WO2019151902A1 - Способ получения трансформированных растительных клеток - Google Patents

Способ получения трансформированных растительных клеток Download PDF

Info

Publication number
WO2019151902A1
WO2019151902A1 PCT/RU2019/000053 RU2019000053W WO2019151902A1 WO 2019151902 A1 WO2019151902 A1 WO 2019151902A1 RU 2019000053 W RU2019000053 W RU 2019000053W WO 2019151902 A1 WO2019151902 A1 WO 2019151902A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
alkaline phosphatase
cells
gene
callus
human alkaline
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/000053
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Наталья Анатольевна ШМЫКОВА
Роман Александрович КОМАХИН
Сергей Александрович СТАНКЕВИЧ
Вениамин Абрамович ХАЗАНОВ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Инновационные Фармакологические Разработки" (Ооо "Ифар")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Инновационные Фармакологические Разработки" (Ооо "Ифар") filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Инновационные Фармакологические Разработки" (Ооо "Ифар")
Priority to CN201980011908.3A priority Critical patent/CN111787809A/zh
Priority to US16/967,390 priority patent/US20210214738A1/en
Priority to EP19748181.5A priority patent/EP3750407A4/en
Publication of WO2019151902A1 publication Critical patent/WO2019151902A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/14—Vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
    • A23L19/01—Instant products; Powders; Flakes; Granules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/198—Dry unshaped finely divided cereal products, not provided for in groups A23L7/117 - A23L7/196 and A23L29/00, e.g. meal, flour, powder, dried cereal creams or extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/23—Apiaceae or Umbelliferae (Carrot family), e.g. dill, chervil, coriander or cumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the invention relates to food industry and medicine and relates to a method for producing transformed plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase, and their use to maintain gastrointestinal tract (GIT) homeostasis.
  • GIT gastrointestinal tract
  • the intestine is known to be an important barrier organ consisting of normal (synanthropic) microflora, mucous layer, epithelium and subepithelial immune system.
  • the main function of the intestinal barrier is to protect the body from bacterial translocation into the systemic circulation.
  • Normal microflora is able to be in the intestinal lumen without stimulating the host's immune response, however, these same bacteria cause an immune response and inflammation if they translocate through the intestinal barrier into the bloodstream and enter other organs.
  • Violation of the intestinal barrier leads to the development of a hypertrophic immune response to the components of synanthropic bacteria and, as a result, to the development of chronic inflammatory bowel diseases (IBD), such as Crohn's disease, ulcerative colitis (Podolsky, 2010).
  • IBD chronic inflammatory bowel diseases
  • Crohn's disease Crohn's disease
  • ulcerative colitis Podolsky, 2010
  • a significant contribution to the induction of these disorders is stress, infections, aging, and the toxic effects of xenobiotics, including drugs (Cadwell et al., 2010).
  • LPS which is constantly released by intestinal microflora, enters the bloodstream when the intestinal barrier is broken and even at minimal concentrations of ng / kg causes an inflammatory reaction.
  • LPS binds to the membrane protein CD 14 on the surface of macrophages, causing their activation, which leads to the release of dozens of biologically active substances: prostaglandins, nitric oxide, and cytokines, including interleukins and TNFa (Nathan, 1987). It is LPS and extracellular ATP that are the most important factors in the formation of a systemic immune and inflammatory response to alien and danger signals (Matzinger, 2002).
  • Intestinal alkaline phosphatase which is produced by cells of the intestinal mucosa, plays an important role in intestinal homeostasis precisely through the inactivation (detoxification) of LPS and the prevention of translocation of LPS, regulation of intestinal microflora and intestinal surface pH, (Eskandari et al., 1999; Weemaes et al., 2002; Riggle et al., 2013; Tuin et al., 2009).
  • the catalyzed alkaline phosphatase dephosphorylation of LPS eliminates its pro-inflammatory activity and thereby protects the body from the development of various inflammatory and autoimmune diseases (Park, Lee, 2013).
  • alkaline phosphatase in the form of a pure protein, previously purified from foreign proteins and other impurities.
  • Such alkaline phosphatase was administered to animals or humans (in clinical trials) in the form of a pure protein or in the form of a pharmaceutical composition comprising purified alkaline phosphatase and various auxiliary substances.
  • alkaline phosphatase was obtained in various ways, including: the isolation of alkaline phosphatase from the intestinal mucosa of a bull; the allocation of alkaline phosphatase from the placenta of mammals; obtaining recombinant human alkaline phosphatase by culturing in mammalian cells, followed by isolation and purification.
  • a common feature of the known methods is the production of alkaline phosphatase in the form of pure protein, which leads to a number of disadvantages listed below, and virtually eliminates the possibility of its use as a food product or as part of food products.
  • alkaline phosphatase isolated from the intestines or other organs of mammals is the foreignness of the protein to humans (due to genetic differences). Therefore, its use in humans can cause sensitization and development of dangerous allergic reactions with repeated use.
  • the content of alkaline phosphatase in animal tissues is insignificant, which makes the process of isolation and purification of the enzyme more expensive. It is also necessary to take into account the risk of human infection with prions and pathogenic microorganisms of animals. Reliable cleaning of similar products from them leads to a tenfold increase in the price of products and sharply limits the possibility of their practical use for economic reasons.
  • a common disadvantage of the described methods for producing alkaline phosphatase in the form of pure protein is the high cost of the final product (up to 1000-2000 USD per 1 package), due to the complexity of the process of isolation, purification and quality control of the protein. This virtually eliminates the possibility of using alkaline phosphatase for prophylactic and therapeutic purposes as a food product.
  • alkaline phosphatase in the form of a pure protein is the high sensitivity of alkaline phosphatase to external conditions, such as temperature, pH (acidity) of the medium.
  • alkaline phosphatase is completely inactivated when it enters the acidic environment of the stomach. This excludes the possibility of using such alkaline phosphatase in food products or requires the creation of complex dosage forms that are resistant to the acidic environment of the stomach.
  • alkaline phosphatase do not allow the use of alkaline phosphatase as an affordable product of mass application to maintain normal intestinal microflora and the body’s immune system, as well as preventing the development of inflammatory and autoimmune diseases associated with impaired gastrointestinal homeostasis. Therefore, the possibility of using alkaline phosphatase in the form of pure protein or as a mixture with standard pharmaceutical ingredients for modulating the microflora of the gastrointestinal tract described in the prototype (US20110206654 dated 08/25/2011) is limited by the disadvantages described above and cannot be practically implemented as a food product or component food product.
  • the problem to which the invention is directed is to create a method for producing a new effective, safe and affordable food product containing alkaline phosphatase to maintain normal intestinal microflora and immune body systems, as well as for the prevention of inflammatory and autoimmune diseases associated with impaired gastrointestinal homeostasis.
  • the problem is solved by obtaining a food product in which recombinant human alkaline phosphatase is a part of plant cells.
  • Plant cells containing alkaline phosphatase (unlike the prototype where purified alkaline phosphatase is used) provide natural protection of alkaline phosphatase from inactivation in an aggressive acidic environment of the stomach and its delivery to the intestine, where alkaline phosphatase fulfills its function - dephosphorylates (inactivates) bacterial endotoxins produced by pathogenic microflora Gastrointestinal tract.
  • a food product containing alkaline phosphatase provides: maintaining the normal microflora of the gastrointestinal tract and the body's immune system, preventing violations of the normal microflora of the gastrointestinal tract and the body's immune system, restoring the normal microflora of the gastrointestinal tract and the body's immune system during toxic and stressful effects, as well as preventing the development of inflammatory and autoimmune diseases.
  • Plant cells with recombinant human alkaline phosphatase contained in the food product are safe food for humans, which do not cause sensitization and the development of dangerous allergic reactions when reused, and also cannot cause human infection with prions and pathogenic microorganisms of animals (unlike alkaline phosphatase isolated from animal organs).
  • a food product based on plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase is not only safer, but also 2-3 orders of magnitude cheaper than preparations based on purified recombinant human alkaline phosphatase obtained from mammalian cells. This allows it to be used precisely as a food product for the mass prevention of disorders of the gastrointestinal microflora and the body’s immune system, as well as the prevention of the development of inflammatory and autoimmune intestinal diseases in the general population.
  • a method of obtaining a food product based on plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase includes the creation of a plant expression vector with the human alkaline phosphatase gene, embedding a plant expression vector with the human alkaline phosphatase gene in agrobacterial strains, production of callus plant cells, the implementation of agrobacterial transformation of callus cells with using agrobacterial strains, and the food product is obtained by growing in suspension ion transformed callus culture of plant cells with a gene of human alkaline phosphatase.
  • Another variant of the method for producing a food product based on plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase involves the creation of a plant expression vector with the human alkaline phosphatase gene, embedding a plant expression vector with the human alkaline phosphatase gene in agrobacterial strains, production of callus plant cells, the implementation of agrobacterial transformation of callus cells using agrobacterial strains, and obtaining somatic embryoids and h transformed callus cells, and the food product is obtained by growing in suspension culture somatic embryoids with the human alkaline phosphatase gene.
  • Somatic embryoids In the process of growing somatic embryoids, the development of embryoids is synchronized by filtration through sieves of different sizes, centrifugation, automatic separation or other synchronization methods. Somatic embryoids are grown in a liquid nutrient medium with the addition of substances that increase the osmotic pressure. The optimal concentration of such substances is up to 10%. As substances that increase the osmotic pressure, polyethylene glycol, mannitol and other substances that increase the osmotic pressure are used.
  • Tissue-specific alkaline phosphatases for example, intestinal and placental, or tissue-non-specific alkaline phosphatases or other alkaline phosphatase isoforms are used as recombinant human alkaline phosphatase.
  • the transformed callus cells or somatic embryoids grown in suspension culture are dried and used as a food product, for example, in the form of capsules, tablets, sachets and other prepared forms, or added to other food products.
  • the resulting food product is used to regulate the microflora of the gastrointestinal tract; for the prevention of disorders of the body's immune system and the restoration of the immune system in case of violations as an immunomodulating agent.
  • plants can be used any plants suitable for food and for recombinant proteins, including, but not limited to: carrots (Daucus carotd), lettuce (Latuca sativa), Chinese cabbage (Brassica pekinensis), white cabbage (Brassica oleracea), dill (Anethum graveolens), celery (Apium graveolens), cucumber (Cucisis sativus), pumpkin (Cucurbita pepo), stevia (Stevia rebaudiana), tobacco (Nicotiana tabacum), rice (Oryza sativa), alfalfa (Medicago sativa), tomato (Solanum lycopersicum) and other plants.
  • carrots Digicus carotd
  • lettuce Latuca sativa
  • Chinese cabbage Brassica pekinensis
  • white cabbage Brassica oleracea
  • dill Anethum graveolens
  • celery Apium graveolens
  • cucumber
  • Plants can be used in their entirety or in the form of their components, including, but not limited to: cells, embryoids, leaves, stems and other constituents. Plants or their components containing recombinant human alkaline phosphatase can be used for food in whole or in crushed (up to separation into separate cells) form, both in natural and dried form, using various drying methods or without her.
  • the food product may contain tissue-specific alkaline phosphatase, for example, intestinal and placental, or tissue-specific alkaline phosphatase or other human alkaline phosphatase.
  • the first variant of the method includes the following technological steps: creating a plant expression vector with a human alkaline phosphatase gene, embedding a plant expression vector with a human alkaline phosphatase gene in agrobacterial strains, obtaining callus plant cells, and performing an agrobacterial transformation of callus cells.
  • the food product is obtained by growing in a suspension culture of transformed callus plant cells with the human alkaline phosphatase gene.
  • the second variant of the method includes the following technological steps: creating a plant expression vector with the human alkaline phosphatase gene, embedding a plant expression vector with the human alkaline phosphatase gene in agrobacterial strains, obtaining callus plant cells and performing agrobacterial transformation of callus cells, obtaining somatic embryoids from transformed callus cells.
  • the food product is obtained by growing in suspension culture somatic embryoids with the human alkaline phosphatase gene.
  • Plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase can also be used to produce and grow plants.
  • the resulting plant biomass can be used as raw material for obtaining a food product based on plant cells containing recombinant human alkaline phosphatase.
  • nucleotide sequence of the recombinant human alkaline phosphatase gene (ALP) of 1587 nucleotide pairs was synthesized in full accordance with the nucleotide sequence of the native human alkaline phosphatase gene mRNA (Homo sapiens alkaline phosphatase, intestinal (ALPI), Sequence ID: NM_00l63l.4).
  • the sequence of the Bgill restriction site was introduced into the sequence of the recombinant alkaline phosphatase gene at the 5 'end to the translation initiation site (atg), and the sequence including the Xba ⁇ restriction site ((3) end after the stop codon (tga) atctagaat).
  • the nucleotide sequence of the recombinant alkaline phosphatase gene of 1602 pairs of nucleotides containing the sequence of the restriction sites Bgl II and Xbal was inserted into the pAL-T vector plasmid and designated as pAL-T-alkaline phosphatase.
  • the nucleotide sequence of the alkaline phosphatase gene of 1600 nucleotide pairs was excised from the plasmid pAL-T-alkaline phosphatase at the BgBl and Xbal restriction sites and ligated into the previously created plasmid p35S-NLS-recA- / zcBM3 [1], previously hydrolyzed at the restriction sites of Wat and Xbal, s obtaining plasmid p358-ALP, in which the recombinant gene AL is under the control of the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus [2]. The accuracy of the assembly of the p358-AL genetic construct was verified by sequencing.
  • LB containing tryptone - 10 g, yeast extract - 5 g, sodium chloride - 5 g and bacto-agar - 15 g.
  • the medium was autoclaved under standard conditions of 15-20 min After cooling to 65 ° C, antibiotics were added: for strain AGL0, kanamycin and rifampicin - each to a final concentration of 100 mg / l; for strain GV3101 - kanamycin and rifampicin - each to a final concentration of 100 mg / l and gentamicin to a final concentration of 25 mg / l.
  • callus cells of plants were placed on sterile filter paper in Petri dishes and 10-25 ⁇ l of the “nocturnal” culture of agrobacteria of AGL0 strains were applied to each transplant. and GV3101 with the alkaline phosphatase gene.
  • Callus after application of a culture of agrobacteria, was slightly dried and transferred into test tubes on an MSM culture medium with 0.2 mg / L 2,4D. After 3 days, the calli were transferred onto an agar medium of the same composition supplemented with 500 mg / l cefotaxime and 100 mg / l kanamycin. Cultivated for 10 days in the dark at a temperature of 22-24 ° C.
  • callus cells were transferred to the MSM culture medium with 0.2 mg / L 2,4D with 200 mg / L cefotaxime.
  • Callus tissue can be maintained in culture for an unlimited time, periodically dividing it into fragments and transplanting to a new environment.
  • the ability of alkaline phosphatase to dephosphorylate p-nitrophenyl phosphate was used, with the formation of yellow-colored paranitrophenol.
  • callus cells with the human alkaline phosphatase gene were grown in suspension culture on a liquid nutrient medium of the same composition without agar.
  • somatic embryoids were obtained, which were then grown in suspension culture.
  • somatic embryoids a suspension of callus cells was cultured in an MSM liquid nutrient medium containing 0.2 mg / L IAA (indolylacetic acid) and kinetin.
  • the embryogenic suspensions thus obtained contained various pre-embryonic structures, as well as individual non-embryogenic cells and groups of cells.
  • the suspension culture was passed through nylon sieves with a mesh size of 120 ⁇ m, and then through 50 ⁇ m. The mass of cells that remained on the second sieve was transferred to fresh medium for embryoid formation. On average, up to 70 thousand embryos were obtained in 1 liter of medium.
  • Plant cells for example, carrots with the human alkaline phosphatase gene, were dried using freeze drying at -55 ° C, followed by drying at 20, 30, 40, 50, and 60 ° C. Dry biomass (weighed about 1 g) was triturated with 10 ml of a buffer solution containing 5 mM Tris-HCl, 0.1 mM magnesium chloride, 0.1 mM zinc chloride, centrifuged at 100 g for 30 minutes. The supernatant was tested for the dephosphorylating ability of alkaline phosphatase when 20 mM pNPP (p-nitrophenyl phosphate) was added to the solution. The reaction mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes to develop color with the reaction product. To stop the reaction, 2 ml of chilled 0.5 M NaOH was used. The unit of activity was taken as the amount of enzyme necessary for the formation of 1 ⁇ m pNF. Specific activity was calculated in units per gram of carrot cells.
  • Table 2 the activity of alkaline phosphatase biomass of carrot cells in various drying modes
  • Table 5 shows that the best explant for obtaining embryogenic callus is zygotic embryos.
  • grown callus cells or somatic plant embryoids with the human alkaline phosphatase gene can be dried by any suitable means.
  • the resulting food product based on plants containing human alkaline phosphatase can be used for oral administration in dosage forms, including, but not limited to, in the form of capsules, tablets, sachets and other finished forms.
  • the resulting food product based on plants containing human alkaline phosphatase can be used as a component of food products for mass consumption, for example, dairy products, drinks, confectionery products, as well as as part of medical-dietary, medical-prophylactic products, functional food products.
  • the resulting product based on plant callus cells and somatic embryoids containing human alkaline phosphatase can be used to maintain health, including to maintain gastrointestinal tract (GIT) homeostasis, and to prevent diseases associated with gastrointestinal tract homeostasis.
  • GIT gastrointestinal tract
  • this product can be used:
  • the resulting food product based on plants containing human alkaline phosphatase can be used both by healthy people and people suffering from various inflammatory and autoimmune diseases, including intestinal diseases (ulcerative colitis, Crohn’s disease, enterocolitis), arthritis, eczema and other systemic diseases associated with with increased permeability of the intestinal wall.
  • intestinal diseases including intestinal colitis, Crohn’s disease, enterocolitis
  • arthritis eczema
  • the resulting food product can be used by individuals who are obese and have various cosmetic problems.
  • Example 1 Obtaining a food product based on carrots containing human alkaline phosphatase
  • the nucleotide sequence of 1587 pairs of nucleotides was synthesized in full accordance with the nucleotide sequence of the native alkaline alkaline phosphatase gene mRNA.
  • the sequence of the Bglll restriction site (agatct) was introduced at the 5 'end to the translation initiation site (atg) into the recombinant alkaline phosphatase gene sequence, and the sequence of the Xbal restriction site (atctagaat) at the 3'-end after the stop codon (tga).
  • the resulting nucleotide sequence of 1602 pairs of nucleotides was cloned into the pAL-T vector plasmid. Further, from the resulting plasmid pAL- T-ALPs cut the nucleotide sequence of 1600 nucleotide pairs at the BglU nXbal restriction sites and ligated into the previously created plasmid p35S-NLS-recA- / g ' cMBP to obtain the plasmid p35B-ALP, in which the recombinant gene AL is controlled by the 35S promoter of the mosaic virus cauliflower. The accuracy of the assembly of the p35B-ALP genetic construct was verified by sequencing.
  • An agrobacterial strain with the human ALP gene AGL0 r35B-ALF was obtained using Escherichia coli cells with plasmid rZbB-ALF as donors, as an intermediary for the conjugative transfer of E. coli cells of strain HB101 pRK20l3, and as an acceptor of Agrobacterium tumefaciens cells of strain AGL.
  • callus cells from zygotic embryos of carrot seeds were used, which were prepared as follows: carrot seeds were sterilized in a 50% aqueous solution of the Belizna chlorine preparation with Tween-20 (1 drop per 100 ml of solution), then they were washed three times with in sterile distilled water; then, from sterilized seeds under sterile conditions, embryos were isolated, which were transferred into tubes on an MSM growth medium with growth regulators 2,4-D and kinetin; the tubes were placed in a thermostat and incubated at 23 ° C in the dark until a callus formed.
  • Agrobacteria of strain AGL0 were expanded as follows: in a laminar box, using a sterile microbiological loop, a separate bacterial colony from a fresh culture with selective antibiotics was applied to a test tube containing 3 ml of sterile liquid LB medium of the composition described above; Further, agrobacteria increased 24-48 hours at 28 ° C on a thermostatically controlled rocking chair with circular rotation (amplitude 5-10 cm and speed 150-200 rpm).
  • carrot callus cells were carried out as follows: in a laminar box, carrot calli from zygotic embryos were placed on sterile filter paper in Petri dishes; then, 10-25 ⁇ l of an overnight culture of agrobacteria of strain AGL0 with the AP gene was applied to each transplant; then the calli were slightly dried and transferred into tubes on an MSM culture medium with 0.2-0.5 mg / L 2,4D; after 3 days, the calli were transferred to an agar medium of the same composition, supplemented with 500 mg / l of the cefotaxime antibiotic; calli were cultured for 10 days in the dark at a temperature of 22-24 ° C.
  • callus cells of carrots with the human alkaline phosphatase gene were washed from the nutrient medium with distilled water and subjected to freeze drying at a temperature of -55 ° C; in the dried mass, the activity of alkaline phosphatase was determined by the ability to dephosphorylate p-nitrophenyl phosphate; the dried mass was packaged in sachets.
  • the resulting food product was used to maintain normal microflora of the gastrointestinal tract and maintain the normal state of the body's immune system, adding 0.5-1 packet of sachets per person per day to dairy products or drinks.
  • Example 2 Obtaining a food product based on stevia containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was obtained as described in Example 1, but Stevia (Stevia rebaudiana) was used as the plant, and somatic embryogenesis technology was used to grow cells containing alkaline phosphatase.
  • Stevia Stevia rebaudiana
  • somatic embryogenesis technology was used to grow cells containing alkaline phosphatase.
  • the cell suspension was cultured in an MSM liquid nutrient medium containing 0.2 mg / L indolylacetic acid and kinetin; then, to obtain a homogeneous population of embryoids, a suspension culture was passed through nylon sieves with a mesh size of 120 ⁇ m, and then through 50 ⁇ m; the cell mass obtained on the second sieve was transferred to fresh medium for embryoid formation. On average, up to 70 thousand embryoids can be obtained in 1 liter of medium.
  • the resulting food product was used to restore the body’s immune system in case of its violations, adding to food products or drinks that are not subjected to heat treatment (heating) above 40 ° C, calculated at 0.5-1 packet of sachets per person per day.
  • Example 3 Obtaining a food product based on a salad containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was obtained as described in example 1, but lettuce (Latuca sativa) was used as a plant, the secretory alkaline alkaline gene of the human was cloned into the plant expression vector, and strain GV3101 p35B-alkaline phosphatase was used as an agrobacterial strain obtained by using Escherichia coli cells with plasmid p35S-ALP as donors, as an intermediary for conjugative transfer of E. coli cells of strain HB101 pRK20l3, and as an acceptor of Agrobacterium tumefaciens cells of strain GV3101.
  • the resulting food product was used to reduce the effects of intoxication, including those associated with food poisoning, intestinal infections or taking medications, using 1-2 packets of sachet orally per person per day for 7-10 days.
  • Example 4 Obtaining a food product based on Chinese cabbage containing human alkaline phosphatase.
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was prepared and used similarly to that described in Example 1, but Chinese cabbage (Brassica pekinensis) was used as a plant, and MS culture medium with the addition of 0.1 -1 was used to obtain and grow callus cells , 0 mg / l 2,4D.
  • the resulting food product was used to prevent negative side effects associated with the use of antibacterial drugs, using 1 packet of sachet orally per person per day for 7-10 days.
  • Example 5 Obtaining a food product based on white cabbage containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was prepared and used as described in Example 4, but white cabbage (Brassica oleracea) was used as a plant, and the human placental alkaline phosphatase gene was cloned into the plant expression vector.
  • the resulting food product was used by volunteers to prevent negative side effects associated with taking antibiotics, using 1 packet of sachet orally per person per day for 7-10 days.
  • Example 6 Obtaining a food product based on dill containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was obtained as described in Example 1, but dill (Anethum graveolens) was used as a plant, and dill cells with the human alkaline alkaline gene were lyophilized to produce a finished food product, followed by drying at temperatures up to +30 ° C.
  • the resulting food product was used to prevent disorders of the gastrointestinal tract and the body’s immune system associated with the negative influence of stress factors, using 0.5-1 packets of sachet orally per person per day for 7-10 days.
  • Example 7 Obtaining a food product based on celery containing human alkaline phosphatase A plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was obtained as described in Example 1, but celery (Apium graveolens) was used as a plant, and dill cells with the human alkaline phosphatase gene were lyophilized to prepare the finished food product, followed by drying at a temperature of + 30 ° C to 40 ° C.
  • the resulting food product was used to prevent disorders of the digestive tract and the body’s immune system associated with the negative influence of stress factors, adding 0.5-1 packet of sachets per person to foods or drinks of everyday use (at food temperatures not exceeding 40 ° C) per day.
  • Example 8 Obtaining a food product based on a cucumber containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was prepared and used similarly to that described in Example 1, but cucumber (Cucumis sativus) was used as a plant, and B-5 culture medium with 0.1 - 1.0 mg / L 2.4D.
  • Example 9 Obtaining a food product based on pumpkin containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was obtained as described in Example 1, but pumpkin (Cucurbita rero) was used as the plant, and to obtain the finished food product, pumpkin cells with the human alkaline phosphatase gene were mixed with excipients and packaged in gelatin capsules .
  • the resulting food product was used to prevent negative side effects associated with taking antibacterial drugs, taking 2 capsules per person per day for 7-10 days.
  • Example 10 Obtaining a food product based on rice containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was obtained as described in Example 10, but rice (Oryza sativa) was used as the plant, and spray drying was used to obtain the finished food product, which was carried out at a temperature not exceeding + 50 ° ⁇ to prevent protein denaturation.
  • Example 11 Obtaining a food product based on alfalfa containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was prepared and used as described in Example 2, but alfalfa (Medicago sativa) was used as a plant, and embryoid development was synchronized to optimize alkaline phosphatase content (by filtration through sieves, centrifugation and automatic separation) and used the embryoid growth mode in a liquid nutrient medium with the addition of PEG, mannitol or other substances that increase the osmotic pressure.
  • Example 12 Obtaining a food product based on tomato containing human alkaline phosphatase
  • a plant-based food product containing recombinant human alkaline phosphatase was obtained as described in Example 1, but a tomato (Solarium lycopersicum) was used as a plant, and to obtain a finished food product, tomato cells were dried to a moisture content of 4-8% at 40 ° C and covered with polymers carboxymethyl cellulose, sodium alginate to form microcapsules / pellets, which were Packed in sachets or gelatin capsules.
  • the resulting food product was used to prevent violations of the normal microflora of the gastrointestinal tract and the state of the body's immune system, adding 0.5-1 packet of sachets with microcapsules / pellets per person per day to foods or drinks of everyday use.
  • Example 13 Recovery using carrot cells containing the gene for human alkaline phosphatase, indicators of immunity, impaired under the influence of lipopolysaccharide
  • Immune system disorders associated with impaired intestinal homeostasis were modeled by intragastric administration of a CD-1 lipopolysaccharide of E. coli (Sigma-Aldrich) to mice.
  • a CD-1 lipopolysaccharide of E. coli Sigma-Aldrich
  • Example 14 The restoration of intestinal microflora after antibiotic therapy with streptomycin when feeding mice with carrot cells containing the human intestinal alkaline phosphatase gene.
  • a study of the ability of carrots containing the human intestinal alkaline phosphatase gene to restore intestinal microflora impaired after antibiotic therapy was performed on CD-1 runoff mice.
  • One group of animals was injected intragastrically with the antibiotic streptomycin at a dose of 200 mg / kg once; the second group - intragastrically streptomycin 200 mg / kg, once and lyophilized dried carrot cells containing the human intestinal alkaline phosphatase gene, 100 mg / kg; the third group - intragastric streptomycin 200 mg / kg and the Linex probiotic preparation containing lyophilized lactic acid bacteria (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis, Enterococcus faecium), at a dose of 100 mg (capsule weight) / kg.
  • mice treated with streptomycin bacterial growth was stopped 24 hours after taking the drug.
  • the feces of animals of this group remained sterile for 8 days and began to recover on the 9th day.
  • mice treated with streptomycin along with carrot cells containing the human intestinal alkaline phosphatase gene microflora began to recover after 4 days.
  • microflora recovery began only on the 8th day.
  • Example 15 Carrot cells containing the human intestinal alkaline phosphatase gene accelerate the restoration of intestinal microflora after antibiotic therapy with ampicillin
  • mice of the first group for 7 days received intragastrically at 50 mg / kg per day antibiotic ampicillin.
  • Animals of the second group at the same time taking the antibiotic received freeze-dried carrot cells containing the gene for human intestinal alkaline phosphatase in a dose of 50 mg / kg per day.
  • the animals of the third group simultaneously with the antibiotic received a comparison drug - the Linex probiotic containing lyophilized lactic acid bacteria (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis, Enterococcus faecium), at a dose of 50 mg (capsule weight) / kg per day. Every day for 3 weeks, sowing feces of mice of each group were performed on LB medium. The results are presented in table 7.
  • Table 7 The content of bacteria in feces in mice treated with ampicillin and mice treated with ampicillin and freeze-dried carrot cells with the human intestinal alkaline phosphatase gene
  • mice treated with the antibiotic ampicillin stopped 24 hours after the start of treatment.
  • normal intestinal microflora began to recover only on the 20th day of the experiment.
  • mice that took carrot cells containing the gene for human intestinal alkaline phosphatase at the same time as ampicillin normal intestinal microflora began to recover already on the 11th day of the experiment.
  • the comparison drug - Linex probiotic, microflora recovery began only on the 18th day.
  • the claimed invention can find wide application as components of food products for mass consumption, for example, dairy products, drinks, confectionery products, as well as in the composition of medical and dietary, therapeutic and prophylactic products, functional food products.
  • Information sources for example, dairy products, drinks, confectionery products, as well as in the composition of medical and dietary, therapeutic and prophylactic products, functional food products.
  • Intestinal alkaline phosphatase prevents the systemic inflammatory response associated with necrotizing enterocolitis // J Surg Res. 2013 .-- Vol. 180. - P. 21-26. http: //dx.d0i.0rg/l 0.1016 / j.jss.2012.10.0.042.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)

Abstract

Изобретение относится к пищевой промышленности и медицине и касается способов получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную человеческую фосфотазу. Способ включает создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфотазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфотазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток, осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток с помощью агробактериальных штаммов, получение соматических эмбриодов из трансформированных каллусных клеток и выращивание в суспензионной культуре соматических эмбриодов с геном человеческой щелочной фосфотазы. Изобретение направлено на регуляцию микрофлоры желудочно-кишечного тракта, профилактику и восстановление иммунной системы организма.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к пищевой промышленности и медицине и касается способа получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную человеческую щелочную фосфатазу, и их применения для поддержания гомеостаза желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
Предшествующий уровень техники
Известно, что кишечник является важным барьерным органом, состоящим из нормальной (синантропной) микрофлоры, слизистого слоя, эпителия и субэпителиальной иммунной системы. Основная функция кишечного барьера состоит в защите организма от бактериальной транслокации в системный кровоток. Нормальная микрофлора способна находиться в просвете кишечника без стимуляции иммунного ответа хозяина, однако эти же бактерии вызывают иммунный ответ и воспаление, если они транслоцируются через кишечный барьер в кровоток и попадают в другие органы. Нарушение кишечного барьера приводит к развитию гипертрофированного иммунного ответа на компоненты синантропных бактерий и как следствие - к развитию хронических воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), таких как болезнь Крона, неспецифический язвенный колит (Podolsky, 2010). В индукцию этих нарушений значительный вклад вносит стресс, инфекции, старение, токсическое действие ксенобиотиков, в том числе лекарственных средств (Cadwell et al., 2010).
В настоящее время единственными доступными средствами поддержания гомеостаза желудочно-кишечного тракта, в том числе регуляции микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма, являются препараты и продукты на основе пробиотиков - живых культур микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры кишечника. Однако, убедительных доказательств клинической эффективности таких продуктов нет. Более того, вносимая извне микрофлора не приживается в организме человека, а отторгается собственной микрофлорой. Кроме этого, пробиотики - это преимущественно 2 вида бактерий - лакто- и бифидобактерии, а микрофлора человека включает в себя более 300 видов бактерий. Поэтому после прекращения приема пробиотиков, как правило, возвращаются исходные нарушения гомеостаза ЖКТ. В то же время перспективны новые способы регуляции гомеостаза ЖКТ, основанные на применении фермента щелочная фосфатаза (ЩФ). Дело в том, что нарушения микрофлоры, состояния иммунной системы и барьерной функции кишечника, а также развитие ВЗК в значительной степени инициируются индукторами воспаления, которые являются физиологическими субстратами фермента ЩФ. Наиболее мощными индукторами воспаления являются: 1) липополисахариды (ЛПС) - бактериальные эндотоксины E.coli и других грамотрицательных бактерий; 2) внеклеточная АТФ и другие нуклеотиды и нуклеозиды. ЛПС, который постоянно высвобождается кишечной микрофлорой, попадает в кровь при нарушении кишечного барьера и даже в минимальных концентрациях на уровне нг/кг вызывает воспалительную реакцию. ЛПС при этом связывается с мембранным белком CD 14 на поверхности макрофагов, вызывая их активацию, что приводит к выделению десятков биологически активных веществ: простагландинов, оксида азота и цитокинов, включая интерлейкины и TNFa (Nathan, 1987). Именно ЛПС и внеклеточная АТФ представляют собой важнейшие факторы формирования системного иммунного и воспалительного ответа на сигналы“чужой” и“опасность” (Matzinger, 2002).
Кишечная ЩФ, которая вырабатывается клетками слизистой кишечника, играет важную роль в кишечном гомеостазе именно через инактивацию (детоксикацию) ЛПС и предотвращение транслокации ЛПС, регуляцию кишечной микрофлоры и pH поверхности кишечника, (Eskandari et al., 1999; Weemaes et al., 2002; Riggle et al., 2013; Tuin et al., 2009). Катализируемое ЩФ дефосфорилирование ЛПС устраняет его провоспалительную активность и тем самым защищает организм от развития различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний (Park, Lee, 2013).
Нарушение нормального уровня (активности) кишечной ЩФ за счет снижения экспрессии генов, кодирующих ЩФ, отмечено при воспалительных заболеваниях кишечника, целиакии, а также при ожирении. Пероральное введение ЩФ у мышей с колитом снижает уровень mRNK провоспалительного цитокина TNFa и оксида азота (Muginova et al., 2007). Molnar с коллегами (2012) показали, что уровень ЩФ в воспаленной слизистой оболочке кишечника детей с болезнью Крона и неспецифическим язвенным колитом достоверно понижен по сравнению с контрольной группой. Введение экзогенной ЩФ пациентам с активной формой воспаления кишечника может предупреждать обострение. В другом исследовании показано, что при введении экзогенной ЩФ снижалось воспаление кишечника у новорожденных животных; и сделано предположение, что ЩФ можно использовать для профилактики воспалительных заболеваний у новорожденных (Biesterveld et al., 2015). В уровне техники известны следующие патенты и патентные заявки, описывающие применение ЩФ для коррекции микрофлоры кишечника, активности иммунной системы, а также для профилактики и лечения различных заболеваний: US20130280232 от 24.10.2013 «Применение щелочной фосфатазы для детоксикации ЛПС, присутствующих в слизистых барьерах» («Use of alkaline phosphatase for the detoxification of LPS present at mucosal barriers»), US20110206654 от 25.08.2011 «Способ модулирования микрофлоры желудочно- кишечного тракта с помощью щелочной фосфатазы» («Methods of Modulating Gastrointestinal Tract Flora Levels with Alkaline Phosphatase»), US20130022591 от 24.01.2013 «Способ снижения ингибирующих токсических эффектов, связанных с бактериальной инфекцией, с использованием щелочной фосфатазы» («Methods of Reducing or Inhibiting Toxic Effects Associated with a Bacterial Infection Using Alkaline Phosphatase”), US8574863 от 05.11.2013 «Щелочная фосфатаза для лечения воспалительных заболеваний желудочно- кишечного тракта» («Alkaline phosphatase for treating an inflammatory disease of the gastro- intestinal tract»).
Наиболее близким к заявляемому способу получения пищевого продукта является способ по патентной заявке US20110206654 от 25.08.2011 «Способ модулирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта с помощью щелочной фосфатазы» («Methods of Modulating Gastrointestinal Tract Flora Levels with Alkaline Phosphatase»), описывающей возможность применения ЩФ для регуляции микрофлоры ЖКТ, в том числе - для защиты и восстановления нормальной микрофлоры на фоне применения антибиотиков. В прототипе и других опубликованных источниках, касающихся применения ЩФ, авторы использовали ЩФ в виде чистого белка, предварительно очищенного от посторонних белков и иных примесей. Такую ЩФ вводили животным или людям (при клинических испытаниях) в виде чистого белка или в виде фармацевтической композиции, включающей очищенную ЩФ и различные вспомогательные вещества. Очищенную ЩФ получали различными способами, включающими: выделение ЩФ из слизистой кишечника быка; выделение ЩФ из плаценты млекопитающих; получение рекомбинантной человеческой ЩФ культивированием в клетках млекопитающих с последующим выделением и очисткой. Общим признаком известных способов является получение ЩФ в виде чистого белка, что обуславливает целый ряд недостатков, указанных ниже, и практически исключает возможность его применения в качестве пищевого продукта или в составе пищевых продуктов.
Важнейшим недостатком ЩФ, выделенной из кишечника или иных органов млекопитающих, является чужеродность белка для человека (обусловленная генетическими различиями). Поэтому его применение у людей может вызвать сенсибилизацию и развитие опасных аллергических реакций при повторном применении. Кроме этого, содержание ЩФ в тканях животных незначительное, что удорожает процесс выделения и очистки фермента. Также необходимо учитывать риск заражения человека прионами и патогенными микроорганизмами животных. Надежная очистка от них подобных продуктов приводит к удорожанию продуктов в десятки раз и резко ограничивает возможность их практического применения по экономическим соображениям.
Получение рекомбинантной ЩФ человека в клеточных системах млекопитающих in vitro имеет свои недостатки, среди которых: ограниченная масштабируемость процесса, высокая себестоимость и риск заражения патогенами человека.
Общим недостатком описанных способов получения ЩФ в виде чистого белка является высокая стоимость конечного продукта (до 1000-2000 USD за 1 упаковку), обусловленная сложностью процесса выделения, очистки и контроля качества белка. Это практически исключает возможность применения ЩФ с профилактической и лечебной целью как пищевого продукта.
Другим общим недостатком описанных способов получения ЩФ в виде чистого белка является высокая чувствительность ЩФ к внешним условиям, таким как температура, pH (кислотность) среды. Например, ЩФ полностью инактивируется при попадании в кислую среду желудка. Это исключает возможность применения такой ЩФ в составе продуктов питания либо требует создания сложных лекарственных форм, устойчивых к кислой среде желудка.
Перечисленные недостатки получения ЩФ не позволяют применять ЩФ в качестве доступного продукта массового применения для поддержания нормальной микрофлоры кишечника и иммунной системы организма, а также профилактики развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний, связанных с нарушением гомеостаза желудочно-кишечного тракта. Поэтому описанная в прототипе (US20110206654 от 25.08.2011) возможность применения ЩФ в виде чистого белка или в виде его смеси со стандартными фармацевтическими ингредиентами для модулирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта ограничена описанными выше недостатками и не может быть практически реализована в качестве пищевого продукта или компонента пищевого продукта.
Сущность изобретения
Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в создании способа получения нового эффективного, безопасного и доступного пищевого продукта, содержащего ЩФ, для поддержания нормальной микрофлоры кишечника и иммунной системы организма, а также для профилактики развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний, связанных с нарушением гомеостаза желудочно-кишечного тракта.
Поставленная задача решается получением пищевого продукта, в котором рекомбинантная щелочная фосфатаза человека находится в составе растительных клеток. Растительные клетки, содержащие ЩФ (в отличие от прототипа, где используется очищенная ЩФ), обеспечивают естественную защиту ЩФ от инактивации в агрессивной кислой среде желудка и ее доставку в кишечник, где ЩФ выполняет свою функцию - дефосфорилирует (инактивирует) бактериальные эндотоксины, вырабатываемые патогенной микрофлорой ЖКТ. Тем самым пищевой продукт, содержащий ЩФ, обеспечивает: поддержание нормальной микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма, профилактику нарушений нормальной микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма, восстановление нормальной микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма при токсических и стрессовых воздействиях, а также профилактику развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Находящиеся в составе пищевого продукта растительные клетки с рекомбинантной ЩФ человека являются безопасными продуктами питания для человека, которые не вызывают сенсибилизацию и развитие опасных аллергических реакций при повторном применении, а также не могут вызвать заражение человека прионами и патогенными микроорганизмами животных (в отличие от ЩФ, выделенной из органов животных). Наконец, пищевой продукт на основе растительных клеток, содержащих рекомбинантную ЩФ человека, не только безопаснее, но и на 2-3 порядка дешевле препаратов на основе очищенной рекомбинантной ЩФ человека, полученной из клеток млекопитающих. Это позволяет его применять именно как пищевой продукт для массовой профилактики нарушений микрофлоры ЖКТ и иммунной системы организма, а также профилактики развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний кишечника у широких слоев населения.
Способ получения пищевого продукта на основе растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, включает создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток, осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток с помощью агробактериальных штаммов, а пищевой продукт получают путем выращивания в суспензионной культуре трансформированных каллусных клеток растений с геном человеческой щелочной фосфатазы. Другой вариант способа получения пищевого продукта на основе растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, включает создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток, осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток с помощью агробактериальных штаммов, и получение соматических эмбриоидов из трансформированных каллусных клеток, а пищевой продукт получают путем выращивания в суспензионной культуре соматических эмбриоидов с геном человеческой щелочной фосфатазы.
В процессе выращивания соматических эмбриоидов проводят синхронизацию развития эмбриоидов с помощью фильтрации через сита разного размера, центрифугирования, автоматического сепарирования или иным способом синхронизации. Соматические эмбриоиды выращивают в жидкой питательной среде с добавлением веществ, повышающих осмотическое давление. Оптимальная концентрация таких веществ - до 10%. В качестве веществ, повышающих осмотическое давление, используют полиэтиленгликоль, маннитол и другие повышающие осмотическое давление вещества.
В качестве рекомбинантной человеческой щелочной фосфатазы используют ткане- специфические щелочные фосфатазы, например, кишечную и плацентарную, или ткане- неспецифические щелочные фосфатазы или иные изоформы щелочных фосфатаз.
Выращенные в суспензионной культуре трансформированные каллусные клетки или соматические эмбриоиды высушивают и используют в качестве пищевого продукта, например, в виде капсул, таблеток, пакетов саше и в иных готовых формах, или добавляя в другие пищевые продукты.
Полученный пищевой продукт используют для регуляции микрофлоры желудочно- кишечного тракта; для профилактики нарушений иммунной системы организма и восстановления иммунной системы при ее нарушениях в качестве иммуномодулирующего средства.
Известно, что растительные продуценты считаются наиболее перспективными для производства высококачественных, безопасных и относительно недорогих белков (Conley et al., 2011; Sharma, Sharma, 2009; Sabalza et al., 2014). Мы использовали преимущества растительных продуцентов для создания совершенно нового продукта, который представляет собой не ЩФ в чистом виде или в составе композиций веществ, а растения, содержащие рекомбинантную щелочную фосфатазу человека. В качестве таких растений могут использоваться любые растения, пригодные в пищу и для получения рекомбинантных белков, включая, но не ограничиваясь: морковь ( Daucus carotd), салат ( Latuca sativa), капуста китайская ( Brassica pekinensis ), капуста белокочанная ( Brassica oleracea), укроп ( Anethum graveolens ), сельдерей ( Apium graveolens), огурец ( Cucumis sativus), тыква ( Cucurbita pepo), стевия ( Stevia rebaudiana), табак ( Nicotiana tabacum), рис (Oryza sativa), люцерна ( Medicago sativa), томат ( Solanum lycopersicum) и другие растения. Предпочтительно использовать растения, у которых соматический эмбриогенез возможен не менее, чем в 60% клеток. Растения могут использоваться в цельном виде или в виде их компонентов, включая, но не ограничиваясь: клетки, эмбриоиды, листья, стебли и другие составные части. Растения или их компоненты, содержащие рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, могут использоваться для приема в пищу как в цельном, так и измельченном (вплоть до разделения на отдельные клетки) виде, как в натуральном, так и высушенном виде, с использованием различных способов сушки или без нее. Пищевой продукт может содержать ткане-специфическую щелочную фосфатазу, например, кишечную и плацентарную, или ткане-неспецифическую щелочную фосфатазу или иную щелочную фосфатазу человека.
Заявленный способ (его варианты^) реализуется следующим образом.
Первый вариант способа включает следующие технологические этапы: создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток и осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток. Пищевой продукт получают путем выращивания в суспензионной культуре трансформированных каллусных клеток растений с геном человеческой щелочной фосфатазы.
Второй вариант способа включает следующие технологические этапы: создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток и осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток, получение соматических эмбриоидов из трансформированных каллусных клеток. Пищевой продукт получают путем выращивания в суспензионной культуре соматических эмбриоидов с геном человеческой щелочной фосфатазы.
Растительные клетки, содержащие рекомбинантную человеческую щелочную фосфатазу, могут быть также использованы для получения и выращивания растений. Полученная растительная биомасса может быть использована в качестве сырья для получения пищевого продукта на основе растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека.
Создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной Фосфатазы осуществляли слелуюшим образом.
Нуклеотидную последовательность рекомбинантного гена щелочной фосфатазы человека (ЩФ) размером 1587 пар нуклеотидов синтезировали в полном соответствии с последовательностью нуклеотидов нативной мРНК гена щелочной фосфатазы человека (Homo sapiens alkaline phosphatase, intestinal (ALPI), Sequence ID: NM_00l63l.4). Для удобства клонирования в последовательность рекомбинантного гена ЩФ на 5 '-конце до сайта инициации трансляции (atg) вводили последовательность сайта рестрикции Bgill (agatct), а на 3'- конце после стоп-кодона (tga) последовательность, включающая сайт рестрикции Xba\ (atctagaat). Нуклеотидную последовательность рекомбинантного гена ЩФ размером 1602 пар нуклеотидов, содержащая последовательность сайтов рестрикции Bgl II и Xbal, встраивали в плазмиду pAL-T vector и обозначали как pAL-T-ЩФ. Нуклеотидную последовательность гена ЩФ размером 1600 пар нуклеотидов вырезали из плазмиды pAL- Т-ЩФ по сайтам рестрикции BgBl и Xbal и лигировали в ранее созданную плазмиду p35S- NLS-recA-/zcBM3 [1], предварительно гидролизованную по сайтам рестрикции Ват и Xbal, с получением плазмиды р358-ЩФ, в которой рекомбинатный ген ЩФ находится под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты [2]. Точность сборки генетической конструкции р358-ЩФ верифицировали секвенированием.
Встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной Фосфатазы в агробактериальные штаммы осуществляли следующим образом.
Для встраивания растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы применяли метод «трехродительского скрещивания», где в качестве доноров клетки использовали Escherichia coli с плазмидой р358-ЩФ, в качестве посредника конъюгативного переноса - клетки Е. со И штамма НВ101 pRK20l3, а в качестве акцептора - клетки агробактерии Agrobacterium tumefaciens штаммов GV3101 или AGL0. В результате были получены агробактериальные штаммы с геном человеческой щелочной фосфатазы GV3101 р358-ЩФ и AGL0 р358-ЩФ.
Получение каллусных растительных клеток и осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток.
В стерильных условиях (ламинар-бокс) семена растений стерилизовали в водном растворе коммерческого хлорсодержащего препарата с добавлением Твина-20 (1 капля на 100 мл раствора), затем трехкратно промывали в стерильной дистиллированной воде, в каждой порции по 10 минут. Затем из простерилизованных семян в стерильных условиях выделяли зародыши, которые переносил в пробирки на модифицированную Мурасиге и Скуга питательную среду (МСМ), дополненную регуляторами роста 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) и кинетином. Пробирки помещали в термостат и инкубировали при 23°С в темноте до образования каллуса.
Таблица 1 - Состав модифицированной среды Мурасиге и Скуга (Mutsuda et al., 1981)
Figure imgf000010_0001
В условиях ламинар-бокса с помощью стерильной микробиологической петли наносили отдельные бактериальные колонии из свежей культуры агробактериальных штаммов с геном человеческой щелочной фосфатазы GV3101 р35Б-ЩФ или AGLO p35S- ЩФ в пробирку, содержащую 3 мл стерильной жидкой среды LB с соответствующими для штамма бактерий антибиотиками. Агробактерии наращивали 20-48 часов при температуре 28°С на термостатируемой качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см и скорость 150-200 об /минуту).
Использовали стандартные среды для выращивания агробактерий, например, LB, содержащую (на 1 л): триптон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлористый натрий - 5 г и бакто-агар - 15 г. Среду автоклавировали при стандартных условиях 15-20 мин. После остывания до 65°С добавляли антибиотики: для штамма AGL0 - канамицин и рифампицин - каждого до конечной концентрации 100 мг/л; для штамма GV3101 - канамицин и рифампицин - каждого до конечной концентрации 100 мг/л и гентамицин до конечной концентрации 25 мг/л.
В условиях ламинар-бокса каллусные клетки растений помещали на стерильную фильтровальную бумагу в чашки Петри и наносили на каждый трансплант по 10-25 мкл «ночной» культуры агробактерий штаммов AGL0. и GV3101 с геном щелочной фосфатазы. Каллус после нанесения культуры агробактерий слегка подсушивали и переносили в пробирки на питательную среду МСМ с 0,2 мг/л 2,4Д. Через 3 суток каллусы переносили на агаризованную среду того же состава, дополненную 500 мг/л цефотаксима и 100 мг/л канамицина. Культивировали в течение 10 суток в темноте при температуре 22-24°С. Далее проводили еще 1-2 пассажа на среде этого же состава до появления новых колоний каллусных клеток. Для размножения каллусные клетки переносили на питательную среду МСМ с 0,2 мг/л 2,4Д с 200 мг/л цефотаксима. Каллусную ткань можно поддерживать в культуре неограниченно длительное время, периодически разделяя её на фрагменты и пересаживая на новую среду. Для отбора трансгенных клеток использовали способность щелочной фосфатазы дефосфорилировать п-нитрофенилфосфат, с образованием окрашенного в желтый цвет паранитрофенола. Для наработки необходимого количества пищевого продукта каллусные клетки с геном человеческой ЩФ выращивали в суспензионной культуре на жидкой питательной среде того же состава без агара.
В случае реализации 2-го варианта способа получения пищевого продукта из трансформированных каллусных клеток растений получали соматические эмбриоиды, которые затем выращивали в суспензионной культуре.
Получение соматических эмбриоидов из трансформированных каллусных клеток
Figure imgf000011_0001
Для получения соматических эмбриоидов суспензию каллусных клеток культивировали в жидкой питательной среде МСМ, содержащей 0,2 мг/л ИУК (индолилуксусной кислоты) и кинетина. Полученные таким образом эмбриогенные суспензии содержали различные предзародышевые структуры, а также отдельные неэмбриогенные клетки и группы клеток. Для синхронизации (получения однородной популяции) соматических эмбриоидов суспезионную культуру пропускали через нейлоновые сита с размером ячеек 120 мкм, а затем через 50 мкм. Массу клеток, которая оставалась на втором сите, переносили в свежую среду для формирования эмбриоидов. В среднем в 1 литре среды получали до 70 тыс. зародышей.
Получение высушенного пищевого продукта на основе растительных каллусных клеток или с геном человеческой Каллусные клетки с геном человеческой ЩФ отмывали от остатков питательной среды дистиллированной водой и подвергали лиофильной сушке при температуре -55°С с последующим досушиванием при +30°С, не допуская денатурации белков. В высушенной массе клеток определяли активность щелочной фосфатазы по способности дефосфорилировать п-нитрофенилфосфат. Готовую массу растительных клеток с геном ЩФ упаковывали в виде капсул, таблеток, пакетов саше или в иных готовых формах, а применяли в качестве компонента продуктов питания.
К подтверждению описанного выше можно привести описание отработки и оптимизации технологических параметров получения пищевых продуктов.
Клетки растений, например, моркови с геном щелочной фосфатазы человека сушили с использованием лиофильной сушки при температуре -55°С с последующим досушиванием при 20, 30, 40, 50 и 60°С. Сухую биомассу (навеска около 1 г) растирали с 10 мл буферного раствора, содержащего 5 мМ Трис-НС1, 0,1 мМ хлорида магния, 0,1 мМ хлорида цинка, центрифугировали при 100g в течение 30 минут. Супернатант испытывали на дефосфорилирующую способность ЩФ при добавлении к раствору 20 мМ пНФФ (п- нитрофенилфосфата). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут для развития окраски продуктом реакции. Для остановки реакции использовали 2 мл охлажденного 0,5 М NaOH. За единицу активности принимали количество фермента, необходимого для образования 1мкМ пНФ. Специфическую активность рассчитывали в единицах на 1 г клеток моркови.
Таблица 2 - Активность ЩФ биомассы клеток моркови при различных режимах сушки
Figure imgf000012_0001
Из таблицы 2 видно, что температурный режим досушивания клеток растений влияет на активность ЩФ, наиболее оптимальные температуры для досушивания находятся в интервале от 20°С до 40°С.
Влияние состава питательной среды на каллусообразование изучали на двух сортах моркови Нантская 4 и Московская зимняя А-555, относящихся к разным сортотипам. В качестве экспланта использовали зиготические зародыши, выделенные из зрелых семян моркови. Зародыши культивировали на трех наиболее часто используемых средах МС (Murashige, Skoog, 1964), MCM (Masuda et al, 1981) и B5 (Gamborg et al., 1976). Для индукции каллусообразования в среды добавляли 2ДД в различных концентрациях, результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Каллусообразование в культуре зиготических зародышей моркови на питательных средах различного состава
Figure imgf000013_0001
Из таблицы видно, что каллусообразование у моркови происходит на всех исследуемых вариантах сред, однако наиболее оптимальный является среда МСМ для обоих сортов моркови.
Влияние регуляторов роста на способность каллусных тканей растений, например, моркови сорта Нантская 4 к соматическому эмбриогенезу изучали в суспензионной культуре на среде МСМ с различными сочетаниями регуляторов роста типа ауксинов (2,4-Д, ИУК) и цитокининов (кинетин и БАЛ). В качестве трансплантов использовали каллусную ткань моркови сорт Нантская 4, полученную из зиготических зародышей, клеточную суспензию культивировали в колбах объемом 100 мл на шейкере, скорость 80 об/мин, результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Среднее число эмбриоидов, полученных в суспензионной культуре клеток моркови сорт Нантская 4 на средах с различным сочетанием регуляторов роста
Figure imgf000014_0001
4з таблицы 4 видно, что образование эмбриоидов может успешно осуществляться на средах, не содержащих 2,4-Д. Для получения каллусных тканей растений использовали различные типы эксплантов: ткани корнеплода, фрагменты стебля и листа, черешок листа, семядоли и гипокотиль и зиготические зародыши моркови сорт Нантская 4. Экспланты культивировали на питательной среде МСМ с 0,2 мг/л 2,4-Д, затем для индукции эмбриогенеза образовавшийся каллус переносили на среды следующего состава: МСМ с 0,2 мг/л 2,4-Д и кинетина и среда МСМ с 0,2 мг/л ИУК и кинетина. Клеточную суспензию культивировали в колбах объемом 100 мл на шейкере, скорость 80 об/мин. Результаты исследований представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Число эмбриоидов, образовавшихся из каллуса, полученного из различных эксплантов моркови сорт Нантская 4
Figure imgf000015_0001
Из таблицы 5 видно, что лучшим эксплантом для получения эмбриогенного каллуса служат зиготические зародыши.
Возможность получения и применения пищевых продуктов на основе растений, содержащих человеческую ЩФ, иллюстрируется следующими примерами.
Для удобства применения продукта, выращенные каллусные клетки или соматические эмбриоиды растений с геном человеческой щелочной фосфатазы могут подвергаться сушке любыми приемлемыми способами.
Полученный пищевой продукт на основе растений, содержащих человеческую ЩФ, можно использовать для приема внутрь в дозированных формах, в том числе, но не ограничиваясь, в виде капсул, таблеток, пакетов саше и в иных готовых формах.
Полученный пищевой продукт на основе растений, содержащих человеческую ЩФ, можно использовать в виде компонента продуктов питания для массового потребления, например, молочных продуктов, напитков, кондитерских изделий, а также в составе лечебно-диетических, лечебно-профилактических продуктов, продуктов функционального питания. Полученный продукт на основе растительных каллусных клеток и соматических эмбриоидов, содержащих человеческую ЩФ, можно использовать для поддержания здоровья, в том числе для поддержания гомеостаза желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), и профилактики заболеваний, связанных с нарушением гомеостаза ЖКТ. В частности, данный продукт можно использовать:
- для регуляции микрофлоры ЖКТ, в том числе для поддержания нормальной микрофлоры ЖКТ и предотвращения роста патогенной микрофлоры ЖКТ;
- для регуляции иммунной системы организма, включая поддержание нормального уровня иммунной системы и восстановление иммунной системы при ее нарушениях, связанных с различными негативными воздействиями, включая стресс, неблагоприятные экологические факторы, прием лекарственных средств и других ксенобиотиков;
- для снижения токсических эффектов, в том числе связанных с бактериальной инфекцией или воспалительными заболеваниями кишечника;
- для профилактики нарушений ЖКТ, связанных с приёмом ксенобиотиков различной природы, включая лекарственные препараты.
Полученный пищевой продукт на основе растений, содержащих человеческую ЩФ, можно использовать как здоровым людям, так и людям, страдающим различными воспалительными и аутоиммунными заболеваниями, включая заболевания кишечника (язвенный колит, болезнь Крона, энтероколиты), артриты, экзему и другие системные заболевания, связанные с повышенной проницаемостью стенки кишечника. Полученный пищевой продукт можно использовать лицам, страдающим ожирением и имеющим различные косметические проблемы.
Получение пищевого продукта заявляемым способом может быть проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1. Получение пищевого продукта на основе моркови, содержащей человеческую ЩФ
Для встраивания гена человеческой кишечной ЩФ в растительный экспрессионный вектор нуклеотидную последовательность размером 1587 пар нуклеотидов синтезировали в полном соответствии с последовательностью нуклеотидов нативной мРНК гена щелочной ЩФ. Далее в последовательность рекомбинантного гена ЩФ на 5 '-конце до сайта инициации трансляции (atg) была введена последовательность сайта рестрикции Bglll (agatct), а на 3'- конце после стоп-кодона (tga) последовательность сайта рестрикции Xbal (atctagaat). Полученную нуклеотидную последовательность размером 1602 пар нуклеотидов клонировали в плазмиду pAL-T vector. Далее из полученной плазмиды pAL- Т-ЩФ вырезали нуклеотидную последовательность размером 1600 пар нуклеотидов по сайтам рестрикции BglU nXbal и лигировали в ранее созданную плазмиду p35S-NLS-recA- /г'сВМЗ с получением плазмиды р35Б-ЩФ, в которой рекомбинантный ген ЩФ находится под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Точность сборки генетической конструкции р35Б-ЩФ верифицировали секвенированием.
Агробактериальный штамм с геном человеческой ЩФ AGL0 р35Б-ЩФ получали, используя в качестве доноров клетки Escherichia coli с плазмидой рЗбБ-ЩФ, в качестве посредника конъюгативного переноса клетки Е. coli штамма НВ101 pRK20l3, а в качестве акцептора клетки Agrobacterium tumefaciens штамма AGL0.
В качестве объекта агробактериальной трансформации использовали каллусные клетки из зиготических зародышей семян моркови, которые получали следующим образом: семена моркови стерилизовали в 50% водном растворе хлорсодержащего препарата «Белизна» с добавлением Твин-20 (1 капля на 100 мл раствора), затем их трехкратно промывали в стерильной дистиллированной воде; затем из простерилизованных семян в стерильных условиях выделяли зародыши, которые переносили в пробирки на питательную среду МСМ с регуляторами роста 2,4-Д и кинетином; пробирки помещали в термостат и инкубировали при температуре 23°С в темноте до образования каллуса.
Агробактерии штамма AGL0 наращивали следующим образом: в условиях ламинарного бокса с помощью стерильной микробиологической петли наносили отдельную бактериальную колонию из свежей культуры с селективными антибиотиками в пробирку, содержащую 3 мл стерильной жидкой среды LB описанного выше состава; далее агробактерии наращивали 24-48 часов при 28°С на термостатируемой качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см и скорость 150-200 об /минуту).
Трансформацию и выращивание каллусных клеток моркови проводили следующим образом: в ламинарном боксе каллусы моркови из зиготических зародышей помещали на стерильную фильтровальную бумагу в чашках Петри; затем наносили на каждый трансплант по 10-25 мкл ночной культуры агробактерий штамма AGL0 с геном ЩФ; затем каллусы слегка подсушивали и переносили в пробирки на питательную среду МСМ с 0,2- 0,5 мг/л 2,4Д; через 3 суток каллусы переносили на агаризованную среду того же состава, дополненную 500 мг/л антибиотика цефотаксима; каллусы культивировали 10 суток в темноте при температуре 22-24°С. Далее проводили еще 1-2 пассажа на среде этого же состава до появления новых колоний клеток моркови. Для размножения суспензионные каллусные клетки моркови переносили на питательную среду МСМ с 0, 2-0, 5 мг/л 2,4Д с 200 мг/л цефотаксима. Для отбора трансгенных клеток моркови использовали способность ЩФ дефосфорилировать п-нитрофенилфосфат с образованием окрашенного в желтый цвет п-нитрофенола.
Далее каллусные клетки моркови с геном человеческой ЩФ отмывали от питательной среды дистиллированной водой и подвергали лиофильной сушке при температуре -55°С; в высушенной массе определяли активность ЩФ по способности дефосфорилировать п-нитрофенилфосфат; высушенную массу фасовали в пакеты саше.
Полученный пищевой продукт использовали для поддержания нормальной микрофлоры ЖКТ и поддержания нормального состояния иммунной системы организма, добавляя в молочные продукты или напитки в расчете 0,5-1 пакет саше на человека в сутки.
Пример 2. Получение пищевого продукта на основе стевии, содержащей человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1 , но в качестве растения использовали стевию (Stevia rebaudiana), а для выращивания клеток, содержащих ЩФ, использовали технологию соматического эмбриогенеза. Для получения соматических эмбриоидов стевии клеточную суспензию культивировали в жидкой питательной среде МСМ, содержащей 0,2 мг/л индолилуксусной кислоты и кинетина; затем для получения однородной популяции эмбриоидов суспезионную культуру пропускали через нейлоновые сита с размером ячеек 120 мкм, а затем через 50 мкм; массу клеток, полученную на втором сите, переносили в свежую среду для формирования эмбриоидов. В среднем в 1 литре среды можно получать до 70 тыс. эмбриоидов.
Полученный пищевой продукт использовали для восстановления иммунной системы организма при ее нарушениях, добавляя в пищевые продукты или напитки, не подвергающиеся тепловой обработке (нагреванию) выше 40°С, в расчете 0,5-1 пакет саше на человека в сутки.
Пример 3. Получение пищевого продукта на основе салата, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1 , но в качестве растения использовали салат (Latuca sativa), в растительный экспрессионный вектор клонировали ген секреторной ЩФ человека, а в качестве агробактериального штамма использовали штамм GV3101 р35Б-ЩФ, который получали, используя в качестве доноров клетки Escherichia coli с плазмидой p35S- ЩФ, в качестве посредника конъюгативного переноса клетки Е. coli штамма НВ101 pRK20l3, а в качестве акцептора клетки Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101. Полученный пищевой продукт использовали для снижения последствий интоксикаций, в том числе связанных пищевыми отравлениями, кишечными инфекциями или приемом лекарств, употребляя по 1-2 пакета саше перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 4. Получение пищевого продукта на основе капусты китайской, содержащей человеческую ЩФ.
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали и использовали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали капусту китайскую (Brassica pekinensis), а для получения и выращивания каллусных клеток использовали культуральную среду МС с добавлением 0,1 -1,0 мг/л 2,4Д.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики негативных побочных эффектов, связанных с приёмом антибактериальных лекарственных препаратов, употребляя по 1 пакету саше перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 5. Получение пищевого продукта на основе капусты белокочанной, содержащей человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали и использовали аналогично описанному в примере 4, но в качестве растения использовали капусту белокочанную (Brassica oleracea), а в растительный экспрессионный вектор клонировали ген плацентарной ЩФ человека.
Полученный пищевой продукт использовали на добровольцах для профилактики негативных побочных эффектов, связанных с приёмом антибиотиков, употребляя по 1 пакету саше перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 6. Получение пищевого продукта на основе укропа, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1 , но в качестве растения использовали укроп (Anethum graveolens), а для получения готового пищевого продукта клетки укропа с геном ЩФ человека лиофилизировали с последующим досушиванием при температуре до +30°С.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики нарушений ЖКТ и иммунной системы организма, связанных с негативным влиянием стресс-факторов, употребляя по 0,5-1 пакета саше перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 7. Получение пищевого продукта на основе сельдерея, содержащего человеческую ЩФ Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали сельдерей (Apium graveolens), а для получения готового пищевого продукта клетки укропа с геном ЩФ человека лиофилизировали с последующим досушиванием при температуре от+30°С до 40°С.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики нарушений ЖКТ и иммунной системы организма, связанных с негативным влиянием стресс-факторов, добавляя в продукты питания или напитки повседневного употребления (при температуре продуктов не выше 40°С) в расчете 0,5-1 пакет саше на человека в сутки.
Пример 8. Получение пищевого продукта на основе огурца, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали и использовали аналогично описанному в примере 1, но в качестве растения использовали огурец (Cucumis sativus), а для получения и выращивания каллусных клеток использовали культуральную среду В-5 с добавлением 0,1 -1,0 мг/л 2,4Д.
Пример 9. Получение пищевого продукта на основе тыквы, содержащей человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1 , но в качестве растения использовали тыкву (Cucurbita реро), а для получения готового пищевого продукта клетки тыквы с геном ЩФ человека смешивали со вспомогательными веществами и фасовали в желатиновые капсулы.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики негативных побочных эффектов, связанных с приёмом антибактериальных лекарственных препаратов, употребляя по 2 капсулы внутрь на человека в сутки в течение 7-10 дней.
Пример 10. Получение пищевого продукта на основе риса, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 10, но в качестве растения использовали рис (Oryza sativa), а для получения готового пищевого продукта использовали распылительную сушку, которую проводили при температуре, не превышающей +50°С, чтобы не допустить денатурации белков.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики негативных побочных эффектов, связанных с приёмом антибиотиков, употребляя по 1-3 капсулы перорально на человека в сутки в течение 7-10 дней. Пример 11. Получение пищевого продукта на основе люцерны, содержащей человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали и использовали аналогично описанному в примере 2, но в качестве растения использовали люцерну (Medicago sativa), а для оптимизации содержания ЩФ проводили синхронизацию развития эмбриоидов (с помощью фильтрации через сита, центрифугирования и автоматического сепарирования) и использовали режим подращивания эмбриоидов в жидкой питательной среде с добавлением ПЭГ, маннитола или других веществ, повышающих осмотическое давление.
Пример 12. Получение пищевого продукта на основе томата, содержащего человеческую ЩФ
Пищевой продукт на основе растений, содержащий рекомбинантную ЩФ человека, получали аналогично описанному в примере 1 , но в качестве растения использовали томат (Solarium lycopersicum), а для получения готового пищевого продукта клетки томата высушивали до содержания влаги 4 - 8 % при 40°С и покрывали полимерами карбоксиметилцеллюлозой, альгинатом натрия с образованием микрокапсул/пеллет, которые фасовали в пакеты саше или желатиновые капсулы.
Полученный пищевой продукт использовали для профилактики нарушений нормальной микрофлоры ЖКТ и состояния иммунной системы организма, добавляя в продукты или напитки повседневного употребления в расчете 0,5-1 пакет саше с микрокапсулами/пеллетами на человека в сутки.
Пример 13. Восстановление с помощью клеток моркови, содержащих ген человеческой ЩФ, показателей иммунитета, нарушенных под влиянием липополисахарида
Нарушения иммунной системы, связанные с нарушением кишечного гомеостаза, в частности - нарушением нормальной микрофлоры и барьерной функции кишечника, моделировали введением мышам стока CD-1 липополисахарида E.coli (Sigma- Aldrich) в дозе 0,5 мг/кг внутрижелудочно. Под влиянием ЛПС в крови мышей наблюдалось повышение уровня провоспалительных цитокинов: ИЛ-6, ИЛ-8 и TNFa, характеризующих развитие системной воспалительной реакции Предварительное внутрижелудочное введение мышам клеток моркови, содержащих ген человеческой ЩФ, приводило к существенному снижению (на 53-77%) уровня провоспалительных цитокинов.
Пример 14. Восстановление кишечной микрофлоры после антибактериальной терапии стрептомицином при кормлении мышей клетками моркови, содержащими ген человеческой кишечной ЩФ Изучение способности моркови, содержащей ген человеческой кишечной ЩФ, восстанавливать кишечную микрофлору, нарушенную после антибактериальной терапии, проводили на мышах стока CD-1.
Одной группе животных вводили внутрижелудочно антибиотик стрептомицин в дозе 200 мг/кг однократно; второй группе - внутрижелудочно стрептомицин 200 мг/кг однократно и лиофильно высушенные клетки моркови, содержащие ген человеческой кишечной ЩФ, 100 мг/кг; третьей группе - внутрижелудочно стрептомицин 200 мг/кг и препарат-пробиотик «Линекс», содержащий лиофилизированные молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis, Enterococcus faecium), в дозе 100 мг (капсульной массы)/кг.
Ежедневно проводили забор и посев каловых масс на питательную среду LB и анализировали наличие или отсутствие нормальной кишечной микрофлоры (таблица 6).
Таблица 6 - Качественная оценка (наличие или отсутствие) общего количества бактерий кишечной микрофлоры в кале у мышей
Figure imgf000022_0001
Как демонстрируют полученные данные, у мышей, получавших стрептомицин, рост бактерий был прекращен через 24 часа после приема препарата. Кал животных этой группы оставался стерильным на протяжении 8 суток и начинал восстанавливаться на 9-е сутки. У мышей, получавших стрептомицин вместе с клетками моркови содержащими ген человеческой кишечной ЩФ, микрофлора начала восстанавливаться через 4 суток. При этом, в группе животных, получавших стрептомицин и препарат сравнения— пробиотик «Линекс», восстановление микрофлоры начиналось только на 8-е сутки. Таким образом, употребление мышами клеток моркови, содержащих ген человеческой кишечной ЩФ, способствует восстановлению микрофлоры кишечника после лечения антибиотиком стрептомицином.
Пример 15. Клетки моркови, содержащие ген человеческой кишечной ЩФ, ускоряют восстановление кишечной микрофлоры после антибактериальной терапии ампициллином
Эксперимент проводили на мышах стока CD-I . Животные первой группы в течение 7 суток получали внутрижелудочно по 50 мг/кг в сутки антибиотик ампицилин. Животные второй группы одновременно с приемом антибиотика получали лиофильно высушенные клетки моркови, содержащие ген человеческой кишечной ЩФ, в дозе 50 мг/кг в сутки. Животные третьей группы одновременно с приемом антибиотика получали препарат сравнения - пробиотик «Линекс», содержащий лиофилизированные молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium infantis, Enterococcus faecium), в дозе 50 мг (капсульной массы)/кг в сутки. Каждый день в течение 3-х недель проводили посевы кала мышей каждой группы на среду LB. Результаты представлены в таблице 7.
Таблица 7 - Содержание бактерий в кале у мышей, получавших ампициллин, и мышей, получавших одновременно ампициллин и лиофильно высушенные клетки моркови с геном человеческой кишечной ЩФ
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Рост бактерий в кишечнике мышей, получавших антибиотик ампициллин, прекратился через 24 часа после начала лечения. В группе мышей, получавшей только ампициллин, нормальная микрофлора кишечника начала восстанавливаться только на 20-е сутки эксперимента. В тоже время, у мышей, принимавших одновременно с ампициллином клетки моркови, содержащие ген человеческой кишечной ЩФ, нормальная микрофлора кишечника начала восстанавливаться уже на 11-е сутки эксперимента. В группе животных, получавших одновременно с ампициллином препарат сравнения - пробиотик «Линекс», восстановление микрофлоры начиналось только на 18-е сутки.
Заявляемое изобретение может найти широкое применение в качестве компонентов продуктов питания для массового потребления, например, молочных продуктов, напитков, кондитерских изделий, а также в составе лечебно-диетических, лечебно-профилактических продуктов, продуктов функционального питания. Источники информации
1. Bol-Schoenmakers М., Fiechter D., Raaben W., Hassing I., Bleumink R., Kruijswijk D., Maijoor K., Tersteeg-Zijderveld M., Brands R., Pieters R. Intestinal alkaline phosphatase contributes to the reduction of severe intestinal epithelial damage // Eur J Pharmacol. 2010/ - Vol. 633(1-3). - P.71-77. doi: l0.l0l6/j.ejphar.20l0.0l.023. Epub 2010 Feb 2.
2. Brenchley, J.M., Prince D.A., Schacker T.W., Ascher T.E., Silvestri G., Rao S., Kazzaz Z. et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection / // Nat. Med. - 2006. - Ns 1 Bird AP. CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus. Trends Genet 1987; 3: 342-7. 2. - P. 1365-1371. РМШ: 17115046 DOI: l0.l038/nml5l l.
3. Cadwell K., Patel K.K., Maloney N.S., Liu T.C., Ng A.C., Storer C.E., Head R.D., Xavier R., Stappenbeck T.S., Virgin H.W. Virus-plus-susceptibility gene interaction determines Crohn’s disease gene Atgl6Ll phenotypes in intestine // Cell. 2010. - Vol.141.— P.l 135—1145. DOI: 10.l0l6/j.cell.2010.05.009. 4. Eskandari M.K., Kalff J.C., Billiar T. R., Lee K.K., Bauer A.J. LPS-induced muscularis macrophage Nathan CF. Secretory products of macrophages // J Clin Invest. 1987. - Vol. 79. - P. 319-326.
5. Jiang, W., Lederman M.M., Hunt P., Sieg S.F., Haley K., Rodriguez B., LandayA., Martin
J., Sinclair E., Asher A.I., Deeks S.G., Douek D.C., Brenchley J.M. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection // J. Infect. Dis. - 2009. -
Figure imgf000025_0001
199. - P. 1177-1185. PMID:
19265479 PMCID: PMC2728622 DOI: 10.1086/597476.
6. Kats S., Brands R., Hamad M.A.S.Seinen W.,Schamhorst V., Wulkan R. W., Schonberger J., P., van Oeveren W. Prophylactic treatment with cardiac surgery induces end phosphatase release // Int J Artif Organs 2012. Vol. 35. No 2. P. 144-151.
7. Maloy K.J., Powrie F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease // Nature. 2011. - Vol. 474. - P. 298-306. PMID: 2167774, D01:10.l038/naturel0208
8. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self // Science. 2002.- N. 12. Vol. 296(5566). - P. 301-305. РМШ: 11951032, DOI: 10.1126/science.1071059.
9. Molnar K., Vannay A., Szebeni B., Banki N.F, Sziksz E., Cseh A., Gyorffy H., Lakatos P.L. , Papp M., Arato A., Veres G. Intestinal alkaline phosphatase in the colonic mucosa of children ith inflammatory bowel disease. // World J Gastroenterol 2012. - Vol. 18. - P. 3254-3259 [PMID: 22783049 DOI: l0.3748/wjg.vl8.i25.3254].
10. Muginova S.V., Zhavoronkova A.M., Polyakov A.E., Shekhovtsova T.N. Application of alkaline phosphatases from different sources in pharmaceutical and clinical analysis for the determination of their cofactors; zinc and magnesium ions // Anal Sci 2007. - Vol. 23. - P. 357- 363 [PMID: 17372382].
11. Odell J.T., Nagy F., Chua N.H. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter // Nature. 1985. V. 313. P. 810-812.
12. Park B. S, Lee J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes // Exp Mol Med. 2013. - Vol. 45. - P. 66. http://dx.doi.org/10.1038/emm .2013.97.
13. Pickkers P., Snellen F., Rogiers P., Bakker J., Jorens P., Meulenbelt J. , Spapen H., Tulleken J. E., Lins R., Ramael S., Bulitta M., . van der Hoeven J. G. Clinical pharmacology of exogenously administered alkaline phosphatase // Eur J Clin Pharmacol. 2009. Vol. 65. P. 393- 402. 14. Podolsky DK. Inflammatory bowel disease. // N Engl J Med . 2002.- Vol. 347.- P.417- 429.
15. Poelstra K, Bakker WW, Klok PA, et al. A physiologic function for alkaline phosphatase: Endotoxin detoxification. Lab Invest 1997. - Vol. 76(3). - P. 319-327. PMID: 9121115.
16. Rezende, A. A., J. M. Pizauro, et al. (1994). "Phosphodiesterase activity is a novel property of alkaline phosphatase from osseous plate." Biochem J. 1994. - Vol. 301 ( Pt 2).- P. 517-522. PMCID: PMC1137111.
17. Riggle K.M., Rentea R.M., Welak S.R., Pritchard K.A., Jr, Oldham K.T., Gourlay D.M.
Intestinal alkaline phosphatase prevents the systemic inflammatory response associated with necrotizing enterocolitis // J Surg Res . 2013. - Vol. 180. - P. 21-26. http://dx.d0i.0rg/l 0.1016/j.jss.2012.10.042.
18. Sabalza M., Christou P., Capell T. Recombinant plant-derived pharmaceutical proteins: current technical and economic bottlenecks // Biotechnol Lett. - 2014. DOI 10.1007/s 10529-014- 1621-3.
19. Sharma A.K., Sharma M.K. Plants as bioreactors: Recent developments and emerging opportunities // Biotechnology Advances 2009. - Vol. 27. - P. 811-832.
Conley AJ, Joensuu JJ, Richman A, Menassa R Protein body-inducing fusions for high-level production and purification of recombinant proteins in plants. // Plant Biotechnol J. 2011. -Vol. 9. - P. 419-433.
20. Tuin A., Poelstra K., de Jager-Krikken A., Bok L., Raaben W., Velders M.P., Dijkstra G. Role of alkaline phosphatase in colitis in man and rats. Gut 2009; 58: 379-387 [PMID: 18852260 DOI: 10.1136/gut.2007.128868] .
21. Weemaes A.M., Meijer D.K., Poelstra K.. Removal of phosphate from lipid A as a strategy to detoxify lipopolysaccharide // Shock. 2002. - Vol. 18. - P. 561-566. http://dx.d0i.0rg/l 0.1097/00024382-200212000-00013.
22. Wise A.A., Liu Z., Binns A.N. Three methods for the introduction of foreign DNA into Agrobacterium // Agrobacterium Protocols. Springer, 2006. P. 43-54.
23. Комахин P.A., Комахина B.B., Жученко A. A. 2007. Создание генетических конструкций, содержащих бактериальный ген recA Е. coli для индукции рекомбинации в растениях. Сельскохозяйственная биология. 3, 25-32.

Claims

Формула изобретения
1. Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, включающий создание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы, встраивание растительного экспрессионного вектора с геном человеческой щелочной фосфатазы в агробактериальные штаммы, получение каллусных растительных клеток, осуществление агробактериальной трансформации каллусных клеток с помощью агробактериальных штаммов, получение соматических эмбриоидов из трансформированных каллусных клеток и выращивание в суспензионной культуре соматических эмбриоидов с геном человеческой щелочной фосфатазы.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после агробактериальной трансформации каллусных клеток в суспензионной культуре выращивают трансформированные каллусные клетки с геном человеческой щелочной фосфатазы.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что производят сушку выращенных трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве рекомбинантной человеческой щелочной фосфатазы используют ткане-специфические щелочные фосфатазы, например, кишечную и плацентарную, или ткане-неспецифические щелочные фосфатазы.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводят синхронизацию развития эмбриоидов.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что соматические эмбриоиды выращивают в жидкой питательной среде с добавлением веществ, повышающих осмотическое давление, в качестве которых используют полиэтиленгликоль, маннитол и другие повышающие осмотическое давление вещества.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформированные растительные клетки с геном человеческой щелочной фосфатазы используют в виде капсул, таблеток, пакетов саше и в иных готовых формах.
8. Применение трансформированных растительных клеток, полученных способом по п.1, для профилактики нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и ее восстановления при токсических и стрессовых воздействиях.
9. Применение трансформированных растительных клеток, полученных способом по п.1, для профилактики нарушений иммунной системы организма, связанных с нарушениями микрофлоры кишечника и барьерной функции кишечника, и восстановления иммунной системы при ее нарушениях в качестве иммуностимулирующего средства.
PCT/RU2019/000053 2018-02-05 2019-01-29 Способ получения трансформированных растительных клеток WO2019151902A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980011908.3A CN111787809A (zh) 2018-02-05 2019-01-29 生产含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的方法以及含重组人碱性磷酸酶的转化植物细胞的用途
US16/967,390 US20210214738A1 (en) 2018-02-05 2019-01-29 Method of producing transformed plant cells, containing recombinant human alkaline phosphatase, and the use of said transformed plant cells, containing recombinant human alkaline phosphatase
EP19748181.5A EP3750407A4 (en) 2018-02-05 2019-01-29 METHOD FOR OBTAINING TRANSFORMED PLANT CELLS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018104401A RU2698397C2 (ru) 2018-02-05 2018-02-05 Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека
RU2018104401 2018-02-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019151902A1 true WO2019151902A1 (ru) 2019-08-08

Family

ID=67479386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/000053 WO2019151902A1 (ru) 2018-02-05 2019-01-29 Способ получения трансформированных растительных клеток

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210214738A1 (ru)
EP (1) EP3750407A4 (ru)
CN (1) CN111787809A (ru)
RU (1) RU2698397C2 (ru)
WO (1) WO2019151902A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2292348C2 (ru) * 2001-02-28 2007-01-27 Борд Оф Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Небраска Способы и материалы для создания и применения трансгенных организмов, дикамба-разрушающих
US20110206654A1 (en) 2008-08-29 2011-08-25 The General Hospital Corporation Methods of Modulating Gastrointestinal Tract Flora Levels with Alkaline Phosphatase
US20130022591A1 (en) 2010-02-12 2013-01-24 The General Hospital Corporation Methods of Reducing or Inhibiting Toxic Effects Associated with a Bacterial Infection Using Alkaline Phosphatase
US20130280232A1 (en) 2004-02-04 2013-10-24 Pharmaaware Sepsis B.V. Use of alkaline phosphatase for the detoxification of lps present at mucosal barriers

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU644097B2 (en) * 1989-08-09 1993-12-02 Monsanto Technology, Llc Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US20010007157A1 (en) * 1993-11-18 2001-07-05 Ebrahim Firoozabady Genetically transformed rose plants and methods for their production
US20170130236A1 (en) * 2014-06-02 2017-05-11 University Of Tennessee Research Foundation Methods of plant transformation using transformable cell suspension culture and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2292348C2 (ru) * 2001-02-28 2007-01-27 Борд Оф Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Небраска Способы и материалы для создания и применения трансгенных организмов, дикамба-разрушающих
US20130280232A1 (en) 2004-02-04 2013-10-24 Pharmaaware Sepsis B.V. Use of alkaline phosphatase for the detoxification of lps present at mucosal barriers
US8574863B2 (en) 2004-02-04 2013-11-05 Pharmaaware Sepsis B.V. Alkaline phosphatase for treating an inflammatory disease of the gastro-intestinal tract
US20110206654A1 (en) 2008-08-29 2011-08-25 The General Hospital Corporation Methods of Modulating Gastrointestinal Tract Flora Levels with Alkaline Phosphatase
US20130022591A1 (en) 2010-02-12 2013-01-24 The General Hospital Corporation Methods of Reducing or Inhibiting Toxic Effects Associated with a Bacterial Infection Using Alkaline Phosphatase

Non-Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOL-SCHOENMAKERS M.FIECHTER D.RAABEN W.HASSINQ I.BLEUMINK R.KRUIISWIIK D.MAIIOOR K.TERSTEEG-ZIIDERVELD M.BRANDS R.PIETERS R.: "Intestinal alkaline phosphatase contributes to the reduction of severe intestinal epithelial damage", EUR J PHARMACOL., vol. 633, no. 1-3, 2010, pages 71 - 77, XP026971823
BRENCHLEY, J.M.PRINCE D.A.SCHACKER T.W.ASCHER T.E.SILVESTRI G.RAO S.KAZZAZ Z. ET AL.: "Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection", NAT. MED., 2006
CADWELL K.PATEL K.K.MALONEY N.S.LIU T.C.NG A.C.STORER C.E.HEAD R.D.XAVIER R.STAPPENBECK T.S.VIRGIN H.W.: "Virus-plus-susceptibility gene interaction determines Crohn's disease gene Atg16L1 phenotypes in intestine", CELL, vol. 141, 2010, pages 1135 - 1145
CONLEY AJJOENSUU JJRICHMAN AMENASSA R: "Protein body-inducing fusions for high-level production and purification of recombinant proteins in plants", PLANT BIOTECHNOL J., vol. 9, 2011, pages 419 - 433, XP055006552, DOI: 10.1111/j.1467-7652.2011.00596.x
ESKANDARI M.K.KALFF J.C.BILLIART. R.LEE K.K.BAUER A.J.: "LPS-induced muscu-laris macrophage Nathan CF. Secretory products of macrophages", J CLIN INVEST., vol. 79, 1987, pages 319 - 326
JIANG, W.LEDERMAN M.M.HUNT P.SIEQ S.F.HALEY K.RODRIGUEZ B.LANDAY A.MARTIN J.SINCLAIR E.ASHER A.I.: "Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection", J. INFECT. DIS., 2009, pages 1177 - 1185
KATS S.BRANDS R.HAMAD M.A.S.SEINEN W.SCHAMHORST V.WULKAN R. W.SCHONBERGER J., P.VAN OEVEREN W.: "Prophylactic treatment with cardiac surgery induces end phosphatase release", INT J ARTIF ORGANS, vol. 35, no. 2, 2012, pages 144 - 151
KOMAHIN R.A.KOMAHINA V.V.ZHUCHENKO A.A.: "Creation of genetic constructions, containing bacterial gene recA E. coli, to induce recombination in plants", AGRICULTURAL BIOLOGY., vol. 3, 2007, pages 25 - 32
MALOY K.J.POWRIE F.: "Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease", NATURE, vol. 474, 2011, pages 298 - 306, XP055045571, DOI: 10.1038/nature10208
MATZINQER P: "The danger model: a renewed sense of self", SCIENCE, vol. 296, no. 5566, 2002, pages 301 - 305
MOLNAR K.VANNAY A.SZEBENI B.BANKI N.FSZIKSZ E.CSEH A.GYORFFY H.LAKATOS P.L.PAPP M.ARATO A.: "Intestinal alkaline phosphatase in the colonic mucosa of children ith inflammatory bowel disease", WORLD J GASTROENTEROL, vol. 18, 2012, pages 3254 - 3259, XP055461070, DOI: 10.3748/wjg.v18.i25.3254
MUGINOVA S.V.ZHAVORONKOVA A.M.POLYAKOV A.E.SHEKHOVTSOVA T.N.: "Application of alkaline phosphatases from different sources in pharmaceutical and clinical analysis for the determination of their cofactors; zinc and magnesium ions", ANAL SCI, vol. 23, 2007, pages 357 - 363
ODELL J.T.NAGY F.CHUA N.H.: "Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter", NATURE, vol. 313, 1985, pages 810 - 812, XP002915192, DOI: 10.1038/313810a0
PARK B. SLEE J. O.: "Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes", EXP MOL MED., vol. 45, 2013, pages 66, Retrieved from the Internet <URL:http://dx.doi.ora/10.1038/emm.2013.97.>
PICKKERS P.SNELLEN F.ROGIERS P.BAKKER J.JORENS P.MEULENBELT J.SPA-PEN H.TULLEKEN J. E.LINS R.RAMAEL S.: "Clinical pharmacology of exogenously administered alkaline phosphatase", EUR J CLIN PHARMACOL., vol. 65, 2009, pages 393 - 402, XP019703922
PODOLSKY DK: "Inflammatory bowel disease", N ENGL J MED ., vol. 347, 2002, pages 417 - 429
POELSTRA KBAKKER WWKLOK PA ET AL.: "A physiologic function for alkaline phosphatase: Endotoxin detoxification", LAB INVEST, vol. 76, no. 3, 1997, pages 319 - 327
REZENDE, A. A.J. M. PIZAURO ET AL.: "Phosphodiesterase activity is a novel property of alkaline phosphatase from osseous plate", BIOCHEM J., vol. 301, 1994, pages 517 - 522
RIGGLE K.M.RENTEA R.M.WELAK S.R.PRITCHARD K.A., JROLDHAM K.T.GOURLAY D.M.: "Intestinal alkaline phosphatase prevents the systemic inflammatory response associated with necrotizing enterocolitis", J SURG RES ., vol. 180, 2013, pages 21 - 26, XP055625828, Retrieved from the Internet <URL:http://dx.doi.org/10.1016/j.jss.2012.10.042> DOI: 10.1016/j.jss.2012.10.042
SABALZA M.CHRISTOU P.CAPELL T.: "Recombinant plant-derived pharmaceutical proteins: current technical and economic bottlenecks", BIOTECHNOL LETT., 2014
See also references of EP3750407A4
SHARMA A.K.SHARMA M.K.: "Plants as bioreactors: Recent developments and emerging opportunities", BIOTECHNOLOGY ADVANCES, vol. 27, 2009, pages 811 - 832, XP026675569, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2009.06.004
TRENDS GENET, vol. 3, no. 342-7, 1987, pages 1365 - 1371
TUIN A.POELSTRA K.DE JAGER-KRIKKEN A.BOK L.RAABEN W.VELDERS M.P.DIJKS-TRA G.: "Role of alkaline phosphatase in colitis in man and rats", GUT, vol. 58, 2009, pages 379 - 387, XP009114818, DOI: 10.1136/gut.2007.128868
WEEMAES A.M.MEIJER D.K.POELSTRA K.: "Removal of phosphate from lipid A as a strategy to detoxify lipopolysaccharide", SHOCK, vol. 18, 2002, pages 561 - 566, Retrieved from the Internet <URL:http://dx.doi.ora/10.1097/00024382-200212000-00013>
WISE A.A.LIU Z.BINNS A.N.: "Agrobacterium Protocols", 2006, SPRINGER, article "Three methods for the introduction of foreign DNA into Agrobacterium", pages: 43 - 54

Also Published As

Publication number Publication date
RU2018104401A (ru) 2019-08-06
EP3750407A1 (en) 2020-12-16
CN111787809A (zh) 2020-10-16
US20210214738A1 (en) 2021-07-15
RU2698397C2 (ru) 2019-08-26
RU2018104401A3 (ru) 2019-08-06
EP3750407A4 (en) 2021-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102010207B1 (ko) 세균 균주를 포함하는 조성물
ES2748812T3 (es) Composiciones que comprenden cepas bacterianas
ES2660813T3 (es) Nueva bacteria de ácido láctico, fármaco, producto alimenticio o bebida, y pienso que contienen la nueva bacteria de ácido láctico
CN100552016C (zh) 用于治疗炎性疾病的双歧杆菌
JP6062931B2 (ja) 噴霧乾燥ラクトバチルス株／細胞およびヘリコバクターピロリに対するその使用
JP5709883B2 (ja) 新規なラクトバチルス・プランタラム及びこれを含む組成物
CN108495642A (zh) 包含细菌菌株的组合物
RU2662985C1 (ru) Новый бактериофаг шига-токсин продуцирующей e. coli типа f18 esc-cop-1 и его применение для ингибирования пролиферации шига-токсин продуцирующей e. coli типа f18
JP2013139477A (ja) 経口投与される剤
CN101384700A (zh) 新的乳杆菌属菌株及其用于对抗幽门螺杆菌的用途
ES2407150T3 (es) Bacteria ácido láctica novedosa con actividad anti-alérgica, agente anti-alérgico, alimento y composición farmacéutica que comprenden, cada uno de ellos, la bacteria ácido láctica, y proceso para la producción del agente anti-alérgico
KR102084825B1 (ko) 유아의 과도한 울음용 프로바이오틱
US20200147150A1 (en) Compositions comprising bacterial strains
CN107206034A (zh) 包含双歧杆菌的免疫调节组合物
JP4565057B2 (ja) イムノグロブリンａ誘導能の高い新規乳酸菌
CN114390897A (zh) 一种益生元和益生菌的组合物及其应用
KR20140026326A (ko) 신장 기능을 강화시키는 조성물 및 방법
ES2321602T3 (es) Composicion para fomentar la proliferacion de lactobacillus casei subsp.casei.
TW202008996A (zh) 乳雙歧桿菌gkk2之活性物質、含其之組合物及其促進長壽之用途
RU2698397C2 (ru) Способ получения трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека, и применение трансформированных растительных клеток, содержащих рекомбинантную щелочную фосфатазу человека
ES2655668T3 (es) Tratamiento del IBS con probióticos
TW202019447A (zh) 包含細菌菌株之組合物
CN116024131A (zh) 一种植物乳杆菌菌株goldgut-lp101及用途
RU2491336C1 (ru) Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей старше 14 лет, способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта людей старше 14 лет
KR20210158357A (ko) 신규 락토바실러스 루테리 균주 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19748181

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019748181

Country of ref document: EP

Effective date: 20200907