）にしてから、上記と同様の方法で抽出しアルカロ
イド画分を得た。

アンバーライトＸＡＤ−２，４，７およびセパ１＝”−
ズＨＰ−２０は重量を測定したのち、クロロホルム抽出
を行い、減圧下にクロロホルムを蒸発乾固させ、毛状根
と同様の方法で抽出しアルカロイド画分を得た。

アルカロイド画分中のアトロピン、スコポラミンの定壷
は、ガスクロマトグラフィーで行った。

カラムはＯＶ　　ｌ　７　（２ｍ　Ｘ３　ｍ［ＩＩ）　
、カラム温度は２３５℃、キャリアガスは窒素で流速は
５０＃１１！／分、検出器にはＦＩＤを用いた。

王者のアトロピン、スコポラミン量を加えて、フラスコ
当たりの総生成量を求めた。

培地に加えたアンバーライトＸＡＤ−２，４，７および
セパビーズＨＰ−２０の量と得られた結果を表−２に示
す。尚、表中の結果は３回行った試験の平均値である。

又、表中、ＡＴはアトロピンを、ＳＣはスコポラミンを
示す（以下、同じ）。

表−１表−２から明らかなように、アルカロイドを培養中に培
地から回収しない方法（比較例）に比べて、本発明の方
法によれば多量のアルカロイドを製造できることがわか
る。

実施例２吸着剤を入れずに、表−３及び４に示した間隔で同じ組
成の新鮮なＭＳ−３の液体培地に植え換えていく以外は
実施例１と同様な方法でケチョウセンアサガオ（Ｄａｔ
ｕｒａ　１ｎｎｏｘｉａ　Ｍｉｌｌ）とズボイシア交配
種（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ　ｘＤ
、１ｅｉｃｈａｒｄｔｉｉ）の毛状根の培養とアルカロ
イドの定量を行った。

培地を更新した間隔と得られた結果を表−３，４に示す
。

表−３，４から明らかなように、培地を更新しない方法
（比較例）に比べて、本発明の方法によれば多量のアル
カロイドを製造できることがわかる。

実施例３２リツトルのエアリフト型植物培養装置（柴田バリオ硝
子株式会社製）にＭＳ−３の液体培地１リツトルを入れ
、ポンプとガラス管及びシリコン管で培養中に常に培地
が４０ｍｊ！／時間で循環する循環装置を取り付け、そ
の流路の途中にアンバーライトＸＡＤ−４を２０ｇ封入
した直径３５ｍｍ。

長さ１５０ｍｍのガラスカラムを取り付け、循環する培
地がこれを通るようにし、装置を１２０℃で１５分間滅
菌した。

実施例１と同様な方法で得たケチョウセンアサガオ（Ｄ
ａｔｕｒａ　１ｎｎｏｘｉａ　Ｍｉｌｌ）とアトローバ
ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ　Ｌ
、）の毛状根を上記培地に約１ｇ＜新鮮重量）植え付け
、２５℃で３０日間暗黒下に培養した。

また別に上記装置のガラスカラムからアンバーライ）Ｘ
ＡＤ−４だけを取り除いた装置で全く同様な培養を行い
比較例とした。

培養後、実施例１と同様な方法でアルカロイドの定量を
行った。

得られた結果を表−５，６に示すが、この結床から明ら
かなように、アルカロイドを培養中に培地から回収しな
い方法（比較例）に比べて、本究明の方法によれば多量
のアルカロイドを製造できることがわかる。

□ 実施例４２リツトルのエアリフト型植物培養装置（柴田バリオ硝
子株式会社製）にＭＳ−３の液体培地１リツトルを入れ
、ポンプとガラス管及びシリコン管で培養中に常に培地
が４ｍｌ！／時間で更新する装置を取り付けた。すなわ
ち、新鮮なＭＳ−３の液体培地３リツトルを貯蔵びんに
入れ第１のポンプによって４−７時間の流速で培養装置
に注入し、第２のポンプによって同じ流速で培養装置か
らアルカロイドを含んだ培地を流出させ、これを別の貯
蔵びんに蓄えた。装置は１２０℃で１５分間滅菌した。

実施例１と同様な方法で得たヒヨスチアムスアルプス（
Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｍｕｔｉｃｕｓ　Ｌ、）の毛状
根を上記培地に約１ｇ（新鮮重量）植え付け、２５℃で
３０日間暗黒下に培養した。

得られた結果を表−７に示す。

表−７から明らかなように、アルカロイドを培養中に培
地から回収しない方法（比較例）に比べて、本発明の方
法によれば多量のアルカロイドを製、造できることがわ
かる。

実施例５３リツトルのエアリフト型植物培養装置（柴田バリオ硝
子株式会社製）にシュークロースを３％含有するウツデ
イ−プラント培地（ＷＰ−３と略称する。；組成を表−
９に示す。）の液体培地３リツトルを入れ、ポンプとガ
ラス管及びシリコン管で培養中にＷＰ−３培地が４０ｍ
１’／時間で循環する循環装置を取り付け、その流路の
途中にアンバーライトＸＡＤ−４を２０ｇ封入した直径
１７ｍｍ、長さ３００ｍｍのガラスカラムを取り付け、
循環する培地がこれを通るようにし、装置を１２０℃で
１５分間滅菌した。

実施例１と同様な方法で得たヒヨスチアムスアルプス（
Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ａｌｂｕｓ　Ｌ、）の毛状根を
上記培地に約１ｇ（新鮮重量）植え付け、２５℃で２３
日間暗黒下に培養したのち、上記ポンプを作動させ培地
の循環を行ないながらさらに２１日間暗黒下に培養した
。

得られた結果を表−８に示すが、この結果から明らかな
ように、アルカロイドを培養中に培地から回収しない方
法（比較例）に比べて、本発明の方法によれば多量のア
ルカロイドを製造できることがわかる。

Claims

【特許請求の範囲】

　ナス科植物細胞をアグロバクテリウム・リゾジェネス
が保持するＲｉプラスミドにより形質転換し、生じた毛
状根を培養して、該毛状根が培地中に分泌するアルカロ
イドを培養中に培地から連続的に回収することを特徴と
するアルカロイドの製造方法。