CN102286511A - 一种用于有性繁殖植物外源基因生物安全控制的基因自动删除双元系统及其相关植物表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明构建了一种用于控制有性繁殖植物外源基因生物安全隐患的新型基因自动删除双元系统(Gene-Auto-Excision Binary System，GAEBS)。主要利用转录激活系统(transcription system)作为分子开关控制重组酶删除系统，一方面维持了位于重组酶识别位点之间的重组酶基因在植物有性世代中沉默，实现“GM-gene-deletor”技术导入的外源基因在亲本植物有性世代中的稳定遗传；另一方面通过将分别携带效应子元件和激活子元体的亲本植物进行杂交的方式，使转录激活系统的两个相互配合的元件合拢，从而呈现转录激活因子活性的同时，利用植物组织特异性启动子启动重组酶的表达进而实现外源基因的删除，获得安全的转基因植物，解决外源基因可能带来的生物安全隐患问题。

Description

一种用于有性繁殖植物外源基因生物安全控制的基因自动删除双元系统及其相关植物表达载体

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说涉及用于转基因植物安全性控制的方法和系统。

背景技术

自1983年第一例转基因烟草诞生以来，随着基因工程技术的广泛发展，转基因植物及其产品大量问世，在世界范围内掀起了生物技术发展的一个新高潮。据统计，到2009年，全球转基因作物种植面积达到了1.34亿公顷。

尽管植物转基因技术已成为了世界上增加粮食产量、减少环境污染最重要的手段之一。但是，该技术从其诞生之初，人们就争论不断。相对于传统育种技术，转基因技术的最大优势在于突破了物种间的生殖隔离，在人工条件下，把目标基因转移到受体植物中，定向改良植物的性状，实现诸如抗虫、抗旱、抗病等人类期望的目的，提高作物产量。人们可以利用生物技术将从细菌、病毒、动物、人类、远缘植物来源的基因甚至人工合成的基因导入植物基因组中。而这种情况在自然界中几乎不可能发生，所以人们无法预测基因的这种转移对未来生态环境和人类的健康会产生什么样的影响。因此，世界各国(尤其是欧洲)对转基因技术的安全性心存顾虑，担心转基因植物会对生态环境造成破坏甚至会给人类健康带来不利影响。随着转基因生物应用的范围不断扩大，科学界和公众对转基因生物安全性的担忧也日益增加。这种担忧已经严重影响到了转基因作物的大面积商业化推广。

目前，人们对转基因作物生物安全性的担忧主要集中在两个方面：

一、生态安全：研究证明在许多农作物与其野生近缘种之间，花粉介导的基因逃逸现象非常普遍。因此，人们担心转基因植物中抗虫、抗病、抗除草剂等外源基因可能逃逸到自然界中，出现所谓的“超级杂草”。某些抗虫基因(如Bt基因)不仅能有效杀死害虫，同时也会对非靶标生物造成伤害。另外，转基因种子也可能借助风、昆虫、鸟等媒介进入其它环境中，进而可能破坏当地的生态平衡。上述问题都可能给生态平衡和生物多样性带来灾难性的后果。

二、食品安全：公众担心转基因产品中的杀虫、抗菌基因以及过敏蛋白会对人类健康不利，造成诸如慢性食物中毒、癌变或过敏反应等危害。最近的一项研究发现，人体内微生物的某些基因能够水平转移到人类基因组上。转基因食品的外源基因有可能通过人体微生物转移到人类的染色体上，给我们的健康和后代造成潜在危险。这种潜在的危险导致一些团体和个人对转基因生物的强烈反对，甚至要求销毁和完全抵制转基因生物。

对新兴技术采取完全的排斥和抵制是片面的。正确的方式是，首先要充分认识到转基因生物的安全隐患，同时建立起转基因生物安全性的评估与控制体系，确保其应用的安全性。目前，世界主要发达国家和部分发展中国家都制定了各自对转基因生物(包括植物)的管理法规，负责对其安全性进行评价和监控。但是，这种管理、评价和监控所需时间长，不仅耗资巨大、难度也很大。而且，我国的农业生产的特点是以小型家庭经济为主。因此，要实现对转基因种子的完全控制难度更大，不利于转基因产品的商业化发展。

在加强对转基因生物管理的同时，科学家们正在积极探索控制转基因生物安全隐患的生物技术。消除转基因安全隐患技术的主要目的是控制或消除外源基因可能通过花粉和种子带来的生物安全危害的途径。该技术的要点是，在外源基因(如抗虫、抗病、抗除草剂)完成其生物学功能后，转基因植物向环境扩散或其产品被食用前，消除这些外源基因的潜在安全隐患。生物技术由于操作简单，成本低廉，而受到各国科学家们的青睐。然而，现有的生物技术大多不能满足田间大规模种植转基因作物安全性控制的需要，特别是水稻、玉米、油菜等杂交作物种外源基因的生物安全隐患，目前，还没有一种有效适用的生物控制措施。

关于控制转基因生物安全隐患的技术研究已有许多报道。这些研究主要集中在如何控制和消除抗生素等筛选标记基因的生物安全隐患上。一种策略是选用目前无争议的生物安全标记基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、核糖醇操纵子(NL)和6-磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)等。这种策略无法解决目的基因(如抗病基因)及启动子可能带来的生物安全隐患。而另一种策略是在抗生素等标记基因完成其功能后，利用生物技术手段将其从转基因植物基因组中去除，从而消除转基因可能造成的生物安全隐患。抗生素等外源基因删除的生物技术通常从两方面考虑：一方面，为了防止转基因逃逸带来的生态问题，花粉和种子不育技术、“终止子”技术、叶绿体转基因技术等已经发展起来，消除外源基因通过花粉或种子引起的扩散。另一方面是关于转基因食用安全的问题，相关的技术主要有：转座子(transposon)技术、共转化(co-transformation)技术、无抗生素筛选标记基因转化技术等。

但是，上述技术存在以下缺点：一、技术操作难度大，且繁琐；二、无法同时解决转基因的环境和食用安全问题；三、只考虑抗性标记基因的删除，而忽视了目的基因可能带来的安全性问题；四、删除外源基因的效率低、周期长。因此，现有的技术均不能满足田间大规模种植转基因作物安全性控制的需要。

此外，来源于微生物的位点特异性重组酶系统，也是一类很好的删除外源基因的工具。目前，已经在植物上得到较多应用的位点特异性重组酶系统包括：一、来源于细菌噬菌体P1(Bacteriophage P1)的Cre/loxP系统；二、来自于酵母(Saccharomyces cerevisiae)2μ质粒的FLP/FRT系统；三、来自于Zygosaccharomyces rouxii pSR1质粒的R/Rs。

相对而言，基于位点特异性重组酶系统Cre/loxP和FLP/FRT的基因删除技术因具有操作简单易行，删除效率高等优点，近年来已被广泛应用到转基因植物生物安全控制中。这些系统工作原理简单，完成重组反应的元件仅需：重组酶(recombinase)和识别位点(recognitionsite)。其反应过程：重组酶识别基因组中对应的特异性识别位点，并与之结合形成“Holliday”结构；然后重组酶C-端酪氨酸残基的羟基发生亲核攻击，破坏识别位点中不对称8bp序列两端的磷酸键；随后重组酶4个单体发生脂基转移反应，将位于识别位点间的DNA片断和1个识别位点删除，最后，基因组DNA再重新连接，完成重组。自重组酶系统在植物中应用以来，目前已经在烟草、玉米、水稻、拟南芥等多种植物获得了标记基因的删除。

利用位点特异性重组酶系统删除外源基因主要有以下两种方式：

一、反式作用删除外源基因。主要用于标记基因的删除，其基本策略：构建两个植物表达载体，其中一个载体含有一对同向识别位点、标记基因和目的基因，并将标记基因置于同向识别位点之间；另一个载体含有CaMV35S等组成型启动子控制的重组酶基因表达元件。当获得含有目的基因的转基因植物后，其标记基因的删除有两种途径：一是通过二次转化将组成型表达的重组酶基因导入转基因植物中，将位于识别位点间的标记基因删除掉(Russellet al.，1992；Corneille et al.，2001；Marjanac et al.，2008)；二是将含有目的基因的转基因植株与含有重组酶基因的植株杂交，将含有目的基因的转基因植株中的标记基因删除(Corneille etal.，2001；Arumugam et al.，2007)。在这种删除策略中，重组酶基因和识别位点位于不同的染色体上，两者的相互作用可看作是一种反式作用。无论是二次转化还是杂交途径所获得的无标记基因的植株，都需通过有性世代的遗传分离，去除重组酶基因，因此操作繁琐，时间较长，而且无法用于无性繁殖植物中标记基因的删除。

二、位点特异性重组酶介导的基因自动删除。在反式作用删除外源基因策略中，CaMV35S启动子控制Cre重组酶超量表达常常导致植物表型异常，如植株生长迟滞，叶片黄化(Coppoolse et al.，2003)。因此，作为方式一的改进，将重组酶基因、识别位点序列以及外源基因放在同一表达载体上，除目的基因外，所有外源基因均位于识别位点之间。重组酶基因的表达受诱导型启动子或组织特异性启动子的控制，可以在转基因植物生长的任何组织或任何阶段删除除目的基因外的所有外源基因(包括标记基因)。诱导型启动子控制的重组酶删除技术删除外源基因具有可控性优点，即当我们需要删除时，可以人工诱导启动重组酶删除外源基因，而不需要时可让重组酶基因保持沉默。然而由于其删除效率低且不彻底，因而，难于用于农业生产中，控制转基因可能带来的生物安全问题。而组织特异性启动子控制的重组酶删除技术由于操作简单、删除效率高而被广泛的研究和应用(Gidoni et al.，2008)。

2002年，Keenan等提出了一种从转基因植物生产非转基因食品的技术思路(Keenan andStemmer，2002)：即将所有外源基因置于loxp识别位点之间，用化学诱导启动子或组织特异启动子控制重组酶基因的表达。在化学诱导启动子控制下，可以随时删除所有外源基因，获得非转基因植株。更令人振奋的是：如果用种子、花粉、果实等组织特异启动子控制重组酶的表达，就可以从转基因植物上生产出不含任何外源基因的种子、花粉和果实等，解决转基因通过花粉和种子带来的生态安全问题，以及转基因食品的食用安全问题。

在此基础上，本实验研究人员曾与美国康涅狄格大学合作，成功构建了“基因删除系统”(“GM-gene-deletor”)(Luo et al.，2007)。该系统主要包括一对同向融合识别位点loxP-FRT和由组织(如花粉或种子)特异性启动子控制的重组酶基因FLP。其中，所有外源基因均置于loxP-FRT识别位点序列之间。转基因烟草试验结果表明，该删除系统具有高效、准确、彻底等优点。在采用“GM-gene-deletor”系统的转基因植物中，花粉或种子特异启动子控制重组酶的表达，目的基因(如GUS)在转基因植物的营养体(根、茎、叶)中正常表达而发挥其生物功能，而所有外源基因(NPTII、GUS和重组酶基因)在花粉和种子的基因组中被高效而彻底地删除，删除效率达到100％。可以实现keenan等的“用转基因植物生产非转基因产品”的设想。该技术发表后，被认为是“生物技术领域的一次重大革命”。

尽管“GM-gene-deletor”删除系统在转基因烟草中已经获得了很高达的删除效率(100％)，实现了对所有外源基因的彻底删除，但该系统目前还只能应用于无性繁殖的转基因植物中。这是因为利用该技术一旦将外源基因导入植物基因组后，外源基因的删除就随植物的发育进程而程序性地自动进行，导致外源基因在转基因植物T₀代花粉或种子中就被完全切除。因而，在转基因植物的后代中，将不再具有提高植物抗性、改良作物品质等外源目的基因。也就是说，通过“GM-gene-deletor”技术导入的优良基因无法通过有性繁殖传给后代，也就无法使农民享受转基因带来的利益。而像玉米、水稻、小麦和油菜等主要农作物都是以有性繁殖的方式进行转基因品种的培育。因此，如果“GM-gene-deletor”系统能应用于有性繁殖的植物中，其重要性是不言而喻的。

要实现通过“GM-gene-deletor”技术导入的外源基因在植物有性世代中的稳定遗传，就必需维持位于重组酶识别位点序列之间的重组酶基因在植物有性世代中沉默。Zuo等(2001)利用XVE化学诱导系统控制重组酶基因的条件性表达，实现了外源基因在转基因植株后代的稳定遗传，可以用于有性繁殖的植物，然而删除效率只有29％-60％，只适用于选择标记基因的删除，且化学药品的使用也会带来环境污染问题。Zhang等(2003)将重组酶与识别位点分别导入烟草中，虽然实现了NPTII基因在转基因F₁代营养体和生殖细胞中的删除，然而无法解决重组酶基因带来的潜在生物安全隐患。虽然，重组酶对人类健康的危害还未见报道，但有研究表明，高水平表达的Cre重组酶蛋白能导致转基因小鼠100％雄性不育(Schmidtet al.，2000)。因此，在利用重组酶删除系统控制外源基因的生物安全隐患时，必需考虑重组酶可能带来的生物安全隐患。所以，如何利用现有生物技术手段保证重组酶删除系统在植物有性繁殖世代中稳定遗传的同时，实现在需要删除外源基因时能高效删除包括重组酶酶基因在内的所有外源基因是目前重组酶删除技术应用所面临的一大技术瓶颈。

在现有的转基因调控技术中，转录激活系统(transactivation system)已被广泛地用于植物基因的功能研究中。该类系统的工作原理是基于基因转录激活的反式作用原理所建立的。众所周知，细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的(modular)，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域(domain)构成，其中有DNA结合功能域(DNAbinding domain，DNA-BD)和转录激活结构域(activation domain，DNA-AD)。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列(upstream activatingsequence，UAS)的下游启动子(Target promoter)，使启动子下游基因得到转录。而且将来源不同转录因子的DNA结合功能域和转录激活结构域组成杂合蛋白，该蛋白仍能同相应的顺式作用元件结合，激活下游基因的转录。这种顺反作用是特异的，即特定的Target promoter只应答相应的DNA结合功能域(DNAbinding domain，DNA-BD。显然，靶标启动子(Targetpromoter)控制的基因的表达与否及表达模式受控于转录激活蛋白的调控且与后者的表达模式一致，且在缺乏相应的转录激活因子时，靶标启动子控制的下游基因将保持沉默。

目前，据此原理设计的许多高效转录激活系统已被广泛用于植物基因功能、基因克隆、enhancer trapping等研究中。其中，转录激活系统通过有性杂交激活目的基因的反式作用原理正好与有性繁殖植物的特点相吻合，即可以利用转绿激活系统作为分子开关反式控制重组酶删除系统，维持外源基因在作物有性繁殖时代中的稳定遗传，然后通过杂交的方式实现外源基因在植物特定发育时空中删除，解决现有重组酶删除技术特别是“GM-gene-deletor”技术无法用于有性繁殖植物生物安全控制的问题。

发明内容

鉴于以上情况，为了解决“GM-gene-deletor”等现有基因删除技术不能解决有性繁殖植物外源基因生物安全隐患控制的技术难题，本发明提供了一种有效控制有性繁殖植物转基因生物安全的基因自动删除双元系统(GAEBS)。该系统利用转绿激活系统作为分子开关反式控制重组酶删除系统的表达，一方面维持了位于重组酶识别位点之间的重组酶基因在植物有性世代中沉默，实现“GM-gene-deletor”技术导入的外源基因在植物有性世代中的稳定遗传；另一方面通过杂交的方式，使转录激活系统的两个相互配合的元件合拢，从而呈现转录激活因子活性的同时，利用植物组织特异性启动子启动重组酶基因的表达进而实现外源基因的删除，解决外源基因可能带来的生物安全隐患问题。

根据本发明的一个方面，本发明的一个目的是提供一种用于有性繁殖植物外源基因生物安全控制的基因自动删除双元系统，所述基因自动删除双元系统通过构建两个植物表达载体，分别称为第一植物表达载体和第二植物表达载体，来实现有性繁殖植物外源基因生物安全性的控制。其中，植物表达载体包括必要的元件和携带这些元件的质粒载体，用于构建第一植物表达载体的元件称为效应子元件，以下称Effector元件，用于构建第二植物表达载体元件称为激活子元件，以下称Activator元件。具体地说，Effector元件包括两个同向的重组酶特异识别位点；且在所述两个同向重组酶特异性识别位点之间插入下述基因或核苷酸：控制外源基因表达的启动子、用于导入外源基因的多克隆位点、重组酶基因以及维持所述重组酶基因沉默的靶标启动子(target promoter)。Activator元件包括两个同向的重组酶特异识别位点；在所述两个重组酶特异性识别位点之间插入下述基因或核苷酸：控制外源基因表达的启动子、用于导入外源基因的多克隆位点、控制转录激活因子基因的启动子以及与Effector元件中的靶标启动子配合的转录激活因子基因。通过将上述效应子元件/激活子元件可操作地插入质粒载体构建第一植物表达载体和第二植物表达载体，通过第一植物表达载体和第二植物表达载体，分别将所述Effector元件和Activator元件导入植物基因组中，当携带Effector元件和Activator元件的植物作为亲本相互杂交时，所述Effector元件中的靶标启动子将与Activator元件中的转录激活因子基因相结合，使转录激活因子的活性得到呈现并可激活控制转录激活因子基因的启动子活性从而使重组酶基因得到表达，实现包括重组酶基因在内的所有外源基因的删除，达到控制有性繁殖植物外源基因生物安全性的目的。

进一步地说，本发明中用于有性繁殖植物转基因生物安全性控制的基因自动删除双元系统中的重组酶删除系统可以是从动物、植物或微生物中分离克隆到的天然重组酶系统，或者是人工改造、设计合成的重组酶系统；优选来源于细菌噬菌体P1(Bacteriophage P1)的Cre/loxP系统和Cre^int/loxP系统，或来自于酵母(Saccharomyces cerevisiae)2μ质粒的FLP/FRT系统。所述重组酶特异性识别位点序列优选loxp、lox2272，lox5171和FRT识别位点，所述重组酶基因选自FLP、Cre和Cre^int’基因。其中cre^int基因为含有植物来源内含子的人工改造过的重组酶基因，具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，其中植物来源的内含子为pCAMBIA1305.1(GenBank登录号：AF354045.1)，载体上GUS基因的内含子为catalaseintron。

进一步地说，本发明中用于控制转录激活因子基因的启动子可以是从动物、植物或微生物中分离克隆到的天然启动子，也可以是人工改造或设计合成的启动子；优选强启动子或组织特异性启动子，特别是椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(CaMV35S)。

进一步地说，本发明中转录激活系统可以为动物、微生物中分离克隆得到的天然转录激活系统，或者是人工改造、设计合成的转录激活系统，优选tTA/TOP10/pTAX、Gal4:VP16/UAS、mGal4:VP16/UAS或pOp/LhG4等人工设计的转录激活系统。特别是，靶标启动子为pOp，和与之配合的转录激活因子基因为LhG4ATO，后者是转录激活因子基因LhG4的改进版，其密码子具有拟南芥密码子偏好性。

根据本发明的另一个方面，提供包含上述Effector元件和Activator元件的植物表达载体，即第一植物表达载体和第二植物表达载体，以下分别称Effector植物表达载体和Activator植物表达载体。所述Effector植物表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点；且在所述两个同向重组酶特异性识别位点之间插入下述基因或核苷酸：控制外源基因表达的启动子、用于导入外源基因的多克隆位点、重组酶基因以及维持所述重组酶基因沉默的靶标启动子。所述Activator植物表达载体包括两个同向的重组酶特异识别位点：在所述两个重组酶特异性识别位点之间插入下述基因或核苷酸：控制外源基因表达的启动子、用于导入外源基因的多克隆位点、控制转录激活因子基因的启动子以及与Effector元件中的靶标启动子配合的转录激活因子基因。

根据本发明的又一个方面，本发明的另一个目的是提供上述基因自动删除双元系统在制备安全的转基因植物中的用途。当分别携带Effector元件和Activator元件的植物作为亲本相互杂交时，所述Effector元件中的靶标启动子将与Activator元件中的转录激活因子基因结合，呈现转录激活因子的活性并可激活控制转录激活因子基因的启动子活性从而使重组酶基因得到表达，实现包括重组酶基因在内的所有外源基因的删除，达到控制有性繁殖植物外源基因生物安全性的目的。

本发明的再一个方面是提供一种制备安全的转基因植物的方法，首先是构建基因自动删除双元系统的Effector元件和Activator元件，并将需要导入植物基因组的外源基因插入Effector元件和/或Activator元件的多克隆位点中，然后分别将得到的Effector植物表达载体和Activator植物表达载体转化到宿主植物中，获得第一基因植物以及第二转基因植物，以下分别称为Effector转基因植物以及Activator转基因植物；最后将Effector转基因植物以及Activator转基因植物作为亲本进行杂交，使分别来自Effector转基因植株和Activator转基因植株的Activator元件和Effector元件合拢，重新呈现转录激活因子活性并在植物组织特异性的启动子的作用开启重组酶基因的表达，最终实现包括重组酶基因在内的所有外源基因的删除，获得安全的转基因植物。

本发明针对“GM-gene-deletor”等基因删除技术无法维持外源基因在植物有性世代中稳定遗传的缺点，通过大量研究和分析以及前期试验，创造性地提出利用转录激活系统(transactivation system)作为分子开关控制重组酶删除系统的表达，构建了一种全新的基因自动删除双元系统GAEBS。根据GAEBS的工作原理，在大量筛选转录激活系统和重组酶系统的基础上，采用了pOp/LhG4转录激活系统和Cre/loxp重组酶系统构建GAEBS系统，GAEBS系统中的Activator元件和Effector元件可以转入本领域常用的载体中构建成表达载体再转入植物基因组中。在Activator元件和Effector元件中均提供了用于外源功能基因插入的多克隆位点序列，任何外源功能基因均可插入其中，用于植物基因工程的遗传改良。

本发明中转基因烟草实验结果表明，通过Effector转基因植物与Activator转基因植物的有性杂交，在植物组织特异性启动子CaMV 35S调控的基因自动删除系统的指导下能高效地将来源于双亲的所有外源基因从杂交后代的特定组织或部位中彻底删除，删除效率达到100％。因此，本发明成功地构建了基因自动删除双元系统GAEBS和包含该系统的植物表达载体，该系统成功解决了现有技术无法解决有性繁殖世代中外源基因稳定遗传的技术难题，即维持了位于重组酶识别位点序列之间的重组酶基因在植物有性世代中沉默，实现“GM-gene-deletor”技术导入的外源基因在植物有性世代中的稳定遗传；并利用植物组织特异性启动子在特定的组织或部位启动重组酶的表达从而删除外源基因，解决外源基因可能带来的生物安全隐患问题，具有明显有益的效果。

附图的简要说明

图1为携带有CaMV 35S-GFP-nos元件的克隆载体pUC-CaMV 35S-GFP-nos结构示意图

其中，CaMV35S和35S为来源于花椰菜花叶病毒的植物组织特异性启动子；mGFPer(本发明简称为“GFP”)为绿色荧光蛋白基因；nos为冠瘿碱合成酶基因转录终止序列。AP^r为安卡青霉素抗性基因，用于阳性克隆子的筛选。

图2为携带有35S-bar-nos元件的克隆载体pUC-35S-bar-nos结构示意图

其中，bar为膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinthricin acetyltransferase，PAT)基因。

图3为含有Spacer序列的克隆载体pBS-spacer结构示意图

Spacer片段为来自pCAMBIA4956:ET15载体的长约2.4kb的非功能片段。

图4为携带有loxp-CaMV35S:GFP-MCS-35S:bar-loxp元件的双元表达载体ploxpGMBloxp的构建流程图。

其中，NPTIII为卡那霉素抗性基因；NPTII为新霉素磷酸转移酶基因；LB为T-DNA左边界；RB为T-DNA右边界；loxp为cre/loxp重组酶系统的识别位点序列。pBIN 19为用于构建植物表达载体的骨架载体。

图5为含有lox2272-CaMV35S:GFP-MCS-35S:bar-lox2272元件的双元表达载体plox2272GMNlox2272的构建流程图。

其中，Loxp2272为loxp序列的突变型识别位点序列；nosP为冠瘿碱合成酶基因启动子。

图6为含有loxp-CaMV35S:GUS:NPTII-MCS-loxp的双元载体pLoxpGN-MCS的构建流程图。

Amp-r为氨苄青霉素抗性基因。

图7为含有pOp:cre^int元件的Effector植物表达载体pLOCB的构建流程图。

T3A为豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基rbcS-3A基因的polyA序列；AP^r为氨苄青霉素抗性基因。

图8为含有pOp:cre^int元件的Effector植物表达载体pL2272OCN的构建流程图。

图9为含有35S:LhG4^ATO元件的Activator植物表达载体pL35SLhG4构建流程图。

图10为Effector转基因烟草植株的检测图。

其中，A和B为转基因植株不同组织中GFP基因表达的荧光检测图。A为GFP基因在转基因叶片中的表达；B为GFP基因在转基因根中的表达。CK为野生型再生植株组织。C为部分pLOCB转基因烟草的PCR验证结果。其中，P泳道为以pLOCB质粒为模板；1-10泳道为以pLOCB GFP⁺阳性植株的DNA为模板。D为pL2272OCN转基因烟草的PCR验证。其中，11-20泳道为以pL2272OCN GFP⁺阳性植株的DNA为模板。M泳道为DNA分子marker；H泳道为以H₂O为模板；WT为以非转基因再生植株的DNA为模板。扩增的靶标片段为长约0.8kb的pOp-cre^int片段。Bar＝3mm。

图11为Activator转基因烟草植株的获得检测图。

其中，A和B为转基因植株不同组织中GUS基因表达的组织化学染色分析。A为转基因根、茎、叶中的GUS组织化学染色结果图；B为非转基因植株的根、茎、叶的GUS组织化学染色结果图。C为pL35SLhG4转基因烟草的PCR验证结果图。其中，M泳道为DNA分子marker；WT为以非转基因再生植株的DNA为模板。P泳道为以pL35SLhG4质粒为模板；1-9泳道为以pL35SLhG4GUS⁺阳性植株的DNA为模板。扩增的靶标片段为长约1.4kb的35S-LhG4^ATO片段。Bar＝2mm。

图12为GAEBS系统在同一pL35SLhG4植株与不同pLOCB植株的杂交后代中删除外源基因的效率分析图。

分别统计后代种子中系统删除GFP和GUS基因的删除效率，然后计算平均删除效率：平均删除效率(％)＝(删除GFP基因的效率+删除GUS基因的效率)/2。

图13为GAEBS系统在同一pLOCB植株与不同pL35SLhG4植株的杂交后代中删除外源基因的效率分析图。

分别统计后代种子中系统删除GFP和GUS基因的删除效率，然后计算平均删除效率：平均删除效率(％)＝(删除GFP基因的效率+删除GUS基因的效率)/2。

图14为GAEBS系统在pL2272OCN植株与pL35SLhG4植株的杂交后代中删除外源基因的效率分析图。

分别统计后代种子中系统删除GFP基因和GUS的删除效率，然后计算平均删除效率：平均删除效率(％)＝(删除GFP基因的效率+删除GUS基因的效率)/2。

图15为不同基因自动删除双元系统删除外源基因效率的统计结果图。

误差棒Vertical bars＝S.E.。其中，“*”表示GAEBS系统在pL22272OCN×pL35SLhG4杂交后代中删除Activator外源基因的效率显著高于在pLOCB×pL35SLhG4杂交后代中删除Activator外源基因的效率(p＜0.05；t-test)。“**”表示系统在在pLOCB×pL35SLhG4杂交后代中删除Activator外源基因的效率明显低于删除Effector外源基因的效率，差异达到极显著水平(p＜0.01；t-test)。

图16为系统在转基因植物杂交后代中删除外源基因之后残余片段的PCR分析图。

其中，M为DNA分子marker；f27115为以2272-11×35S-5杂交F₁代基因组DNA为模板；f17413为以L174×35S-13杂交F₁代基因组DNA为模板；f413为以35S-4×L13杂交F₁代基因组DNA为模板；L13为以L13转基因植株亲本基因组DNA为模板；f795为以L79×35S-5杂交F₁代基因组DNA为模板；f1316为以L131×35S-6杂交F₁代基因组DNA为模板；f1987为以L198×35S-7杂交F₁代基因组DNA为模板；35S-4为以35S-4转基因植株亲本基因组DNA为模板。扩增用引物参见SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37。如果外源基因被删除，将扩增得到约800bp的特异条带，否则将扩增得到约7.3kb或/和9.1kb的条带。

图17为系统转基因植物杂交后代中删除外源基因的PCR分析图。

其中M泳道为DNA分子marker。2272-11泳道为以2272-11母本基因组为模板；f27115泳道为以2272-11×35S-5杂交F₁代基因组DNA为模板；35S-5泳道为以35S-5父本基因组为模板。L79泳道为以L79母本基因组为模板；f795为以L79×35S-5杂交F₁代基因组DNA为模板；35S-5泳道为以35S-5父本基因组为模板。L131泳道为以L131母本基因组为模板；f1316泳道为以L131×35S-6杂交F₁代基因组DNA为模板；35S-6泳道为以35S-6父本基因组为模板。L198泳道为以L198母本基因组为模板；f1987泳道为以L198×35S-7杂交F₁代基因组DNA为模板；35S-7泳道为以35S-4父本基因组DNA为模板。扩增母本基因组所用引物序列如SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所示，目标片段为cre^int重组酶基因。扩增父本基因组所用引物序列如SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43所示，目标片段为LhG4^ATO转录激活因子基因。扩增杂交后代基因组所用引物为以上两对引物。从图中可见在杂交后代中均未检测到来自母本cre^int重组酶基因和来自父本LhG4^ATO转录激活因子基因的存在。

图18为pL2272OCN与pL35SLhG4亲本杂交F₁代中残余T-DNA片段测序结果图。

将图16中扩增得到的约0.8kb的残余片段进行测序分析。结果显示，所有外源基因均被删除，最后在基因组上只留下一个L2272和loxp识别位点序列以及T-DNA片段上的一段非功能性片段。粗箭头示识别位点序列的方向(5’→3’)。

发明的具体实施方式

以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook and Lasel，2002)。

【实施例1】DNA的提取和目的片段序列的PCR扩增

1.DNA的提取

选取烟草幼嫩叶0.3-0.5g，在液氮中迅速磨成白色粉末，转入10mL离心管，加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀。65℃水浴45min，期间混匀2-3次。然后加入1mL 5mol/L KAc，冰浴20min。用等体积(4mL)的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次(10,000r/min，25℃离心10min)。取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，室温静置约30min。挑出絮状沉淀，用75％的乙醇反复漂洗两次，再用无水乙醇漂洗1次。室温吹干，重悬于600μL TE中。加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h去除样品中的RNA。再用酚(Ph8.0)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，离心10min)，取上清，2.5倍体积无水乙醇于-20℃沉淀30min以上。13,000r/min，离心10min收集沉淀，弃上清，沉淀用75％的乙醇漂洗。减压离心干燥，沉淀最终溶于50-200μL TE中，-20℃保存备用。

2.目的片段序列的PCR扩增

扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1～4min，35个循环；72℃延伸10min。

3.DNA片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5α

紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块。回收方法参照试剂盒(Roche公司)的使用说明书。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

酶切体系的建立和反应条件均参考Roche公司限制性内切酶试剂盒的说明书进行。酶切回收的片段，或者扩增获得的回收片段按连接酶试剂盒说明书克隆到pUCm-T(上海Sangon)或pGEM-T/pGEM-T Easy(Promega)载体上。连接反应体系如下：

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比＝1∶3。

16℃连接2-8h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，37℃培养。

【实施例2】双元表达载体的构建

1.pOp/LhG4转录激活系统的获得

1.1pOp靶标启动子的克隆

根据pH-pOp(A)(Moore et al.，2006)质粒上pOp启动子序列设计一对引物(如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，PCR扩增得到5’末端和3’末端分别含有HindIII和XbaI内切酶识别位点序列的pOp启动子，T克隆到pGEM-T-easy载体上，得到pGEM-t-pOp载体。测序确认。

1.2LhG4ATO转录激活因子基因的克隆

根据pBIN-LR-LhGR²(Craft et al.，2005；Samalova et al.，2005)质粒上的LhG4^ATO基因序列设计一对引物(如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)，PCR扩增获得5’末端和3’末端分别含有BamHI和SalI内切酶识别位点序列的LhG4^ATO基因，T克隆到pUCm-T载体上，得到pUCm-t-LhG4^ATO载体。测序确认。

2.含有植物来源内含子的cre重组酶基因的人工合成

根据植物基因组中内含子边界保守序列特点，将来源于pCAMBIA1305.1载体(GenBank登录号：AF354045.1)上GUS基因中的内含子(catalase intron)插入到cre重组酶基因编码Gln144/Val145氨酸残基的密码子之间。为此，分别用引物对c-5F/c-5R(如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)、c-3F/c-3R(如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)和int-L/int-R(如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示)扩增得到cre重组酶基因5’端432bp长的碱基序列cre-5、3’端589bp长的碱基序列cre-3以及190bp长的catalase intron。然后，cre-5与intron进行平末端连接反应，再以此反应液为模板，用c-5F/int-R引物扩增得到长约600bp大小的cre-5+int片段。再将该片段与cre-3相连，用c-5F/c-3R扩增得到长约1.2kb的cre^int基因片段。最后，回收1.2kb长的cre^int片段，克隆后测序分析得到了第432和433位碱基之间含有catalase intron内含子的Cre重组酶基因，命名为cre^int，如SEQ ID NO.11所示。

3.携带有loxp-CaMV35S:GFP-MCS-35S:bar-loxp的双元表达载体ploxpGMBloxp的构建

首先，构建含有GFP报告基因的CaMV35S-GFP-nos表达元件。根据pCAMBIA1305.1(GenBank登录号：AF354045.1)载体上GUS基因上游的CaMV35S启动子的序列设计一对引物(如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示)，PCR扩增，并在CaMV35S启动子3’端引入BglII内切酶识别位点。根据pCAMBIA4956:ET15(Johnson et al.，2005)载体上mGFP-er基因(本发明简称为“GFP”)的序列设计特异引物(如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示)，两条引物的5’末端分别加上BamHI和NheI酶识别位点；以及该载体上GFP基因下游1000bp的序列(包括nos终止序列)，设计引物nos-up/nos-down(如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示)，并在前者5’末端引入SpeI酶识别位点。PCR扩增以上目的片段，T-cloning到pUCm-T(上海生工生物技术有限公司)载体上，分别得到pUCm-T-CaMV35S，pUCm-T-GFP和pUCm-T-nos中间载体。测序确认。在此基础上，用BamHI/NheI将GFP从pUCm-T-GFP切下，SpeI/HindIII将nos从pUCm-T-nos上切下，两者与BglII/HindIII酶切的pUCm-T-CaMV35S载体相连，得到pUC-CaMV35S-GFP-nos，该载体含有CaMV35S-GFP-nos表达元件(如图1所示)。备用。

其次，构建含有抗除草剂基因bar的35S-bar-nos表达元件。首先，用HindIII/EcoRI将35S-GUS-nos元件从pBI121(GenBank登录号：AF485783.1)载体上切下，连入经相同酶切处理的pUCm-T载体上，得到pUC-35S-GUS-nos载体。然后，根据pFGC5941(Genbank登录号：AY310901.1)载体上抗除草剂基因bar的序列设计一对引物(如SEQ ID NO.18和SEQID NO.19所示)，PCR扩增获得5’和3’端分别带有SpeI和SacI的bar基因，T-cloning到pUCm-T载体上，测序确认。SpeI/SacI将bar基因从该载体上切下，连入经XbaI/SacI酶处理的pUC-35S-GUS-nos载体上，得到pUC-35S-bar-nos载体。然后，再用SacI酶消化该载体，并补平粘端，环化载体，从而消掉bar和nos之间的SacI内切酶识别位点(如图2所示)。备用。

然后，pBS-spacer载体的构建。用HindIII/EcoRI从pCAMBIA4956:ET15载体上将约2.4kb的spacer序列(非功能序列)切下，插入经相同酶处理的pBluescript SK(pBS)(Genbank登录号：X52328.1)载体上，得到pBS-spacer载体，以备用(如图3所示)。

最后，根据loxp识别位点序列和CaMV35S-GFP-nos元件序列设计一对引物(如SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21所示)，其中引物1的5’端含有34bp-长的loxp，3’端与CaMV 35S启动子5’端匹配，引物2与nos的3’端互补。以pUC-CaMV35S-GFP-nos质粒为模板，PCR扩增得到loxp-CaMV35S-GFP-nos元件。同样，以pUC-35S-bar-nos质粒为模板，用一对引物(如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示)扩增得到loxp-35S-bar-nos元件。这两条片段的5’端都添加了Cre重组酶的识别位点loxp。将以上片段T-cloning到pUCm-T载体上，测序确认。首先用SacI/KpnI从中间载体pUC-loxp-CaMV35S-GFP-nos上切下loxp-CaMV35S-GFP-nos元件，连入经相同酶处理的pBIN 19(Genbank登录号：U09365.1)载体中，得到pLoxp-GFP中间载体。然后，XhoI/XbaI酶将loxp-35S-bar-nos元件从pUC-loxp-35S-bar-nos载体上切下，并与SalI/NheI酶消化的pLoxp-GFP载体相连，产生pLoxpGBLoxp中间载体。最后，XbaI/KpnI酶切pBS-spacer载体，并补平KpnI粘端，回收spacer片段，同时，SmaI/XbaI酶切pLoxpGBLoxp载体，与spacer片段连接，产生植物表达载体ploxpGMBloxp。其中，在GFP和Bar表达元件之间插入了2.4kb的间隔序列，间隔序列两端含有多克隆位点。这样，包括多克隆位点MCS在内的所有外源基因片段均位于loxp识别位点序列之间(如图4所示)。

4.含有lox2272-CaMV35S:GFP-MCS-35S:bar-lox2272元件的双元表达载体plox2272GMNlox2272的构建

相似的，根据lox2272识别位点序列和CaMV35S-GFP-nos元件序列设计一对引物(如SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示)，pUC-CaMV35S-GFP-nos质粒为模板，PCR扩增得到lox2272-CaMV35S-GFP-nos元件。同样，以pBIN 19植物表达载体为模板，用一对引物(如SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示)扩增得到lox2272-nosP-NPTII-nos元件。这两条片段的5’端都添加了Cre重组酶的识别位点序列lox2272。将以上片段T-cloning到pUCm-T载体上，测序确认。用XhoI/XbaI酶切pUC-lox2272(-nosP-NPTII-nos载体，回收lox2272-nosP-NPTII-nos片段，与SalI/NheI处理的pBIN 19载体相连，得到plox2272-NPTII中间载体。然后，SacI/XbaI酶切，回收该载体。同时，SacI/KpnI酶切pUC-lox2272-CaMV35S-GFP-nos载体，回收lox2272-CaMV35S-GFP-nos片段，以及KpnI/XbaI酶切pBS-spacer，回收spacer片段，将回收的三个片段连接，就得到植物表达载体plox2272GMNlox2272。同样，包括多克隆位点MCS在内的所有外源基因片段均位于lox2272识别位点序列之间(如图5所示)。

5.含有loxp-CaMV35S:GUS:NPTII-MCS-loxp的双元载体pLoxpGN-MCS的构建

为了将loxp识别位点加入到2×CaMV35S启动子上游，根据pCAMBIA1305.1载体中的2×CaMV 35S启动子序列设计一对引物(如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示)，以pCAMBIA1305.1质粒为模板，PCR扩增得到loxp-2xCaMV35S元件。同样的，以pBIN 19载体上的nos序列设计一对引物(如SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.31所示，以pBIN 19质粒为模板，PCR扩增得到nos-loxp元件。这样，就将loxp识别位点序列添加到nos序列的3’端。T-cloning到pGEM-T-easy载体上，得到pGEM-T-nos-loxp中间载体。测序确认。SacI/EcoRI酶切pGEM-t-nos-loxp中间载体，回收nos-loxp元件，连入经相同酶处理的pBIN19载体中，产生pBIN-loxp-nos中间载体。其次，用BamHI/SalI酶将GUS:NPTII-nos元件从pSackiss-35S-GUS:NPTII-nos载体上切下，与经BglII/SalI酶处理过的pGEM-t-loxp-35S载体相连，得到pUC-loxp-35S-GUS:NPTII-nos克隆载体。最后，用HindIII/NheI酶消化该载体，回收loxp-35S-GUS:NPTII-nos片段，与经相同酶处理过的pBIN-loxp-nos载体相连，得到pLoxpGN-MCS载体。在该载体中，GUS、NPTII以及多克隆位点MCS均位于一对同向识别位点序列loxp之间(如图6所示)。

【实施例3】植物表达载体的构建

1.含有pOp:cre^int元件的Effector植物表达载体的构建

为了构建Effector植物表达载体，首先构建pOp-cre^int-T3A表达元件。用一对引物(如SEQID NO.32和SEQ ID NO.33所示)从pER8载体上扩增得到终止序列T3A，其5’端引入XhoI内切酶识别位点，T-cloning到pUCm-T载体上，产生pUC-T-T3A载体。测序确认。然后，SacI/XbaI将pOp启动子从pGEM-T-pOp载体上切下，XhoI/BglII将T3A终止序列从pUC-t-T3A载体切下，XbaI/SalI将cre^int基因从pUC-T-Cre^int载体上切下，三个片段共同连入SacI/BglII消化过的pUC载体上，得到pUC-pOp-Cre^int-T3A载体，该载体含有pOp-Cre^int-T3A表达元件。

最后，用HindIII/XhoI将pOp-Cre^int-T3A表达元件切下，分别连入由HindIII/XhoI消化处理的ploxpGMBloxp和plox2272GMNlox2272植物表达载体中，产生相应的Effector植物表达载体pLOCB和pL2272OCN(图7，8)。

2.含有35S:LhG4^ATO元件的Activator植物表达载体pL35SLhG4的构建

首先构建LhG4^ATO-T3A元件，用BamHI/SalI将LhG4^ATO基因从pUCm-t-LhG4^ATO载体上切下，XhoI/KpnI将T3A(pea 3A)转录终止序列从pER8载体(Genbank登录号：AF309825.2)上切下，将两者连入BamHI/KpnI酶处理的pBS载体上，得到pBS-LhG4^ATO-T3A，该载体含有LhG4^ATO-T3A元件。然后，用KpnI/BamHI将该元件切下，SalI/BamHI从pSackiss-35S-mcs-nos载体上切下35S启动子，将35S启动子和LhG4^ATO-T3A元件一并连入用SalI/KpnI酶处理过的pLoxpGN-MCS载体中，得到pL35SLhG4植物表达载体(如图9所示)。

【实施例4】表达载体的转化

1.用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌EHA105中。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌EHA105。

2.GAEBS系统的Effector和Activator元件整合到烟草基因组

通过根癌农杆菌介导的方法进行烟草的遗传转化

表1：根癌农杆菌介导的烟草遗传转化用培养基

MS：Murashige & Skoog，1962

B5：Gamborg，1986

上述的表达载体通过农杆菌介导叶盘的方法导入烟草。具体方法如下：

烟草种子用1％的次氯酸钠消毒后，在固体培养基MSB₀上萌发，培养条件为25℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期。约一个月后生长健壮的无菌苗即可用作转化外植体。

选取健壮叶片，超净工作台上切成约0.5cm×0.5cm的叶盘，保持湿润备用。牙签挑取YEB平板上培养的转化用农杆菌单菌落，液体培养活化，再转入三角瓶中培养至OD₆₀₀＝0.5。把切好的叶盘浸泡于MSB液体基本培养基重悬的农杆菌菌液中，静止浸染10-20min。倾去菌液，用无菌的吸水纸吸去叶盘表面多余的菌液，将叶盘接入共培养基MSB₁上，24℃暗培养2d。共培养完成后，将叶盘接入筛选培养基MSB₂中进行分化培养2周，培养条件为25℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期。出现再生绿色愈伤后，转入诱芽培养基MSB₃促进芽的产生。当抗性苗生长到3-4cm长时，切下转入生根培养基MSB₄中，诱导生根。当抗性苗的根生长到2-3cm长时，洗净培养基，并水培炼苗2-3d，移栽到营养钵中，于温室生长。获得的转基因烟草在表型和生长发育上与野生型的对照没有明显区别。

【实施例5】转基因植株的筛选

1.Effector转基因烟草植株的获得

由于Effector载体中含有绿色荧光蛋白GFP报告基因，因此，对经过PPT(pLOCB)和Km(pL2272OCN)抗性筛选得到的烟草再生植株，在荧光体视显微镜下检测了植株叶片等组织中GFP的表达情况。转基因烟草的GFP绿色荧光鉴定参见Haseloff所述(Haseloff，1999)。采摘抗性苗的叶片，在Olympus SZX-ILLB2-200体视荧光显微镜成像系统(日本)下观察烟草的绿色荧光信号(激发波峰是488nm，发射波峰是520nm)，并照相记录。如图10A，B所示，转基因烟草叶片和根均可检测到绿色荧光信号，而对照没有检测到任何的绿色荧光信号，只呈现叶绿素的红色荧光信号。其中，对照植株(CK)根的荧光显著减弱。根据以上观察结果，以抗性苗叶片呈现均一的绿色荧光信号为标准筛选Effector转基因植株。

对GFP阳性植株，进一步用PCR验证了外源基因的整合。如图10C-D所示，在所有呈现绿色荧光信号的转基因烟草中都检测到了约0.8kb pOp-Cre^int的特异片段，说明这些GFP阳性植株确实为转基因植株(如图10中C，D所示)。所用引物为序列如SEQ ID NO.34和SEQID NO.35所示。

2.Activator转基因烟草植株的获得

由于Activator载体中含有GUS报告基因。因此，首先用GUS组织化学染色法对抗性苗染色。GUS组织染色的方法参见Jefferson等(1987)的方法。主要过程如下：

将转基因植物材料(叶片、茎、根等)切成薄片，放入新鲜配置的X-Gluc染色液中，37℃保温1～12h。待充分染色后，用75％(v/v)乙醇脱色2～3次，至对照材料(野生型植物)呈白色。并进行体视镜下的观察和照相。如图11A，B，转基因植株的根、茎、叶均呈现强烈的GUS蓝色，而非转基因植株组织未见蓝色。然后，利用PCR进一步鉴定GUS染色呈蓝色的转基因植株中外源基因的整合。结果表明在GUS染色呈蓝色的转基因植株中均检测到了1.4kb 35S-LhG4^ATO的特异条带(如图11中C所示)。所用引物为序列如SEQ IDNO.36和SEQ ID NO.37所示。

【实施例6】外源基因在Effector转基因植株有性世代中遗传稳定性的分析

在150ml三角瓶中加入适量的T₀代种子，然后加入约30mL自来水，110rpm，26℃震荡培养5-7d。待两片真叶完全展开后，在荧光体视显微镜下分别统计显绿色荧光(GFP⁺)和不显绿色荧光(GFP^-)幼苗的数量。然后根据单基因3∶1和双基因15∶1的孟德尔遗传规律，对所得数据进行χ_c ²分析。

(O代表观察次数，E代表理论次数)：

根据表3.2的统计结果，在分析的33株Effector转基因植物中，除L178转基因植株的外源基因拷贝数不确定外，有16个转基因植株的外源基因分离比符合3∶1，其余转基因植株均符合15∶1的分离比，没有发现分离比不符合3∶1或15∶1的现象。这些结果说明在pLOCB和pL2272OCN转基因植株的有性繁殖世代中，pOp启动子能高效维持重组酶基因的沉默，保持外源基因在有性世代中的稳定遗传。

表2转基因pLOCB和pL2272OCN烟草中外源基因拷贝数的分析

【实施例7】单拷贝转基因植株的筛选

为了便于分析杂交后GAEBS系统删除外源基因的效率和特点，本研究参照实施例六的方法筛选单考贝转基因植株用于杂交试验。对Effector转基因植物拷贝数的分析主要检测自交T₁代幼苗中GFP绿色荧光的分离情况，初步确定转基因pLOCB和pL2272OCN的单拷贝植株。从表2可以看出绝大部分转基因植株都是单拷贝和双拷贝植株，其中单拷贝转基因植株pLOCB有16株，pL2272OCN有6株。

而对转基因pL35SLhG4烟草，对幼苗进行GUS组织染色分析，统计蓝色(GUS⁺)和白色(GUS^-)幼苗的数量。通过分析自交T₁代中GUS基因的分离比来确定单拷贝植株。

表3显示所分析的6个转化子均为单拷贝转基因植株。

表3转基因pL35SLhG4烟草中外源基因拷贝数的分析

^aT₀代种子中GUS染色呈蓝色的种子对孟德尔分离比适合度的检测。如果：GUS(+)∶GUS(-)符合3∶1，即为单拷贝；如果符合15∶1，即为双拷贝。

【实施例8】转基因烟草的杂交试验

杂交方法参见刘仁祥等(2000)所述，在烟草盛花期，每天下午采集第2天要裂开的花药存于实验室，待第2天早上，花药已裂开，拿到田间用毛笔粘取花粉涂于要授粉的柱头(去雄蕊)上，即完成授粉过程。

【实施例9】GAEBS系统通过杂交途径删除外源基因效率的分析

1.GAEBS系统能100％同时将来源于双亲的外源基因从杂交后代中删除根据孟德尔遗传规律，T₀代pLOCB(母本)与pL35SLhG4(父本)转基因杂交后代种子中只有四分之一的合子同时含有pLOCB和pL35SLhG4转基因，因此，删除只可能发生在这些合子及其产生的植株中。根据杂交后代中GFP和GUS的表达活性，如果外源基因在杂交后代种子中被完全删除，将产生三种表型：GFP+/GUS-、GFP-/GUS+和-/-(外源基因被彻底删除的植株)；如果删除不彻底，有可能产生第四种表型：GFP+/GUS+。因此，首先对杂交后代幼苗进行GFP和GUS活性检测，确定杂交后代幼苗的表型，并统计不同表型的幼苗数。然后，根据孟德尔遗传规律计算基因自动删除系统通过杂交途径删除外源基因的效率。在本研究中，分别用GFP和GUS报告基因被删除的效率来评价系统对Effector和Activator元件的删除效率。统计结果见表4和表5。

随机选出35S-4和35S-13转化子分别与不同的pLOCB独立转化子杂交，统计系统在这些杂交组合中删除外源基因的平均效率(系统删除Effector和Activator效率的平均值)。如图12所示，35S-4与L13、L19、L79、L91、L102、L131、L198和L213转基因植株的杂交组合中，系统在杂交种子中删除外源基因的效率在23％-100％之间；同样，35S-13与上述10个pLOCB转基因植株的杂交后代中，系统删除外源基因的效率在31％-100％之间。用同一株pLOCB植株分别与不同的pL35SLhG4转基因植株杂交，比较系统在这些杂交组合中删除外源基因的效率，结果显示在L91、L79、L131和L213分别与5株pL35SLhG4独立转基因植株的杂交组合中，系统的删除效率分别为：23％-49％、83％-100％、91％-100％和36％-50％。其中，L198与5株pL35SLhG4转基因植株杂交，系统的删除效率均为100％(如图13所示)。从以上结果可以看出，系统在不同的pLOCB转基因植株之间删除外源基因的效率差异比较明显；而同一pLOCB转基因植株与不同的pL35SLhG4杂交后，系统删除外源基因的效率比较稳定。因此，相对于Activator而言，Effector在基因组中的插入位置是影响系统删除效率的一个关键因素。

利用相似的方法，分析了系统在pL2272OCN与pL35SLhG4的杂交后代中删除外源基因的效率，结果如图14所示。9株pL2272OCN植株作为母本分别与35S-4父本杂交，统计系统在这些杂交组合中删除外源基因的平均效率。从图11中可以看出，系统的删除效率在20％-100％之间。其中，2272-4×35S-4和2272-11×35S-4两个组合中删除效率均达到100％。然而当将2272-4和2272-11植株分别与其他pL35SLhG4转基因植株(如35S-5、35S-6和35S-7)杂交时，系统在种子中删除外源基因的平均效率均没达到100％(表5)。从表5可以看出，在分析的9个pL2272OCN Effector中，没有得到能与不同Activator杂交而系统删除外源基因的效率均为100％的转化子。比较而言，2272-1、2272-3、2272-4、2273-6、2272-11和2272-12都是比较高效的应答子，删除效率在88％以上。

总之，在35个杂交组合中，系统在8个组合中删除Effector和Activator外源基因的效率均同时达到100％。其中，L198植株与5株不同的pL35SLhG4杂交后，系统在杂交后代中删除外源基因的效率均达到100％。这些结果表明，GAEBS系统能同时将来源于双亲不同染色体上的所有外源基因从合子中高效删除，删除效率高达100％。

表4T₀代转基因pLOCB与pL35SLhG4杂交种中系统删除效率的统计分析

^aGFP和GUS检测均呈阳性的幼苗。

(O代表观察次数，E代表理论次数)：如果没有删除发生，杂交F₁代幼苗中GUS(+)∶GUS(-)＝1∶1以及GFP(+)∶GFP(-)＝1∶1。χ₁ ²指GFP阳性幼苗对1∶1比例的适合性检测。χ₂ ²指GUS阳性幼苗对1∶1比例的适合性检测。^c只有当χ²大于3.84时，才分别估测GFP和GUS外源基因被删除的效率。双亲均为单拷贝时：删除效率按如下公式计算Deletion efficiency(％)＝[(4×G^--2×T)/T]×100。对于一方亲本转基因pLOCB为双拷贝时，GFP外源基因删除的效率按如下公式计算Deletion efficiency(％)＝[2×G^-/T]×100。G^-指GFP或GUS阴性幼苗，T指分析的幼苗总数。

表5T₀代转基因pL2272OCN与pL35SLhG4杂交种中外源基因删除效率的统计分析

^aGFP和GUS检测均呈阳性的幼苗。

(O代表观察次数，E代表理论次数)：

如果没有删除发生，杂交F₁代幼苗中GUS(+)：GUS(-)＝1∶1以及GFP(+)∶GFP(-)＝1∶1。χ₁ ²指GFP阳性幼苗对1∶1比例的适合性检测。χ₂ ²指GUS阳性幼苗对1∶1比例的适合性检测。

^c只有当χ₁ ²和χ₂ ²大于3.84时，才分别估测GFP和GUS外源基因被删除的效率。双亲均为单拷贝时：删除效率按如下公式计算Deletion efficiency(％)＝[(4×G^--2×T)/T]×100。对于一方亲本转基因pL2272OCB为双拷贝时，GFP外源基因删除的效率按如下公式计算Deletionefficiency(％)＝[2×G^-/T]×100。G^-指GFP或GUS阴性幼苗，T指分析的幼苗总数。

2.Effector中不同识别位点序列对系统删除效率的影响

为了进一步比较Effector中突变体lox2272和野生型loxp识别位点序列对基因自动删除系统删除效率的影响，分别统计了表4、5中系统对GFP和GUS基因的平均删除效率，结果如图15所示。以GFP为准统计系统对Effector的平均删除效率：pLOCB×pL35SLhG4为85％；pL2272OCN×pL35SLhG4为81％。两者没有明显的差异。以GUS为准统计系统对Activator的平均删除效率：pL2272OCN×pL35SLhG4较高，为73％；而pLOCB×pL35SLhG4为48％。从上可以看出系统对Effector的删除效率均高于对Activator的删除效率。在pL2272OCN×pL35SLhG4系统中，系统对含有突变体识别位点序列(lox2272)Effector的删除效率高于对含有野生型识别位点(loxp)Activator的删除效率，但没有显著差异。而在都含有野生型识别位点的pLOCB×pL35SLhG4系统中，系统对Effector的删除效率比对Activator的删除效率高出37个百分点，两者的差异达到极显著水平(p＜0.01)。另外，当将Effector元件中loxp识别位点替换为突变体lox2272时，可以显著提高系统对Activator的删除效率(由48％增加到73％)(p＜0.05)。

尽管在pLOCB×pL35SLhG4杂交组合中，系统对Activator的平均删除效率明显低于对Effector的平均删除效率，但能获得删除效率均到达100％的pLOCB转基因植株，如L198。在所分析的9个pL2272OCN转基因植株中没有得到删除效率均达到100％的转基因植株。但是，在pL2272OCN×pL35SLhG4杂交组合中，系统均能高效删除Effector和Activator，平均删除效率在73％以上。因此，pLOCB×pL35SLhG4和pL2272OCN×pL35SLhG4是高效的基因自动删除双元系统组合。

【实施例10】GAEBS系统删除外源DNA片段的检测

杂交F₁代中外源基因删除的PCR分析

通过转基因pLOCB或pL2272OCN与pL35SLhG4烟草杂交后代的GFP和GUS活性检测已证明了GAEBS系统能同时将来源于双亲的外源基因高效删除，删除效率达到100％。为了进一步分析系统在杂交后代删除外源基因的情况，分别提取杂交后代和杂交用亲本的基因组DNA，进行PCR分析。根据所用植物表达载体骨架(pBIN 19)的T-DNA两端边界序列与重组酶识别位点序列之间的DNA序列设计一对引物(如SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39所示)，常规PCR筛选出发生外源基因删除的植株，如果发生了外源基因的删除，将只检测到约800bp的非功能残留片段(如图16A所示)。

对已经被确认发生外源基因删除的植株，进一步用PCR检测了来自双亲的外源基因cre^int和LhG4^ATO等的删除情况，其中，检测cre^int基因所用的引物如SEQ ID NO.40和SEQ JD NO.41所示；检测LhG4^ATO基因所用的引物如SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43所示。研究结果表明在2272-11×35S-5、L79×35S-5、L131和L198×35S-7的杂交后代f27115，f795，f1316和f1987植株中，来自母本的creint基因和来自父本的LhG4ATO基因确已从这些杂交后代的基因组中被成功彻底删除(如图17所示)。

在此基础上，改变扩增条件，增加片段延伸时间，进一步用PCR分析外源基因发生删除的分子特点。所用PCR反应条件为：94℃5min；98℃10sec；68℃8min，35个循环。DNA聚合酶为LATaq(TaKaRa)聚合酶。如果发生删除，将检测到约800bp的非功能T-DNA残余片段，否则将检测到约7.0kb或/和9.0kb的T-DNA大片段(如图16中A所示)。从图16B中可知，以亲本35S-13基因组为模板，扩增得到一条约7.0kb大小的特异大片段，该片段包括Loxp识别位点、35S-GUS:NPTII-nos、和35S-LhG4ATO-T3A片段。同样，以亲本L13基因组为模板，扩增得到一条长约9.0kb的特异大片段，该片段包括loxp识别位点、35S-GFP-nos、pOp-creint-T3A和35S-bar-nos片段。而在已经确认外源基因被完全删除的f27115，f795，f1316和f1987植株中只检测到约0.8kb大小的残存片段，表明在这些植株中来源于父本和母本中的所有外源基因被完全删除(包括Effector和Activator)。另外，在f17413植株中，除了检测到0.8kb的特异条带外，还检测到大约7.0kb的大片段，该片段大小与亲本35S-13的一致，说明Activator的外源基因没有被删除；同样在f413植株中，额外检测到一条与亲本L13大小一致的长约9.0kb的大片段，显示Effector的外源基因没被删除。这些结果从分子水平上证明了GAEBS系统能同时将来源于双亲的所有外源功能基因从杂交后代基因组中彻底删除。

2.杂交F1代中系统删除外源基因后残余片段的序列分析

根据Creint/loxP系统重组原理(Lee and Saito，1998；Ennifar et al.，2003；Ghosh et al.，2005)，基因自动删除双元系统删除外源基因后，将只在植物基因组上留下约800bp长、含有一个loxp识别位点序列的T-DNA非功能片段(如图14所示)。为了解基因自动删除双元系统删除外源基因后残余片段的确切序列信息，将图14B中f27115和f1987泳道扩增得到的约800bp片段分别回收、克隆、测序分析。具体过程及测序结果如图18所示。

从测序结果可知，在L2272-11与35S-LhG4转基因植物杂交后代f27115中，确实只剩下一个loxP和lox2272识别位点序列以及T-DNA两端的非功能区序列，另外一个loxP和lox2272识别位点以及35S-GUS:NPTII-nos、35S-GFP-nos、pOp-cre^int-3TA和nosP-NTPII-nos序列已经被完全删除。而在L198与35S-LhG4转基因植物杂交后代f1987植株中，测序结果与f27115的相同，只是来自Effector亲本的识别位点序列为loxP。这些结果也进一步从分子水平确证，在转基因pLOCB或pL2272OCN与转基因pL35SLhG4亲本杂交F₁代种子细胞中，系统合并后，能彻底将所有外源基因删除。

上述实施例表明，本发明用于控制外源基因生物安全隐患的GAEBS系统，不但能有效维持外源基因在亲本有性繁殖世代中的稳定遗传，而且能将所有外源基因从杂交合子中高效彻底删除，删除效率达到100％。本发明方法简便易行，在需要删除外源基因时，能100％删除所有外源基因，效果显著，具有很好的应用前景。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

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Claims (9)

1.一种用于有性繁殖植物外源基因生物安全控制的基因自动删除双元系统，包括

1)用于构建第一植物表达载体的效应子元件，所述效应子元件包括

两个同向的重组酶特异识别位点；在所述两个重组酶特异性识别位点之间插入下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

重组酶基因；以及

维持重组酶基因沉默的靶标启动子；

2)用于构建第二植物表达载体的激活子元件，所述激活子元件包括：

两个同向的重组酶特异识别位点；在所述两个重组酶特异性识别位点之间插入下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

控制转录激活因子基因的启动子；以及

与所述靶标启动子配合的转录激活因子基因；

3)植物表达载体，包括第一植物载体和第二植物载体，用于分别将所述效应子元件和激活子元件导入植物基因组。

2.权利要求1所述的基因自动删除双元系统，其中所述重组酶特异性识别位点选自loxP，lox2272，lox5171和FRT识别位点，所述重组酶基因选自FLP、Cre和Cre^int重组酶基因。

3.权利要求1所述的基因自动删除双元系统，其中所述控制转录激活因子基因的启动子为CaMV35S启动子。

4.权利要求1所述的基因自动删除双元系统，其中所述靶标启动子及与之配合的转录激活因子基因选自pOp/LhG4、tTA/TOP10/pTAX、Gal4:VP16/UAS或mGal4:VP16/UAS转录激活系统。

5.权利要求1所述的基因自动删除双元系统，其中所述重组酶特异性识别位点为loxP或lox2272，所述重组酶基因为Cre^int，所述靶标启动子及与之配合的转录激活因子基因为pOp/LhG4，所述控制外源基因表达的启动子和控制转录激活因子基因的启动子为CaMV35S启动子。

6.包含效应子元件的第一植物表达载体，包括：两个同向的重组酶特异识别位点；在所述两个重组酶特异性识别位点之间插入下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

重组酶基因；以及

维持重组酶基因沉默的靶标启动子。

7.包含激活子元件的第二植物表达载体，包括两个同向的重组酶特异识别位点；在所述两个重组酶特异性识别位点之间插入下述基因或核苷酸：

控制外源基因表达的启动子；

用于导入外源基因的多克隆位点；

控制转录激活因子基因的启动子；以及

与所述靶标启动子配合的转录激活因子基因；

8.权利要求1所述的基因自动删除双元系统在制备转基因植物中的应用。

9.一种制备安全的转基因植物的方法，包括下述步骤：

1)构建权利要求6所述的第一植物表达载体；

2)构建权利要求7所述的第二植物表达载体；

3)将步骤1)所述的第一植物表达载体导入植物基因组，制备第一转基因植物；

4)将步骤2)所述的第二植物表达载体导入植物基因组，制备第二转基因植物；

5)将第一转基因植物和第二转基因植物作为亲本相互杂交，获得删除外源基因的安全的转基因植物。

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