CN113615691B - 一种植物抗冷剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种植物抗冷剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物抗冷剂及其制备方法和应用。该抗冷剂包括谷氨酰胺，还包括表面活性剂、氯化钙和5‑氨基乙酰丙酸，将谷氨酰胺(或谷氨酰胺、氯化钙和5‑氨基乙酰丙酸)溶于水，再加入表面活性剂，调节pH为中性后得到的混合溶液。在植物叶面正反面各喷施该植物抗冷剂后在低温条件下可有效地提高植物对低温冷害的耐受能力，使植物可以在较低的温度下具有较强的生长势，在早春遭遇低温冷害时保持较高光合同化性能，在植物生产上具有良好的应用前景。

Description

一种植物抗冷剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种植物抗冷剂及其制备方法和应用，属于种植技术领域。
背景技术
低温冷害是影响植物正常生长发育，导致其生长和产量下降的重要因素之一。全球每年因低温伤害造成的农林作物损失高达数千亿元。低温对作物的危害主要表现在细胞膜透性、渗透调节作用和活性氧自由基的产生和消除等方面。
(1)细胞膜系统与植物抗冷性的关系生物膜是植物细胞与环境的界面，膜系统是植物遭受伤害的敏感部位。电解质渗透率常用来表示细胞膜的伤害程度。植物在冷害胁迫过程中会导致膜质过氧化产物丙二醛大量累积。丙二醛含量高低是判断膜过氧化程度的重要指标。
(2)渗透调节作用在植物抗冷的过程中起着非常重要的作用。脯氨酸是最重要和有效的有机渗透调节物质之一。植物在正常条件下，游离脯氨酸的含量很低，而逆境胁迫条件下，游离脯氨酸便会大量积累，其含量与植物抗冷性之间呈正相关。
(3)逆境条件下，植物体内产生活性氧自由基使植物系统受到伤害，植物可以积极调动保护酶系统来有效清除自由基。过氧化氢酶能分解H2O2，从而清除过氧化体中的H2O2，该酶活性与植物抗寒性呈正相关。
鉴于低温对植物生长造成的伤害，采取一定的措施来防御低温冷害并改善低温冷害对作物的损伤十分有必要。为植物施加外源物质来提高植物的抗冷性对于提高作物生产具有重要意义。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种植物抗冷剂，本发明还要解决的技术问题是提供该植物抗冷剂的制备方法，本发明最后要解决的技术问题是提供该植物抗冷制剂在烟草低温抗冷中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种植物抗冷剂，所述植物抗冷剂包括谷氨酰胺，所述谷氨酰胺的浓度为1～1.5mM。
本发明所述植物抗冷剂还包括表面活性剂土温20、Silwet L-77或Triton X-100，当表面活性剂为土温20时，所述谷氨酰胺与土温20质量比为146-219:10，当表面活性剂为Silwet L-77时，所述谷氨酰胺与Silwet L-77质量比为146-219:1，当表面活性剂为TritonX-100时，所述氨酰胺与Triton X-100质量比为146-219:10。
本发明所述植物抗冷剂还包括氯化钙和5-氨基乙酰丙酸，所述谷氨酰胺、氯化钙和5-氨基乙酰丙酸三者质量比为219:15-25:2-5。
本发明所述的植物抗冷剂包括谷氨酰胺时，其制备方法包括以下步骤：称取谷氨酰胺溶于水中，调节pH至中性，于容量瓶内定容即得。
本发明所述的植物抗冷剂包括谷氨酰胺与表面活性剂时，其制备方法包括以下步骤：称取谷氨酰胺溶于水中，然后加入表面活性剂，调节pH至中性，于容量瓶内定容即得。
本发明所述的植物抗冷剂包括谷氨酰胺、氯化钙、5-氨基乙酰丙酸及表面活性剂时，其制备方法包括以下步骤：分别称取谷氨酰胺、氯化钙和5-氨基乙酰丙酸溶于水中，然后加入表面活性剂，调节pH至中性，于容量瓶内定容即得。
进一步地，制备植物抗冷剂时，所述谷氨酰胺的浓度为1～1.5mM。
本发明所述的植物抗冷剂在烟草低温抗冷中的应用。
进一步地，所述应用包括将所述植物抗冷剂均匀喷施在烟草叶片的正反面后置于低温条件。
进一步地，所述低温条件为0～4℃。
本发明的抗冷机理：本发明所述的植物抗冷剂喷施后，叶片在低温条件下细胞膜透性显著降低，可以减少低温对细胞膜的伤害，并通过提高渗透调节物质脯氨酸含量和产生更高清除活性氧自由基的酶含量来增强植物抗冷性，并促进烟草植株的叶片光合能力和生物量的增加而促进植株生长。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：
(1)本发明首次提供了新的植物抗冷剂。植物叶片喷施植物抗冷剂后植物抗冷能力增强，还能促进植物生长。
(2)将该植物抗冷剂用于烟草植株，该抗冷剂能促进烟草植株的抗冷能力，且显著促进烟草的光合作用、叶片面积增大和生物量显著增加，最终增强烟草的秧苗素质。
附图说明
图1为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的相对电导率图；
图2为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的丙二醛含量图；
图3为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的脯氨酸含量图；
图4为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的可溶性蛋白含量图；
图5为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的过氧化氢酶含量图；
图6为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草生物量图；
图7为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草叶面积图；
图8为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和3种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草表型图；
图9为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和3种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的净光合速率图；
图10为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的相对电导率图；
图11为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的丙二醛含量图；
图12为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的脯氨酸含量图；
图13为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的可溶性蛋白含量图；
图14为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的过氧化氢酶含量图；
图15为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草地上部生物量图；
图16为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草叶面积图；
图17为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草表型图；
图18为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的净光合速率图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明技术方案作进一步的说明。
实施例1植物抗冷剂--不同浓度的谷氨酰胺溶液的制备
1mM谷氨酰胺：称取0.1462g谷氨酰胺溶于700毫升水中，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
1.25mM谷氨酰胺：称取0.1827g谷氨酰胺溶于700毫升水中，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
1.5mM谷氨酰胺：称取0.2192g谷氨酰胺溶于700毫升水中，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
实施例2植物抗冷剂--谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物的制备
谷氨酰胺表面活性剂组合物1：称取0.2192g谷氨酰胺溶于700毫升水中，加入10mL表面活性剂土温20，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
谷氨酰胺表面活性剂组合物2：称取0.2192g谷氨酰胺溶于700毫升水中，加入1mL表面活性剂Silwet L-77，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
谷氨酰胺表面活性剂组合物3：称取0.2192g谷氨酰胺溶于700毫升水中，加入10mL表面活性剂Triton X-100，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
实施例3植物抗冷剂-谷氨酰胺、氯化钙和5-氨基酮戊酸的组合物的制备
谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L氯化钙+3mg/L 5-氨基酮戊酸的混合溶液)：分别称取0.2192g谷氨酰胺、0.015g氯化钙和0.003g 5-氨基酮戊酸，溶于700毫升水中，加入10mL表面活性剂土温20，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L氯化钙+5mg/L 5-氨基酮戊酸的混合溶液)：分别称取0.2192g谷氨酰胺、0.02g氯化钙、0.005g 5-氨基酮戊酸溶于700毫升水中，加入10mL表面活性剂土温20，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L氯化钙+2mg/L 5-氨基酮戊酸的混合溶液)：称取0.2192g谷氨酰胺、0.025g氯化钙、0.002g 5-氨基酮戊酸溶于700毫升水中，加入10mL表面活性剂土温20，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
20mg/L氯化钙混合溶液：称取0.02g氯化钙溶于700毫升水中，加入10mL表面活性剂土温20，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
2mg/L 5-氨基酮戊酸混合溶液：称取0.002g 5-氨基酮戊酸溶于700毫升水中，加入10mL表面活性剂土温20，调节pH至中性，于1L容量瓶内定容。
实施例4叶片喷施
分别在喷壶中加入实施例1～2配制好的植物抗冷剂--不同浓度的谷氨酰胺溶液(谷氨酰胺浓度为1mM、1.25mM、1.5mM)及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物谷氨酰胺表面活性剂组合物1-3(浓度为1.5mM的谷氨酰胺与吐温20、Silwet L-77、Triton X-100质量之比分别为146-219:10、146-219:1和146-219:10)，然后分别均匀喷施在烟草(品种K326)叶片的正反面，喷施体积为每株2毫升，对照组为喷施相同体积的清水，连续喷施三天后进行低温(0℃)6h处理。低温处理结束后每种供试的烟草植株分成两份，一份立即进行指示细胞膜系统伤害程度的相对电导率和膜质过氧化产物丙二醛、渗透调节物质游离脯氨酸及清除活性氧自由基过氧化氢酶，来检测试验低温处理的抗冷效果，具体见实施例5～实施例9。试验方法主要参考王学奎主编的“植物生理生化实验原理和技术”(2006第2版，高等教育出版社)。另一份转移到人工气候室继续培养一周，观察供试植物的生长情况。
实施例5指示细胞膜系统伤害程度的相对电导率的测定
叶片的处理：分别将实施例4喷施不同浓度的谷氨酰胺溶液、谷氨酰胺表面活性剂组合物1-3的叶片进行0℃低温处理6h后，叶片表面污物清除后用去离子水冲洗1～2次，干净纱布吸干叶片表面水分，然后用叶片打孔器获取圆叶(避开主叶脉)，叶片面积约8cm2。
每组随机取10个，分别放入加有10mL去离子水的烧杯中浸泡12h，测定烧杯中溶液的电导率，记为R1；然后将烧杯放入沸水浴加热30min，放至室温后再测定烧杯中溶液的电导率，记为R2。按照公式(1)计算相对电导率：
相对电导率＝R1/R2×100％ (1)
相对电导率测定结果如图1所示，图1为分别连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的相对电导率图，其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，C3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+Triton X-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图1可知，与喷施清水相比，喷施谷氨酰胺浓度1mM、1.25和1.5mM的叶片的相对电导率均显著下降，说明喷施1～1.5mM的谷氨酰胺的烟草叶片细胞伤害小，且随着谷氨酰胺浓度增大叶片的相对电导率下降的越明显，效果越好。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺，且喷施氨酰胺表面活性剂组合物3、氨酰胺表面活性剂组合物1和氨酰胺表面活性剂组合物2的效果依次增强。
实施例6指示细胞膜系统伤害程度的膜质过氧化产物丙二醛的测定
配置0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.8)，用5％三氧乙酸溶液配置0.5％硫代巴比妥酸溶液。
分别称取0.5g按照实施例5处理的烟草叶片，各加入2mL预冷的0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)与少量石英砂，在预冷的研钵内研磨成匀浆，转移到10mL离心管中，将研钵用磷酸缓冲液洗净，清洗液也移入离心管中，最后用磷酸缓冲液加至5mL。在离心机中4500r/min离心10min。上清液即为丙二醛提取液。
分别吸取2mL丙二醛提取液于刻度试管中，各加入3mL 0.5％硫代巴比妥酸溶液，于沸水浴中加热10min，迅速冷却。于离心机中4500r/min离心10min。取上清液在分光光度计上于532nm和600nm波长下，以蒸馏水为空白调透光率100％，测定吸光度。按照公式(2)计算丙二醛含量：
Figure BDA0003199587370000061
其中，A：吸光度，V1：反应液总量(5mL)，V：提取液总量(5mL)，V2：反应液中的提取液体积(2mL)，W：植物样品重量(0.5g)。
丙二醛含量的结果如图2所示，图2为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的丙二醛含量图，其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，C3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+Triton X-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图2可知，与喷施清水的处理相比，喷施三个不同浓度谷氨酰胺处理烟草叶片的丙二醛含量均显著下降，说明谷氨酰胺的喷施不仅抗冷性强且能显著促进植株生长能保护烟草叶片细胞不受伤害，且随着谷氨酰胺喷施浓度的增加叶片中丙二醛含量下降的越明显，效果越好。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺，且喷施氨酰胺表面活性剂组合物3、氨酰胺表面活性剂组合物1和氨酰胺表面活性剂组合物2的效果依次增强。
实施例7指示细胞膜系统伤害程度的渗透调节物质游离脯氨酸的测定
配置酸性茚三酮溶液，将1.25g酸性茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL6mol/L磷酸中，在70℃下搅拌加热溶解，贮于冰箱中。
1、标准曲线的绘制
(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线，此脯氨酸液浓度为100μg/mL。
(2)系列脯氨酸浓度的配制：取6个50mL容量瓶，分别加入脯氨酸溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸标准溶液浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL和6μg/mL。
(3)取6支试管，分别吸取2mL系列浓度脯氨酸标准溶液于试管中国，分别加入2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，将6只试管在沸水浴中加热30min。
(4)冷却后各试管分别准确加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液，上层为脯氨酸甲苯溶液。
(5)用注射器轻轻吸取各试管中的上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在分光光度计上于520nm波长测定吸光度。
(6)标准曲线的绘制：先求出吸光度值(Y)依脯氨酸浓度(X)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2mL测定液中脯氨酸的含量(μg/2mL)。
2、样品测定
称取按照实施例5处理的叶片各0.5g，剪碎后分别置入大试管中，而后向各试管中分别加入3％磺基水杨酸溶液5mL，在沸水浴中提取10min(同时摇动)，冷却后过滤于干净的大试管中，滤液即为脯氨酸提取液；分别吸取2mL脯氨酸提取液于另一干净的试管中，加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮溶液，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色；冷却后加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，取上层液至于10mL离心管中，在离心机中3000r/mii下离心5min；用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色皿中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处测定吸光度。根据回归方程或从标准曲线上查出2mL测定液中脯氨酸的浓度x(μg/mL)，然后按照公式(3)计算叶片中脯氨酸含量的百分数。
每克叶片鲜重中脯氨酸含量(％)＝X×(V1/V2)/(W×106)×100％ (3)
其中，X：标准曲线查出的2mL测定液中脯氨酸的含量，V1：脯氨酸提取液总体积(5mL)，V2:测定时所用脯氨酸提取液体积(2mL)，W：叶片重量(0.5g)。
脯氨酸含量结果如图3所示，图3为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的脯氨酸含量图，其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，C3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+Triton X-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图3可知，与喷施清水的处理相比，喷施三个不同浓度谷氨酰胺处理烟草叶片的脯氨酸含量均显著增加，说明谷氨酰胺的喷施能保护烟草叶片细胞不受伤害，且随着谷氨酰胺浓度的增加叶片中脯氨酸含量越高，效果越好。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺，且喷施氨酰胺表面活性剂组合物3、氨酰胺表面活性剂组合物1和氨酰胺表面活性剂组合物2的效果依次增强。
实施例8可溶性蛋白的测定
使用的试剂为100μg/mL的标准蛋白质溶液和考马斯亮蓝G-250试剂(称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95％的乙醇中，加入85％(W/V)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，于棕色试剂瓶中保存)。
1、标准曲线的绘制
取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样，蛋白质含量分别为0mg、20mg、40mg、60mg、80mg、100mg。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光径的比色皿在可见分光光度计上于595nm波长下比色，记录各管测定的OD光密度值，并以标准蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。
表1
试管号 1 2 3 4 5 6
100μg/mL的标准蛋白质溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝G-250试剂/mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
2、样品测定
分别称取按照实施例5处理的叶片0.5g，各用5mL磷酸缓冲液研磨成匀浆后，在离心机中3000r/min离心10min，吸取上清液1mL，放入试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置2min后在分光光度计上于595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。按照公式(4)计算叶片中可溶性蛋白质含量。
可溶性蛋白质含量＝(C×V1)/(1000×V2×W) (4)
其中，C：查得的标准曲线值(μg)，V1：提取液体积(5mL)，W：叶片重量(0.5g)，V2：测定时加样量(1mL)。
可溶性蛋白质含量结果如图4所示，图4为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的可溶性蛋白含量图，其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，C3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+Triton X-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图4可知，与喷施清水的处理相比，喷施三个不同浓度的谷氨酰胺处理烟草叶片的可溶性蛋白含量显著增加，说明谷氨酰胺的喷施能促进叶片可溶性蛋白含量的增加保护烟草叶片细胞不受低温伤害，且随着谷氨酰胺浓度的增加可溶性蛋白的含量越高，效果越好。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺，且喷施氨酰胺表面活性剂组合物3、氨酰胺表面活性剂组合物1和氨酰胺表面活性剂组合物2的效果依次增强。
实施例9指示细胞膜系统伤害程度的清除活性氧自由基过氧化氢酶含量的测定
使用的试剂为0.05mol/L磷酸缓冲液(pH为7.0)、0.3％H2O2溶液。
称取按照实施例5处理的叶片0.5g于预冷的研钵中，加lmL磷酸缓冲液，在冰浴上研磨成浆，加磷酸缓冲液至5mL。在离心机中10000r/min冷冻离心20min，上清液为提取液用于测过氧化氢酶含量。
取提取液50μL，加入3mL浓度为0.05mo1/L磷酸缓冲液再加入0.3％H2O2溶液200μL，迅速摇匀，立即计时，1min后在紫外分光光度计上于240nm波长下比色，每1min记录一次吸光度值，连续记录5min。以每分钟内A240下降0.01为1个酶含量单位(U)。按照公式(5)计算过氧化氢酶含量。
Figure BDA0003199587370000091
其中，ΔA240：反应时间内吸光度的变化，Vt：提取液体积(5mL)，W：叶片重量(0.5g)，Vs：测定时取用酶液体积(0.05mL)，t：反应时间(min)。
过氧化氢酶含量结果如图5所示，图5为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂组合物三天后0℃低温处理6h的过氧化氢酶含量图，其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+Triton X-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图5可知，与喷施清水的处理相比，喷施三个不同浓度的谷氨酰胺处理烟草叶片的过氧化氢酶含量显著增加，说明谷氨酰胺的喷施后叶片清除含量氧自由基的能力增强，且随着谷氨酰胺浓度的增加效果更好。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺，且喷施氨酰胺表面活性剂组合物3、氨酰胺表面活性剂组合物1和氨酰胺表面活性剂组合物2的效果依次增强。
实施例10连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物三天后0℃低温处理6h，然后移至人工气候室继续培养一周后烟草植株的生长情况
将实施例4的连续喷施植物抗冷剂-不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物溶液三天后0℃低温处理6h的烟草移至人工气候室继续培养一周后观察烟草植株的生长情况，结果如图6-图8所示。图6为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草生物量图，其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+TritonX-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图6可知，与喷施清水的处理相比，喷施谷氨酰胺的三个浓度处理烟草地上部生物量均显著增加，且喷施谷氨酰胺浓度越高效果越好，说明谷氨酰胺的喷施不仅增强植物抗冷性且能显著促进植株生长。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺，且喷施氨酰胺表面活性剂组合物3、氨酰胺表面活性剂组合物1和氨酰胺表面活性剂组合物2的效果依次增强。图7为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草叶面积图，其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+Triton X-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图7可知，与喷施清水的处理相比，喷施谷氨酰胺的三个浓度处理烟草叶面积均显著增加，且喷施谷氨酰胺浓度越高效果越好，说明谷氨酰胺的喷施能显著促进植株叶片的生长。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺，且喷施氨酰胺表面活性剂组合物3、氨酰胺表面活性剂组合物1和氨酰胺表面活性剂组合物2的效果依次增强。图8为连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草表型图；其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+Triton X-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图8可知，与喷施清水的处理相比，喷施谷氨酰胺的三个浓度处理烟草的生长均显著被促进，且喷施谷氨酰胺浓度越高效果越好。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺。说明谷氨酰胺及谷氨酰胺+三种表面活性剂的喷施后叶片受低温冷害的伤害小。
实施例11连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物三天后继续0℃低温处理6h，然后移至人工气候室继续培养一周后烟草植株净光合速率的测定
对实施例4连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物三天后低温(0℃)处理6h烟草植株继续移至人工气候室培养一周，选择光照充足的上午9:00-11:00，使用LI-6800光合仪进行净光合速率测定，结果如图9所示。图9为喷连续喷施不同浓度谷氨酰胺及谷氨酰胺和三种表面活性剂的组合物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的净光合速率图，其中，水为喷施清水(对照处理)，C1为喷施谷氨酰胺浓度1mM，C2为喷施谷氨酰胺浓度1.25mM，C3为喷施谷氨酰胺浓度1.5mM，3-1为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物3(谷氨酰胺浓度1.5mM+Triton X-100)，C3-2为喷施喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物1(谷氨酰胺浓度1.5mM+吐温20)，C3-3为喷施谷氨酰胺表面活性剂组合物2(谷氨酰胺浓度1.5mM+Silwet L-77)。由图9可知，与喷施清水的处理相比，喷施三个不同浓度的谷氨酰胺处理烟草叶片的净光合速率显著增加，且随着谷氨酰胺浓度的增加叶片的净光合速率增加越显著，效果越好。1.5mM的谷氨酰胺配合三种表面活性剂的效果优于单施谷氨酰胺。说明谷氨酰胺及谷氨酰胺+三种表面活性剂的喷施后叶片受低温冷害的伤害小，且喷施氨酰胺表面活性剂组合物3、氨酰胺表面活性剂组合物1和氨酰胺表面活性剂组合物2的效果依次增强。
实施例12喷施植物抗冷剂--谷氨酰胺组合物
实验步骤同实施例4，将实施例3配置的不同浓度的植物抗冷剂--谷氨酰胺组合物1、谷氨酰胺组合物2和谷氨酰胺组合物3分别喷施于不同烟草叶片的正反面，同时设置对照组：喷施清水，喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，喷施20mg/L CaCl2混合溶液，喷施1.5mM谷氨酰胺溶液。连续喷施三天后0℃低温处理6h，0℃低温处理6h结束后供试的烟草植株分成两份，一份立即进行指示细胞膜系统伤害程度的相对电导率和膜质过氧化产物丙二醛、渗透调节物质游离脯氨酸及清除活性氧自由基过氧化氢酶，来检测试验低温处理的抗冷效果，具体见实施例13～实施例17。试验方法主要参考王学奎主编的“植物生理生化实验原理和技术”(2006第2版，高等教育出版社)。另一份移至人工气候室继续培养一周，观察供试植物的生长情况
实施例13连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺组合物后指示细胞膜系统伤害程度的相对电导率的测定
供试的烟草植株为实施例12处理过的烟草植株，叶片处理方式及实验过程同实施例5，同时设置7组处理，对照组：喷施清水，喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，喷施20mg/L CaCl2混合溶液，喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液。实验组：喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，结果如图10所示。图10为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的相对电导率图，其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液；B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液；C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。由图10可知，与对照清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能显著降低烟草叶片的相对电导率，而喷施谷氨酰胺的降幅要大于喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙处理；而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。
实施例14连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺组合物后指示细胞膜系统伤害程度的膜质过氧化产物丙二醛的测定
供试的烟草植株为实施例12处理过的烟草植株，叶片处理方式同实施例5，实验步骤同实施例6，同时设置7个处理，对照组：喷施清水，喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，喷施20mg/L CaCl2混合溶液，喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液。实验组：喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，结果如图11所示。图11为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的丙二醛含量图；其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液，C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。由图11可知，对照清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能显著降低烟草叶片的丙二醛含量，而喷施谷氨酰胺后丙二醛含量的降幅要大于喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙处理的；而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。
实施例15连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺组合物后指示细胞膜系统伤害程度的渗透调节物质游离脯氨酸的测定
供试的烟草植株为实施例12处理过的烟草植株，叶片处理方式同实施例5，实验步骤同实施例7，同时设置7个处理，对照组：喷施清水，喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，喷施20mg/L CaCl2混合溶液，喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液。实验组：喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，结果如图12所示。图12为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的脯氨酸含量图，其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液，C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。由图12可知，对照清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能显著增加烟草叶片的脯氨酸含量，而喷施谷氨酰胺的脯氨酸含量增幅要大于5-氨基乙酰酸和氯化钙处理；而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。
实施例16连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺组合物后可溶性蛋白的测定
供试的烟草植株为实施例12处理过的烟草植株，叶片处理方式同实施例5，实验步骤同实施例8，同时设置7个处理，对照组：喷施清水，喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，喷施20mg/L CaCl2混合溶液，喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液。实验组：喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。结果如图13所示。图13连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的可溶性蛋白含量图，其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液，C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。由图13可知，与对照清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能显著增加烟草叶片的可溶性蛋白含量，而喷施谷氨酰胺的可溶性蛋白含量增幅要大于5-氨基乙酰酸和氯化钙处理；而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。
实施例17连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺组合物后指示细胞膜系统伤害程度的清除活性氧自由基过氧化氢酶含量的测定
供试的烟草植株为实施例12处理过的烟草植株，叶片处理方式同实施例4，实验步骤同实施例9，同时设置7个处理，对照组：喷施清水，喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，喷施20mg/L CaCl2混合溶液，喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液。实验组：喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。结果如图14所示。图14为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h的过氧化氢酶含量图，其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液；C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。由图14可知，与对照清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能显著增加烟草叶片的过氧化氢酶活性，而喷施谷氨酰胺的过氧化氢酶活性增幅要大于5-氨基乙酰酸和氯化钙处理；而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。
实施例18连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺组合物三天后0℃低温处理6h继续正常生长1周烟草植株生长情况
讲实施例12中的烟草植株另一份移至人工气候室继续培养一周，观察供试植物的生长情况，同时设置7个处理，对照组：喷施清水，喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，喷施20mg/L CaCl2混合溶液，喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液。实验组：喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。结果如图15所示。图15为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草植株生物量图，其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液，C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/LCaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/LCaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/LCaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。由图15可知，与对照清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能显著促进烟草地上部生物量增加，而喷施谷氨酰胺(的效果要优于5-氨基乙酰酸和氯化钙处理而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。图16为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草叶面积图，其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液，C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/LCaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/LCaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/LCaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。由图16可知，与清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能显著促进烟草叶面积增加，而喷施谷氨酰胺的效果要优于5-氨基乙酰酸和氯化钙处理，而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。图17为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的烟草表型图，其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液，C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。由图17可知，与清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能烟草的生长均显著被促进，而喷施谷氨酰胺的效果要优于5-氨基乙酰酸和氯化钙处理，而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。
实施例19连续喷施植物抗冷剂--不同浓度谷氨酰胺组合物三天后继续0℃低温处理6h，然后移至人工气候室继续培养一周后烟草植株净光合速率的测定
供试的烟草植株为实施例12处理过的烟草植株，实验步骤同实施例11，同时设置7个处理，对照组：喷施清水，喷施2mg/L 5-氨基乙酰丙酸混合溶液，喷施20mg/L CaCl2混合溶液，喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液。实验组：喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，结果如图18所示。图18为连续喷施不同浓度谷氨酰胺组合物及其他对照物三天后0℃低温处理6h继续生长1周的净光合速率图，其中，水为喷施清水，A为喷施2mg/L5-氨基乙酰丙酸混合溶液，B为喷施20mg/L CaCl2混合溶液，C为喷施1.5mM谷氨酰胺混合溶液，组合1为喷施谷氨酰胺组合物1(1.5mM谷氨酰胺+15mg/L CaCl2+3mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合2为喷施谷氨酰胺组合物2(1.5mM谷氨酰胺+20mg/L CaCl2+5mg/L 5-氨基乙酰丙酸)，组合3为喷施谷氨酰胺组合物3(1.5mM谷氨酰胺+25mg/L CaCl2+2mg/L 5-氨基乙酰丙酸)。如图18可知，与对照清水处理相比，喷施5-氨基乙酰酸和氯化钙能显著促进烟草叶片净光合速率的增加，而喷施谷氨酰胺的效果要优于5-氨基乙酰酸和氯化钙处理，而喷施谷氨酰胺组合物的效果要优于单独喷施谷氨酰胺混合溶液的效果，说明谷氨酰胺与氯化钙和5-氨基乙酰丙酸起到了协同增效的作用。

Claims (8)

1.一种植物抗冷剂，其特征在于，所述植物抗冷剂包括谷氨酰胺，所述谷氨酰胺的浓度为1 ~1.5mM，所述植物抗冷剂还包括氯化钙和5-氨基乙酰丙酸，所述谷氨酰胺、氯化钙和5-氨基乙酰丙酸三者质量比为219:15-25:2-5。
2.权利要求1所述的植物抗冷剂，其特征在于，所述植物抗冷剂还包括表面活性剂土温20、Silwet L-77或Triton X-100。
3.权利要求1所述的植物抗冷剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分别称取谷氨酰胺、氯化钙和5-氨基乙酰丙酸溶于水中，调节pH至中性，于容量瓶内定容即得。
4.权利要求2所述的植物抗冷剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分别称取谷氨酰胺、氯化钙和5-氨基乙酰丙酸溶于水中，然后加入表面活性剂，调节pH至中性，于容量瓶内定容即得。
5.根据权利要求3或4所述的植物抗冷剂的制备方法，其特征在于，所述谷氨酰胺的浓度为1 ~1.5mM。
6.权利要求1或2所述的植物抗冷剂在烟草低温抗冷中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述植物抗冷剂均匀喷施在烟草叶片的正反面后置于低温条件。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述低温条件为0~4℃。
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CN104886129A (zh) * 2015-05-21 2015-09-09 刘洋 一种应用于花卉及蔬菜抗低温、耐弱光的配方制剂
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