JPS63230093A - ナフトキノン系化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はムラサキ科植物が生合成する生理活性物質及び
薬用成分でもあるナフトキノン系化合物を、ムラサキ科
植物の毛状根を培養して連続的に製造する方法に関する
ものである。

〔従来の技術〕

ムラサキ科の植物であるムラサキの根には、下記の式 （式中、Ｒは−ＯＨ，−ＤＣＯＣ８３など）で示される
シコニン（Ｒ＝−ＤＨ）等のナフトキノン系の化合物が
含まれており、従来から「紫根」と呼ばれる漢方薬に用
いられている。具体的には、ゴマ油等の油脂によって、
紫根からシコニンその他の物質を抽出して得られる軟膏
は紫雲膏と呼ばれ、各種皮膚疾患、切傷、火傷、痔疾等
の症状に用いられ、血管透過性亢進、肉芽形成作用等の
あることが知られている。

しかしながら紫根から抽出できるシコニン等の薬効成分
は微量であり、またムラサキの栽培には時間がかかり、
自然環境や天候にも左右される等の問題があり、その安
定供給が危ぶまれている。

これに対し、ムラサキ科植物の細胞・組織培養法によっ
て、ナフトキノン系化合物を工業的に生産する方法が、
種々知られている。

その一つは、カルスを培養する方法である。

圧端、原らは、この方法に好適な培地を開発し、その成
分に関する特許出願が行われている。例えば、セルロー
ス系繊維を含有する液体培地を用いる方法（特公昭８０
−３４号）、窒素源のうちのアンモニウムイオンの割合
が１０モル％以下であ゛る液体培地を用いる方法（特公
昭６０−３５号）、酢酸セルロース、キチン、活性炭及
びペクチン酸から選ばれる少なくとも１種以上の添加物
を含有する液体培地を用いる方法（特公昭６０−３６号
）、銅イオン濃度が、０．２μＭ以上である液体培地を
用いる方法（特公昭６０−９８４号）、サイトカイニン
類の濃度が５μＭ以下である液体培地を用いる方法（特
公昭６０−９８５号）、特定のアミノ酸を特定量用いる
方法（特公昭６０−９８６号）、硫酸イオン濃度が、０
，１ｍＭ以上である液体培地を用いる方法（特公昭６０
−９８７号）、マンガン、モリブデン又はヨウ素イオン
を特定量含む液体培地を用いる方法（特公昭６０−９８
８号）などである。

これに対して、カルス培養以外の方法としては、植物に
毛根病菌アグロバクテリウム・リゾジェネス（＾ｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を接種し
、生えてきた毛状根を培養する方法が知られている。こ
の方法は、次の原理に基づくものである。すなわち、ア
グロバクテリウム・リゾジェネスを植物の茎・葉・根な
どに接種すると、感染部位から毛状根と呼ばれる根が発
生する。この根は、リゾジェネス中に存在する巨大プラ
スミド（Ｒｉプラスミド）の遺伝子の一部が植物の遺伝
子に組み込まれることにより発生し、通常の根に比べて
生育が非常に速く又は二次代謝物の生産量が同等以上で
あることが知られている。

さらに、昭和６１年の日本植物学会大会において、鎌田
らは、ムラサキの毛状根を培養することによって、ナフ
トキノン系化合物が、毛状根により生産され、それが培
地中に分泌されることを発表した。

しかしながら、ムラサキ科植物の毛状根を通常の培地（
ＭＳ培地など）で培養すると、毛状根の生育速度及び毛
状根のナフトキノン系化合物含有率と培地への分泌量が
、未だ十分でないという問題が生じた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

そこで本発明者らは、特定の元素を含有しないか又は特
定量含有する液体培地を用いると上記問題点を有効に解
決できるとの知見を得、特許出願したく特願昭６１−２
８１１９５号、特願昭６１−２８１１９６号）。

しかしながら、分泌されたナフトキノン系化合物を培地
中に存在させたまま培養を続けるバッチ方式で毛状根を
培養すると、毛状根の生育速度及び毛状根のナフトキノ
ン系化合物の含有率と培地への分泌量は、未だ十分とは
いえず、一層の向上が望まれている。

従って、本発明は、Ｒｉプラスミドにより形質転換して
生じた毛状根の生育とナフトキノン系化合物の生産に適
した培養方法を開発し、毛状根の生育速度を速めるとと
もに、ナフトキノン系化合物の生産効率の高い方法を提
供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ムラ、サキ科植物の毛状根が培地中に分泌す
るナフトキノン系化合物が、毛状根の生育やナフトキノ
ン系化合物の生産を阻害するので、これを培養中に培地
から連続的に回収することにより、上記問題を解決でき
るとの知見に基づいてなされたものである。

すなわち、本発明は、ムラサキ科植物細胞をアグロバク
テリウム・リゾジェネスが保持するＲｉブラスミドによ
り形質転換し、生じた毛状根を培養して、該毛状根が培
地中に分泌するナフトキノン系化合物を培養中に培地か
ら連続的に回収することを特徴とするナフトキノン系化
合物の製造方法を提供する。

本発明では、任意のムラサキ科植物が用いられるが、ム
ラサキ属植物から選ばれるものを用いるのが好ましい。

具体的には、ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅ−ｒｕｍｕｍ
　ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）、ホタルカズラ（Ｌ、
ｚｏｌｌｉ−ｎｇｅｒｉ）、Ｌ、ｃａｎｅｓｃｅｎｓ、
　　Ｌ、ｄｉｆｆｕｓｕｍ、Ｌ、ｇｒａｍｉｎ−ｉｆｏ
ｌｉｕｍ、　　Ｌ、ｐｅｔｒａｅｕｍ、　　Ｌ、ｐｕｒ
ｐｕｒｅｏ−ｃａｅｒｕｌｅｕｍ。

Ｌ、　ｒｏｓｍｏｒｉｎｉｆｏｌｉｕｍが例示され、と
りわけムラサキが好ましい。

これらの植物に毛状根を作らせるために利用できるアグ
ロバクテリウム・リゾジェネス菌としては、 アグロバクテリウム・リゾジェネス　２５８１８アグロ
バクテリウム・リゾジェネス　１５８３４アグロバクテ
リウム・リゾジェネス　　８１９６アグロバクテリウム
・リゾジェネス　　Ａ４などがあげられる。また大腸菌
などの他の菌にＲｉプラスミドまたはその一部のＴ−Ｄ
ＮＡを遺伝子導入した菌も使用できる。

本発明により植物をアグロバクテリウム・リゾジェネス
菌で処理すると、リゾジェネス菌中のＲｉプラスミドの
一部（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞の核ＤＮＡの中に導入（
形質転換）される。

前記ムラサキ科植物の茎・根・葉などにＲｉプラスミド
Ｔ−ＤＮＡを導入し形質転換させた毛状根を得る方法と
しては、例えば、次の方法があげられる。

１、植物個体への直接接種法 ２、　葉片を用いたリーフディスク法 （Ｒ，Ｂ、　Ｈｏｒｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　５ＣＩＥ
ＮＣＥ　　２２７　。

３、植物体のプロトプラストを利用した共存培養法（Ｚ
ｏＭ、Ｗｅｉ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ
　Ｒｅｐ、、　５　：９３−９．６　（１９８６）　） ４、植物体のプロトプラストとアグロバクテリウム・リ
ゾジェネスのスフ二ロプラスト法（Ｒ。

Ｈａｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ
ｅｐ、、　　３．６０５、　アグロバクテリウム・リゾ
ジェネス菌のＲｉプラスミドまたはその一部のＴ−ＤＮ
Ａをマイクロインジェクションなどの方法で直接細胞内
に注入する方法 Ｒ１プラスミドを上記１〜４の方法で導入した場合は、
その後アグロバクテリウム・リゾジェネス菌の除菌処理
が必要で、その方法としては下記のものがある。

○　高温処理（４０℃） ○　抗生物質処理 ○　毛状根先端部の早いサイクルでの植え継ぎ以上の方
法により得られた毛状根の培養方法としては下記のもの
が有効である。

本発明では、例えば、従来植物の組織培養に用いられて
いる培地、つまり、無機成分および炭素源を必須成分と
し、これに植物ホルモン類、ビタミン類およびアミノ酸
類から選ばれる少なくとも１種類以上の成分を添加し必
要に応じてその他の成分も添加されている培地を用いる
ことができる。

上記培地中の無機成分としては、窒素、亜鉛、鉄、銅、
モリブデン、ホウ素、リン、コバルト、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、イオウ、マンガン、塩素、ナト
リウム、ヨウ素等があり、具体的には、硝酸アンモニウ
ム、リン酸２水素アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝
酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、エチ
レンジアミン４酢酸鉄、硫酸銅、モリブデン酸、モリブ
デン酸ナトリウム、ホウ酸、リン酸、リン酸ｌナトリウ
ム、リン酸１カリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸３
ナトリウム、塩化コバルト、塩化カリウム、塩化カルシ
ウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸マンガ
ン、ヨウ化カリウムなどが例示される。

また炭素源には、ショ糖及び、他の炭化水素、その誘導
体、脂肪酸等の有機酸、エタノール等の１級アルコール
などが例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸（ＩＡＡ）ナフタ
レン酢酸（ＮＡＡ）、ｐ−クロロフェノキシイソ醋酸、
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などの
オーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼアチ
ン等のサイトカイニン類が例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢｌ　
　）ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、ア
スコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン
酸などが例示される。

アミノ酸類には、グリシン、アラニン、グルタミン、シ
スティンなどが例示される。

本発明では、上記成分を含有する種々の培地を用いるこ
とができるが、液体培地を用いるのが好ましい。尚、液
体培地中の成分の濃度は、広い範囲で変えることができ
る。通常は、無機成分を約０．１μＭ〜約１００　ｍＭ
程度、炭素源を約１ｇ／β〜１２０ｇ／ｊ’程度、さら
に植物ホルモン類を約０．０１μＭ〜約１０μＭ程度、
ビタミン類およびアミノ酸類を、それぞれ約０．１ｍｇ
／ｊ！〜約１００ｍｇ／β程度とすることができる。

本発明では、液体培地中の毛状根の初期植え付は量を広
い範囲で変えることができる。通常は液体培地５０ｍｊ
２に対して、毛状根を約１０ｍｇ〜約Ｉｇ（新鮮重量）
程度植え付けすることが望ましい。

本発明の毛状根の培養において、光は必ずしも必要では
なく、かえって暗所での培養がナフトキノン系化合物の
生合成に望ましく、培養温度は約り０℃〜約３５℃、特
に約り３℃〜約２８℃が好適である。つまり、約１０℃
未満では毛状根の増殖速度が小さく、約３５・℃を越え
ても同様に毛状根の増殖速度が小さくなるからである。

以上の方法により培養を行いながら、毛状根が培地中に
分泌するナフトキノン系化合物を連続的に回収する方法
としては下記のものが有効である。

尚、ここで連続的にとは、一定の時間をあけて継続的に
行うことも含む。

バッチ方式で培養を行う場合には、培養容器内にナフト
キノン系化合物を吸着する物質を入れておき、培地中に
分泌されるナフトキノン系化合物を連続的に吸着させて
回収することができる。このような物質としては、次の
ようなものが例示される。シリカゲノ吠アルミナ、活性
炭、アンバーライト（オルガノ株式会社製）、セパビー
ズ（三菱化成工業株式会社製）等の吸着剤があげられる
。

尚、ナフトキノン系化合物が吸着剤に連続的に吸着され
るように培養中、培地を攪拌又は振とうするのがよい。

上記吸着剤の代りに、培地には溶解せず、−かつナフト
キノン系化合物を溶解する有機溶媒（抽出剤）を用いる
こともできる。このような有機溶媒としては、流動パラ
フィン、ヘプタメチルノナン、ミリスチン酸メチル等が
あげられる。この溶媒を用いる場合にも、培地中に分泌
されたナフトキノン化合物が連続的に培地から取り除か
れるようにするために、培地を攪拌又は振とうするのが
よい。

上記吸着剤や溶媒は、培地重量のｏ、　ｏ　ｏ　ｏ　ｏ
　ｉ〜１０倍、好ましくは０．００１〜１倍の量で用い
るのがよい。

また、培地を循環させ、その途中にナフトキノン系化合
物を回収する装置を設置し、回収後の培地を、再び培養
容器中に戻す方法がある。回収装置としては、ガラスカ
ラム等の中に上記のような吸着剤または有機溶媒を封入
しその中をナフトキノン系化合物を含む培地を通すもの
等が例示される。

また新らしい培地を連続的に供給し、一方古い培地を連
続的に取り出し、取り出した培地からナフトキノン系化
合物を回収することができる。更新は、連続的に行って
もよいし、時々培地の一部または全部を交換してもよい
。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ムラサキ科植物細胞からナフトキノン
系化合物を効率的に製造することができるので、本発明
の方法は工業的なナフトキノン系化合物の製造方法とし
て極めて好適である。

次に本発明を実施例により説明する。

〔実施例〕

実施例１ ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｕｍｕａ＋　ｅｒｙｔｈ
ｒｏｒｈｉｚｏｎ）の種子を次亜塩素酸す）　ＩＪウム
溶液などの殺菌剤で滅菌したのち、シュークロースを３
％含有するムラシゲ・スクーグ（ＭＳ　　３と略す）の
固型培地上に播種し、発芽した無菌植物の茎・葉部など
にＲｉプラスミドを保持する、アグロバクテリウム・リ
ゾジェネス（１５８３４）菌を接種した。

２〜５週間後に接種部位から発生した毛状根を切り取り
、カルベニシリンＬｇ／Ｉｔを含むＭＳ−３の固型培地
上に移植し、１〜２週間で同じ組成の新しい培地に移植
した。２〜３回この操作を繰り返して、除菌された毛状
根を得た。

１００ＴＩｌｊ！のエーレンマイヤーフラスコにＭＳ−
３の液体培地５０＋ｙ＋ｊｌ’を入れ、１２０℃で１５
分間滅菌した。

この液体培地に同様な条件で滅菌した活性炭、アンバー
ライトＸＡＤ−２，４，７（オルガノ株式会社製）、流
動パラフィンを表−１に示した量だけ無菌的に加えたの
ち、上記の毛状根約１００ｍｇを植え付け２５℃で３５
日間、暗黒下で振とう培＃（旋回回転数１００回／分、
振幅３０ｍｍ）した。

培養後のムラサキの毛状根をろ過により採取し、秤量し
たのち凍結乾燥した。乾燥後も秤量を行ってから、乳鉢
ですりつぶし粉末にした。次に粉末をクロロホルムで抽
出し、ナフトキノン系化合物を得た。培地は、重量を測
定したのち、クロロホルム抽出を行った。活性炭、アン
バーライ）　ＸＡＤ−２，４，７（オルガノ株式会社製
）は、重量を測定したのち、クロロホルム抽出を行った
。

クロロホルムまたは流動パラフィン中のナフトキノン系
化合物の定量燻、５２０ｎｍで吸光度を測定することに
より行った。

上記の方法で得た３者のナフトキノン系化合物の量を加
えて、フラスコ当たりの総生成量を求めた。

培地に加えた活性炭、アンバーライ）ＸＡＤ−２，４，
７（オルガノ株式会社製）、流動パラフィンの量と得ら
れた結果をまとめて表−１に示す。

尚、表中の結果は３回行った試験の平均値である。

（以下、同じ）。

表−１から明らかなように、ナフトキノン系化合物を培
養中に培地から回収しない方法（比較例）に比べて、本
発明の方法によれば多量のナフトキノン系化合物を製造
できることがわかる。

実施例２ 吸着または抽出剤を入れずに、表−２に示した間隔で同
じ組成の新鮮な培地に植え換えていく以外は実施例Ｉと
同様な方法で毛状根の培養とナフトキノン系化合物の定
量を行った。

培地を更新した間隔と得られた結果をまとめて表−２に
示す。

表−２から明らかなように、培地を更新しない方法（比
較例）に比べて、本発明の方法によれば多量のナフトキ
ノン系化合物を製造できることがわかる。

実施例３ ２リツトルのエアリフト型植物培養装置（柴田バリオ硝
子株式会社製）にＭＳ−３の液体培地１リツトルを入れ
、ペリスタ−・ポンプとガラス管及びシリコン管で培養
中に常に培地が４ｍｆ／時間で循環する循環装置を取り
付け、その流路の途中にアンバーライ１−ＸＡＤ−２を
３５ｇ封入した直径３５ｍｍ、長さ１５０ｍｍのガラス
カラムを取り付け、循環する培地がこれを通るようにし
、装置を１２０℃で１５分間滅菌した。

実施例１と同様な方法で得た毛状根を上記培地に約１ｇ
植え付け、２５℃で４０日間暗黒下に培養した。

また別に上記装置のガラスカラムからアンバーライ）Ｘ
ＡＤ−２だけを取り除いた装置で全く同様な培養を行い
比較例とした。

培養後、実施例１と同様な方法でナフトキノン系化合物
の定量を行った。

得られた結果をまとめて表−３に示す。

実施例４ ２リツトルのエアリフト型植物培養装置（柴田バリオ硝
子株式会社製）にＭＳ−３の液体培地１リツトルを入れ
、ペリスタ−・ポンプとガラス管及びシリコン管で培養
中に常に培地が４ｍＩ２／時間で更新する装置を取り付
けた。すなわち、新鮮なＭＳ−３の液体培地３リツトル
を貯蔵びんに入れ第１のペリスター・ポンプによって４
ｍ１／時間の流速で培養装置に注入し、第２のペリスタ
ー・ポンプによって同じ流速で培養装置からナフトキノ
ン系化合物を含んだ培地を流出させ、これを別の貯蔵び
んに蓄えた。装置は１２０℃で１５分間滅菌した。

実施例１と同様な方法で得た毛状根を上記培地に約１ｇ
植え付け、２５℃で４０日間暗黒下に培養した。

培養後、実施例１と同様な方法でナフトキノン系化合物
の定量を行った。

得られた結果をまとめて表−３に示す。

表−３から明らかなように、ナフトキノン系化合物を培
養中に培地から回収しない方法（比較例）に比べて、本
発明の方法によれば多量のナフトキノン系化合物を製造
できることがわかる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ムラサキ科植物細胞をアグロバクテリウム・リゾ
   ジェネスが保持するＲｉプラスミドにより形質転換し、
   生じた毛状根を培養して、該毛状根が培地中に分泌する
   ナフトキノン系化合物を培養中に培地から連続的に回収
   することを特徴とするナフトキノン系化合物の製造方法
   。
2. （２）培地中に分泌されたナフトキノン系化合物を吸着
   剤に連続的に吸着させて回収を行う特許請求の範囲第（
   １）項記載の方法。
3. （３）培地が液体培地であり、該培地を連続的に取り出
   してナフトキノン系化合物の回収を行う特許請求の範囲
   第（１）項記載の方法。
4. （４）ムラサキ科植物が、ムラサキ属植物から選ばれる
   特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。