JP2705125B2

JP2705125B2 - 毛状根培養によるトロパンアルカロイドの長期連続製造方法

Info

Publication number: JP2705125B2
Application number: JP18578588A
Authority: JP
Inventors: 俊哉村中; 秀郎大川
Original assignee: 住友化学工業株式会社
Priority date: 1988-07-25
Filing date: 1988-07-25
Publication date: 1998-01-26
Anticipated expiration: 2013-01-26
Also published as: JPH0235094A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、ナス科植物から誘発した毛状根を培養し、
医薬品などとして重要なトロパンアルカロイドを効率よ
く長期に連続製造する方法に関する。

〔従来技術および問題点〕

ナス科植物が含有するスコポラミン、１−ヒヨシアミ
ンなどのトロパンアルカロイドは、鎮痛剤、鎮痙剤、抗
パーキンソン病薬などに用いられる。これらの化合物
は、天然の植物体から抽出して製造されているが、含有
植物の栽培は長期にわたること、天候に左右されるこ
と、また、栽培地域が限定されていること、など生産に
多くの問題点がある。そのため、植物組織培養技術を応
用し、植物有用成分を安価に工業生産する試みがなされ
ている。植物の外植片から誘導したカルスを培養するこ
とにより、トロパンアルカロイドを生産させようとした
試みは多いが、ほとんどの場合、トロパンアルカロイド
を全く生産しないか、生産してもごく微量であった。そ
こで、すでに、本発明者らは、土壌細菌であるアグロバ
クテリウム・リゾゲネスを植物体に感染することにより
誘発した毛状根から、高増殖性でしかもアルカロイド高
生産性の毛状根を選択し、それらを培養することによ
り、アルカロイドを製造する方法を開発した（特開昭61
−254195）。この方法は、毛状根を一定期間培養した後
収穫し組織を粉砕して、組織中に蓄積したアルカロイド
を抽出するといった煩雑な製造工程を要する。

一方、毛状根を培養すると培地中にアルカロイドを漏
出することが知られている。しかし、通常その量は微量
であり、しかも、アルカロイドの培地中での存在を確認
しただけであって、効果的な回収法は知られていなかっ
た（Plant Cell Reports,5,111（1986）、特開昭62−20
5792、Biotechnology Letters,8,415（1986））。

〔問題解決の手段〕

本発明者らは、ナス科植物の毛状根からトロパンアル
カロイド、特にスコポラミンを培地中に効率よく漏出さ
せる培養方法を鋭意研究の結果見出し、さらに、培地に
漏出したトロパンアルカロイドを培地外にとりつけた吸
着樹脂で効率よく吸着回収し、しかも、樹脂を交換する
ことによりトロパンアルカロイドを長期連続的に生産す
る方法を見いだした。すなわち、本発明は、ナス科植物
にアグロバクテリウム・リゾゲネスを感染させ誘発した
毛状根をアンモニウムイオンを含まない、高い硝酸イオ
ン濃度（25〜100mM）を含む培地で培養することによ
り、トロパンアルカロイド、特にスコポラミンを効率よ
く漏出させる方法、およびアグロバクテリウム・リゾゲ
ネスを感染させ誘発した毛状根を培養し、毛状根が培地
に漏出したトロパンアルカロイドを培地外に取りつけた
巨大網状樹脂などの吸着樹脂に培地を流すことによりに
吸着させた後、効率よく回収することを特徴とするトロ
パンアルカロイドの製造方法を提供する。本方法によれ
ば、毛状根の生産するトロパンアルカロイドを培地中に
漏出させ、それを連続的に吸着回収することにより、毛
状根のトロパンアルカロイド生産性が高まり、吸着樹脂
の交換により長期の連続生産が可能となった。しかも、
抽出精製が容易になることから、トロパンアルカロイ
ド、特に、スコポラミンを有利に生産することが可能と
なる。次に本発明について詳細に説明する。

本発明ではトロパンアルカロイドを生産する任意のナ
ス科植物が用いられるが、スコポラミン含量の高いズボ
イシア属植物ズボイシア・ライヒハルディ（Duboisia l
eichhardtii）、ズボイシア・ミオポロイデス（Duboisi
a myoporoides）およびズボイシア・ポップ−ディ（Dub
oisia hopwoodtii）などを用いるのが好ましい。

毛状根の誘発に用いられるアグロバクテリウム・リゾ
ゲネスとしては、特に限定されるものではなく、例えば
A4、15834、1855、8196、2659株など公知のものが挙げ
られる（Mol.Gen.Genet.190,204（1983））。

ナス科植物にアグロバクテリウム・リゾゲネスを感染
させ毛状根を誘発する方法としては 1.植物固体の一部
への直接接種法、2.培養組織への接種法、3.植物体のプ
ロトプラストとアグロバクテリウム・リゾゲネスとの共
存培養、4.アグロバクテリウム・リゾゲネスのRiプラス
ミドまたはその一部のDNAをエレクトロポーレーショ
ン、マイクロインジェクションなどにより導入する方
法、などがある。

上記の方法で誘発した毛状根は、カルベニシリン、テ
トラサイクリンなどの抗生物質を含む培地で培養する、
あるいは、根端組織を切り出し早いサイクルで植えかえ
る、などにより除菌する。

除菌した毛状根を植物ホルモン無添加の培地で継代培
養する。培地は既知の無機塩合成培地に炭素源を加えた
ものを基本とし、これにビタミン類、アミン酸類、有機
物などを加えたものを用いる。例えば、HF培地（Agric.
Biol.Chem.,50,2715（1986））、ヘラー培地、ホワイト
培地、リンスマイヤーアンドスクーグ（LS）培地、ガン
ボルグのB5培地などが用いられる。

＜トロパンアルカロイド高漏出株の培養方法＞本発明では、上記の方法で得られた毛状根を、植物ホ
ルモン無添加の液体培地で培養する。

培地の無機成分のうち無機窒素を除く成分について
は、既知の無機塩合成培地の成分を基本とし、これにビ
タミン類、アミノ酸類、有機物などを、加えたものを用
いる。無機窒素については、アンモニウムイオンを含ま
ない、硝酸イオン濃度25〜100mMとなる培地を用いるこ
とを特徴とする。アンモニウムイオンを含む培地、硝酸
イオン濃度が25mMより低い培地、および100mMより高い
培地ではトロパンアルカロイドの漏出量が低下するので
好ましくない。硝酸イオンを含みアンモニウムイオンを
含まない無機塩であれば化合物は特定されないが、硝酸
カリウム、硝酸ナトリウムなどが例示できる。また、こ
れらの培地組成を改良したものも使用できる。

アンモニウムイオンを含まず硝酸イオン濃度20mMより
低い基本培地、例えば、HF培地、ヘラー培地、ニッチ培
地、ニッチアンドニッチ培地、クノップ培地などでは、
硝酸イオンを含む化合物、例えば、硝酸カリウム、硝酸
ナトリウムで、硝酸イオン濃度を25〜100mMに改変す
る。アンモニウムイオンを含み硝酸イオン濃度25mMより
低い基本培地、例えば、シェンクアンドヒルデブラント
培地、コーレンバッハアンドシュミット培地などでは、
アンモニウムイオンを含む成分を除き、硝酸イオン濃度
を25〜100mMに改変する。アンモニウムイオンを含み、
硝酸イオン濃度が25〜100mMの基本培地、例えば、リン
スマイヤーアンドスクーグ培地、ガンボルグのB5培地な
どでは、アンモニウムを含む成分を除く。

炭素源としては、ショ糖、グルコース、フラクトース
などが使用できるが、特にショ糖が好ましい。糖濃度は
１〜10％ W/V 好ましくは、３〜５％ W/V である。培地
のpH値は、弱酸性から中性、すなわちpH4.0〜7.0が適当
であり培養温度は通常20〜30℃、好ましくは24〜27℃で
行う。培養槽は、毛状根を傷つけないものが好ましく、
エアーリフト型培養槽、回転培養槽、あるいは旋回培養
槽などが適している。旋回培養の場合は、50〜150rpm程
度の回転数が好ましい。暗所で１〜６週間程度培養する
と、毛状根の増殖とともに、毛状根からスコポラミン、
ヒヨシアミンが培地中に高濃度漏出する。

この方法により、スコポラミンを１〜2mg/50ml/4wk程
度培地に漏出する毛状根株を選定できる。

＜培地中に漏出したトロパンアルカロイドの回収法＞（１）吸着樹脂への吸着上記のようにして得られたトロパンアルカロイド高漏
出性ナス科植物毛状根を植物ホルモン無添加の液体培地
で培養する。培地は既知の無機塩合成培地に炭素源を加
えたものを基本とし、これにビタミン類、アミノ酸類、
有機物などを加えたものを用いる。例えば、HF培地、ヘ
ラー培地、ホワイト培地、リンスマイヤーアンドスクー
グ培地、ガンボルグのB5培地などが用いられる。前記の
＜トロパンアルカロイド高漏出株の培養方法＞で示した
培地で培養することが、トロパンアルカロイドの漏出量
が高く、好ましい。

培養装置は、培養槽、吸着樹脂入カラム、ポンプから
構成される。培養槽は、回転培養槽、旋回培養槽なども
用いることができるが、エアーリフト型培養槽を用いる
のが好ましい。この場合通気は酸素ないし、空気でおこ
なう。培養装置一式の概念図を図１に示す。

カラムには吸着樹脂を充填する。吸着樹脂としては、
イオン交換樹脂、シリカゲル、活性炭なども使用できる
が、スコポラミン、ヒヨシアミンなどのトロパンアルカ
ロイドの吸着率が高く、ニコチンや培地成分の吸着率が
低い、巨大網状構造樹脂を使用することが望ましい。巨
大網状構造樹脂として、アンバーライト^RXAD−２、XAD
−４、XAD−７（オルガノ社）や、ダイヤイオン^RHP20、
HP40、HP50、HP1MG、HP2MG（三菱化成）などがあげられ
る。

ポンプは、培養槽から培地をカラムに送り込む能力が
あれば、特定されない。流量も特定されないが、好まし
くは、流量SV＝２〜15（処理（１）／（樹脂量（１）×
時間（ｈ））である。

ポンプを運転させ、培地の一部をカラムに流す。カラ
ムに流した培地は、全量廃棄する、一部廃棄し新鮮培地
を追加する、全量培養槽に戻す、のいずれでもかまわな
い。ポンプを始動する時期は特定されないが、培養開始
と同時に始動するとアルカロイドの回収量が増すので好
ましい。吸着樹脂を、培養期間中、例えば、５日から10
日ごとに新しいものと交換することにより、長期間、連
続的に生産を継続できる。

（２）吸着樹脂からトロパンアルカロイドの回収上記方法で樹脂に吸着したトロパンアルカロイドは、
有機溶媒、好ましくはメタノール、エタノールあるいは
メタノール、エタノールとアンモニアの混合物で溶出す
ることができる。

溶出したトロパンアルカロイドを含む溶液からのスコ
ポラミン、ヒヨシアミンの精製は、通常の方法で行うこ
とができる。例えば、スコポラミンの精製品は、トロパ
ンアルカロイドを含む溶液を蒸発乾固し、残査を0.5N硫
酸に溶解、濾過した後、25％アンモニア水を加えpH9〜1
0に調整し、クロロホルムで抽出し減圧乾固することに
より、粗アルカロイド画分を得る、1N臭化水素酸で中和
後濃縮し、臭化水素酸スコポラミンとして結晶化させる
ことにより得られる。

次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明する。
以下の実施例は、本発明を例示的に示すものであり、本
発明は以下に挙げる実施例のみに限定されるものではな
い。

実施例１ズボイシア・ライヒハルデイの毛状根をHF培地で継代
培養した。HF（硝酸ナトリウム7.0mMを含む）液体培地5
0mlに硝酸カリウム30mMを添加した培地を調製し、HF−
３培地とした。毛状根100mg湿重をHF−３液体培地50ml
に植え込み、85rpmの旋回培養で４週間暗所25℃で培養
した。

その結果、培地および根に含まれるスコポラミン量
は、それぞれ、1.4〜1.9mg、0.5〜2.4mgであった。

実施例２〜４、比較例１〜４無機窒素濃度を表１に示したように変えた以外は実施
例１と同様にして行った結果を表１に示す。

実施例５ズボイシア・ライヒハルデイ毛状根クローン計29株
（100mg 湿重）をHF−３培地50mlに植え込み、85rpmの
旋回培養で４週間暗所25℃で培養した。そのうち、スコ
ポラミン漏出量が最も高い値2.0mgとなったDL47−１株
を選抜した。

実施例６アルカロイドが漏出したと仮定した培地（以下、仮想
培地と略する）として、HF培地に、スコポラミン200mg/
l、ヒヨシアミン200mg/l、ニコチン2mg/lの濃度で溶解
したものを調製した。アンバーライトXAD−２ 25mlを
直径20mm、長さ95mmの円筒型カラムに充填し、前記の仮
想培地をポンプを用い流量SV＝15で処理した。流出した
画分の各成分について、高速液体クロマトグラフィーで
定量分析し、リーク率を求めた。リーク率５％となった
ときの仮想培地の処理量から、各アルカロイドおよび培
地成分である塩酸チアミンの吸着量を求めた。

その結果、樹脂への吸着量は、ニコチン0.6mg、塩酸
チアミン0.02mgであるのに対し、スコポラミン28mg、ヒ
ヨシアミン48mgであった。

実施例７〜10 吸着樹脂および流量を表２に示したように変えた以外
は、実施例５と同様にして行った結果を表２に示す。

実施例11 スコポラミン28mgを吸着させた25mlのXAD−２を充填
したカラムから流量SV＝５でメタノール／アンモニア
（19:1）溶液50mlで溶出したところ、スコポラミン95.7
％が回収された。

実施例12〜14 吸着樹脂、スコポラミン量、流量を表３で示すように
変えた以外は、実施例10と同様にして行った結果を表３
に示す。

実施例15 ズボイシア・ライヒハルデイ毛状根DL47−１株（植え
込み量、15g湿重）を21のHF−３培地でエアーリフト式
培養槽を用い培養した。通気量0.51/分で酸素を底面か
ら通気した。培養槽から、低圧ポンプを用い、流量SV＝
15でXAD−２ 25mlを充填したカラムに培地を流入し、
溶出液を再び培養槽に戻した。培養期間中ポンプを連続
運転させ、１週間ごとにカラムをはずし、カラムに200m
lのメタノール／アンモニア（19:1）を流し、溶出した
メタノール溶液を回収した。メタノール溶出後のカラム
を500mlの水で洗い、滅菌処理後、再び培養装置に取り
付けた。培養４週間後、カラムからの溶出画分、毛状根
および培地のアルカロイド量を測定した。

その結果、スコポラミン総生産量は511mg（256mg/l）
で、その内訳は、カラム405mg（203mg/l）、毛状根86mg
（43mg/l）、培地20mg（10mg/l）であった。また、ヒヨ
シアミン5mg（2.5mg/l）がカラムに吸着、回収された。

カラムからのメタノール溶出画分のうち、スコポラミ
ン395mgを含む量を測りとり、減圧乾固した。0.5N硫酸4
0mlに溶解後、不溶物を濾過により除去し、アンモニア5
mlを加えpHを10とした。分液ロートに移し、40mlのクロ
ロホルムで２回抽出し、クロロホルム層をとり減圧乾固
し、シロップ状の塩基を得た。1N臭化水素酸塩1.2mlで
中和し、不溶の油状物質を遠心分離で除いた後、上清を
濃縮し、臭化水素酸スコポラミンの結晶423mg（収率、8
4.6％）を得た。

実施例16 毛状根の植え込み量を、30g湿重に変えた以外は、実
施例14と同様にして培養した。その結果、培養６週間
後、カラムからの溶出画分のアルカロイド量は、スコポ
ラミン475mg（238mg/l）、ヒヨシアミン13mg（6.5mg/
l）であった。

〔発明の効果〕

本発明により、ナス科植物の有用成分であるスコポラ
ミンなどのトロパンアルカロイドを、効率よく連続生産
することができる。

本発明によれば、これまでに知られた毛状根培養によ
るトロパンアルカロイド生産の利点（特開昭61−25419
5）に加え、１）スコポラミンなどのトロパンアルカロイドを、培
地中に高濃度に漏出することができる。

２）トロパンアルカロイドは培地に漏出されるので、
根を収穫し粉砕する煩雑な操作が不要である。

３）吸着樹脂、特に巨大網状樹脂では、スコポラミ
ン、ヒヨシアミンが選択的に吸着され、ニコチン、培地
成分などは吸着されないので、精製操作が容易になる。

４）吸着樹脂の交換により、長期間、連続生産でき
る。

５）培地に漏出したトロパンアルカロイドを連続的に
吸着させ取り出すことにより、毛状根が培地中に漏出す
るアルカロイドの生産量が増す。

という利点がある。

本発明により、４週間の培養で、スコポラミンを161
〜203mg/l、ヒヨシアミンを2.5〜5mg/l程度、また、６
週間の培養で、ヒコポラミンを237mg/l、ヒヨシアミン
を6.5mg/l程度生産することが可能となった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ナス科植物にアグロバクテリム・リゾゲネ
ス（A.rhizogenes）を感染し誘発した毛状根を、アンモ
ニウムイオンを含ず、25mM〜100mMの硝酸イオンを含む
培地で培養することにより、トロパンアルカロイドを効
率よく培地中に漏出させる生産方法。
【請求項２】ナス科植物が、ズボイシア属植物である第
１項記載の方法。
【請求項３】毛状根が培地に漏出したトロパンアルカロ
イドを、培地外に取り付けた吸着樹脂に培地を流すこと
により、樹脂に吸着した後回収し、生産することを特徴
とする請求項１記載のトロパンアルカロイドの製造方
法。
【請求項４】ナス科植物が、ズボイシア属植物である第
３項記載の方法。
【請求項５】吸着樹脂が、巨大網状構造樹脂である第３
項記載の方法。