RU2698397C2 - Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека - Google Patents
Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2698397C2 RU2698397C2 RU2018104401A RU2018104401A RU2698397C2 RU 2698397 C2 RU2698397 C2 RU 2698397C2 RU 2018104401 A RU2018104401 A RU 2018104401A RU 2018104401 A RU2018104401 A RU 2018104401A RU 2698397 C2 RU2698397 C2 RU 2698397C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- alkaline phosphatase
- cells
- human alkaline
- plant cells
- gene
- Prior art date
Links
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 title claims abstract description 157
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 title claims abstract description 119
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 95
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 244000005706 microflora Species 0.000 claims abstract description 28
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 16
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 claims abstract description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 claims abstract description 7
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims abstract description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims abstract 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 73
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims description 48
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 11
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 9
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 abstract description 9
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 81
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 70
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 30
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 16
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 14
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 101000688216 Homo sapiens Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 235000021135 plant-based food Nutrition 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 8
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 7
- 240000000662 Anethum graveolens Species 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001264 anethum graveolens Substances 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 7
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 7
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 7
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 6
- 244000228451 Stevia rebaudiana Species 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 6
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 5
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 5
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 5
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 4
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 4
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 4
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 4
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 4
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N rebaudioside A Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 3
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 3
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 3
- 244000178937 Brassica oleracea var. capitata Species 0.000 description 3
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 3
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 3
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 3
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000030118 somatic embryogenesis Effects 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 3
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150080498 ALP gene Proteins 0.000 description 2
- XKJMBINCVNINCA-UHFFFAOYSA-N Alfalone Chemical compound CON(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XKJMBINCVNINCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007227 Anethum graveolens Nutrition 0.000 description 2
- 235000017311 Anethum sowa Nutrition 0.000 description 2
- 235000002764 Apium graveolens Nutrition 0.000 description 2
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 2
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 description 2
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 2
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 2
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000006092 Stevia rebaudiana Nutrition 0.000 description 2
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 2
- 101150067977 ap gene Proteins 0.000 description 2
- 239000001387 apium graveolens Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 2
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 102000053119 human ALPI Human genes 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004609 intestinal homeostasis Effects 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 206010070545 Bacterial translocation Diseases 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 101000658547 Escherichia coli (strain K12) Type I restriction enzyme EcoKI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658543 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoAI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658546 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoEI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658530 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoR124II endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658540 Escherichia coli Type I restriction enzyme EcoprrI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 1
- 235000002262 Lycopersicon Nutrition 0.000 description 1
- 101000658548 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) Putative type I restriction enzyme MjaIXP endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658542 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) Putative type I restriction enzyme MjaVIIIP endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000658529 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) Putative type I restriction enzyme MjaVIIP endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 235000002560 Solanum lycopersicum Nutrition 0.000 description 1
- 101001042773 Staphylococcus aureus (strain COL) Type I restriction enzyme SauCOLORF180P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838760 Staphylococcus aureus (strain MRSA252) Type I restriction enzyme SauMRSORF196P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838761 Staphylococcus aureus (strain MSSA476) Type I restriction enzyme SauMSSORF170P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838758 Staphylococcus aureus (strain MW2) Type I restriction enzyme SauMW2ORF169P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001042566 Staphylococcus aureus (strain Mu50 / ATCC 700699) Type I restriction enzyme SauMu50ORF195P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838763 Staphylococcus aureus (strain N315) Type I restriction enzyme SauN315I endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838759 Staphylococcus epidermidis (strain ATCC 35984 / RP62A) Type I restriction enzyme SepRPIP endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000838756 Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus (strain ATCC 15305 / DSM 20229 / NCIMB 8711 / NCTC 7292 / S-41) Type I restriction enzyme SsaAORF53P endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000007375 bacterial translocation Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 235000019543 dairy drink Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 208000010227 enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007373 microbial translocation Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004682 mucosal barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000422 nocturnal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000013324 preserved food Nutrition 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
- C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/14—Vegetable proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
- A23L19/01—Instant products; Powders; Flakes; Granules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
- A23L7/10—Cereal-derived products
- A23L7/198—Dry unshaped finely divided cereal products, not provided for in groups A23L7/117 - A23L7/196 and A23L29/00, e.g. meal, flour, powder, dried cereal creams or extracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/23—Apiaceae or Umbelliferae (Carrot family), e.g. dill, chervil, coriander or cumin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и решает задачу способа получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и его применения для профилактики нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и ее восстановления при токсических и стрессовых воздействиях, а также для его применения для профилактики нарушений иммунной системы организма, связанных с нарушениями микрофлоры кишечника и барьерной функции кишечника, и восстановления иммунной системы при ее нарушениях в качестве иммуностимулирующего средства. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 табл., 15 пр.
Description
Изобретение относится к пищевой промышленности и медицине и касается способа получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную человеческую щелочную фосфатазу, и его применения для поддержания гомеостаза желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
Известно, что кишечник является важным барьерным органом, состоящим из нормальной (синантропной) микрофлоры, слизистого слоя, эпителия и субэпителиальной иммунной системы. Основная функция кишечного барьера состоит в защите организма от бактериальной транслокации в системный кровоток. Нормальная микрофлора способна находиться в просвете кишечника без стимуляции иммунного ответа хозяина, однако эти же бактерии вызывают иммунный ответ и воспаление, если они транспонируются через кишечный барьер в кровоток и попадают в другие органы. Нарушение кишечного барьера приводит к развитию гипертрофированного иммунного ответа на компоненты синантропных бактерий и как следствие - к развитию хронических воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), таких как болезнь Крона, неспецифический язвенный колит (Podolsky, 2010). В индукцию этих нарушений значительный вклад вносит стресс, инфекции, старение, токсическое действие ксенобиотиков, в том числе лекарственных средств (Cadwell et al., 2010).
В настоящее время единственными доступными средствами поддержания гомеостаза желудочно-кишечного тракта, в том числе регуляции микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма, являются препараты и продукты на основе пробиотиков - живых культур микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры кишечника. Однако, убедительных доказательств клинической эффективности таких продуктов нет. Более того, вносимая извне микрофлора не приживается в организме человека, а отторгается собственной микрофлорой. Кроме этого, пробиотики - это преимущественно 2 вида бактерий - лакто- и бифидобактерии, а микрофлора человека включает в себя более 300 видов бактерий. Поэтому после прекращения приема пробиотиков, как правило, возвращаются исходные нарушения гомеостаза ЖКТ.
В то же время перспективны новые способы регуляции гомеостаза ЖКТ, основанные на применении фермента щелочная фосфатаза (ЩФ). Дело в том, что нарушения микрофлоры, состояния иммунной системы и барьерной функции кишечника, а также развитие ВЗК в значительной степени инициируются индукторами воспаления, которые являются физиологическими субстратами фермента ЩФ. Наиболее мощными индукторами воспаления являются: 1) липополисахариды (ЛПС) - бактериальные эндотоксины E.coli и других грамотрицательных бактерий; 2) внеклеточная АТФ и другие нуклеотиды и нуклеозиды. ЛПС, который постоянно высвобождается кишечной микрофлорой, попадает в кровь при нарушении кишечного барьера и даже в минимальных концентрациях на уровне нг/кг вызывает воспалительную реакцию. ЛПС при этом связывается с мембранным белком CD14 на поверхности макрофагов, вызывая их активацию, что приводит к выделению десятков биологически активных веществ: простагландинов, оксида азота и цитокинов, включая интерлейкины и TNFα (Nathan, 1987). Именно ЛПС и внеклеточная АТФ представляют собой важнейшие факторы формирования системного иммунного и воспалительного ответа на сигналы "чужой" и "опасность" (Matzinger, 2002).
Кишечная ЩФ, которая вырабатывается клетками слизистой кишечника, играет важную роль в кишечном гомеостазе именно через инактивацию (детоксикацию) ЛПС и предотвращение транслокации ЛПС, регуляцию кишечной микрофлоры и pH поверхности кишечника, (Eskandari et al., 1999; Weemaes et al., 2002; Riggle et al., 2013; Tuin et al., 2009). Катализируемое ЩФ дефосфорилирование ЛПС устраняет его провоспалительную активность и тем самым защищает организм от развития различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний (Park, Lee, 2013).
Нарушение нормального уровня (активности) кишечной ЩФ за счет снижения экспрессии генов, кодирующих ЩФ, отмечено при воспалительных заболеваниях кишечника, целиакии, а также при ожирении. Пероральное введение ЩФ у мышей с колитом снижает уровень mRNK провоспалительного цитокина TNFα и оксида азота (Muginova et al., 2007). Molnar с коллегами (2012) показали, что уровень ЩФ в воспаленной слизистой оболочке кишечника детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом достоверно понижен по сравнению с контрольной группой. Введение экзогенной ЩФ пациентам с активной формой воспаления кишечника может предупреждать обострение. В другом исследовании показано, что при введении экзогенной ЩФ снижалось воспаление кишечника у новорожденных животных; и сделано предположение, что ЩФ можно использовать для профилактики воспалительных заболеваний у новорожденных (Biesterveld et al., 2015).
В уровне техники известны следующие патенты и патентные заявки, описывающие применение ЩФ для коррекции микрофлоры кишечника, активности иммунной системы, а также для профилактики и лечения различных заболеваний: US 20130280232 от 24.10.2013 «Применение щелочной фосфатазы для детоксикации ЛПС, присутствующих в слизистых барьерах» («Use of alkaline phosphatase for the detoxification of LPS present at mucosal barriers»), US 20110206654 от 25.08.2011 «Способ модулирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта с помощью щелочной фосфатазы» («Methods of Modulating Gastrointestinal Tract Flora Levels with Alkaline Phosphatase»), US 20130022591 от 24.01.2013 «Способ снижения ингибирующих токсических эффектов, связанных с бактериальной инфекцией, с использованием щелочной фосфатазы» («Methods of Reducing or Inhibiting Toxic Effects Associated with a Bacterial Infection Using Alkaline Phosphatase"), US 8574863 от 05.11.2013 «Щелочная фосфатаза для лечения воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта» («Alkaline phosphatase for treating an inflammatory disease of the gastrointestinal tract»).
Наиболее близким к заявляемому способу получения пищевого продукта является способ по патентной заявке US 20110206654 от 25.08.2011 «Способ модулирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта с помощью щелочной фосфатазы» («Methods of Modulating Gastrointestinal Tract Flora Levels with Alkaline Phosphatase»), описывающей возможность применения ЩФ для регуляции микрофлоры ЖКТ, в том числе - для защиты и восстановления нормальной микрофлоры на фоне применения антибиотиков. В прототипе и других опубликованных источниках, касающихся применения ЩФ, авторы использовали ЩФ в виде чистого белка, предварительно очищенного от посторонних белков и иных примесей. Такую ЩФ вводили животным или людям (при клинических испытаниях) в виде чистого белка или в виде фармацевтической композиции, включающей очищенную ЩФ и различные вспомогательные вещества. Очищенную ЩФ получали различными способами, включающими: выделение ЩФ из слизистой кишечника быка; выделение ЩФ из плаценты млекопитающих; получение рекомбинантной человеческой ЩФ культивированием в клетках млекопитающих с последующим выделением и очисткой. Общим признаком известных способов является получение ЩФ в виде чистого белка, что обуславливает целый ряд недостатков, указанных ниже, и практически исключает возможность его применения в качестве пищевого продукта или в составе пищевых продуктов.
Важнейшим недостатком ЩФ, выделенной из кишечника или иных органов млекопитающих, является чужеродность белка для человека (обусловленная генетическими различиями). Поэтому его применение у людей может вызвать сенсибилизацию и развитие опасных аллергических реакций при повторном применении. Кроме этого, содержание ЩФ в тканях животных незначительное, что удорожает процесс выделения и очистки фермента. Также необходимо учитывать риск заражения человека прионами и патогенными микроорганизмами животных. Надежная очистка от них подобных продуктов приводит к удорожанию продуктов в десятки раз и резко ограничивает возможность их практического применения по экономическим соображениям.
Получение рекомбинантной ЩФ человека в клеточных системах млекопитающих in vitro имеет свои недостатки, среди которых: ограниченная масштабируемость процесса, высокая себестоимость и риск заражения патогенами человека.
Общим недостатком описанных способов получения ЩФ в виде чистого белка является высокая стоимость конечного продукта (до 1000-2000 USD за 1 упаковку), обусловленная сложностью процесса выделения, очистки и контроля качества белка. Это практически исключает возможность применения ЩФ с профилактической и лечебной целью как пищевого продукта.
Другим общим недостатком описанных способов получения ЩФ в виде чистого белка является высокая чувствительность ЩФ к внешним условиям, таким как температура, pH (кислотность) среды. Например, ЩФ полностью инактивируется при попадании в кислую среду желудка. Это исключает возможность применения такой ЩФ в составе продуктов питания либо требует создания сложных лекарственных форм, устойчивых к кислой среде желудка.
Перечисленные недостатки получения ЩФ не позволяют применять ЩФ в качестве доступного продукта массового применения для поддержания нормальной микрофлоры кишечника и иммунной системы организма, а также профилактики развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний, связанных с нарушением гомеостаза желудочно-кишечного тракта. Поэтому описанная в прототипе (US 20110206654 от 25.08.2011) возможность применения ЩФ в виде чистого белка или в виде его смеси со стандартными фармацевтическими ингредиентами для модулирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта ограничена описанными выше недостатками и не может быть практически реализована в качестве пищевого продукта или компонента пищевого продукта.
Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в создании способа получения нового эффективного, безопасного и доступного пищевого продукта, содержащего ЩФ, для поддержания нормальной микрофлоры кишечника и иммунной системы организма, а также для профилактики развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний, связанных с нарушением гомеостаза желудочно-кишечного тракта.
Поставленная задача решается получением пищевого продукта, в котором рекомбинантная щелочная фосфатаза человека находится в составе растительных клеток. Растительные клетки, содержащие ЩФ (в отличие от прототипа, где используется очищенная ЩФ), обеспечивают естественную защиту ЩФ от инактивации в агрессивной кислой среде желудка и ее доставку в кишечник, где ЩФ выполняет свою функцию - дефосфорилирует (инактивирует) бактериальные эндотоксины, вырабатываемые патогенной микрофлорой ЖКТ. Тем самым пищевой продукт, содержащий ЩФ, обеспечивает: поддержание нормальной микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма, профилактику нарушений нормальной микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма, восстановление нормальной микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма при токсических и стрессовых воздействиях, а также профилактику развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Находящиеся в составе пищевого продукта растительные клетки с рекомбинантной ЩФ человека являются безопасными продуктами питания для человека, которые не вызывают сенсибилизацию и развитие опасных аллергических реакций при повторном применении, а также не могут вызвать заражение человека прионами и патогенными микроорганизмами животных (в отличие от ЩФ, выделенной из органов животных). Наконец, пищевой продукт на основе растительных клеток, содержащих рекомбинантную ЩФ человека, не только безопаснее, но и на 2-3 порядка дешевле препаратов на основе очищенной рекомбинантной ЩФ человека, полученной из клеток млекопитающих. Это позволяет его применять именно как пищевой продукт для массовой профилактики нарушений микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма, а также профилактики развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний кишечника у широких слоев населения.
Способ получения пищевого продукта на основе растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, включает создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток, осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток с помощью агробактериальных штаммов, а пищевой продукт получают путем выращивания в суспензионной культуре трансформированных каллусных клеток растений с геном человеческой щелочной фосфатазы.
Другой вариант способа получения пищевого продукта на основе растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, включает создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток, осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток с помощью агробактериальных штаммов, и получение соматических эмбриоидов из трансформированных каллусных клеток, а пищевой продукт получают путем выращивания в суспензионной культуре соматических эмбриоидов с геном человеческой щелочной фосфатазы.
В процессе выращивания соматических эмбриоидов проводят синхронизацию развития эмбриоидов с помощью фильтрации через сита разного размера, центрифугирования, автоматического сепарирования или иным способом синхронизации. Соматические эмбриоиды выращивают в жидкой питательной среде с добавлением веществ, повышающих осмотическое давление. Оптимальная концентрация таких веществ - до 10%. В качестве веществ, повышающих осмотическое давление, используют полиэтиленгликоль, маннитол и другие повышающие осмотическое давление вещества.
В качестве рекомбинантной человеческой щелочной фосфатазы используют ткане-специфические щелочные фосфатазы, например, кишечную и плацентарную, или ткане-неспецифические щелочные фосфатазы или иные изоформы щелочных фосфатаз.
Выращенные в суспензионной культуре трансформированные каллусные клетки или соматические эмбриоиды высушивают и используют в качестве пищевого продукта, например, в виде капсул, таблеток, пакетов саше и в иных готовых формах, или добавляя в другие пищевые продукты.
Полученный пищевой продукт используют для регуляции микрофлоры желудочно-кишечного тракта; для профилактики нарушений иммунной системы организма и восстановления иммунной системы при ее нарушениях в качестве иммуномодулирующего средства.
Известно, что растительные продуценты считаются наиболее перспективными для производства высококачественных, безопасных и относительно недорогих белков (Conley et al., 2011; Sharma, Sharma, 2009; Sabalza et al., 2014). Мы использовали преимущества растительных продуцентов для создания совершенно нового продукта, который представляет собой не ЩФ в чистом виде или в составе композиций веществ, а растения, содержащие рекомбинантную щелочную фосфатазу человека. В качестве таких растений могут использоваться любые растения, пригодные в пищу и для получения рекомбинантных белков, включая, но не ограничиваясь: морковь (Daucus carota), салат (Latuca sativa), капуста китайская (Brassica pekinensis), капуста белокочанная (Brassica oleracea), укроп (Anethum graveolens), сельдерей (Apium graveolens), огурец (Cucumis sativus), тыква (Cucurbita реро), стевия (Stevia rebaudiana), табак (Nicotiana tabacum), рис (Oryza sativa), люцерна (Medicago sativa), томат (Solanum lycopersicum) и другие растения. Предпочтительно использовать растения, у которых соматический эмбриогенез возможен не менее, чем в 60% клеток. Растения могут использоваться в цельном виде или в виде их компонентов, включая, но не ограничиваясь: клетки, эмбриоиды, листья, стебли и другие составные части. Растения или их компоненты, содержащие рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, могут использоваться для приема в пищу как в цельном, так и измельченном (вплоть до разделения на отдельные клетки) виде, как в натуральном, так и высушенном виде, с использованием различных способов сушки или без нее. Пищевой продукт может содержать ткане-специфическую щелочную фосфатазу, например, кишечную и плацентарную, или ткане-неспецифическую щелочную фосфатазу или иную щелочную фосфатазу человека.
Заявленный способ (его варианты) реализуется следующим образом.
Первый вариант способа включает следующие технологические этапы: создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток и осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток. Пищевой продукт получают путем выращивания в суспензионной культуре трансформированных каллусных клеток растений с геном человеческой щелочной фосфатазы.
Второй вариант способа включает следующие технологические этапы: создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток и осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток, получение соматических эмбриоидов из трансформированных каллусных клеток. Пищевой продукт получают путем выращивания в суспензионной культуре соматических эмбриоидов с геном человеческой щелочной фосфатазы.
Растительные клетки, содержащие рекомбинантную человеческую щелочную фосфатазу, могут быть также использованы для получения и выращивания растений. Полученная растительная биомасса может быть использована в качестве сырья для получения пищевого продукта на основе растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека.
Создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы осуществляли следующим образом.
Нуклеотидную последовательность рекомбинантного гена щелочной фосфатазы человека (ЩФ) размером 1587 пар нуклеотидов синтезировали в полном соответствии с последовательностью нуклеотидов нативной мРНК гена щелочной фосфатазы человека (Homo sapiens alkaline phosphatase, intestinal (ALPI), Sequence ID: NM 001631.4). Для удобства клонирования в последовательность рекомбинантного гена ЩФ на 5'-конце до сайта инициации трансляции (atg) вводили последовательность сайта рестрикции BglII (agatct), а на 3'-конце после стоп-кодона (tga) последовательность, включающая сайт рестрикции XbaI (atctagaat). Нуклеотидную последовательность рекомбинантного гена ЩФ размером 1602 пар нуклеотидов, содержащая последовательность сайтов рестрикции BglII и XbaI, встраивали в плазмиду pAL-T vector и обозначали как pAL-T-ЩФ. Нуклеотидную последовательность гена ЩФ размером 1600 пар нуклеотидов вырезали из плазмиды pAL-T-ЩФ по сайтам рестрикции BglII и XbaI и лигировали в ранее созданную плазмиду p35S-NLS-recA-licBM3 [1], предварительно гидролизованную по сайтам рестрикции BamHI и XbaI, с получением плазмиды p35S-ЩФ, в которой рекомбинатный ген ЩФ находится под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты [2]. Точность сборки генетической конструкции p35S-ЩФ верифицировали секвенированием.
Встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы осуществляли следующим образом.
Для встраивания растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы применяли метод «трехродительского скрещивания», где в качестве доноров клетки использовали Escherichia coli с плазмидой p35S-ЩФ, в качестве посредника конъюгативного переноса - клетки Е. coli штамма НВ101 pRK2013, а в качестве акцептора - клетки агробактерии Agrobacterium tumefaciens штаммов GV3101 или AGL0. В результате были получены агробактериальные штаммы с геном человеческой щелочной фосфатазы GV3101 p35S-ЩФ и AGL0 p35S-ЩФ.
Получение каллусных растительных клеток и осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток.
В стерильных условиях (ламинар-бокс) семена растений стерилизовали в водном растворе коммерческого хлорсодержащего препарата с добавлением Твина-20 (1 капля на 100 мл раствора), затем трехкратно промывали в стерильной дистиллированной воде, в каждой порции по 10 минут. Затем из простерилизованных семян в стерильных условиях выделяли зародыши, которые переносил в пробирки на модифицированную Мурасиге и Скуга питательную среду (МСМ), дополненную регуляторами роста 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) и кинетином. Пробирки помещали в термостат и инкубировали при 23°C в темноте до образования каллуса.
В условиях ламинар-бокса с помощью стерильной микробиологической петли наносили отдельные бактериальные колонии из свежей культуры агробактериальных штаммов с геном человеческой щелочной фосфатазы GV3101 p35S-ЩФ или AGL0 p35S-ЩФ в пробирку, содержащую 3 мл стерильной жидкой среды LB с соответствующими для штамма бактерий антибиотиками. Агробактерии наращивали 20-48 часов при температуре 28°C на термостатируемой качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см и скорость 150-200 об/минуту).
Использовали стандартные среды для выращивания агробактерий, например, LB, содержащую (на 1 л): триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлористый натрий - 5 г и бакто-агар - 15 г. Среду автоклавировали при стандартных условиях 15-20 мин. После остывания до 65°C добавляли антибиотики: для штамма AGL0 - канамицин и рифампицин - каждого до конечной концентрации 100 мг/л; для штамма GV3101 - канамицин и рифампицин - каждого до конечной концентрации 100 мг/л и гентамицин до конечной концентрации 25 мг/л.
В условиях ламинар-бокса каллусные клетки растений помещали на стерильную фильтровальную бумагу в чашки Петри и наносили на каждый трансплант по 10-25 мкл «ночной» культуры агробактерий штаммов AGL0. и GV3101 с геном щелочной фосфатазы. Каллус после нанесения культуры агробактерий слегка подсушивали и переносили в пробирки на питательную среду МСМ с 0,2 мг/л 2,4Д. Через 3 суток каллусы переносили на агаризованную среду того же состава, дополненную 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Культивировали в течение 10 суток в темноте при температуре 22-24°C. Далее проводили еще 1-2 пассажа на среде этого же состава до появления новых колоний каллусных клеток. Для размножения каллусные клетки переносили на питательную среду МСМ с 0,2 мг/л 2,4Д с 200 мг/л цефотаксима. Каллусную ткань можно поддерживать в культуре неограниченно длительное время, периодически разделяя ее на фрагменты и пересаживая на новую среду. Для отбора трансгенных клеток использовали способность щелочной фосфатазы дефосфорилировать п-нитрофенилфосфат, с образованием окрашенного в желтый цвет паранитрофенола. Для наработки необходимого количества пищевого продукта каллусные клетки с геном человеческой ЩФ выращивали в суспензионной культуре на жидкой питательной среде того же состава без агара.
В случае реализации 2-го варианта способа получения пищевого продукта из трансформированных каллусных клеток растений получали соматические эмбриоиды, которые затем выращивали в суспензионной культуре.
Получение соматических эмбриоидов из трансформированных каллусных клеток осуществляли следующим образом.
Для получения соматических эмбриоидов суспензию каллусных клеток культивировали в жидкой питательной среде МСМ, содержащей 0,2 мг/л ИУК (индолилуксусной кислоты) и кинетина. Полученные таким образом эмбриогенные суспензии содержали различные предзародышевые структуры, а также отдельные неэмбриогенные клетки и группы клеток. Для синхронизации (получения однородной популяции) соматических эмбриоидов суспезионную культуру пропускали через нейлоновые сита с размером ячеек 120 мкм, а затем через 50 мкм. Массу клеток, которая оставалась на втором сите, переносили в свежую среду для формирования эмбриоидов. В среднем в 1 литре среды получали до 70 тыс. зародышей.
Получение высушенного пищевого продукта на основе растительных каллусных клеток или соматических эмбриоидов с геном человеческой щелочной фосфатазы.
Каллусные клетки с геном человеческой ЩФ отмывали от остатков питательной среды дистиллированной водой и подвергали лиофильной сушке при температуре -55°C с последующим досушиванием при +30°C, не допуская денатурации белков. В высушенной массе клеток определяли активность щелочной фосфатазы по способности дефосфорилировать п-нитрофенилфосфат. Готовую массу растительных клеток с геном ЩФ упаковывали в виде капсул, таблеток, пакетов саше или в иных готовых формах, а применяли в качестве компонента продуктов питания.
К подтверждению описанного выше можно привести описание отработки и оптимизации технологических параметров получения пищевых продуктов.
Клетки растений, например, моркови с геном щелочной фосфатазы человека сушили с использованием лиофильной сушки при температуре -55°C с последующим досушиванием при 20, 30, 40, 50 и 60°C. Сухую биомассу (навеска около 1 г) растирали с 10 мл буферного раствора, содержащего 5 мМ Трис-HCl, 0,1 мМ хлорида магния, 0,1 мМ хлорида цинка, центрифугировали при 100 g в течение 30 минут. Супернатант испытывали на дефосфорилирующую способность ЩФ при добавлении к раствору 20 мМ nНФФ (п-нитрофенилфосфата). Реакционную смесь инкубировали при 37°C в течение 30 минут для развития окраски продуктом реакции. Для остановки реакции использовали 2 мл охлажденного 0,5 М NaOH. За единицу активности принимали количество фермента, необходимого для образования 1 мкМ nНФ. Специфическую активность рассчитывали в единицах на 1 г клеток моркови.
Из таблицы 2 видно, что температурный режим досушивания клеток растений влияет на активность ЩФ, наиболее оптимальные температуры для досушивания находятся в интервале от 20°C до 40°C.
Влияние состава питательной среды на каллусообразование изучали на двух сортах моркови Нантская 4 и Московская зимняя А-555, относящихся к разным сортотипам. В качестве экспланта использовали зиготические зародыши, выделенные из зрелых семян моркови. Зародыши культивировали на трех наиболее часто используемых средах МС (Murashige, Skoog, 1964), МСМ (Masuda et al, 1981) и В5 (Gamborg et al., 1976). Для индукции каллусообразования в среды добавляли 2,4Д в различных концентрациях, результаты исследований представлены в таблице 3.
Из таблицы видно, что каллусообразование у моркови происходит на всех исследуемых вариантах сред, однако наиболее оптимальный является среда МСМ для обоих сортов моркови.
Влияние регуляторов роста на способность каллусных тканей растений, например, моркови сорта Нантская 4 к соматическому эмбриогенезу изучали в суспензионной культуре на среде МСМ с различными сочетаниями регуляторов роста типа ауксинов (2,4-Д, ИУК) и цитокининов (кинетин и БАП). В качестве трансплантов использовали каллусную ткань моркови сорт Нантская 4, полученную из зиготических зародышей, клеточную суспензию культивировали в колбах объемом 100 мл на шейкере, скорость 80 об/мин, результаты исследований представлены в таблице 4.
Из таблицы 4 видно, что образование эмбриоидов может успешно осуществляться на средах, не содержащих 2,4-Д.
Для получения каллусных тканей растений использовали различные типы эксплантов: ткани корнеплода, фрагменты стебля и листа, черешок листа, семядоли и гипокотиль и зиготические зародыши моркови сорт Нантская 4. Экспланты культивировали на питательной среде МСМ с 0,2 мг/л 2,4-Д, затем для индукции эмбриогенеза образовавшийся каллус переносили на среды следующего состава: МСМ с 0,2 мг/л 2,4-Д и кинетина и среда МСМ с 0,2 мг/л ИУК и кинетина. Клеточную суспензию культивировали в колбах объемом 100 мл на шейкере, скорость 80 об/мин. Результаты исследований представлены в таблице 5.
Из таблицы 5 видно, что лучшим эксплантом для получения эмбриогенного каллуса служат зиготические зародыши.
Возможность получения и применения пищевых продуктов на основе растений, содержащих человеческую ЩФ, иллюстрируется следующими примерами.
Для удобства применения продукта, выращенные каллусные клетки или соматические эмбриоиды растений с геном человеческой щелочной фосфатазы могут подвергаться сушке любыми приемлемыми способами.
Полученный пищевой продукт на основе растений, содержащих человеческую ЩФ, можно использовать для приема внутрь в дозированных формах, в том числе, но не ограничиваясь, в виде капсул, таблеток, пакетов саше и в иных готовых формах.
Полученный пищевой продукт на основе растений, содержащих человеческую ЩФ, можно использовать в виде компонента продуктов питания для массового потребления, например, молочных продуктов, напитков, кондитерских изделий, а также в составе лечебно-диетических, лечебно-профилактических продуктов, продуктов функционального питания.
Полученный продукт на основе растительных каллусных клеток и соматических эмбриоидов, содержащих человеческую ЩФ, можно использовать для поддержания здоровья, в том числе для поддержания гомеостаза желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), и профилактики заболеваний, связанных с нарушением гомеостаза ЖКТ. В частности, данный продукт можно использовать:
- для регуляции микрофлоры ЖКТ, в том числе для поддержания нормальной микрофлоры ЖКТ и предотвращения роста патогенной микрофлоры ЖКТ;
- для регуляции иммунной системы организма, включая поддержание нормального уровня иммунной системы и восстановление иммунной системы при ее нарушениях, связанных с различными негативными воздействиями, включая стресс, неблагоприятные экологические факторы, прием лекарственных средств и других ксенобиотиков;
- для снижения токсических эффектов, в том числе связанных с бактериальной инфекцией или воспалительными заболеваниями кишечника;
- для профилактики нарушений ЖКТ, связанных с приемом ксенобиотиков различной природы, включая лекарственные препараты.
Полученный пищевой продукт на основе растений, содержащих человеческую ЩФ, можно использовать как здоровым людям, так и людям, страдающим различными воспалительными и аутоиммунными заболеваниями, включая заболевания кишечника (язвенный колит, болезнь Крона, энтероколиты), артриты, экзему и другие системные заболевания, связанные с повышенной проницаемостью стенки кишечника. Полученный пищевой продукт можно использовать лицам, страдающим ожирением и имеющим различные косметические проблемы.
Получение пищевого продукта заявляемым способом может быть проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1. Получение пищевого продукта на основе моркови, содержащей человеческую ЩФ
Для встраивания гена человеческой кишечной ЩФ в растительный экспрессионный вектор нуклеотидную последовательность размером 1587 пар нуклеотидов синтезировали в полном соответствии с последовательностью нуклеотидов нативной мРНК гена щелочной ЩФ. Далее в последовательность рекомбинантного гена ЩФ на 5'-конце до сайта инициации трансляции (atg) была введена последовательность сайта рестрикции BglII (agatct), а на 3'-конце после стоп-кодона (tga) последовательность сайта рестрикции XbaI (atctagaat). Полученную нуклеотидную последовательность размером 1602 пар нуклеотидов клонировали в плазмиду pAL-T vector. Далее из полученной плазмиды pAL-T-ЩФ вырезали нуклеотидную последовательность размером 1600 пар нуклеотидов по сайтам рестрикции BglII и XbaI и лигировали в ранее созданную плазмиду p35S-NLS-recA-licBM3 с получением плазмиды p35S-ЩФ, в которой рекомбинантный ген ЩФ находится под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Точность сборки генетической конструкции p35S-ЩФ верифицировали секвенированием.
Агробактериальный штамм с геном человеческой ЩФ AGL0 p35S-ЩФ получали, используя в качестве доноров клетки Escherichia coli с плазмидой p35S-ЩФ, в качестве посредника конъюгативного переноса клетки Е. coli штамма НВ101 pRK2013, а в качестве акцептора клетки Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0.
В качестве объекта агробактериальной трансформации использовали каллусные клетки из зиготических зародышей семян моркови, которые получали следующим образом: семена моркови стерилизовали в 50% водном растворе хлорсодержащего препарата «Белизна» с добавлением Твин-20 (1 капля на 100 мл раствора), затем их трехкратно промывали в стерильной дистиллированной воде; затем из простерилизованных семян в стерильных условиях выделяли зародыши, которые переносили в пробирки на питательную среду МСМ с регуляторами роста 2,4-Д и кинетином; пробирки помещали в термостат и инкубировали при температуре 23°C в темноте до образования каллуса.
Агробактерий штамма AGL0 наращивали следующим образом: в условиях ламинарного бокса с помощью стерильной микробиологической петли наносили отдельную бактериальную колонию из свежей культуры с селективными антибиотиками в пробирку, содержащую 3 мл стерильной жидкой среды LB описанного выше состава; далее агробактерий наращивали 24-48 часов при 28°C на термостатируемой качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см и скорость 150-200 об /минуту).
Трансформацию и выращивание каллусных клеток моркови проводили следующим образом: в ламинарном боксе каллусы моркови из зиготических зародышей помещали на стерильную фильтровальную бумагу в чашках Петри; затем наносили на каждый трансплант по 10-25 мкл ночной культуры агробактерий штамма AGL0 с геном ЩФ; затем каллусы слегка подсушивали и переносили в пробирки на питательную среду МСМ с 0,2-0,5 мг/л 2,4Д; через 3 суток каллусы переносили на агаризованную среду того же состава, дополненную 500 мг/л антибиотика цефотаксима; каллусы культивировали 10 суток в темноте при температуре 22-24°C. Далее проводили еще 1-2 пассажа на среде этого же состава до появления новых колоний клеток моркови. Для размножения суспензионные каллусные клетки моркови переносили на питательную среду МСМ с 0,2-0,5 мг/л 2,4Д с 200 мг/л цефотаксима. Для отбора трансгенных клеток моркови использовали способность ЩФ дефосфорилировать п-нитрофенилфосфат с образованием окрашенного в желтый цвет п-нитрофенола.
Далее каллусные клетки моркови с геном человеческой ЩФ отмывали от питательной среды дистиллированной водой и подвергали лиофильной сушке при температуре -55°C; в высушенной массе определяли активность ЩФ по способности дефосфорилировать п-нитрофенилфосфат; высушенную массу фасовали в пакеты саше.
Полученный пищевой продукт использовали для поддержания нормальной микрофлоры ЖКТ и поддержания нормального состояния иммунной системы организма, добавляя в молочные продукты или напитки в расчете 0,5-1 пакет саше на человека в сутки.
Пример 2. Получение пищевого продукта на основе стевии, содержащей человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали стевию (Stevia rebaudiana), а для выращивания клеток, содержащих ЩФ, использовали технологию соматического эмбриогенеза. Для получения соматических эмбриоидов стевии клеточную суспензию культивировали в жидкой питательной среде МСМ, содержащей 0,2 мг/л индолилуксусной кислоты и кинетина; затем для получения однородной популяции эмбриоидов суспезионную культуру пропускали через нейлоновые сита с размером ячеек 120 мкм, а затем через 50 мкм; массу клеток, полученную на втором сите, переносили в свежую среду для формирования эмбриоидов. В среднем в 1 литре среды можно получать до 70 тыс. эмбриоидов.
Полученный пищевой продукт использовали для восстановления иммунной системы организма при ее нарушениях, добавляя в пищевые продукты или напитки, не подвергающиеся тепловой обработке (нагреванию) выше 40°C, в расчете 0,5-1 пакет саше на человека в сутки.
Пример 3. Получение пищевого продукта на основе салата, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали салат (Latuca sativa), в растительный экспрессионный вектор клонировали ген секреторной ЩФ человека, а в качестве агробактериального штамма использовали штамм GV3101 p35S-ЩФ, который получали, используя в качестве доноров клетки Escherichia coli с плазмидой p35S-ЩФ, в качестве посредника конъюгативного переноса клетки Е. coli штамма НВ101 pRK2013, а в качестве акцептора клетки Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101.
Полученный пищевой продукт использовали для снижения последствий интоксикаций, в том числе связанных пищевыми отравлениями, кишечными инфекциями или приемом лекарств, употребляя по 1-2 пакета саше перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 4. Получение пищевого продукта на основе капусты китайской, содержащей человеческую ЩФ.
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали и использовали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали капусту китайскую (Brassica pekinensis), а для получения и выращивания каллусных клеток использовали культуральную среду МС с добавлением 0,1-1,0 мг/л 2,4Д.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики негативных побочных эффектов, связанных с приемом антибактериальных лекарственных препаратов, употребляя по 1 пакету саше перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 5. Получение пищевого продукта на основе капусты белокочанной, содержащей человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали и использовали аналогично описанному в примере 4, но в качестве растения использовали капусту белокочанную (Brassica oleracea), а в растительный экспрессионный вектор клонировали ген плацентарной ЩФ человека.
Полученный пищевой продукт использовали на добровольцах для профилактики негативных побочных эффектов, связанных с приемом антибиотиков, употребляя по 1 пакету саше перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 6. Получение пищевого продукта на основе укропа, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали укроп (Anethum graveolens), а для получения готового пищевого продукта клетки укропа с геном ЩФ человека лиофилизировали с последующим досушиванием при температуре до +30°C.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики нарушений ЖКТ и иммунной системы организма, связанных с негативным влиянием стресс-факторов, употребляя по 0,5-1 пакета саше перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 7. Получение пищевого продукта на основе сельдерея, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали сельдерей (Apium graveolens), а для получения готового пищевого продукта клетки укропа с геном ЩФ человека лиофилизировали с последующим досушиванием при температуре от +30°C до 40°C.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики нарушений ЖКТ и иммунной системы организма, связанных с негативным влиянием стресс-факторов, добавляя в продукты питания или напитки повседневного употребления (при температуре продуктов не выше 40°C) в расчете 0,5-1 пакет саше на человека в сутки.
Пример 8. Получение пищевого продукта на основе огурца, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали и использовали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали огурец (Cucumis sativus), а для получения и выращивания каллусных клеток использовали культуральную среду В-5 с добавлением 0,1-1,0 мг/л 2,4Д.
Пример 9. Получение пищевого продукта на основе тыквы, содержащей человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали тыкву (Cucurbita реро), а для получения готового пищевого продукта клетки тыквы с геном ЩФ человека смешивали со вспомогательными веществами и фасовали в желатиновые капсулы.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики негативных побочных эффектов, связанных с приемом антибактериальных лекарственных препаратов, употребляя по 2 капсулы внутрь на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 10. Получение пищевого продукта на основе риса, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 10, но в качестве растения использовали рис (Oryza sativa), а для получения готового пищевого продукта использовали распылительную сушку, которую проводили при температуре, не превышающей +50°C, чтобы не допустить денатурации белков.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики негативных побочных эффектов, связанных с приемом антибиотиков, употребляя по 1-3 капсулы перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 11. Получение пищевого продукта на основе люцерны, содержащей человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали и использовали аналогично описанному в примере 2, но в качестве растения использовали люцерну (Medicago sativa), а для оптимизации содержания ЩФ проводили синхронизацию развития эмбриоидов (с помощью фильтрации через сита, центрифугирования и автоматического сепарирования) и использовали режим подращивания эмбриоидов в жидкой питательной среде с добавлением ПЭГ, маннитола или других веществ, повышающих осмотическое давление.
Пример 12. Получение пищевого продукта на основе томата, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали томат (Solatium lycopersicum), а для получения готового пищевого продукта клетки томата высушивали до содержания влаги 4-8% при 40°C и покрывали полимерами карбоксиметилцеллюлозой, альгинатом натрия с образованием микрокапсул/пеллет, которые фасовали в пакеты саше или желатиновые капсулы.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики нарушений нормальной микрофлоры ЖКТ и состояния иммунной системы организма, добавляя в продукты или напитки повседневного употребления в расчете 0,5-1 пакет саше с микрокапсулами/пеллетами на человека в сутки.
Пример 13. Восстановление с помощью клеток моркови, содержащих ген человеческой ЩФ, показателей иммунитета, нарушенных под влиянием липополисахарида
Нарушения иммунной системы, связанные с нарушением кишечного гомеостаза, в частности - нарушением нормальной микрофлоры и барьерной функции кишечника, моделировали введением мышам стока CD-1 липополисахарида E.coli (Sigma-Aldrich) в дозе 0,5 мг/кг внутрижелудочно. Под влиянием ЛПС в крови мышей наблюдалось повышение уровня провоспалительных цитокинов: ИЛ-6, ИЛ-8 и TNFα, характеризующих развитие системной воспалительной реакции Предварительное внутрижелудочное введение мышам клеток моркови, содержащих ген человеческой ЩФ, приводило к существенному снижению (на 53-77%) уровня провоспалительных цитокинов.
Пример 14. Восстановление кишечной микрофлоры после антибактериальной терапии стрептомицином при кормлении мышей клетками моркови, содержащими ген человеческой кишечной ЩФ
Изучение способности моркови, содержащей ген человеческой кишечной ЩФ, восстанавливать кишечную микрофлору, нарушенную после антибактериальной терапии, проводили на мышах стока CD-1.
Одной группе животных вводили внутрижелудочно антибиотик стрептомицин в дозе 200 мг/кг однократно; второй группе - внутрижелудочно стрептомицин 200 мг/кг однократно и лиофильно высушенные клетки моркови, содержащие ген человеческой кишечной ЩФ, 100 мг/кг; третьей группе - внутрижелудочно стрептомицин 200 мг/кг и препарат-пробиотик «Линекс», содержащий лиофилизированные молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis, Enterococcus faecium), в дозе 100 мг (капсульной массы)/кг.
Ежедневно проводили забор и посев каловых масс на питательную среду LB и анализировали наличие или отсутствие нормальной кишечной микрофлоры (таблица 6).
Как демонстрируют полученные данные, у мышей, получавших стрептомицин, рост бактерий был прекращен через 24 часа после приема препарата. Кал животных этой группы оставался стерильным на протяжении 8 суток и начинал восстанавливаться на 9-е сутки. У мышей, получавших стрептомицин вместе с клетками моркови содержащими ген человеческой кишечной ЩФ, микрофлора начала восстанавливаться через 4 суток. При этом, в группе животных, получавших стрептомицин и препарат сравнения - пробиотик «Линекс», восстановление микрофлоры начиналось только на 8-е сутки.
Таким образом, употребление мышами клеток моркови, содержащих ген человеческой кишечной ЩФ, способствует восстановлению микрофлоры кишечника после лечения антибиотиком стрептомицином.
Пример 15. Клетки моркови, содержащие ген человеческой кишечной ЩФ, ускоряют восстановление кишечной микрофлоры после антибактериальной терапии ампициллином
Эксперимент проводили на мышах стока CD-1. Животные первой группы в течение 7 суток получали внутрижелудочно по 50 мг/кг в сутки антибиотик ампицилин. Животные второй группы одновременно с приемом антибиотика получали лиофильно высушенные клетки моркови, содержащие ген человеческой кишечной ЩФ, в дозе 50 мг/кг в сутки. Животные третьей группы одновременно с приемом антибиотика получали препарат сравнения - пробиотик «Линекс», содержащий лиофилизированные молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis, Enterococcus faecium), в дозе 50 мг (капсульной массы)/кг в сутки. Каждый день в течение 3-х недель проводили посевы кала мышей каждой группы на среду LB. Результаты представлены в таблице 7.
Рост бактерий в кишечнике мышей, получавших антибиотик ампициллин, прекратился через 24 часа после начала лечения. В группе мышей, получавшей только ампициллин, нормальная микрофлора кишечника начала восстанавливаться только на 20-е сутки эксперимента. В тоже время, у мышей, принимавших одновременно с ампициллином клетки моркови, содержащие ген человеческой кишечной ЩФ, нормальная микрофлора кишечника начала восстанавливаться уже на 11-е сутки эксперимента. В группе животных, получавших одновременно с ампициллином препарат сравнения - пробиотик «Линекс», восстановление микрофлоры начиналось только на 18-е сутки.
Заявляемое изобретение может найти широкое применение в качестве компонентов продуктов питания для массового потребления, например, молочных продуктов, напитков, кондитерских изделий, а также в составе лечебно-диетических, лечебно-профилактических продуктов, продуктов функционального питания.
Источники информации
1. Bol-Schoenmakers М., Fiechter D., Raaben W., Hassing I., Bleumink R., Kruijswijk D., Maijoor K., Tersteeg-Zijderveld M., Brands R., Pieters R. Intestinal alkaline phosphatase contributes to the reduction of severe intestinal epithelial damage // Eur J Pharmacol. 2010 / - Vol. 633(1-3). - P. 71-77. doi: 10.1016/j.ejphar.2010.01.023. Epub 2010 Feb 2.
2. Brenchley, J.M., Prince D.A., Schacker T.W., Ascher Т.Е., Silvestri G., Rao S., Kazzaz Z. et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection / // Nat. Med. - 2006. - №1 Bird AP. CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus. Trends Genet 1987; 3: 342-7. 2. - P. 1365-1371. PMID: 17115046 DOI: 10.1038/nm1511.
3. Cadwell K., Patel K.K., Maloney N.S., Liu T.C., Ng A.C., Storer C.E., Head R.D., Xavier R., Stappenbeck T.S., Virgin H.W. Virus-plus-susceptibility gene interaction determines Crohn's disease gene Atg16L1 phenotypes in intestine // Cell. 2010. - Vol. 141. - P. 1135-1145. DOI: 10.1016/j.cell.2010.05.009.
4. Eskandari M.K., Kalff J.C., Billiar T.R., Lee K.K., Bauer A.J. LPS-induced muscularis macrophage Nathan CF. Secretory products of macrophages // J Clin Invest. 1987. - Vol. 79. - P. 319-326.
5. Jiang, W., Lederman M.M., Hunt P., Sieg S.F., Haley K., Rodriguez В., Landay A., Martin J., Sinclair E., Asher A.I., Deeks S.G., Douek D.C., Brenchley J.M. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection // J. Infect. Dis. - 2009. - №199. - P. 1177-1185. PMID: 19265479 PMCID: PMC2728622 DOI: 10.1086/597476.
6. Kats S., Brands R., Hamad M.A.S. Seinen W., Schamhorst V., Wulkan R.W., Schonberger J., P., van Oeveren W. Prophylactic treatment with cardiac surgery induces end phosphatase release // Int J Artif Organs 2012. Vol. 35. No 2. P. 144-151.
7. Maloy K.J., Powrie F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease // Nature. 2011. - Vol. 474. - P. 298-306. PMID: 2167774, DOI:10.1038/nature10208
8. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self // Science. 2002. - N. 12. Vol. 296(5566). - P. 301-305. PMID: 11951032, DOI: 10.1126/science.1071059.
9. Molnar K., Vannay A., Szebeni В., Banki N.F, Sziksz E., Cseh A., 
H., Lakatos P.L., Papp M., 
A., Veres G. Intestinal alkaline phosphatase in the colonic mucosa of children ith inflammatory bowel disease. // World J Gastroenterol 2012. - Vol. 18. - P. 3254-3259 [PMID: 22783049 DOI: 10.3748/wjg.v18.i25.3254].
10. Muginova S.V., Zhavoronkova A.M., Polyakov A.E., Shekhovtsova T.N. Application of alkaline phosphatases from different sources in pharmaceutical and clinical analysis for the determination of their cofactors; zinc and magnesium ions // Anal Sci 2007. - Vol. 23. - P. 357-363 [PMID: 17372382].
11. Odell J.T., Nagy F., Chua N.H. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter // Nature. 1985. V. 313. P. 810-812.
12. Park B.S, Lee J.O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes // Exp Mol Med. 2013. - Vol. 45. - P. 66. http://dx.doi.org/10.1038/emm.2013.97.
13. Pickkers P., Snellen F., Rogiers P., Bakker J., Jorens P., Meulenbelt J., Spapen H., Tulleken J.E., Lins R., Ramael S., Bulitta M.,. van der Hoeven J.G. Clinical pharmacology of exogenously administered alkaline phosphatase // Eur J Clin Pharmacol. 2009. Vol. 65. P. 393-402.
14. Podolsky DK. Inflammatory bowel disease. // N Engl J Med. 2002. - Vol. 347. - P. 417-429.
15. Poelstra K, Bakker WW, Klok PA, et al. A physiologic function for alkaline phosphatase: Endotoxin detoxification. Lab Invest 1997. - Vol. 76(3). - P. 319-327. PMID: 9121115.
16. Rezende, A.A., J.M. Pizauro, et al. (1994). "Phosphodiesterase activity is a novel property of alkaline phosphatase from osseous plate." Biochem J. 1994. - Vol. 301 (Pt 2). - P. 517-522. PMCID: PMC1137111.
17. Riggle K.M., Rentea R.M., Welak S.R., Pritchard K.A., Jr, Oldham K.T., Gourlay D.M. Intestinal alkaline phosphatase prevents the systemic inflammatory response associated with necrotizing enterocolitis // J Surg Res. 2013. - Vol. 180. - P. 21-26. http://dx.doi.org/10.1016/j.jss.2012.10.042.
18. Sabalza M., Christou P., Capell T. Recombinant plant-derived pharmaceutical proteins: current technical and economic bottlenecks // Biotechnol Lett. - 2014. DOI 10.1007/s10529-014-1621-3.
19. Sharma A.K., Sharma M.K. Plants as bioreactors: Recent developments and emerging opportunities // Biotechnology Advances 2009. - Vol. 27. - P. 811-832.
Conley AJ, Joensuu JJ, Richman A, Menassa R Protein body-inducing fusions for high-level production and purification of recombinant proteins in plants. // Plant Biotechnol J. 2011. - Vol. 9. - P. 419-433.
20. Tuin A., Poelstra K., de Jager-Krikken A., Bok L., Raaben W., Velders M.P., Dijkstra G. Role of alkaline phosphatase in colitis in man and rats. Gut 2009; 58: 379-387 [PMID: 18852260 DOI: 10.1136/gut.2007.128868].
21. Weemaes A.M., Meijer D.K., Poelstra K.. Removal of phosphate from lipid A as a strategy to detoxify lipopolysaccharide // Shock. 2002. - Vol. 18. - P. 561-566. http://dx.doi.Org/10.1097/00024382-200212000-00013.
22. Wise A.A., Liu Z., Binns A.N. Three methods for the introduction of foreign DNA into Agrobacterium // Agrobacterium Protocols. Springer, 2006. P. 43-54.
23. Комахин P.А., Комахина B.B., Жученко A.A. 2007. Создание генетических конструкций, содержащих бактериальный ген recA Е. coli для индукции рекомбинации в растениях. Сельскохозяйственная биология. 3,25-32.
Claims (9)
1. Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, включающий создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток, осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток с помощью агробактериальных штаммов, получение соматических эмбриоидов из трансформированных каллусных клеток и выращивание в суспензионной культуре соматических эмбриоидов с геном человеческой щелочной фосфатазы.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после агробактериальной трансформации каллусных клеток в суспензионной культуре выращивают трансформированные каллусные клетки с геном человеческой щелочной фосфатазы.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что производят сушку выращенных трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве рекомбинантной человеческой щелочной фосфатазы используют тканеспецифические щелочные фосфатазы, например кишечную и плацентарную, или тканенеспецифические щелочные фосфатазы.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят синхронизацию развития эмбриоидов.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что соматические эмбриоиды выращивают в жидкой питательной среде с добавлением веществ, повышающих осмотическое давление, в качестве которых используют полиэтиленгликоль, маннитол и другие повышающие осмотическое давление вещества.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансформированные растительные клетки с геном человеческой щелочной фосфатазы используют в виде капсул, таблеток, пакетов саше и в иных готовых формах.
8. Применение трансформированных растительных клеток, содержащих ген щелочной фосфатазы человека, для профилактики нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и ее восстановления при токсических и стрессовых воздействиях, включающее получение клеток способом по п. 1 и добавление полученных клеток в пищевые продукты или напитки.
9. Применение трансформированных растительных клеток, содержащих ген щелочной фосфатазы человека, для профилактики нарушений иммунной системы организма, связанных с нарушениями микрофлоры кишечника и барьерной функции кишечника, и восстановления иммунной системы при ее нарушениях в качестве иммуностимулирующего средства, включающее получение клеток способом по п. 1 и добавление полученных клеток в пищевые продукты или напитки.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018104401A RU2698397C2 (ru) | 2018-02-05 | 2018-02-05 | Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека |
| US16/967,390 US20210214738A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-01-29 | Method of producing transformed plant cells, containing recombinant human alkaline phosphatase, and the use of said transformed plant cells, containing recombinant human alkaline phosphatase |
| PCT/RU2019/000053 WO2019151902A1 (ru) | 2018-02-05 | 2019-01-29 | Способ получения трансформированных растительных клеток |
| CN201980011908.3A CN111787809A (zh) | 2018-02-05 | 2019-01-29 | 生产含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法以及含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的用途 |
| EP19748181.5A EP3750407A4 (en) | 2018-02-05 | 2019-01-29 | METHOD FOR OBTAINING TRANSFORMED PLANT CELLS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018104401A RU2698397C2 (ru) | 2018-02-05 | 2018-02-05 | Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018104401A RU2018104401A (ru) | 2019-08-06 |
| RU2018104401A3 RU2018104401A3 (ru) | 2019-08-06 |
| RU2698397C2 true RU2698397C2 (ru) | 2019-08-26 |
Family
ID=67479386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018104401A RU2698397C2 (ru) | 2018-02-05 | 2018-02-05 | Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210214738A1 (ru) |
| EP (1) | EP3750407A4 (ru) |
| CN (1) | CN111787809A (ru) |
| RU (1) | RU2698397C2 (ru) |
| WO (1) | WO2019151902A1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110206654A1 (en) * | 2008-08-29 | 2011-08-25 | The General Hospital Corporation | Methods of Modulating Gastrointestinal Tract Flora Levels with Alkaline Phosphatase |
| US20130280232A1 (en) * | 2004-02-04 | 2013-10-24 | Pharmaaware Sepsis B.V. | Use of alkaline phosphatase for the detoxification of lps present at mucosal barriers |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991002071A2 (en) * | 1989-08-09 | 1991-02-21 | Dekalb Plant Genetics | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| US20010007157A1 (en) * | 1993-11-18 | 2001-07-05 | Ebrahim Firoozabady | Genetically transformed rose plants and methods for their production |
| EP1379539B1 (en) * | 2001-02-28 | 2010-04-07 | Board of Regents of the University of Nebraska | Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms |
| WO2011100543A2 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | The General Hospital Corporation | Methods of reducing or inhibiting toxic effects associated with a bacterial infection using alkaline phosphatase |
| US20170130236A1 (en) * | 2014-06-02 | 2017-05-11 | University Of Tennessee Research Foundation | Methods of plant transformation using transformable cell suspension culture and uses thereof |
-
2018
- 2018-02-05 RU RU2018104401A patent/RU2698397C2/ru active
-
2019
- 2019-01-29 WO PCT/RU2019/000053 patent/WO2019151902A1/ru unknown
- 2019-01-29 US US16/967,390 patent/US20210214738A1/en active Pending
- 2019-01-29 EP EP19748181.5A patent/EP3750407A4/en active Pending
- 2019-01-29 CN CN201980011908.3A patent/CN111787809A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130280232A1 (en) * | 2004-02-04 | 2013-10-24 | Pharmaaware Sepsis B.V. | Use of alkaline phosphatase for the detoxification of lps present at mucosal barriers |
| US20110206654A1 (en) * | 2008-08-29 | 2011-08-25 | The General Hospital Corporation | Methods of Modulating Gastrointestinal Tract Flora Levels with Alkaline Phosphatase |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NATHAN C.F., Secretory products of macrophages, The Journal of Clinical Investigation, 1987, Vol.79, N2. * |
| ЕФИМЦЕВА Э.А. и др. Щелочная фосфатаза: участие в детоксикации бактериального эндотоксина, Успехи современной биологии, 2015, т.135, н.3. Федеральный закон N 29-ФЗ, О качестве и безопасности пищевых продуктов, 02.01.2000 (ред. от 13.07.2015). * |
| ЕФИМЦЕВА Э.А. и др. Щелочная фосфатаза: участие в детоксикации бактериального эндотоксина, Успехи современной биологии, 2015, т.135, н.3. Федеральный закон N 29-ФЗ, О качестве и безопасности пищевых продуктов, 02.01.2000 (ред. от 13.07.2015). NATHAN C.F., Secretory products of macrophages, The Journal of Clinical Investigation, 1987, Vol.79, N2. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3750407A4 (en) | 2021-04-28 |
| CN111787809A (zh) | 2020-10-16 |
| EP3750407A1 (en) | 2020-12-16 |
| RU2018104401A (ru) | 2019-08-06 |
| WO2019151902A1 (ru) | 2019-08-08 |
| RU2018104401A3 (ru) | 2019-08-06 |
| US20210214738A1 (en) | 2021-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102010207B1 (ko) | 세균 균주를 포함하는 조성물 | |
| ES2748812T3 (es) | Composiciones que comprenden cepas bacterianas | |
| ES2660813T3 (es) | Nueva bacteria de ácido láctico, fármaco, producto alimenticio o bebida, y pienso que contienen la nueva bacteria de ácido láctico | |
| CN100552016C (zh) | 用于治疗炎性疾病的双歧杆菌 | |
| EP2179028B1 (en) | A novel strain of bifidobacterium and active peptides against rotavirus infections | |
| RU2662985C1 (ru) | Новый бактериофаг шига-токсин продуцирующей e. coli типа f18 esc-cop-1 и его применение для ингибирования пролиферации шига-токсин продуцирующей e. coli типа f18 | |
| CN108495642A (zh) | 包含细菌菌株的组合物 | |
| US9657277B2 (en) | Bacteriophage and antibacterial composition comprising the same | |
| US9862935B2 (en) | Bacteriophage and antibacterial composition comprising the same | |
| CN113832077B (zh) | 鼠李糖乳杆菌及其应用 | |
| ES2407150T3 (es) | Bacteria ácido láctica novedosa con actividad anti-alérgica, agente anti-alérgico, alimento y composición farmacéutica que comprenden, cada uno de ellos, la bacteria ácido láctica, y proceso para la producción del agente anti-alérgico | |
| JP6456987B2 (ja) | 成長促進のためのビフィドバクテリウム・ブレーベｃｂｔ ｂｒ３菌株及びこれを含む成長促進用機能性食品組成物 | |
| CN104837506A (zh) | 免疫调节性小细胞及使用方法 | |
| JP2019516750A (ja) | 微生物叢療法のための組成物及び方法 | |
| CN114958650A (zh) | 一种防治幽门螺杆菌感染的副干酪乳杆菌及其组合物与应用 | |
| TW201907928A (zh) | 包含細菌品系之組成物 | |
| JP4565057B2 (ja) | イムノグロブリンａ誘導能の高い新規乳酸菌 | |
| CN114390897A (zh) | 一种益生元和益生菌的组合物及其应用 | |
| CN113249255B (zh) | 一种防控禽肠炎的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| ES2321602T3 (es) | Composicion para fomentar la proliferacion de lactobacillus casei subsp.casei. | |
| RU2698397C2 (ru) | Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека | |
| BR122022016606B1 (pt) | Lactobacillus paracasei mortos pelo aquecimento, medicamento, alimento ou bebida, ração, agente promotor da produção de il-12 e uso | |
| TW202019447A (zh) | 包含細菌菌株之組合物 | |
| CN116024131A (zh) | 一种植物乳杆菌菌株goldgut-lp101及用途 | |
| CN113355259A (zh) | 一株格氏乳杆菌及其在治疗消化性溃疡中的应用 |