JPH04237493A - 毛状根を用いた有用物質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アグロバクテリウム・
リゾジェネスによって誘導した毛状根を用い、色素、生
理活性物質、薬用物質等の有用物質を生産する方法に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】植物を使って医薬品等の有用物質を生産
する場合、普通は通常の植物体が使われるが、最近、そ
ういった植物体よりも格段に生長速度の速い（従って、
物質の生産速度の速い）毛状根を利用しようという動き
が活発である。

【０００３】植物の細胞・組織培養法による植物の二次
代謝物の工業的生産法として、植物に毛根病菌アグロバ
クテリウム・リゾジェネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を接種し、生えてきた毛状
根を培養する方法が知られている。この方法は、次の原
理に基づくものである。すなわち、アグロバクテリウム
・リゾジェネスを植物の茎・葉・根などに接種すると、
感染部位から毛状根と呼ばれる根が発生する。この根は
、リゾジェネス中に存在する巨大プラスミド（Ｒｉ　プ
ラスミド）の遺伝子の一部が植物の遺伝子に組み込まれ
ることにより発生する。そして、毛状根クローンを確立
し、高生産性株を選抜することによって、効率の良い二
次代謝物質生産が可能となる。従って、この性質を利用
して、根に有用物質を含む植物にアグロバクテリウム・
リゾジェネスを接種し、発生した毛状根を切り出してタ
ンクなどの装置で培養し、増殖させた毛状根を破壊して
有用物質を取り出すことができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、この方法では
、有用物質が毛状根の組織、細胞内に貯えられることが
多く、培養後の毛状根を培養液から分離、採取し、有機
、無機の溶媒を用いて抽出を繰り返す必要がある。

【０００５】従って、毛状根の細胞から有用物質を分離
、抽出する操作が複雑であり、製造コストが上昇する。 また、増殖中の毛状根を連続的に培養タンクから取り出
すことは困難であり、バッチ方式による生産しか行うこ
とができない。従って、一旦抽出操作を行った毛状根は
、二度と培養に使えないので、再び毛状根クローン選抜
を行う必要がある。

【０００６】本発明の課題は、毛状根細胞から有用物質
を連続的、効率的に分離、抽出することができるような
、毛状根を用いた有用物質の生産方法を提供することで
ある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、アグロバクテ
リウム・リゾジェネスが保持するＲｉ　プラスミドによ
って植物体を形質転換し、この形質転換によって生じた
毛状根を液体培地中で培養し、次いでこの液体培地中の
酸素濃度を低下させて前記毛状根から前記液体培地中へ
と有用物質を放出させる、毛状根を用いた有用物質の生
産方法に係るものである。

【０００８】

【作用】本発明者は、アグロバクテリウム・リゾジェネ
スの保持するＲｉ　プラスミドにより誘導された毛状根
の培養について研究を重ね、本発明に到達した。

【０００９】即ち、本発明者は、液体培地中の溶存酸素
濃度が毛状根の状態と極めて密接な関係を有しているこ
とを見出した。具体的には、液体培地中で毛状根を増殖
させ、培養したところで、液体培地中の溶存酸素濃度を
下げると、毛状根細胞から液体培地へと有用物質が放出
され、再度溶存酸素濃度を上げると、再び毛状根が増殖
を開始することが解った。従って、有用物質が放出され
た後の液体培地を取り出すことで、有用物質を容易に抽
出することができる。また、液体培地中の溶存酸素濃度
を順次上昇、低下させることにより、毛状根から液体培
地中へと有用物質を放出させる抽出操作と、毛状根を液
体培地中で培養する培養操作とを順次連続して行うこと
ができる。従って、上記抽出操作を行い、液体培地を交
換し、上記培養操作を行うという方法を繰り返すことで
、有用物質を連続的に生産することができる。

【００１０】

【実施例】アグロバクテリウム・リゾジェネスが保持す
るＲｉ　プラスミドによって形質転換すべき植物体と、
これから誘導される毛状根から得られる有用物質の組み
合わせとして、以下のものを挙げることができる。

【００１１】 植物体：ムラサキ科植物細胞　　ムラサキ、ホタルカズ
ラ等 有用物質：ナフトキノン系化合物、特にシコニン：血管
透過性亢進、肉芽形成作用を有する。 植物体：ナス科植物細胞　　アトローパ属、ダツラ属、
ヒヨスチアムス属、ズボイシア属等 有用物質：アルカロイド、特にトロパンアルカロイド，
　生理活性物質、薬用成分 植物体：キハダ、パパイア、シロツメグサ、アマチャズ
ル、ダイズ、ムラサキ、ハシリドコロ、オオマツヨイグ
サ、ステビア、サツマイモ、ミシマサイコ、カンゾウ有
用物質：パーオキシダーゼ 植物体：食用ビート（デトロイト・ダークレッド）有用
物質：ベタニン、ブルガキサンチン等のベタニン系色素

【００１２】アグロバクテリウム・リゾジェネス菌とし
て、以下のものを例示できる。 　　アグロバクテリウム・リゾジェネス　　　　　　２
５８１８　　　　（ＡＴＣＣ　２５８１８）　　　アグ
ロバクテリウム・リゾジェネス　　　　　　１５８３４
　　　　（ＡＴＣＣ　１５８３４）　　　アグロバクテ
リウム・リゾジェネス　　　　　　８１９６　　アグロ
バクテリウム・リゾジェネス　　　　　　Ａ　４　　　
　　　（ＡＴＣＣ　４３０５７）　また大腸菌などの他
の菌にＲｉ　プラミスドまたはその一部のＴ−ＤＮＡを
遺伝子導入した菌も使用できる。

【００１３】植物体をアグロバクテリウム・リゾジェネ
ス菌で処理すると、リゾジェネス菌中のＲｉプラスミド
の一部（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞の核ＤＮＡ　の中に導
入　（形質転換）　される。

【００１４】植物体の茎・根・葉などにＲｉプラスミド
Ｔ−ＤＮＡ　を導入し、形質転換させた毛状根を得る方
法としては、例えば、次の方法があげられる。

【００１５】１．植物個体への直接接種法２．葉片を用
いたリーフディスク法（　Ｒ．　Ｂ．　Ｈｏｒｓｃｈ　
ｅｔ　ａｌ．，　ＳＣＩＥＮＣＥ　　　２２７．　　　
１２２９　　（１９８５））３．植物体のプロトプラス
トを利用した共存培養法（　Ｚ．　Ｍ．　Ｗｅｉ　ｅｔ
　ａｌ．，　　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．，　　
５；９３−９６　　（１９８６）） ４．植物体のプロトプラストとアグロバクテリウム・リ
ゾジェネスのスフェロプラスト法　（Ｒ．　Ｈａｉｎ　
ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．，　
３、　６０　（１９８４））５．アグロバクテリウム・
リゾジェネス菌のＲｉプラスミドまたはその一部のＴ−
ＤＮＡ　をマイクロジェクションなどの方法で直接細胞
内に注入する方法。

【００１６】Ｒｉプラスミドを上記１〜４の方法で導入
した場合は、その後アグロバクテリウム・リゾジェネス
菌の除菌処理が必要で、その方法としては下記のものが
ある。 〇高温処理　　（４０℃）　 〇抗生物質処理 〇毛状根先端部の早いサイクルでの植え継ぎ

【００１７
】本発明では、例えば、従来植物の組織培養に用いられ
ている液体培地、つまり、無機成分および炭素源を必須
成分とし、これに植物生長調節物質、ビタミン類および
アミノ酸類から選ばれる少なくとも１種以上の成分を添
加し必要に応じてその他の成分も添加されている液体培
地を用いることができる。

【００１８】液体培地中の無機成分としては、窒素、亜
鉛、鉄、銅、モリブデン、ホウ素、リン、コバルト、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、マンガン
、塩素、ナトリウム、ヨウ素等があり、具体的には、硝
酸アンモニウム、リン酸２水素アンモニウム、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カ
ルシウム、硝酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄、硫酸
第２鉄、１ナトリウムエチレンジアミン４酢酸第２鉄、
硫酸銅、モリブデン酸、モリブデン酸ナトリウム、ホウ
酸、リン酸、リン酸１ナトリウム、リン酸１カリウム、
リン酸２ナトリウム、リン酸３ナトリウム、塩化コバル
ト、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム
、硫酸ナトリウム、硫酸マンガン、ヨウ化カリウムなど
を例示できる。

【００１９】また炭素源としては、ショ糖及び、他の炭
水化物、その誘導体、脂肪酸等の有機酸、エタノール等
の１級アルコールなどを例示できる。

【００２０】植物生長調節物質としては、インドール酢
酸（ＩＡＡ）　ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、ｐ−クロ
ロフェノキシイソ酪酸、２，　４−ジクロロフェノキシ
酢酸（２，　４−Ｄ）などのオーキシン類、カイネチン
、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類を
例示できる。

【００２１】ビタミン類としては、ビオチン、チアミン
（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（　ビタミンＢ６）、
パントテン酸、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシ
トール、ニコチン酸などを例示できる。

【００２２】アミノ酸としては、グリシン、アラニン、
グルタミン、システインなどを例示できる。液体培地中
の成分の濃度は、広い範囲で変えることができる。通常
は、無機成分を約　０．１μＭ　〜約１０００ｍＭ程度
、炭素源を約１ｇ／ｌ　〜約１２０ｇ／ｌ　程度、さら
に植物生長調節物質を約　０．０１　μＭ　〜約１０μ
Ｍ　程度、ビタミン類およびアミノ酸類を、それぞれ約
　０．１ｍｇ／ｌ　〜約１００ｍｇ／ｌ　程度とするこ
とができる。

【００２３】本発明では、液体培地中の毛状根の初期植
え付け量を広い範囲で変えることができる。通常は液体
培地５０ｍｌに対して、毛状根を約１０ｍｇ〜約１ｇ（
新鮮重量）程度植え付けることが望ましい。

【００２４】毛状根の培養において、光は必ずしも必要
でない。培養温度は約１０℃〜約３５℃、特に約２３℃
〜約２８℃が好適である。つまり、約１０℃未満では毛
状根の増殖速度が小さく、約３５℃を超えても同様に毛
状根の増殖速度が小さくなるからである。

【００２５】培養操作時においては、液体培地中の溶存
酸素濃度を比較的に高く保持するには、以下の方法が考
えられる。 ・液体培地を回転振盪すること。 ・空気等のＯ２含有ガスで培地をバブリングする。

【００２６】抽出操作時における液体培地中の溶存酸素
濃度は、３ｐｐｍ　以下とすることが好ましい。抽出操
作時に液体培地中の溶存酸素濃度を低下させるには、以
下の方法がある。 ・液体培地の回転振盪を止め、気液界面の更新を止めて
溶存酸素濃度を低下させる。 ・Ｎ２ガス等との置換により、気体中のＯ２濃度を下げ
る。 ・バブリングガス中のＯ２濃度を下げる。 ・バブリングガス量を低下させる。

【００２７】抽出操作の後、有用物質が放出された後の
液体培地を、新たな液体培地と一部または全部入れ換え
ることが好ましい。

【００２８】以下、更に具体的な実験例について述べる
。 （リーフディスク法による毛状根の誘導）食用ビート（
Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）の葉を２％次亜塩素酸ナ
トリウム水溶液に浸漬し、殺菌処理をした。この葉を、
コルクボーラーで径１０ｍｍφの寸法となるように切り
取り、アグロバクテリウム・リオジェネス懸濁液中に浸
漬し、アグロバクテリウム・リオジェネス菌を感染させ
た。

【００２９】次いで、感染後の葉を、２０ｇ／ｌ　のシ
ュークロースを含んだムラシゲ・スクーグ　（ＭＳ）　
寒天固形培地上に移植した。１〜２週間後に葉から毛状
根が発根した。

【００３０】なお、多数得られた形質転換体のうち、ベ
タニン色素、ブルガキサンチン色素含有量及び増殖特性
等の点で優れていた不定根細胞を選抜した。濾紙電気泳
動法によるオバインの分析結果から、この不定根細胞が
毛状根であることを確認した。

【００３１】（培養操作及び抽出操作）２０ｇ　／ｌ　
シュークロースを含有する、ホルモン無添加のムラシゲ
、スクーグ（ＭＳ）液体培地を３００ｃｃ　準備した。 これらを容積５００ｃｃ　の三角フラスコ中に入れ、綿
栓をした。暗室中、２５℃にて、この三角フラスコを、
回転数１００ｒｐｍで回転振盪した。この際、気液界面
の更新により、液体培地中に酸素がスムーズに供給され
る。この溶存酸素濃度は、８ｐｐｍ　程度である。

【００３２】そして、本発明の実施例においては、図１
に示すように、９日間上記のように培養した後、２日間
回転振盪を停止し、再び９日間フラスコを回転振盪し、
２日間回転振盪を停止し、また１１日間回転振盪を行い
、２日間回転振盪を停止し、反復培養を行った。そして
、初日から９、１１、１７、２０、２２、２８、３３、
３５日後にそれぞれ細胞量（ｇ／ｌ）を測定し、折れ線
グラフとして表した（停止有）。一方、初日から連続し
てフラスコを回転振盪した例についても、１１、１７、
２２、２８、３５日後にそれぞれ細胞量を測定し、折れ
線グラフとして表した（停止無）。なお、本発明の実施
例においては、フラスコの回転振盪及び回転振盪の停止
の一サイクルを終えると、液体培地を入れ換えた。

【００３３】また、本発明の実施例及び比較例の両者に
つき、初日から１１、２２、３５日後に、ベタニン（Ｂ
Ｔ）及びブルガキサンチン（ＶＸ）色素の生産量を　Ｈ
ＰＬＣ　法　（比色分析）　によって定量し、それぞれ
棒グラフとして表した。

【００３４】図１の結果から解るように、２日間フラス
コの回転振盪を停止することにより、著しい量の色素が
細胞外へと放出されることが解る。これは、回転振盪の
停止時における液体培地中の溶存酸素濃度の低下　（３
ｐｐｍ　以下となる）　により、毛状根細胞が緩んで色
素が放出されるものと考えられる。また、４８時間回転
振盪を停止した後再びフラスコを回転振盪して液体培地
中へと酸素を供給すると、毛状根は再び増殖を開始する
ことも解る。

【００３５】次の実験では、まず、上記したと同様にし
て毛状根をＭＳ培地中で１０日間培養した。そして、回
転振盪を停止する直前にまず毛状根の細胞内の色素量を
測定した所、ベタニン（ＢＴ）は　３．６９ｍｇ　／ｌ
　−ｂｒｏｔｈ　、ブルガキサンチン（ＶＸ）は　１２
．９　ｍｇ／ｌ　−ｂｒｏｔｈ　であった。

【００３６】次いで、回転振盪を停止した後、１２時間
、２４時間、３６時間、４８時間後にそれぞれ　ＢＴ　
、ＶＸの細胞外生産量、即ち液体培地への放出量を測定
し、その結果を図２に示した。これから解るように、特
に回転振盪停止から約２４時間を過ぎると、色素の放出
量は急激に増加する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例及び比較例のそれぞれについて
、培養時間と色素の細胞外生産量及び細胞量との関係を
示したグラフである。

【図２】回転振盪停止後における各色素の細胞外生産量
（液体培地中への放出量）の経時変化を示すグラフであ
る。

【符号の説明】

ＢＴ　　ベタニン ＶＸ　　ブルガキサンチン

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アグロバクテリウム・リゾジェネスが
   保持するＲｉ　プラスミドによって植物体を形質転換し
   、この形質転換によって生じた毛状根を液体培地中で培
   養し、次いでこの液体培地中の酸素濃度を低下させて前
   記毛状根から前記液体培地中へと有用物質を放出させる
   、毛状根を用いた有用物質の生産方法。
2. 【請求項２】　　前記毛状根の培養時における前記液体
   培地中の酸素濃度に対して液体培地中の酸素濃度を低下
   させて前記毛状根から前記液体培地中へと有用物質を放
   出させる抽出操作と、次いで前記液体培地中の酸素濃度
   を上昇させて前記毛状根を前記液体培地中で培養する培
   養操作とを交互に繰り返す、請求項１記載の毛状根を用
   いた有用物質の生産方法。