CN103421837B - 一种根癌农杆菌介导的大麦叶基转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的以大麦幼苗叶基诱导愈伤获得转基因植物的方法。本发明的要点是，以大麦叶基为外植体，诱导愈伤组织，通过农杆菌介导的遗传转化方法，利用Bar基因作为筛选基因，以除草剂草铵膦作为选择剂，对转化后的愈伤组织及分化植株进行筛选，经PCR和Southern杂交分析，证实外源基因已整合到大麦基因组中，获得了转基因大麦植株，与现有技术相比，本发明的转基因的外植体(愈伤组织)可周年供应；与经典的以幼胚为受体的转化方法相比，获得受体的时间从150天缩短到3天，克服了幼胚取材时间限制；与茎尖转化方法相比，本发明对技术要求降低，操作简单。
Description
技术领域
本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及以大麦叶基为外植体材料诱导愈伤，以根癌农杆菌介导的培育转基因植物的方法。本发明涉及大麦叶基材料制备及诱导愈伤方法，经根癌农杆菌介导，用于大麦栽培品种的遗传转化。
背景技术
大麦是世界上最重要的作物之一，其种植面积和产量仅次于水稻、小麦和玉米之后，位于禾谷类作物第四位，主要用作粮食、饲料、啤酒工业原料以及医药工业原料和保健食品等。大麦的遗传改良一直倍受重视。
Tingay等于1997年首次以农杆菌介导法成功转化大麦幼胚，获得转基因大麦植株，随后农杆菌介导的转化方法逐步发展成为大麦遗传转化的重要方法(TingayS，McElroyD，KallaR，FiegS，WangM，ThorntonS&BrettellR.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation.JPlant，1997，11：1369-1376；McCormacAC，WuH，BaoM，WangY，XuR，ElliottMC&ChenDF.Theuseofvisualmarkergenesascell-specificreportersofAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliverytowheat(TriticumaestivumL.)andBarley(HordeumvulgareL.).Euphytica，1998，99：17-25；MatthewsPR，WangMB，WaterhousePM，ThorntonS，FiegSJ，GublerF，JacobsenJV.Markergeneeliminationfromtransgenicbarley，usingco-transformationwithadjacent‘twinT-DNAs’onastandardAgrobacteriumtransformationvector.MolBreeding，2001，7：195-202；MurrayF，BrettellR，MatthewsP，BishopD，JacobsenJ.ComparisonofAgrobacterium-mediatedtransformationoffourbarleycultivarsusingtheGFPandGUSreportergenes.PlantCellRep，2004，22：397-402；WuH，McCormacAC，ElliottMC，ChenDF.Agrobacterium-mediatedstabletransformationofcellsuspensionculturesofbarley(HordeumvulgareL.).PlantCellTiss.Org.Cult，1998，54：161-171；TrifonovaA，MadsenS，OlesenA.Agrobacterium-mediatedtransgenedeliveryandintegrationintobarleyunderarangeofinvitrocultureconditions.PlantSci，2001，161：871-880；FangYD，AkulaC，AltpeterF.Agrobacterium-mediatedbarley(HordeumvulgareL.)transformationusinggreenfluorescentproteinasavisualmarkerandsequenceanalysisoftheT-DNA::barleygenomicDNAjunctions.JPlantPhysiol，2002，159：1131-1138；TravellaS，RossSM，HardenJ，EverettC，SnapeJW，HarwoodWA.AcomparisonoftransgenicbarleylinesproducedbyparticlebombardmentandAgrobacterium-mediatedtechniques.PlantCellRep，2005，23：780-789；KumlehnJ，SerazetdinovaL，HenselG，BeckerD，LoerzH.Genetictransformationofbarley(HordeumvulgareL.)viainfectionofandrogeneticpollencultureswithAgrobacteriumtumefaciens.PlantBiotechnolJ，2006，4：251-261；IngerBAkstedHolme，HenrikBrinch-Pedersen，MetteLange，PrebenBachHolm.Transformationofdifferentbarley(HordeumvulgareL.)cultivarsbyAgrobacteriumtumefaciensinfectionofinvitroculturedovules.PlantCellReports，2008，27，1833-1840)。然而，Tingay等采用的方法是先以基因枪轰击大麦幼胚诱导的愈伤组织，再以农杆菌进行转化。虽然获得了转基因植株，但实验难度大、成本高。同时，在大麦的农杆菌介导转化中，目前存在的突出问题就是以开花后15天左右的幼胚为转化受体，利用模式品种Goldenpromise转化，而以栽培大麦品种开展转化的研究受到限制，转化频率也不高。在实际工作中，大麦生长周期长，从播种至幼胚形成需要约150天，田间一年仅能取材一次，因此，幼胚取材是目前大麦遗传转化研究的最主要限制因素之一。本发明从最关键的转化受体入手，发明了用大麦籽粒直接萌发幼苗，以幼苗叶基为受体用于转化，进一步优化了由叶基诱导愈伤、农杆菌浸染及转基因材料筛选、鉴定过程中的关键问题，从而建立了一种高效的根癌农杆菌介导的大麦叶基愈伤的遗传转化方法。
利用禾谷类作物叶基诱导愈伤作为转化受体，与以其幼胚为受体相比：①可以省去从田间播种至开花灌浆期的长时间栽培管理周期，缩短转化周期，降低成本；②大麦籽粒萌发形成所需幼苗时间仅需3天，可以很容易快速获得大量的叶基，经诱导后获得转化受体，因此，可以随时获得转化受体，解决了取样限制。到目前为止，以禾谷类植物叶基为外植体建立植物再生体系的报道有燕麦(Glessetal.，1998)、小黑麦(Vikrant&A.Rashid，2001)、小麦(KopertekhandStribnaya，2003，WangandWei，2004，K.haliloglu2006)。关于禾谷类作物叶基诱导愈伤进行遗传转化方面的研究，仅有少量经基因枪法介导转化的报道，如玉米(MohammadAhmadabadi，2007)、小麦(ChughandKhurana，2003)。而以农杆菌介导的大麦叶基诱导愈伤进行的遗传转化至今未见报道。与基因枪法获得的转基因植株相比，根癌农杆菌介导的遗传转化具有转基因遗传稳定性高、转基因拷贝数低、减少基因沉默、转基因整合位点边界序列容易鉴定(转基因品种商品化的必要条件)、转化成本低等多种优势。
为解决取材的限制，申请人还申报了大麦茎尖转基因方法。大麦茎尖遗传转化，需要操作人员除去幼苗的根、盾片、幼叶等，才能分离出幼苗的茎尖，同时用针适当刺伤茎尖生长点，这些步骤有一定的技术要求，具有一定经验的人员才能熟练操作。因而，尽管茎尖转化不需要愈伤诱导，但对技术要求较高，不同人员之间操作常有一定的差异。而本发明不需要分离茎尖和针刺，切取叶基甚至比常规剥取幼胚还简单，对操作人员的技术要求较低，更容易实现，而两种转化方法具有相近的转化效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种根癌农杆菌介导的大麦叶基转化方法，利用大麦种子直接萌发后的幼苗叶基为外植体诱导产生愈伤组织，在农杆菌介导下，将外源基因转入大麦栽培品种中，从而避免了取材的限制，降低了大麦遗传转化的成本，为商品化应用转基因技术培育新品种提供技术支撑。
本发明通过以下技术方案实现：
一种根癌农杆菌介导的大麦叶基转化方法，其步骤如下：
1.质粒载体和根癌农杆菌的转化
本发明所用植物表达载体为报道的载体PMBL-9(在专利申请号为201110257189.9文献的说明书第13页即说明书附图2的最终的表达质粒中，该质粒被命名为PMBL-9)。
将PMBL-9表达载体通过电击转化农杆菌GV3101菌株(农杆菌GV3101菌株购自invitrogen公司；电击转化方法参照：Sambrook等，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)，用于大麦的遗传转化。
2.大麦叶基外植体的制备
1)种子灭菌：将大麦种子去掉外面的颖壳，用70％酒精浸泡2min，然后用0.1％HgCl2浸泡15min，用灭菌水浸洗3-4次，每次3～5min。将灭菌后的种子浸泡在无菌水中，室温放置5～10h。
2)剥胚：超净工作台内倒掉灭菌水，剥取完整的成熟胚，将盾片向下，放置在MS培养基上，在黑暗条件下25℃萌发培养3d。
3)叶基外植体制备：用解剖刀切取盾片上端1/5处约1mm的叶基，其包括生长点和胚芽鞘在内的切段，然后纵切成两半，放置在诱导培养基上，25℃黑暗下培养，20d后进行继代培养，再在诱导培养基上培养7d左右。
3.遗传转化
1)根癌农杆菌扩大培养：将保存的含有植物表达载体PMBL-9的农杆菌菌液1mL接种于50mLYEB培养基(配方：5g/L营养肉汤，1g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，5g/L蔗糖；pH7.4使用前添加100mg/L利福平(Rif)，100mg/L羧苄青霉素(Carb)，25mg/L卡那霉素(Kan)，2mmol/LMgSO4)，28℃，200r/min暗培养至OD600＝0.8左右，然后于4℃，5000r/min下离心，收集菌体，将浸染液重悬至OD600＝0.6左右得到重悬液。
2)高渗处理：待转化愈伤组织在高渗培养基中预处理4h。
3)农杆菌浸染：将高渗培养基中预处理后的愈伤组织转移到重悬液中，采用超声波或者抽真空负压处理，放置摇床上，100r/min，30min。
超声波处理：将浸泡在重悬液中的愈伤置于超声波清洗仪中处理20s，频率为5kHz。
真空渗入处理：将浸泡在重悬液中的愈伤置于真空泵中，待真空度升至80kPa时保持15min。
4)共培养：浸染后的愈伤转到带有滤纸的培养皿中，在超净工作台上吹干，大约需要0.5h。然后将吹干后的愈伤转移到共培培养基上。于黑暗下，25℃条件下共培养2d。
5)洗菌：将共培养后的愈伤转到三角瓶中，加入含500mg/L头孢霉素的无菌水(抑菌液)，放置在摇床上，100r/min，30min，然后再用抑菌液冲洗，直到液体澄清为止。
6)恢复培养：洗菌后的愈伤转移到带有滤纸的培养皿中，置于超净工作台上30min吹干。最后将吹干的愈伤转移到恢复培养基上，黑暗，25℃条件下恢复培养7d。
4.诱导筛选
将恢复培养后的愈伤组织继代到诱导筛选培养基上筛选培养15～20d。
5.分化筛选
诱导筛选后的愈伤组织移至分化筛选培养基上，连续分化筛选两轮，每轮15～20d。此时，转化的抗性愈伤上分化出健壮的幼苗，未转化对照愈伤上没有分化或只有少量的弱小幼苗。
6.生根筛选
把分化筛选培养基上分化的幼苗转移至生根筛选培养基上，连续生根筛选两轮，每轮15～20d。此时，转化愈伤上分化的幼苗已生长出根，生长健壮，而对照愈伤分化出的少量幼苗大部分已筛死，个别未筛死的也很弱小。
7.再生植株的移栽
将生根筛选后存活的幼苗转到不含筛选压的生根壮苗培养基上，长出新根后将其放置在4℃条件下春化处理15d，移栽到温室土壤中，于19℃，16h/d日光灯光照(光照强度为9000Lux)下生长至种子成熟。
8.再生植株的鉴定
1)PCR鉴定：提取待鉴定的大麦叶片基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以Ubi-1启动子序列(GenBank：S94464.1)为模板设计引物(正向引物UbiF：5′-CGGTAGTTCTACTTCTGTTC-3′，反向引物UbiR：5′-CATCTCTGTATATGCATCAG-3′)，扩增片段大小为495bp。
引物对的DNA序列如下所示：
正向引物UbiF：5’-CGGTAGTTCTACTTCTGTTC-3’，
反向引物UbiR：5’-CATCTCTGTATATGCATCAG-3’；
扩增得到的片段的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。
反应体系：10×的PCRBuffer2.5μl，25mmol/L的MgCl21.5μl，1.25mmol/L的dNTPs2μl，10μmol/L的引物各0.5μl，5U/μl的Taq酶0.5μl，模板DNA100ng，补超纯水至总体积25μl。
2)Southernblot杂交：以T1代转基因大麦基因组DNA进行了Southernblot杂交，以重复验证获得的转基因植株并确定外源基因拷贝数。
在本发明中，下列培养基是至关重要的，各类培养基组分及其配方如下：
1)成熟胚萌发培养基
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌(121℃，20min)。
2)愈伤诱导培养基
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/lVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2.0mg/L2，4-D，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌(121℃，20min)。
3)高渗培养基
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，0.4mol甘露醇，2.0mg/L2，4-D，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌(121℃，20min)。
4)农杆菌浸染培养基0或称之为浸染液)
190mg/LKNO3，165mg/LNH4NO3，17mg/LKH2PO4，37mg/LMgSO4·7H2O，44mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，200mg/LL-脯氨酸，100mg/L水解酪蛋白，100mg/LVc，1.95g/LMFS(吗啉乙磺酸)，30g/L麦芽糖，10g/L葡萄糖，200μL/LSilwetL-77(Lehleseeds，美国)，0.5g/L谷氨酰胺，2，4-D2.0mg/L，pH5.2。使用时加1‰200mmol/L乙酰丁香酮(AS)，抽滤灭菌。
5)共培培养基
190mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，0.69g/LL-脯氨酸，1g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2，4-D2.0mg/L，6g/L琼脂粉，pH5.2，使用前加1‰(v/v)经抽滤灭菌的200mmol/L乙酰丁香酮和500mg/L头孢霉素。
6)恢复培养基
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌(121℃，20min)后加500mg/L头孢霉素。
7)诱导筛选培养基
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2，4-D2.0mg/L，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌(121℃，20min)后加5mg/L草铵膦(PPT)和500mg/L头孢霉素。
8)分化筛选培养基
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，0.5mg/L6-BA，0.5mg/LKT(激动素)，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌(121℃，20min)后加5mg/LPPT和500mg/L头孢霉素。
9)生根筛选培养基
950mg/LKNO3，825mg/LNH4NO3，85mg/LKH2PO4，185mg/LMgSO4·7H2O，220mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌(121℃，20min)后加3mg/L草铵膦和500mg/L头孢霉素。
10)生根壮苗培养基
950mg/LKNO3，825mg/lNH4NO3，85mg/LKH2PO4，185mg/LMgSO4·7H2O，220mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌(121℃，20min)后加500mg/L头孢霉素。
本发明的有益效果：
本发明以我国生产上广泛种植的两个大麦主推品种鄂32380(又称E32380)和鄂啤2号(Epi2)为实验材料，在参考已发表的大麦农杆菌转化方法，并结合申请人对大麦发育及根癌农杆菌侵染机理研究结果的基础上获得。迄今已报道的大麦农杆菌介导的转化全部以幼胚为受体，诱导愈伤组织后用于转化，所用的基因型也多采用模式品种GoldenPromise。GoldenPromise是国外的酿酒大麦品种，是目前大麦遗传转化研究的主要材料，但其种植成本高昂，在我国并没有广泛种植。同时，Tingay等(TingayS，McElroyD，KallaR，FiegS，WangM，ThorntonS&BrettellR.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation.JPlant，1997，11：1369-1376；TrifonovaA，MadsenS，OlesenA.Agrobacterium-mediatedtransgenedeliveryandintegrationintobarleyunderarangeofinvitrocultureconditions.PlantSci，2001，161：871-880)的经典农杆菌转化方法，以大麦开花灌浆期的幼胚为受体，诱导愈伤组织，用基因枪轰击为辅助手段轰击愈伤组织后，再以农杆菌转化愈伤，该方法繁琐，实验周期长，因而实验成本高昂，限制了其应用及推广。本发明克服了现有技术的不足，利用大麦籽粒萌发3d的幼苗叶基愈伤组织用于转化，经筛选获得转基因植株，完全避免了大麦种植栽培这个耗时的过程，降低了实验成本。以叶基诱导愈伤为受体的遗传转化方法，与常规方法相比，培养转化受体所需的时间从150天缩短到3天，同时，克服了幼胚取材的时间限制。筛选获得的转基因植株经PCR分析鉴定为阳性，进一步经Southern杂交分析证实，外源基因确已整合到大麦基因组中，并且多为单个拷贝。本发明的方法周期短、效率高，程序简单，操作方便，结果可靠，具有十分广泛的应用价值。
与申请人已申请的大麦茎尖转基因方法相比，对技术的要求较低。茎尖转化时，需要操作人员除去幼苗的根、盾片、幼叶等，才能分离出幼苗的茎尖，同时用针适当刺伤茎尖生长点，该步骤有一定的技术要求，具有一定经验的人员才能熟练操作。因而，尽管茎尖转化不需要愈伤诱导，但对技术要求较高，不同人员之间操作常有一定的差异。而本发明不需要分离茎尖和针刺，切取叶基甚至比常规剥取幼胚还简单，对操作人员的技术要求较低，更容易实现。与现有技术相比，本发明的转基因的外植体(愈伤组织)可周年供应，显著提高了大麦转基因操作的效率。
本发明与经典的以幼胚为受体的转化方法相比，获得受体的时间从150天缩短到3天，克服了幼胚取材的时间限制。与茎尖转化方法相比，本发明对技术要求降低，操作简单，因而更适用于推广应用。
附图说明
序列表SEQIDNO：1是本发明的Ubi-1启动子序列，序列长度为495bp。
图1：是本发明使用的表达载体物理图谱。
Ubi：来自玉米的Ubiquitin启动子；Bar：Bar筛选基因；Nos：Nos终止子。
图2：小麦叶基遗传转化过程示意图。
A：剥离的大麦(品种E32380)成熟胚在培养基中暗培养3天；B：切取约2mm叶基用于愈伤组织的诱导；C：大麦叶基诱导28天的愈伤组织；D：愈伤组织在分化筛选培养基中分化出幼苗；E：在生根筛选培养基中生长的抗性幼苗；F：幼苗春化后移栽到上壤中。
图3：T0代植株PCR鉴定示意图。
M：分子量标记；1-2：来自E32380两个转基因植株；3-4：来自Epi2两个转基因植株；WT：来自E32380野生型对照。
图4：T1代株系Southernblot分析示意图。
T1代转基因株系基因组DNASacI消化后，以[32P]-dCTP标记UbiF和UbiR扩增的
Ubiquitin启动子上的PCR片段，进行Southernblot杂交。WT：E32380野生型对照；1-2来自E32380转基因后代(1：A8；2：C4)；3-4来自Epi2转基因后代(3：D4；4：F8)。
具体实施方式
实施例1：质粒载体的构建与根癌农杆菌转化
本发明所用载体为PMBL-9(在专利申请号为201110257189.9专利文献的说明书第13页即附图2的最终的表达质粒中，其命名为PMBL-9，该表达质粒的构建参考申请人的专利申请“一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法”，专利申请号为201110257189.9，公开号为CN102304544A，公开日为2012.01.04)。
转化根癌农杆菌：将PMBL-9载体电击转化农杆菌GV3101菌株(农杆菌GV3101菌株购自invitrogen公司，电击转化方法参照Sambrook等报道的方法，参见：Sambrook等，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)。冰上融解感受态农杆菌细胞，加入25ng质粒载体，混匀，静置5min，转入灭菌并预冷的电转化杯中，放入电转化仪(BIO-RADMicroPulserTM)两电极间，选择农杆菌转化模式，电击转化。转化后的农杆菌细胞，涂布于含有抗生素的YEB固体培养基(YEB培养基配方参见《发明内容》部分，附加100mg/L利福平、100mg/L羧苄青霉素、25mg/L卡那霉素、2mmol/LMgSO4，以及1.5％琼脂)上，28℃生长2-3d，挑单菌落，在YEB液体培养基(附加100mg/L利福平、100mg/L羧苄青霉素、25mg/L卡那霉素、2mmol/LMgSO4)中，28℃，扩大培养，2-3d，加终浓度为25％的甘油，-70℃保存，用于大麦的遗传转化。
实施例2：以大麦叶基切段为外植体进行愈伤诱导
1.大麦籽粒灭菌和成熟胚萌发
选取健康饱满的大麦籽粒(品种为鄂32380，，鄂啤2号(湖北省农业科学院惠赠))，去掉颖壳，先用70％酒精浸泡2min，再用0.1％升汞浸泡15min，倒掉酒精和升汞溶液，用灭菌水浸洗种子3-4次，每次3～5min；将灭菌后的种子浸泡在无菌水中，室温放置5～10h。超净台内倒掉灭菌水，剥取完整成熟胚，盾片向下，放置在MS基本培养基(MurashigeT，SkoogF.1962.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.PhysiologiaPlantarum，15，473-497)上，25℃，黑暗下培养3d。
2.切取大麦叶基诱导愈伤
用解剖刀切取萌发3d的大麦幼苗(图2A)叶基部约1mm叶基切段(包括叶基，胚芽鞘基部，生长点和叶原基)(见图2B)，将叶基切段纵切成两半，放置在诱导培养基上，黑暗，25℃培养。叶基在诱导培养基(含2mg/L2，4-D的MS，pH5.8)上诱导7d开始形成愈伤组织，20d继代在诱导培养基上，继续培养7d后，用于遗传转化。
实施例3：农杆菌介导的大麦遗传转化
1.愈伤的高渗处理
将培养27d的愈伤组织转到高渗培养基上，在25℃高渗处理4h。
2.农杆菌的浸染
保存的含有PMBL-9植物表达载体的农杆菌菌液1mL接种于50mLYEB培养基，该培养基附加100mg/L利福平(Rif)、100mg/L羧苄青霉素(Carb)、25mg/L卡那霉素(Kan)、2mmol/LMgSO4中，28℃、200r/min暗培养至OD600＝0.8左右，然后4℃，5000r/min离心，收集菌体，浸染液重悬(即重悬液)至OD600＝0.6左右。
将高渗处理后的愈伤转移到重悬液中，然后放置于100r/min的脱色摇床上30min进行转化。每次转化500～600个愈伤。其间采用超声波和真空渗入处理，具体步骤如下：
超声波处理：将浸泡在重悬液中的愈伤置于超声波清洗仪中处理20s，频率为5kHz。
真空渗入处理：将浸泡在重悬液中的愈伤置于真空泵中，待真空度升至80kPa时保持15min，处理后使真空度迅速下降为零。
3.愈伤和农杆菌共培养
浸染后将愈伤转到带有滤纸的培养皿中，在超净工作台上吹干，大约需要0.5h。然后将吹干的愈伤转移到共培培养基上，黑暗，25℃条件下共培养2d。
4.转化后的叶基愈伤恢复培养
将共培养后的愈伤转到三角瓶中，加入抑菌液(含500mg/L头孢霉素(Cef)的无菌水，浸过愈伤)，放置在脱色摇床上100r/min，30min，然后再用抑菌液冲洗，直到溶液澄清为止。随后将愈伤转移到带有滤纸的培养皿中，置于超净台上30min吹干。后将吹干的愈伤转移到恢复培养基(含500mg/L头孢霉素的诱导培养基)上。黑暗，25℃条件下恢复7d。
5.转化愈伤的筛选、分化、生根、壮苗及再生植株的春化和移栽
诱导筛选培养：愈伤组织恢复培养后，继代到诱导筛选培养基上，15～20d。
分化筛选培养：愈伤移至分化培养基上，连续分化筛选2轮，每轮15～20d。
生根筛选培养：把分化的幼苗转移至生根筛选培养基上，连续筛选两轮，每轮15～20d。
再生植株春化和移栽：将生长到3叶期的幼苗转到不含筛选压的生根培养基上，生出新根后放置在4℃条件下春化15d，将其转移到土壤中，16h/d光照，光照强度为9000Lux19℃条件下生长。
实施例4：对T0代转化植株的PCR检测
取0.1g左右的T0代大麦转基因植株的叶片，在液氮中研磨成粉末，用常规的CTAB法(参照本申请人的授权专利，专利号为200610019482.0文献“一种非抗生素筛选小麦转基因植物的方法”公开号CN101096703公开的方法)提取大麦总DNA(或称基因组DNA，二者含义相同)。设计一对引物：该引物对的DNA序列如下所示：正向引物UbiF5′-CGGTAGTTCTACTTCTGTTC-3′和反向引物UbiR5′-CATCTCTGTATATGCATCAG-3′进行PCR扩增，得到长度为495bp的片段，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。在25μlPCR反应液中，含有300ng模板DNA，2.5μlPCR缓冲液，1.5μl25mMMgCl2，2μl1.25mMdNTPs，0.5μlUbiF(10pmol/μl)，0.5μlUbiR(10pmol/μl)，1UTaq聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性4min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸10min。1.2％琼脂糖凝胶检测PCR产物反应完成后，取18μlPCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据PCR产物片段判断外源基因的整合情况。结果如图3所示。PCR鉴定获得6株E32380阳性植株，3株Epi2阳性植株，转化率分别为1.2％和0.6％。
实施例5：对T0代转化植株的SouthernBlot分析
选取4个PCR鉴定为阳性的T0代株系，取T1代大麦转基因植株的叶片3～5g，在液氮中研磨成粉末，用常规的CTAB法提取叶片基因组DNA(方法参考实施例4)，经SacI酶切、电泳、转膜后，以[32P]-dCTP标记UbiF和UbiR扩增的Ubiquitin启动子上的PCR片段，进行Southernblot杂交(结果见图4)，结果表明在这4个株系中均检测到杂交条带，其中以鄂32380叶基愈伤组织为受体的2个株系(见图4，1-2)，以鄂啤2号叶基愈伤为受体的株系2个(见图4，3-4)，而未转化的野生型对照(见图4，WT)没有信号。因此，证实这些小麦株系的基因组中整合了外源基因。这4个株系均分别只有1条杂交信号带，说明外源基因在大麦基因组中均为单位点整合。
Claims (1)
1.一种获得转基因大麦植物的方法，其步骤如下：
(1)质粒载体和根癌农杆菌的转化
将PMBL-9表达载体通过电击转化农杆菌GV3101菌株，用于大麦的遗传转化；
(2)大麦叶基外植体的制备
1)种子灭菌：将大麦种子去掉外面的颖壳，用70％酒精浸泡2min，然后用0.1％HgCl2浸泡15min，用灭菌水浸洗3-4次，每次3～5min,将灭菌后的种子浸泡在灭菌水中，室温放置5～10h；
2)剥胚：超净工作台内倒掉灭菌水，剥取完整的成熟胚，将盾片向下，放置在MS培养基上，在黑暗条件下25℃萌发培养3d；
3)叶基外植体制备：用解剖刀切取盾片上端1/5处约1mm的叶基，其包括生长点和胚芽鞘在内的切段，然后纵切成两半，放置在诱导培养基上，25℃黑暗下培养，20d后进行继代培养，再在诱导培养基上培养7d左右，获得愈伤组织；
(3)遗传转化
1)根癌农杆菌扩大培养：将保存的含有植物表达载体PMBL-9的农杆菌菌液1mL接种于50mLYEB培养基，28℃，200r/min暗培养至OD600＝0.8左右，然后于4℃，5000r/min下离心，收集菌体，将浸染液重悬至OD600＝0.6左右得到重悬液；
2)高渗处理：待转化愈伤组织在高渗培养基中预处理4h；
3)农杆菌浸染：将高渗培养基中预处理后的愈伤组织转移到重悬液中，采用超声波或者抽真空负压处理，放置摇床上，100r/min，30min；
超声波处理：将浸泡在重悬液中的愈伤组织置于超声波清洗仪中处理20s，频率为5kHz；
真空渗入处理：将浸泡在重悬液中的愈伤组织置于真空泵中，待真空度升至80kPa时保持15min；
4)共培养：浸染后的愈伤组织转到带有滤纸的培养皿中，在超净工作台上吹干，大约需要0.5h,然后将吹干后的愈伤组织转移到共培培养基上,于黑暗下，25℃条件下共培养2d；
5)洗菌：将共培养后的愈伤组织转到三角瓶中，加入含500mg/L头孢霉素的无菌水，放置在摇床上，100r/min，30min，然后再用抑菌液冲洗，直到液体澄清为止；
6)恢复培养：洗菌后的愈伤组织转移到带有滤纸的培养皿中，置于超净工作台上30min吹干，最后将吹干的愈伤组织转移到恢复培养基上，黑暗，25℃条件下恢复培养7d；
(4)诱导筛选
将恢复培养后的愈伤组织继代到诱导筛选培养基上筛选培养15～20d；
(5)分化筛选
诱导筛选后的愈伤组织移至分化筛选培养基上，连续分化筛选两轮，每轮15～20d，此时，转化的抗性愈伤组织上分化出健壮的幼苗，未转化对照愈伤组织上没有分化或只有少量的弱小幼苗；
(6)生根筛选
把分化筛选培养基上分化的幼苗转移至生根筛选培养基上，连续生根筛选两轮，每轮15～20d；此时，转化愈伤组织上分化的幼苗已生长出根，生长健壮，而对照愈伤组织分化出的少量幼苗大部分已筛死，个别未筛死的也很弱小；
(7)再生植株的移栽
将生根筛选后存活的幼苗转到不含筛选压的生根壮苗培养基上，长出新根后将其放置在4℃条件下春化处理15d，移栽到温室土壤中，于19℃，16h/d日光灯光照，光照强度为9000Lux下生长至种子成熟；
(8)再生植株的鉴定
1)PCR鉴定：提取待鉴定的大麦叶片基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，以Ubi-1启动子序列为模板设计引物，引物对的DNA序列如下所示：
正向引物UbiF：5’-CGGTAGTTCTACTTCTGTTC-3’，
反向引物UbiR：5’-CATCTCTGTATATGCATCAG-3’；
扩增得到的片段的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示；
反应体系：10×的PCRBuffer2.5μl，25mmol/L的MgCl21.5μl，1.25mmol/L的dNTPs2μl，10μmol/L的引物各0.5μl，5U/μl的Taq酶0.5μl，模板DNA100ng，补超纯水至总体积25μl；
2)Southernblot杂交：以T1代转基因大麦基因组DNA进行了Southernblot杂交，以重复验证获得的转基因植株并确定外源基因拷贝数；
所述萌发培养用培养基配方如下：1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8；
所述诱导培养基配方如下：
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/lVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2.0mg/L2，4-D，6g/L琼脂，pH5.8；
所述高渗培养基配方如下：
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，0.4mol/L甘露醇，2.0mg/L2，4-D，6g/L琼脂，pH5.8；
所述农杆菌浸染采用的培养基配方如下：
190mg/LKNO3，165mg/LNH4NO3，17mg/LKH2PO4，37mg/LMgSO4·7H2O，44mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，200mg/LL-脯氨酸，100mg/L水解酪蛋白，100mg/LVc，1.95g/L吗啉乙磺酸，30g/L麦芽糖，10g/L葡萄糖，200μL/LSilwetL-77，0.5g/L谷氨酰胺，2，4-D2.0mg/L，pH5.2，使用时加1‰200mmol/L乙酰丁香酮，抽滤灭菌；
所述共培培养基配方如下：190mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，0.69g/LL-脯氨酸，1g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2，4-D2.0mg/L，6g/L琼脂粉，pH5.2，使用前加1‰(v/v)经抽滤灭菌的200mmol/L乙酰丁香酮和500mg/L头孢霉素；
所述恢复培养基配方如下：1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌后加500mg/L头孢霉素；
所述诱导筛选培养基配方如下：
1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2，4-D2.0mg/L，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌后加5mg/L草铵膦和500mg/L头孢霉素；
所述分化筛选培养基配方如下：1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，0.5mg/L6-BA，0.5mg/LKT，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌后加5mg/L草铵膦和500mg/L头孢霉素；
所述生根筛选培养基配方如下：950mg/LKNO3，825mg/LNH4NO3，85mg/LKH2PO4，185mg/LMgSO4·7H2O，220mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌后加3mg/L草铵膦和500mg/L头孢霉素；
所述生根壮苗培养基配方如下：950mg/LKNO3，825mg/lNH4NO3，85mg/LKH2PO4，185mg/LMgSO4·7H2O，220mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，500mg/L脯氨酸，500mg/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，pH5.8，高压灭菌后加500mg/L头孢霉素。
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|---|
| 李和平等.大麦栽培品种叶基高效再生体系研究.《细胞• * |
| 生命•健康——第十一届中国细胞生物学学术大会暨2009西安细胞生物学国际会议论文集》.2009,219-220. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103421837A (zh) | 2013-12-04 |
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