CN108300734A - 基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用。针对原本只能应用于无性繁殖作物的外源基因清除技术，改进外源基因清除技术的基础载体，采用效应载体与激活载体组成的双载体形式，将效应载体和激活载体分别作用于不同亲本。效应载体包括标记基因表达框1、重组酶识别序列和重组酶表达框；激活载体包括标记基因表达框2、重组酶识别序列和激活表达框；分别含有效应载体的和含有激活载体的两亲本杂交时，实现特定组织和/或时期中将全部外源基因的清除，使该技术能够应用于有性繁殖作物中的异交繁殖作物，生物安全性高，具有良好的研究和应用前景。

Description

基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及 其制备方法和应用

技术领域

本发明应用于解决转基因植物生态安全及食品安全的问题，属于转基因育种技术领域，具体涉及一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用。

背景技术

人们对于转基因植物的安全性主要有两方面的忧虑：一是转基因植物的外源基因可能会通过花粉和种子在种群之间扩散，从而影响生态环境和生物多样性。二是转基因食品可能对人体的健康有不良影响。为解决转基因植物生态安全及食品安全的问题和担忧，目前国内外已经发表了以下几种技术：

(1)花粉不育技术

由于基因漂移主要是通过花粉和种子进行，花粉不育技术可消除由花粉引起的外源基因的逃逸。虽然花粉不育技术可以用于某些无性繁殖的植物，但不能直接用于水稻、玉米等有性繁殖的大田作物。花粉不育可使这些收获种子的作物颗粒无收。同时，花粉不育技术也不能解决种子引起的基因扩散和转基因食品安全等问题。

(2)无籽技术

种子扩散是外源基因逃逸的另一条重要途径。通过利用特异性启动子与IaaM基因融合，可获得无籽烟草、无籽茄子[5]和无籽瓜果[6]。无籽技术可防止由种子引起的外源基因逃逸，也可大幅度地提高很多瓜果类作物的产量和质量。但该技术同样不能用于水稻、玉米等有性繁殖的大田作物。

(3)“终结者”技术

“终结者”技术是美国Delta and PineLand公司研究并经美国专利局1998年3月批准的一项专利[7]，但从未有公开发表的实验数据支持该技术的实际可行性和效果。从理论上讲，该技术可解决转基因植物的外源基因通过种子的扩散问题。“终结者”技术是把一个休眠的种子自杀的基因插入到转基因作物，休眠的自杀基因可以通过化学调控被激活，使农民收获的种子不能正常萌发。由于该技术使农民无法将自收的种子用于来年播种和生产，因此遭到世界各地农民和许多发展中国家的反对[8]。早在1998年，国际农业促进基金会(RAFI)就明确要求美国政府禁止使用终结者技术。另一方面，虽然“终结者”种子技术的概念很好，但根据我们的经验和知识，它的效率会较低，沒有大田的实际应用价值。

(4)叶绿体转化技术

由于大部分植物的花粉不含叶绿体，外源基因整合进叶绿体基因组后，不会像核基因组那样随花粉转移而扩散到坏境中。因而，将外源基因整合到叶绿体基因组可减轻由花粉引起的外源基因漂移问题。目前，虽然叶绿体转化已在烟草等多种植物上取得成功，但还存在转化周期长、同质化难度大等问题。而且，该技术还不能在许多重要作物上使用[9]。有研究还发现，在一些裸子植物和被子植物(如松树、苜蓿、烟草和水稻等)的花粉中含有叶绿体[10,11]。另外，叶绿体基因组中的基因仍存在着渗透现象[12]。转移频率依赖于混合群体的大小、时间长短及它们之间的杂交频率。并且，叶绿体转化不能阻止由种子引起的外源基因扩散问题以及转基因作物的食品安全问题。

(5)无标记基因技术

转基因植物带有的抗生素和除草剂抗性标记基因使一些人担心它们对环境和人畜健康的不利影响。利用共转化、转座子、同源重组、位点特异重组酶删除标记基因等方法可以获得无标记基因的转基因植物。其中的一些技术已相当成熟，并被应用到已商品化的转基因作物上。尽管如此，无标记基因等技术并不能解决抗虫、抗草甘膦等外源基因环境和食品安全性的问题。

(6)“外源基因清除”技术

“外源基因清除”技术(Gene Deletor)利用细菌噬菌体的Cre/LoxP系统和酵母的FLP/FRT系统的有关元件组合了一个新颖的、高效的、能将全部的外源基因在它们完成功能后从转基因植物中彻底清除的系统，从而为解决转基因作物的环境和食品安全问题构建了一个较好的技术平台。LF(即LoxP-FRT)顺序是细菌噬菌体的Cre/LoxP系统的LoxP和酵母的FLP/FRT系统的FRT识别序列的融合顺序。FLP重组酶可识别LF顺序并将两个LF之间的所有的DNA序列删除。花粉和种子特异启动子可用来驱动重组酶基因FLP的表达，目标基因、标记基因及花粉和种子表达的FLP基因等所有的功能基因将被植入两个LF识别序列之间。当植物开花结实时，由于FLP重组酶基因将只在花粉和种子中表达，花粉和种子中存在的全部的外源基因将被彻底清除，只留下没有功能的86个碱基的非编码的LF序列，而其它器官中的外源基因将被保留。

“外源基因清除”技术的两个重要特点是：1)由于使用了新颖的loxP-FRT识别序列，使FLP或Cre DNA重组酶的删除效率大幅度提高；2)全部的外源基因可在转基因植物的特定器官中被彻底清除，从而可以使转基因植物的花粉、种子、果实或其它食用部分变成非转基因的。在筛选出的转基因植物株系中，如果目标器官，如花粉和种子中，所有的外源基因被100％的去除，那么该株系“外源基因清除”载体的效率就是100％。然后可通过无性的方法繁殖该株系，应用于生产上的推广。

然而已发表的“外源基因清除”技术只适用于无性繁殖作物。由于有性繁殖作物在产生花粉、种子的过程中，外源基因将被全部清除，后代植株中不含有外源基因，将失去转基因优势。因此已发表的“外源基因清除”技术不适用于有性繁殖作物，需要在原有技术上进行改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何改进“外源基因清除”技术的基础载体，使原本只能应用于无性繁殖作物的外源基因清除技术，能够应用于有性繁殖作物中的异交繁殖作物，如玉米、水稻等重要的农作物。

本发明的第一个目的是提供一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体，该外源基因清除技术基础载体包含效应载体和激活载体；

效应载体包括重组酶表达框、标记基因表达框1、重组酶识别序列；

重组酶表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的人工启动子pOp、重组酶FLP基因和NOS终止子，重组酶表达框序列如SEQ ID NO.1所示；

标记基因表达框1包括Ubi启动子、Bar-GUS融合基因、35S终止子，标记基因表达框1序列如SEQ ID NO.2所示；

重组酶识别序列包括LB loxP-FRT(SEQ ID NO.3)和RB loxP-FRT(SEQ ID NO.4)；

激活载体包括激活表达框、标记基因表达框2、重组酶识别序列；

激活表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的转录激活子LhG4基因、NOS终止子，激活表达框序列如SEQ ID NO.6所示；

标记基因表达框2包括35S启动子、GUS-NPTII融合基因、35S终止子，标记基因表达框2序列如SEQ ID NO.7所示；

重组酶识别序列与效应载体的相同，包括LB loxP-FRT(SEQ ID NO.3)和RB loxP-FRT(SEQ ID NO.4)；

效应载体和激活载体分别整合在不同的载体pCAMBIA0380上，载体pCAMBIA0380序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，重组酶识别序列LB loxP-FRT整合在载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的左边界内侧；

重组酶识别序列RB loxP-FRT整合在载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的右边界内侧；

重组酶表达框和标记基因表达框1顺序整合在效应载体的重组酶识别序列LBloxP-FRT和RB loxP-FRT之间；

激活表达框和标记基因表达框2顺序整合在激活载体的重组酶识别序列LB loxP-FRT和RB loxP-FRT之间。

本发明的第二个目的是提供一种外源基因清除技术基础载体的制备方法，包括以下步骤：

S1.根据已知的loxP和FRT序列，以5’端-插入位置5’端20个碱基的载体序列-loxP-FRT-EcoRI、SmaI酶切位点-插入位置3’端8个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成loxP-FRT融合序列，即T-DNA左边界处的重组酶识别序列LB loxP-FRT(SEQ ID NO.3)；通过重组连接，将T-DNA左边界处的重组酶识别序列loxP-FRT连入载体pCAMBIA0380(SEQ IDNO.5)的T-DNA插入区域的左、右边界之内，紧邻左边界之处，得到载体LF1；

S2.根据已知的loxP和FRT序列，以5’端-插入位置5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-loxP-FRT-插入位置3’端20个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成loxP-FRT融合序列，即T-DNA右边界处的重组酶识别序列RB loxP-FRT(SEQ ID NO.4)；通过重组连接，将重组酶识别序列RB loxP-FRT连入载体LF1的T-DNA插入区域的左、右边界之内，紧邻右边界之处，得到载体LF2；

S3.根据已知的人工启动子pOp、重组酶FLP基因、NOS终止子序列，以5’端-插入位置5’端8个碱基的载体序列-EcoRI、SmaI酶切位点-pOp-SalI酶切位点-FLP-NOS-HindIII酶切位点-插入位置3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成效应载体的重组酶表达框(SEQ ID NO.1)；通过重组连接，将重组酶表达框连入载体LF2上的限制性内切酶SmaI、HindIII酶切位点之间，得到加载重组酶表达框的载体LF2；

S4.根据已知的Ubi启动子、Bar-GUS融合基因、35S终止子序列，以5’端-插入位置5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-Ubi-Bar-GUS-3’35S-SacI、SpeI、HindIII酶切位点-插入位置3’端2个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成效应载体的标记基因表达框1(SEQID NO.2)；通过重组连接，将效应载体的标记基因表达框1连入加载重组酶表达框的载体LF2上的限制性内切酶KpnI、SacI酶切位点之间，得到效应载体；

S5.根据pOp/LhG二元表达系统中的转录激活子LhG4基因序列、NOS终止子序列，以5’端-插入位置5’端8个碱基的载体序列-EcoRI、SmaI、SalI酶切位点-LhG4-NOS-HindIII酶切位点-插入位置3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成激活载体的激活表达框(SEQID NO.6)；通过重组连接，将激活表达框连入载体LF2上的限制性内切酶SmaI、HindIII酶切位点之间，得到加载激活表达框的载体LF2；

S6.根据已知的35S启动子、GUS-NPTII融合基因、35S终止子序列，以5’端-插入位置5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-35S-GUS-NPTII-3’35S-SpeI、HindIII酶切位点-插入位置3’端8个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成激活载体的标记基因表达框2(SEQID NO.7)；通过重组连接，将激活载体的标记基因表达框2连入加载激活表达框的载体LF2上的限制性内切酶KpnI、SpeI酶切位点之间，得到激活载体。

进一步的，S4获得的效应载体上标记基因表达框1的限制性内切酶SpeI、SacI酶切位点之间，插入与目标作物所需优势性状对应的外源基因片段，将效应载体作用于转基因亲本1，使转基因亲本1表现出所需的优势性状。

进一步的，S6获得的激活载体上标记基因表达框2的限制性内切酶HindIII、SpeI酶切位点之间，插入与目标作物所需优势性状对应的外源基因片段，将激活载体作用于转基因亲本2，使转基因亲本2表现出所需的优势性状。

进一步的，S6获得的激活载体上激活表达框的限制性内切酶SmaI，SalI酶切位点之间，插入特异性启动子序列，驱动LhG4基因表达，实现全部外源基因在所需部位和/或时期中的清除。

本发明的第三个目的是提供基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体在清除有性生殖异交作物目标部位和/或时期中全部外源基因的中的应用，在外源基因清除技术基础载体的效应载体中导入目标外源基因片段，激活载体中导入目标外源基因片段以及目标部位和/或时期的特异性启动子，构建获得清除有性生殖异交转基因作物目标部位和/或时期中全部外源基因的外源基因清除技术完整载体。

进一步的，效应载体和激活载体分别导入有性生殖异交作物的不同亲本，亲本相互杂交，获得清除目标部位和/或时期中全部外源基因的有性生殖异交作物。

本发明的第四个目的是提供基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体在清除抗虫有性生殖异交单子叶作物的花粉和种子中全部外源基因的中的应用，在外源基因清除技术基础载体的效应载体中导入抗虫BT基因序列，获得抗虫效应载体；激活载体中导入有性生殖异交单子叶作物花特异性启动子和抗虫BT基因序列，获得花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体；抗虫效应载体和花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体组成清除抗虫有性生殖异交单子叶作物的花粉和种子中全部外源基因的外源基因清除技术完整载体。

进一步的，效应载体和激活载体分别导入不同亲本，亲本相互杂交，获得清除花粉和种子中全部外源基因的抗虫有性生殖异交单子叶作物。

进一步的，包括以下步骤：

S1.根据已知的35S启动子、抗虫BT基因序列、35S终止子序列，以5’端-35S-BT-3’35S-3’端的顺序，直接基因合成抗虫基因片段(SEQ ID NO.8)；

S2.通过重组连接，将抗虫基因片段连入效应载体上的限制性内切酶SpeI、SacI酶切位点之间，得到抗虫效应载体；

S3.通过重组连接，将抗虫基因片段连入激活载体上的限制性内切酶HindIII、SpeI酶切位点之间，得到抗虫激活载体；

S4.根据已知的有性生殖异交单子叶作物花特异性启动子MADS35序列、以5’端-SmaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-SmaI酶切位点-MADS35-SalI酶切位点-SalI酶切位点3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成MADS35启动子序列(SEQ IDNO.9)；

S5.通过重组连接，将MADS35启动子连入抗虫激活载体上的限制性内切酶SmaI、SalI酶切位点之间，得到花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体；实现特异性地在花器官中驱动LhG4基因的表达。

进一步的，将S2获得的效应载体导入有性生殖异交单子叶作物的转基因亲本1；

S7.将S5获得的激活载体导入有性生殖异交单子叶作物的转基因亲本2；

S8.将S6得到的转基因亲本1和S7得到的转基因亲本2相互杂交，获得清除花粉和种子中全部外源基因的抗虫有性生殖异交单子叶作物。

由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比，有益效果在于：

本发明基于pOp/LhG二元表达系统和FLP重组酶系统的基础载体采用效应载体与激活载体组成的双载体形式，效应载体具有启动子pOp，激活载体具有激活子LhG，效应载体和激活载体分别作用于转基因作物的不同亲本，外源基因清除技术仅在有性繁殖异交条件下发挥作用。

对于仅含有效应载体或仅含有激活载体的作物亲本，其自交或无性繁殖的子代中，由于仅含有启动子pOp或者激活子LhG，无法形成完整的pOp/LhG二元表达系统，因此外源基因不会被清除，能够表现出外源功能基因的优势性状，并用于公司制种。在符合转基因生物安全的条件下种植制种，能够确保外源基因不会在种群之间扩散，不会对生态环境造成影响。

而当分别含有效应载体的和含有激活载体的两作物作为亲本杂交时，子代植株获得完整的pOp/LhG二元表达系统，外源基因清除技术将在特定启动子的驱动下启动，实现特定组织和/或时期中将全部外源基因的清除，使特定器官和/或时期中不含有任何外源基因；而在杂交子代的其他组织或时期中，外源基因仍存在，仍能表现出外源功能基因的优势性状。因此，杂交子代既具有转基因优势，又无转基因安全性隐忧，其果实、种子及相应产品中也不含有任何转基因成分，可应用于大规模农业生产。

本发明开创性的使原本只能应用于无性繁殖作物的外源基因清除技术，能够应用于有性繁殖作物中的异交繁殖作物，经实验证明，在杂交子代玉米的花粉和种子中外源基因的清除率可以达到100％，生物安全性高，具有良好的研究和应用前景。

附图说明

图1为抗虫玉米效应载体的结构示意图；

图2为花专一启动子抗虫玉米激活载体的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。

实施例1.效应载体的构建

1.设计载体引物pCA-LB-F(5’-CCACCACCACGTGTGAATTA-3’)(SEQ ID NO.10)和pCA-LB-R(5’-CCACAATATATCCTGCCACCAG-3’)(SEQ ID NO.11)，以载体pCAMBIA0380为模版，50μl长片段DNA PCR扩增线性化载体pCAMBIA0380。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃ 10s，68℃ 7min，重复30个循环。凝胶回收载体片段。根据已知的loxP和FRT序列，以5’端-引物pCA-LB-R反向互补序列-剩余LB T-DNA repeat序列-loxP-FRT-EcoRI、SmaI、HindIII、SpeI酶切位点-引物pCA-LB-F序列-3’端的顺序，直接基因合成loxP-FRT融合序列(SEQ ID NO.3)，即T-DNA左边界处的重组酶识别序列。利用Infusion方法，将T-DNA左边界处的重组酶识别序列连入载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的左、右边界之内，紧邻左边界之处，得到载体LF1。利用冻融法将载体LF1转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，设计菌检引物LF-F(5’-GCCTGTATCGAGTGGTGATT-3’)(SEQ ID NO.12)和LF-R(5’-ACAAATGGACGAACGGATAAAC-3’)(SEQ ID NO.13)，50μl普通PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表2，PCR反应条件为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃1min，重复30个循环。

表1 50μl长片段DNA PCR扩增反应体系

ddH2O	Up to 50μl
		5×PrimeSTAR Buffer	10μl
dNTP Mixture(2.5mM each)	4μl
		引物1	1μl(0.2μM)
引物2	1μl(0.2μM)
		DNA模板	1μl(10pg–1ng)
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μl)	0.5μl

表2 50μl普通PCR扩增反应体系

ddH2O	Up to 50μl
		引物1	1μl(0.4μM)
引物2	1μl(0.4μM)
		DNA模板	1μl(0.1ng–10ng)
Premix Taq(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye)	25μl

2.设计载体引物pCA-RB-F(5’-AAGGTTTATCCGTTCGTCCATT-3’)(SEQ ID NO.14)和pCA-RB-R(5’-TATCCTAGTTTGCGCGCTATATTT-3’)(SEQ ID NO.15)，以载体LF1为模版，50μl长片段DNA PCR扩增线性化载体LF1。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃ 10s，68℃7min，重复30个循环。凝胶回收载体片段。根据已知的loxP和FRT序列，以5’端-引物pCA-RB-R反向互补序列-KpnI酶切位点-loxP-FRT-载体LF1自RB T-DNA repeat直至引物pCA-RB-F的序列-3’端的顺序，直接基因合成loxP-FRT融合序列(SEQ ID NO.4)，即T-DNA右边界处的重组酶识别序列。利用Infusion的方法，将重组酶识别序列连入载体LF1的T-DNA插入区域的左、右边界之内，紧邻右边界之处；得到载体LF2；利用冻融法将载体LF2转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，使用菌检引物LF-F和LF-R，50μl普通PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表2，PCR反应条件为：94℃ 30s，55℃30s，72℃ 1min，重复30个循环。

3.根据已知的人工启动子pOp、重组酶FLP基因、NOS终止子序列，以5’端-SmaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-SmaI酶切位点-pOp-SalI酶切位点-FLP-NOS-HindIII酶切位点-HindIII酶切位点3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成效应载体的重组酶表达框(SEQ ID NO.1)；使用限制性内切酶SmaI和HindIII双酶切37℃过夜将载体LF2线性化，利用Infusion方法，将重组酶表达框连入载体，得到加载重组酶表达框的载体LF2；利用冻融法将加载重组酶表达框的载体LF2转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，使用菌检引物LF-F和LF-R，50μl长片段DNA PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃2min，重复30个循环。

4.根据已知的Ubi启动子、Bar-GUS融合基因、35S终止子序列，以5’端-KpnI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-Ubi-Bar-GUS-3’35S-SacI、SpeI酶切位点-SpeI酶切位点3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成效应载体的标记基因表达框(SEQ ID NO.2)；使用限制性内切酶SpeI和KpnI双酶切37℃过夜将加载重组酶表达框的载体LF2线性化，利用Infusion方法，将效应载体的标记基因表达框连入载体，得到效应载体；利用冻融法将效应载体转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，设计菌检引物GUS-F(5’-TAGCGCGCAAACTAGGATAAA-3’)(SEQ ID NO.16)和GUS-R

(5’-GGAACTTCGGTCATAACTTCGTA-3’)(SEQ ID NO.17)，50μl长片段DNA PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃10s，68℃ 4min，重复30个循环。

5.DNA凝胶回收的具体步骤：使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，①在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积。②加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。③加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。④吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，12,000×g离心1min。弃滤液。⑤将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。⑥将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1min。⑦将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。⑧将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl Eluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

4.以上各步Infusion反应的反应体系见表3，反应温度为37℃，反应时间30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

表3：Infusion反应体系

ddH2O	Up to 20μl
		5×CE II Buffer	4μl
线性化克隆载体	50-200ng
		插入片段扩增产物	20-200ng
ExnaseTM II酶	2μl

5.冻融法转化大肠杆菌DH5α的步骤：50μl大肠杆菌感受态细胞中加入小于50ng的质粒(1μl)，或者Infusion连接反应液10μl，冰浴30min；然后立即放入42℃水浴锅中热激90s；取出离心管，立即置于冰上冰浴2min，之后加入900μl不含任何抗生素的LB，37℃、220rpm振荡培养45min-1h；取出菌液，3000转离心3min，之后去掉850μl的上清液，留下100μl上清液用枪吸打悬浮菌块沉淀，然后均匀涂布在含相应抗生素的LB平板，在37℃培养箱中倒置培养过夜(12-15h)。

实施例2.激活载体的构建

1.根据pOp/LhG二元表达系统中的转录激活子LhG4基因序列、NOS终止子序列，以5’端-SmaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-SmaI、SalI酶切位点-LhG4-NOS-HindIII酶切位点-HindIII酶切位点3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成激活载体的激活表达框(SEQ ID NO.6)；使用限制性内切酶SmaI和HindIII双酶切37℃过夜将载体LF2线性化，利用Infusion方法，将激活表达框连入载体，得到加载激活表达框的载体LF2；利用冻融法将加载激活表达框的载体LF2转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，使用菌检引物LF-F和LF-R，50μl长片段DNA PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环。

2.根据已知的35S启动子、GUS-NPTII融合基因、35S终止子序列，以5’端-KpnI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-35S-GUS-NPTII-3’35S-SpeI酶切位点-SpeI酶切位点3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成激活载体的标记基因表达框(SEQ ID NO.7)；使用限制性内切酶SpeI和KpnI双酶切37℃过夜将加载激活表达框的载体LF2线性化，利用Infusion方法，将激活载体的标记基因表达框连入载体，得到激活载体；利用冻融法将激活载体转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，使用菌检引物GUS-F和GUS-R，PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。50μl长片段DNAPCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃ 10s，68℃ 4min，重复30个循环。

实施例3.清除抗虫玉米花粉和种子中全部外源基因的外源基因清除技术载体的构建

1.根据已知的35S启动子、BT抗虫基因、35S终止子序列，以5’端-35S-BT-3’35S-3’端的顺序，直接基因合成抗虫基因片段(SEQ ID NO.8)；使用限制性内切酶SacI和SpeI双酶切37℃过夜将效应载体线性化；设计引物BT-效应-F

(5’-TACTAGATCAAGCTTACTAGTTAATTCGGGGGATCTGGATT-3’)(SEQ ID NO.18)和BT-效应-R(5’-GATCCCCCGAATTAGAGCTCGTATTGGCTAGAGCAGCTTG-3’)(SEQ ID NO.19)，50μl长片段DNA PCR扩增抗虫基因片段，在抗虫基因片段两端引入线性化效应载体末端的同源序列，PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃ 10s，68℃ 4min，重复30个循环。利用Infusion方法，将PCR扩增产物连入载体，得到抗虫效应载体；利用冻融法将抗虫效应载体转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，使用菌检引物GUS-F，并设计引物BT-R

(5’-CCCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3’)(SEQ ID NO.20)，50μl长片段DNA PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃10s，68℃ 5min，重复30个循环。

2.使用限制性内切酶HindIII和SpeI双酶切37℃过夜将激活载体线性化；使用引物BT-激活-F(5’-CTATGTTACTAGATCAAGCTTTAATTCGGGGGATCTGGATT-3’)(SEQ ID NO.21)和BT-激活-R(5’-GATCCCCCGAATTAACTAGTGTATTGGCTAGAGCAGCTTG-3’)(SEQ ID NO.22)，50μl长片段DNA PCR扩增抗虫基因片段，在抗虫基因片段两端引入线性化激活载体末端的同源序列，PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃ 10s，68℃ 4min，重复30个循环。利用Infusion方法，将PCR扩增产物连入载体，得到抗虫激活载体；利用冻融法将抗虫激活载体转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，使用菌检引物GUS-F和BT-R，50μl长片段DNA PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃ 10s，68℃ 5min，重复30个循环。

3.根据已知的有性生殖异交单子叶作物花特异性启动子MADS35序列、以5’端-SmaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-SmaI酶切位点-MADS35-SalI酶切位点-SalI酶切位点3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成MADS35启动子序列(SEQ IDNO.9)；使用限制性内切酶SmaI和SalI双酶切37℃过夜将抗虫激活载体线性化，利用Infusion方法，将PCR扩增产物连入载体，得到花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体；利用冻融法将花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌落，使用菌检引物LF-F，并设计引物MADS-LF-R

(5’-ACGGTTCGGGATGTAGTTAAG-3’)(SEQ ID NO.23)，50μl长片段DNA PCR扩增所插入片段并测序检验插入序列及位置是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：98℃10s，55℃ 15s，72℃ 2min，重复30个循环。

实施例4.农杆菌的转化

使用冻融法分别将抗虫效应载体和花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体转化至农杆菌EHA105感受态细胞中。具体步骤如下：50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1-1μg(5-10μl)，冰浴30min；放入液氮中5min(或1min)，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；取出离心管，立即置于冰上冰浴2min，之后加入900μl不含任何抗生素的LB，28℃、220rpm振荡培养3-5h；取出菌液，3000转离心3min，之后去掉850μl的上清液，留下100μl上清液用枪吸打悬浮菌块沉淀，然后均匀涂布在含相应抗生素的LB平板。2天左右菌落可见。挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。设计特异于花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的引物MADS-F(5’-CATTGGGTCACCAGCAAATC-3’)(SEQ ID NO.24)和MADS-R

(5’-CTGTCTTCGGTATCGTCGTATC-3’)(SEQ ID NO.25)，以及特异于抗虫效应载体的引物FLP-F(5’-TCATTTGGAGAGGACACGTATTT-3’)(SEQ ID NO.26)和FLP-R

(5’-CAGATGCTTTCACCCTCACTTA-3’)(SEQ ID NO.27)进行农杆菌菌落PCR(50μl普通PCR扩增)及测序，验证载体转化是否正确。PCR反应体系见表2，PCR反应条件为：94℃30s，55℃ 30s，72℃ 1min，重复30个循环。

实施例5.玉米的转化

1.玉米转化方法的参考文献为：Yanbo Liu,Lijun Qin,Lizhen Han,Yang Xiang,Degang Zhao:Overexpression of maize SDD1(ZmSDD1)improves drought resistancein Zea mays L.by reducing stomatal density.Plant Cell,Tissue and OrganCulture,2015,122(1):147-159。基本方法为：挑选子粒饱满、大小一致的玉米品种“QB506”与“T32”种子，播在装有珍珠岩的塑料盘中催苗萌发，待种子胚芽萌至1～3cm长时，用刀片在玉米茎尖生长点处斜切，去掉胚芽鞘，暴露出茎尖生长点备用。参考农杆菌活化的过程，分别将含有抗虫效应载体和花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的农杆菌活化备用。将暴露出茎尖的玉米植株分别浸入农杆菌重悬液中，在50.65kPa真空渗透压下侵染10min，结束后用滤纸吸去多余的重悬液，播于盛有培养基质(园土:营养土＝1:1)的花盆中，将茎尖暴露在土壤表面，置于28℃光照下生长。待转基因小苗长至3-5叶期，取少量叶片进行GUS染色；并提取叶片DNA，使用引物MADS-F和MADS-R、引物FLP-F和FLP-R分别对可能含有相应载体的DNA进行20μl普通PCR扩增。PCR反应体系见表3，PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃ 1min，重复30个循环。获得经检验含上述转化载体的转基因玉米植株。

表4 20μl普通PCR扩增反应体系

ddH2O	Up to 20μl
		引物1	1μl(0.4μM)
引物2	1μl(0.4μM)
		DNA模板	1μl(0.1ng–5ng)
Premix Taq(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye)	10μl

农杆菌活化的具体步骤：取-80℃下保存的含有目的载体的农杆菌，在含有100mg/L卡那霉素和利福平的YEP平板(蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L，pH7.2)上划线，28℃培养2天。挑取单菌落接种于含有相同浓度抗生素的5ml YEP液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，pH＝7.2)中，200rpm 28℃振荡培养过夜，次日取5ml菌液加入新的50ml YEP培养基中，200rpm 28℃再振荡培养4h左右使OD600值为1.0-1.2。4℃条件下5000rpm离心10min，菌体沉淀用重悬液(MS+20.0g/L Sucrose+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L IBA+100μM AS，pH＝5.6)重悬至OD600为0.8备用。

GUS染色具体步骤为：取植株的幼嫩叶片细丝或花粉浸于GUS染液中，置于真空干燥器内真空渗透10min，之后放置于37℃恒温培养箱中过夜，经无水乙醇溶液脱色处理，再观察叶片颜色。

叶片DNA提取使用TIANGEN DNAsecure Plant Kit，具体步骤为：①取100mg新鲜的玉米叶片，加入液氮充分研磨，把组织粉末用液氮冷却的黄枪头转入1.5ml的离心管中，加入400μl的缓冲液LP1和6μl RNase A(10mg/ml)，漩涡振荡1min，室温放置10min。②加入130μl的缓冲液LP2，漩涡振荡1min使其充分混匀。③12,000rpm离心5min，将上清液移至新的离心管中。④向离心管中加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即15s振荡混匀。⑤将上一步得到的溶液加入到吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，倒掉废液。⑥向吸附柱中加入600μl的漂洗液PW，12,000rpm离心30s，倒掉废液。⑦同上重复一次。⑧12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置5min。⑨将吸附柱转入到一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL的洗脱缓冲液TE，室温放置3min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

实施例6.转基因玉米杂交子代外源基因清除效率的鉴定

使用人工授粉的方法对实施例5中获得的含有抗虫效应载体转基因玉米植株与含有花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的转基因玉米植株进行相互授粉杂交和收获，对收获的F1代种子进行种植。待转基因小苗长至3-5叶期，取少量叶片进行GUS染色；并提取叶片DNA，使用引物MADS-F和MADS-R、引物FLP-F和FLP-R，20μl普通PCR扩增F1代植株DNA。PCR反应体系见表3，PCR反应条件为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，重复30个循环。获得同时含有抗虫效应载体和花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的F1代转基因玉米植株。检测所获得的51个双载体F1代转基因株系的花粉中外源基因清除比例(花粉GUS染色，统计未染成蓝色的花粉的比例)，获得2个外源基因清除比例为100％的双载体F1代转基因玉米株系。将F1代转基因株系外源基因清除比例为100％的4个亲本株系分别自交，获得纯合的分别含有抗虫效应载体与花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的转基因玉米株系。

表5效应载体与激活载体转基因玉米自交与杂交子代花粉中的外源基因清除效率的比较

注：对于自交株系，花粉中的清除效率％＝(白色花粉数-蓝色花粉数)/(白色花粉数+蓝色花粉数)×100％；对于杂交株系，花粉中的清除效率％＝(3×白色花粉数-蓝色花粉数)/3×(白色花粉数+蓝色花粉数)×100％。

实施例7.水稻的转化

1.水稻转化方法为：将水稻成熟种子装入网袋，清水浸泡，放于恒温培养箱中，37℃避光处理，每8h换水一次。2天后种子破肚露白，用清水冲洗水稻种子，并倒掉容器中的水分，盖上盖子，37℃避光条件下进行催芽生根。待胚芽生长到1.5-2.0cm后，将水稻的胚芽及胚芽鞘用手术刀从茎尖茎环处切断，暴露其茎尖分生组织备用。参考农杆菌活化的过程，分别将含有抗虫效应载体和花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的农杆菌活化备用。将暴露出茎尖的水稻植株分别放入制备好的重悬液中，并加入200μl/L的Silwet-L77与100μmol/L的乙酰丁香。使用Bio-Rad台式基因枪进行真空处理，于1.5Kpa下真空处理8min，倒掉重悬液，置于干净湿润的珍珠岩上，28℃暗培养3天。暗培养3天后，使水稻恢复光照培养，5天后剪取叶片进行GUS染色。并提取叶片DNA，使用引物MADS-F和MADS-R、引物FLP-F和FLP-R分别对可能含有相应载体的DNA进行20μl普通PCR扩增。PCR反应体系见表3，PCR反应条件为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，重复30个循环。获得经检验含上述转化载体的转基因水稻植株。

实施例8.转基因水稻杂交子代外源基因清除效率的鉴定

使用人工授粉的方法对实施例5中获得的含有抗虫效应载体转基因水稻植株与含有花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的转基因水稻植株进行相互授粉杂交和收获，对收获的F1代种子进行种植。待转基因小苗长至3-5叶期，取少量叶片进行GUS染色；并提取叶片DNA，使用引物MADS-F和MADS-R、引物FLP-F和FLP-R，20μl普通PCR扩增F1代植株DNA。PCR反应体系见表3，PCR反应条件为：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，重复30个循环。获得同时含有抗虫效应载体和花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的F1代转基因水稻植株。检测所获得的48个双载体F1代转基因株系的花粉中外源基因清除比例(花粉GUS染色，统计未染成蓝色的花粉的比例)，获得1个外源基因清除比例为100％的双载体F1代转基因水稻株系。将F1代转基因株系外源基因清除比例为100％的2个亲本株系分别自交，获得纯合的分别含有抗虫效应载体与花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体的转基因水稻株系。

表6效应载体与激活载体转基因水稻自交与杂交子代花粉中的外源基因清除效率的比较

注：对于自交株系，花粉中的清除效率％＝(白色花粉数-蓝色花粉数)/(白色花粉数+蓝色花粉数)×100％；对于杂交株系，花粉中的清除效率％＝(3×白色花粉数-蓝色花粉数)/3×(白色花粉数+蓝色花粉数)×100％。

序列表

<110> 贵州大学

南京农业大学

<120> 基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体及其制备方法和应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1995

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggaacttcg aattccccgg gaattgtgag cgctcacaat tgaaagacta gaaagaagaa 60

agggaagaga aagaattgtg agcgctcaca attgaaagac tagaaagaag aaagggaaga 120

gaaagaattg tgagcgctca caattgaaag actagaaaga agaaagggaa gagaaagaat 180

tgtgagcgct cacaattgaa agactagaaa gaagaaaggg aagagaaaga attgtgagcg 240

ctcacaattg aaagactaga aagaagaaag ggaagagaaa gaattgtgag cgctcacaat 300

tgaaagacta gaggatcgat cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 360

tttggagagg acacgtattt ttacaacaat taccaacaac aacaaacaac aaacaacatt 420

acaattacta tttacaatta cagtcgacca tgccacaatt tggtatatta tgtaaaacac 480

cacctaaggt gcttgttcgt cagtttgtgg aaaggtttga aagaccttca ggtgagaaaa 540

tagcattatg tgctgctgaa ctaacctatt tatgttggat gattacacat aacggaacag 600

caatcaagag agccacattc atgagctata atactatcat aagcaattcg ctgagtttcg 660

atattgtcaa taaatcactc cagtttaaat acaagacgca aaaagcaaca attctggaag 720

cctcattaaa gaaattgatt cctgcttggg aatttacaat tattccttac tatggacaaa 780

aacatcaatc tgatatcact gatattgtaa gtagtttgca attacagttc gaatcatcgg 840

aagaagcaga taagggaaat agccacagta aaaaaatgct taaagcactt ctaagtgagg 900

gtgaaagcat ctgggagatc actgagaaaa tactaaattc gtttgagtat acttcgagat 960

ttacaaaaac aaaaacttta taccaattcc tcttcctagc tactttcatc aattgtggaa 1020

gattcagcga tattaagaac gttgatccga aatcatttaa attagtccaa aataagtatc 1080

tgggagtaat aatccagtgt ttagtgacag agacaaagac aagcgttagt aggcacatat 1140

acttctttag cgcaaggggt aggatcgatc cacttgtata tttggatgaa tttttgagaa 1200

attctgaacc agtcctaaaa cgagtaaata ggaccggcaa ttcttcaagc aataaacagg 1260

aataccaatt attaaaagat aacttagtca gatcgtacaa taaggctttg aagaaaaatg 1320

cgccttattc aatctttgct ataaaaaatg gcccaaaatc tcacattgga agacatttga 1380

tgacctcatt tctttcaatg aagggcctaa cggagttgac taatgttgtg ggaaattgga 1440

gcgataagcg tgcttctgcc gtggccagga caacgtatac tcatcagata acagcaatac 1500

ctgatcacta cttcgcactt gtttctcggt actatgcata tgatccaata tcaaaggaaa 1560

tgatagcatt gaaggatgag actaatccaa ttgaggagtg gcagcatata gaacagctaa 1620

agggtagtgc tgaaagaagc atacgatacc ccgcatggaa tgggataata tcacaggagg 1680

tactagacta cctttcatcc tacataaata gacgcatata agatcgttca aacatttggc 1740

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 1800

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 1860

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 1920

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcaagctt 1980

actagtccac cacca 1995

<210> 2

<211> 4146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctatacgaa gttatggtac cttgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 60

ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 120

gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 180

taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 240

catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 300

tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 360

ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 420

acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 480

ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 540

taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 600

cagcctgtta aacgccgtcg atcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc 660

gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct 720

ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg 780

cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc 840

agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata 900

aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca 960

cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg 1020

tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc 1080

ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct 1140

gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc 1200

agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgatct 1260

aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag 1320

catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta 1380

taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt 1440

ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc 1500

accctgttgt ttggtgttac ttctgcaaat gagcccagaa cgacgcccgg ccgacatccg 1560

ccgtgccacc gaggcggaca tgccggcggt ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac 1620

aagcacggtc aacttccgta ccgagccgca ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt 1680

ccgtctgcgg gagcgctatc cctggctcgt cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat 1740

cgcctacgcg ggcccctgga aggcacgcaa cgcctacgac tggacggccg agtccaccgt 1800

gtacgtctcc ccccgccacc agcggacggg actgggctcc acgctctaca cccacctgct 1860

gaagtccctg gaggcacagg gcttcaagag cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga 1920

cccgagcgtg cggatgcacg aggcgctcgg atatgcccca cgcggtatgc tgcgggcggc 1980

cggcttcaag cacgggaact ggcatgacgt gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc 2040

ggtgccgccc cgtccggtcc tgcccgtcac cgagatcccc ggctacggtc agtcccttat 2100

gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt 2160

cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga 2220

aagccgggca attgctgtgc caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg 2280

taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg 2340

ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa 2400

tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta 2460

tgttattgcc gggaaaagtg tacgtatcac cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca 2520

gactatcccg ccgggaatgg tgattaccga cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt 2580

ccatgatttc tttaactatg ccggaatcca tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa 2640

cacctgggtg gacgatatca ccgtggtgac gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc 2700

tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca 2760

acaggtggtt gcaactggac aaggcactag cgggactttg caagtggtga atccgcacct 2820

ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga 2880

gtgtgatatc tacccgcttc gcgtcggcat ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt 2940

cctgattaac cacaaaccgt tctactttac tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt 3000

gcgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat 3060

tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc 3120

agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga aactgctgct gtcggcttta acctctcttt 3180

aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa 3240

cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa 3300

ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc 3360

acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat 3420

cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc tcacaccgat accatcagcg atctctttga 3480

tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc 3540

agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc ctggcaggag aaactgcatc agccgattat 3600

catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg 3660

gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag 3720

cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt 3780

gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc 3840

ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg 3900

caaacaatga gatctgtcga tcgacaagct ctagtttctc cataataatg tgtgagtagt 3960

tcccagataa gggaattagg gttcctatag ggtttcgctc atgtgttgag catataagaa 4020

acccttagta tgtatttgta tttgtaaaat acttctatca ataaaatttc taattcctaa 4080

aaccaaaatc cagtactaaa atccagatcc cccgaattag agctcactag taagcttgat 4140

ctagta 4146

<210> 3

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggtggcag gatatattgt ggtgtaaaca ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 60

ttatgaccga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aacttcgaat 120

tccccgggaa gcttactagt ccaccaccac gtgtgaatta 160

<210> 4

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaatatagcg cgcaaactag gataggtacc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 60

ttatgaccga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aacttcgtaa 120

acctaagaga aaagagcgtt tattagaata acggatattt aaaagggcgt gaaaaggttt 180

atccgttcgt ccatt 195

<210> 5

<211> 6813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagccacca ccaccaccac cacgtgtgaa ttacaggtga ccagctcgaa tttccccgat 60

cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg 120

attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg 180

acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg 240

atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg 300

ttactagatc gggaattaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa 360

gagaaaagag cgtttattag aataacggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt 420

tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat 480

ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga 540

aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg 600

gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat aaagtagaat acttgcgact agaaccggag 660

acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac 720

cgacgaccag gacttgacca accaacgggc cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct 780

gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga 840

ccacctacgc cctggcgacg ttgtgacagt gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac 900

ccgcgaccta ctggacattg ccgagcgcat ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct 960

ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc 1020

cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc 1080

cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc 1140

gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct 1200

tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac 1260

cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga ggacgcattg accgaggccg acgccctggc 1320

ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac 1380

gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc 1440

gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat 1500

gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta 1560

aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg 1620

cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc 1680

agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg 1740

ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg 1800

ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg 1860

acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg 1920

acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc 1980

cttacgacat atgggccacc gccgacctgg tggagctggt taagcagcgc attgaggtca 2040

cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg 2100

gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca 2160

cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac 2220

ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca 2280

tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg 2340

tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac gttggccagc ctggcagaca cgccagccat 2400

gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt 2460

acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct atctgaatac atcgcgcagc taccagagta 2520

aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa 2580

atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt 2640

ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc 2700

ccgaggaatc ggcgtgagcg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct 2760

gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga 2820

ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc 2880

ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca 2940

accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat 3000

ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta 3060

cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg 3120

ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg 3180

ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa 3240

gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg 3300

gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt 3360

gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg 3420

gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg 3480

caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg 3540

ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt 3600

caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt 3660

gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca 3720

ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg 3780

ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa 3840

aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 3900

gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac 3960

tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 4020

tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca 4080

aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 4140

cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg 4200

acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc 4260

gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 4320

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 4380

ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa 4440

ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 4500

cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 4560

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 4620

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 4680

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 4740

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 4800

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 4860

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 4920

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 4980

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 5040

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 5100

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 5160

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 5220

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 5280

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 5340

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa 5400

ttcatccagt aaaatataat attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc 5460

aaaaaatagc tcgacatact gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa 5520

ggcaatgtca taccacttgt ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac 5580

tttgccatct ttcacaaaga tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc 5640

ctcttcgggc ttttccgtct ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt 5700

gtcttcttcc cagttttcgc aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa 5760

ttcggctaag cggctgtcta agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg 5820

aaagagcctg atgcactccg catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc 5880

atactcttcc gagcaaagga cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc 5940

atgccgttca aagtgcagga cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat 6000

gtccttttcc cgttccacat cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa 6060

atataggttt tcattttctc ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt 6120

atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt 6180

agccatttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat 6240

tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa 6300

acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt 6360

ttgaaaccgc ggtgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc 6420

ctccgcgaga tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca 6480

tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga 6540

ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 6600

ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 6660

acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcct aggccaccat 6720

gttgggcccg gcgcgccgaa ttcccgggga tccgtcgacc tgcagccaag ctttaagagg 6780

agtccaccat ggtagatctg actagtgtta acg 6813

<210> 6

<211> 1649

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggaacttcg aattccccgg ggtcgaccat gaaaccggta acgttatacg acgtcgctga 60

atacgccggc gtttctcatc aaaccgtttc tagagtggtt aaccaggctt cacatgttag 120

cgctaaaaca agggaaaaag ttgaagctgc gatggctgaa cttaactaca tcccgaaccg 180

tgttgcgcag cagctggctg gtaaacagtc cctgctgatc ggtgtcgcga cctcgagctt 240

ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg 300

tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt 360

gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca 420

ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc 480

tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt 540

ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagccggcc cattaagttc 600

tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca 660

gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca 720

aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct 780

gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt 840

gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca 900

ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca 960

ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccacttcggg 1020

atcggagttc gctaacttca accagtccgg aaacatcgct gattcttcct tgagcttcac 1080

tttcactaac tcttctaacg gacctaacct tatcaccact cagaccaact ctcaggctct 1140

tagccagcca atcgctagct ctaacgtgca cgacaacttc atgaacaacg agatcactgc 1200

tagcaagatc gatgatggta acaattctaa gcctcttagc ccaggatgga ctgatcagac 1260

tgcttacaac gcattcggta tcactaccgg tatgttcaac accactacga tggacgatgt 1320

gtacaactac ctcttcgacg atgaggatac tccacctaac cctaagaagg agtgagatcg 1380

ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat 1440

tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac 1500

gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat 1560

agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt 1620

actagatcaa gcttactagt ccaccacca 1649

<210> 7

<211> 3779

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctatacgaa gttatggtac cgtattggct agagcagctt gccaacatgg tggagcacga 60

cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggctattga 120

gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 180

tcacttcatc aaaaggacag tagaaaagga aggtggcacc tacaaatgcc atcattgcga 240

taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc 300

acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga 360

ttgatgtgaa catggtggag cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag 420

tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg ggaaacctcc 480

tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag gacagtagaa aaggaaggtg 540

gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctgccg 600

acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 660

caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg 720

cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg 780

agaggacacg ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctcg agctttcgca 840

gatctgtcga tcgaccatgt tacgtcctgt agaaacccca acccgtgaaa tcaaaaaact 900

cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt ggaattgatc agcgttggtg 960

ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat tgctgtgcca ggcagtttta acgatcagtt 1020

cgccgatgca gatattcgta attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg aagtctttat 1080

accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt gctgcgtttc gatgcggtca ctcattacgg 1140

caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata cgccatttga 1200

agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg gaaaagtgta cgtatcaccg tttgtgtgaa 1260

caacgaactg aactggcaga ctatcccgcc gggaatggtg attaccgacg aaaacggcaa 1320

gaaaaagcag tcttacttcc atgatttctt taactatgcc ggaatccatc gcagcgtaat 1380

gctctacacc acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc gtggtgacgc atgtcgcgca 1440

agactgtaac cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc aatggtgatg tcagcgttga 1500

actgcgtgat gcggatcaac aggtggttgc aactggacaa ggcactagcg ggactttgca 1560

agtggtgaat ccgcacctct ggcaaccggg tgaaggttat ctctatgaac tgtgcgtcac 1620

agccaaaagc cagacagagt gtgatatcta cccgcttcgc gtcggcatcc ggtcagtggc 1680

agtgaagggc gaacagttcc tgattaacca caaaccgttc tactttactg gctttggtcg 1740

tcatgaagat gcggacttgc gtggcaaagg attcgataac gtgctgatgg tgcacgacca 1800

cgcattaatg gactggattg gggccaactc ctaccgtacc tcgcattacc cttacgctga 1860

agagatgctc gactgggcag atgaacatgg catcgtggtg attgatgaaa ctgctgctgt 1920

cggctttaac ctctctttag gcattggttt cgaagcgggc aacaagccga aagaactgta 1980

cagcgaagag gcagtcaacg gggaaactca gcaagcgcac ttacaggcga ttaaagagct 2040

gatagcgcgt gacaaaaacc acccaagcgt ggtgatgtgg agtattgcca acgaaccgga 2100

tacccgtccg caaggtgcac gggaatattt cgcgccactg gcggaagcaa cgcgtaaact 2160

cgacccgacg cgtccgatca cctgcgtcaa tgtaatgttc tgcgacgctc acaccgatac 2220

catcagcgat ctctttgatg tgctgtgcct gaaccgttat tacggatggt atgtccaaag 2280

cggcgatttg gaaacggcag agaaggtact ggaaaaagaa cttctggcct ggcaggagaa 2340

actgcatcag ccgattatca tcaccgaata cggcgtggat acgttagccg ggctgcactc 2400

aatgtacacc gacatgtgga gtgaagagta tcagtgtgca tggctggata tgtatcaccg 2460

cgtctttgat cgcgtcagcg ccgtcgtcgg tgaacaggta tggaatttcg ccgattttgc 2520

gacctcgcaa ggcatattgc gcgttggcgg taacaagaaa gggatcttca ctcgcgaccg 2580

caaaccgaag tcggcggctt ttctgctgca aaaacgctgg actggcatga acttcggtga 2640

aaaaccgcag cagggaggca aacatgaatc aacaactctc ctggcgcacc atcgtcggct 2700

acagcctcgg gaattgctac cgagctcgag cttggatgga ttgcacgcag gttctccggc 2760

cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga 2820

tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct 2880

gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac 2940

gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct 3000

attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt 3060

atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt 3120

cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt 3180

cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag 3240

gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt 3300

gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg 3360

tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg 3420

cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg 3480

catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg gttcggatcg 3540

atcctctagc tagagtcgat cgacaagctc gagtttctcc ataataatgt gtgagtagtt 3600

cccagataag ggaattaggg ttcctatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa 3660

cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa 3720

accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc ccgaattaac tagtgtattg gctagagca 3779

<210> 8

<211> 4556

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtattggcta gagcagcttg ccaacatggt ggagcacgac actctcgtct actccaagaa 60

tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggctattgag acttttcaac aaagggtaat 120

atcgggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cacttcatca aaaggacagt 180

agaaaaggaa ggtggcacct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ctatcgttca 240

agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga 300

aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgaac atggtggagc 360

acgacactct cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcta 420

ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta 480

tctgtcactt catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa tgccatcatt 540

gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac 600

ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag 660

tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc 720

aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc tgaaatcacc 780

agtctctctc tacaaatcta tctctctcga gctttcgcag atctgtcgat cgaccaggcc 840

tatggataac aatccgaaca tcaatgaatg cattccttat aattgtttaa gtaaccctga 900

agtagaagta ttaggtggag aaagaataga aactggttac accccaatcg atatttcctt 960

gtcgctaacg caatttcttt tgagtgaatt tgttcccggt gctggatttg tgttaggcct 1020

tgttgatata atatggggaa tttttggtcc ctctcaatgg gacgcatttc ttgtacaaat 1080

tgaacagtta attaaccaaa gaatagaaga gttcgctagg aaccaagcca tttccagatt 1140

agaaggacta agcaatcttt atcaaattta cgcagaatct tttagagagt gggaagcaga 1200

tcctactaat ccagcattaa gagaagagat gcgtattcaa ttcaatgaca tgaacagtgc 1260

ccttacaacc gctattcctc tttttgcagt tcaaaattat caagttcctc ttttatcagt 1320

atatgttcaa gctgcaaatt tacatttatc agttttgaga gatgtttcag tgtttggaca 1380

aaggtgggga tttgatgccg cgactatcaa tagtcgttat aatgatttaa ctaggcttat 1440

tggcaactat acagatcatg ctgtacgctg gtacaatacg ggattagagc gtgtatgggg 1500

accggatagc cgggattgga taagatataa tcaatttaga agagaattaa cactaactgt 1560

attagatatc gtttctctat ttccgaacta tgatagtaga acgtatccaa ttcgaacagt 1620

ttcccaatta acaagagaaa tttatacaaa cccagtatta gaaaattttg atggtagttt 1680

tcgaggctcg gctcagggca tagaaggaag tattaggagt ccacatttga tggatatact 1740

taacagtata accatctata cggatgctca tagaggagaa tattattggt cagggcatca 1800

aataatggct tctcctgtag ggttttcggg gccagagttc acttttccgc tatatggaac 1860

tatgggaaat gcagctccac aacaacgtat tgttgctcaa ctaggtcagg gcgtgtatag 1920

aacattatcg tccactttat atagaagacc ttttaatata gggataaata atcaacaact 1980

atctgttctt gacgagacag aatttgctta tggaacctcc tcaaatttgc catccgctgt 2040

atacagaaaa agcggaacgg tagattcgct ggatgaaata ccgccacaga ataacaacgt 2100

gccacctagg caaggattta gtcatcgatt aagccatgtt tcaatgtttc gttcaggctt 2160

tagtaatagt agtgtaagta taatacgcgc acctatgttc tcttggatac atcgtagcgc 2220

tgaatttaat aatataattc cttcatcaca aattacacaa atacctttaa caaaatctac 2280

taatcttggc tctggaactt ctgtcgttaa aggaccagga tttacaggag gagatattct 2340

tcgaagaact tcacctggcc agatttcaac cttaagagta aatattactg cgccattatc 2400

acaaagatat cgggtaagga tcagatatgc ttctaccaca aatttacaat tccatacatc 2460

aattgacgga agacctatta atcaggggaa tttttcagca actatgagta gtgggagtaa 2520

tctacagtcc ggctcgttta ggactgtagg ttttactact ccgtttaact tttcaaatgg 2580

atcaagtgta tttacgttaa gtgctcatgt cttcaattca ggcaatgaag tttatataga 2640

tcgaattgaa tttgttccgg cagaagtaac ctttgaggca gaatatgatt tagaaagagc 2700

acaaaaggcg gtaaatgagc tgtttacttc tttcaatcaa atcgggttaa aaacagatgt 2760

gacggattat catattgatc aagtatccaa tttagttgag tgtttatctg atgaattttg 2820

tctggatgaa aaaaaagaat tgtccgagaa agtcaaacat gcgaagcgac ttagtgatga 2880

gcggaattta cttcaagatc caaactttag agggatcaat agacaactag accgtggctg 2940

gagaggaagt acggatatta ccatccaagg aggcgatgac gtattcaaag agaattacgt 3000

tacgctattg ggcacgtttg atgagtgcta tccaacgtat ttatatcaaa aaatagatga 3060

gtcgaaatta aaagcctata cccgttacca attaagaggg tatatcgaag atagtcaaga 3120

cttagaaatc tatttaattc gctacaatgc caaacacgaa acagtaaatg tgccaggtac 3180

gggttcctta tggccgcttt cagccccaag tccaatcgga aaatgtgccc atcattccca 3240

tcatttctcc ttggacattg atgttggatg tacagactta aatgaggact taggtgtatg 3300

ggtgatattc aagattaaga cgcaagatgg ccatgcaaga ctaggaaacc ttgaatttct 3360

cgaagagaaa ccattagtag gagaagcact agctcgtgtg aaaagagcgg agaaaaaatg 3420

gagagacaaa cgtgaaaaat tggaatggga aacaaatatt gtttataaag aggcaaaaga 3480

atctgtagat gctttatttg taaactctca atatgataga ttacaagcgg ataccaacat 3540

cgcgatgatt catccggcag ataaacgcgt tcatagcatt cgagaagcgt atctgcctga 3600

actgtctgtg attccgggtg tcaatgcggc tatttttgaa gaattagaag ggcgtatttt 3660

cactgcattt tccctatatg atgcgaggaa tgtcattaaa aatggtgatt ttaataatgg 3720

cttatcctgc tggaacgtga aagggcatgt agatgtagaa gaacaaaaca accaccgttc 3780

ggtccttgtt gttccggaat gggaagcaga agtgtcacaa gaagttcgtg tctgtccggg 3840

tcgtggctat atccttcgtg tcacagcgta caaggaggga tatggagaag gttgcgtaac 3900

cattcatgag atcgagaaca atacagacga actgaagttt agcaactgtg tagaagagga 3960

agtatatcca aacaacacgg taacgtgtaa tgattatact gcgactcaag aagaatatga 4020

gggtacgtac acttctcgta atcgaggata tgacggagcc tatgaaagca attcttctgt 4080

accagctgat tatgcatcag cctatgaaga aaaagcatat acagatggac gaagagacaa 4140

tccttgtgaa tctaacagag gatatgggga ttacacacca ctaccagctg gctatgtgac 4200

aaaagaatta gagtacttcc cagaaaccga taaggtatgg attgagatcg gagaaacgga 4260

aggaacattc atcgtggaca gcgtggaact actcctcatg aaagaataac tgcaggcggg 4320

actctggggt tcggatcgat cctctagcta gagtcgatcg acaagctcga gtttctccat 4380

aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg aattagggtt cctatagggt ttcgctcatg 4440

tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata 4500

aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tactaaaatc cagatccccc gaatta 4556

<210> 9

<211> 2075

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggaacttcg aattccccgg ggctgcctta gtttcagtag agttggttct tcatttcttt 60

tcagtgatca aattattgtt tctgttcttt tctgccatgg taagttcctt ttttttttct 120

tcttcttgcc ttcatttgag ttaattacag cattgatttg tgtgaacaaa attcatcata 180

aatcagttcc tcgcgagatc attggtctca acatgatggt gccaagtgag aactgcagta 240

ttgtgcagtt ttcagttttg agtctaagtt gtataaactt gcagttggag tattatgctc 300

tagtattaat ctactatcag acaagataag atcactgatt aattcacccc tgacctgatc 360

catcttgtgc acacgtcggc cagcagcgga attgagcttc tggatcagat cttaggcatc 420

gtttggaaca gagaagtttc aaagatttat gaagaatttg aattaaattc agtatagaat 480

gcatgattgt gaaaagtaca ataatatgaa aaataaagga ttgagatatc atgatttaat 540

aatttattga atactccatg taacaaaccc atagtaattg tccaaagtag atgttgggat 600

agaaggaaaa atacagaaaa cttatgattg tacggtgatt tgatggagag aaaagggaga 660

gagaaagaga caacttgtag tgcaacccta aaaggaattt gaatgaatat agttagaact 720

tttgtggtag aaatttcttc taaaaatgtg gagcaacttt ttcctatcct acaaaattcc 780

ttcaaatcag tcctacataa cctttccaaa atttcacaag aaatgaaata agcataccat 840

tccatcttgt gcacacgtcc cccagtagcg aaattgagtt tctaggtcag atcttgagcc 900

tcgctggaac ggagaaattt taaagattta taaaggattt aaattaaatc tagcatagaa 960

cgtatgaata ttaaaagaaa tatagaaata aggaaaacat aggattgtga taccatgatt 1020

taataattta atgagtccat gaaacaaacc catggtaatt gcccaaaata gatgtttgga 1080

tagcttagaa aaaaaataca gaaaattaag attttacggt gattagttgg agagagaagg 1140

gagagacata agttgcatcg caattctcaa acgaagtcga aaaatatgag gttagatttt 1200

attctagaat tcctctaaaa tacggacgac gaaattactt tgaatcaatc caacaaatct 1260

acataggaat tactctttcg gactcaaact cctcaatttt ttcccactta aaaatccttc 1320

gccctaatta aagttcaccc gttacaaatg gagagcgatc gagctctcaa ctagcctaat 1380

tcaagaggtg atgaagaaaa atggcagaga aaaagaagaa gaagaagaag aagaagccgc 1440

aatcactcct agtccttaca aggttctgcc gccgtggtga ggccaatggc acatactttc 1500

aggcttcagc ccaccaaatg gagacgccat acggcctatg ctgttccagg cccaaattac 1560

accggctaaa ccccatacgg cccatacata taccattcct ggtccaaaac cggtgggttc 1620

ccgagtaggg aatcggacac ggcccgactc aaacacacgc actctccaag tctcgagctc 1680

cacgacgacg acgacgacga tgacgatggc gcacagggca ggggcaggca ggtcacatgt 1740

ggtggtgaat ggtgatggcc atccatccat ccaccaatga aaaggcgagt cgtggtaaag 1800

aagacggatg gacggatgga tgggcatggg cggcgagcga tggacgcgac gcgacccatc 1860

ctggtttccc gaaacgcgct acgctgccga gcatctaggg tttcccaccc ggtacgacct 1920

tgccgaaaat ggcacccact caccatctcc atccttttaa tccccttcct ccacctcgct 1980

tgctttcttg cagtggtggt ggtggtggtg gtgagatcta gcttggttgg ttggttgcag 2040

ctggagatcg atcggtcgac catgaaaccg gtaac 2075

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaccaccac gtgtgaatta 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccacaatata tcctgccacc ag 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcctgtatcg agtggtgatt 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acaaatggac gaacggataa ac 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaggtttatc cgttcgtcca tt 22

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tatcctagtt tgcgcgctat attt 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tagcgcgcaa actaggataa a 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggaacttcgg tcataacttc gta 23

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tactagatca agcttactag ttaattcggg ggatctggat t 41

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gatcccccga attagagctc gtattggcta gagcagcttg 40

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccagataag ggaattaggg ttc 23

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctatgttact agatcaagct ttaattcggg ggatctggat t 41

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatcccccga attaactagt gtattggcta gagcagcttg 40

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acggttcggg atgtagttaa g 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cattgggtca ccagcaaatc 20

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctgtcttcgg tatcgtcgta tc 22

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcatttggag aggacacgta ttt 23

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cagatgcttt caccctcact ta 22

Claims (10)

1.一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体，其特征在于，所述外源基因清除技术基础载体包含效应载体和激活载体；

所述效应载体包括重组酶表达框、标记基因表达框1、重组酶识别序列；

所述重组酶表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的人工启动子pOp、重组酶FLP基因和NOS终止子，重组酶表达框序列如SEQ ID NO.1所示；

所述标记基因表达框1包括Ubi启动子、Bar-GUS融合基因、35S终止子，标记基因表达框1序列如SEQ ID NO.2所示；

所述重组酶识别序列包括LB loxP-FRT(SEQ ID NO.3)和RB loxP-FRT(SEQ ID NO.4)；

所述激活载体包括激活表达框、标记基因表达框2、重组酶识别序列；

所述激活表达框包括pOp/LhG二元表达系统中的转录激活子LhG4基因、NOS终止子，激活表达框序列如SEQ ID NO.6所示；

所述标记基因表达框2包括35S启动子、GUS-NPTII融合基因、35S终止子，标记基因表达框2序列如SEQ ID NO.7所示；

所述重组酶识别序列与效应载体的相同，包括LB loxP-FRT(SEQ ID NO.3)和RB loxP-FRT(SEQ ID NO.4)；

所述效应载体和激活载体分别整合在不同的载体pCAMBIA0380上，载体pCAMBIA0380序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体，其特征在于，所述重组酶识别序列LB loxP-FRT整合在载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的左边界内侧；

所述重组酶识别序列RB loxP-FRT整合在载体pCAMBIA0380的T-DNA插入区域的右边界内侧；

所述重组酶表达框和标记基因表达框1顺序整合在效应载体的重组酶识别序列LBloxP-FRT和RB loxP-FRT之间；

所述激活表达框和标记基因表达框2顺序整合在激活载体的重组酶识别序列LB loxP-FRT和RB loxP-FRT之间。

3.权利要求1或2所述的外源基因清除技术基础载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1.根据已知的loxP和FRT序列，以5’端-插入位置5’端20个碱基的载体序列-loxP-FRT-EcoRI、SmaI酶切位点-插入位置3’端8个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成LB loxP-FRT(SEQ ID NO.3)；通过重组连接，将loxP-FRT连入载体pCAMBIA0380(SEQ ID NO.5)的T-DNA插入区域的左、右边界之内，紧邻左边界之处，得到载体LF1；

S2.根据已知的loxP和FRT序列，以5’端-插入位置5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-loxP-FRT-插入位置3’端20个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成RB loxP-FRT(SEQID NO.4)；通过重组连接，将RB loxP-FRT连入载体LF1的T-DNA插入区域的左、右边界之内，紧邻右边界之处，得到载体LF2；

S3.根据已知的人工启动子pOp、重组酶FLP基因、NOS终止子序列，以5’端-插入位置5’端8个碱基的载体序列-EcoRI、SmaI酶切位点-pOp-SalI酶切位点-FLP-NOS-HindIII酶切位点-插入位置3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成重组酶表达框(SEQ ID NO.1)；通过重组连接，将重组酶表达框连入载体LF2，得到加载重组酶表达框的载体LF2；

S4.根据已知的Ubi启动子、Bar-GUS融合基因、35S终止子序列，以5’端-插入位置5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-Ubi-Bar-GUS-3’35S-SacI、SpeI、HindIII酶切位点-插入位置3’端2个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成标记基因表达框1(SEQ ID NO.2)；通过重组连接，将标记基因表达框1连入加载重组酶表达框的载体LF2，得到效应载体；

S5.根据pOp/LhG二元表达系统中的转录激活子LhG4基因序列、NOS终止子序列，以5’端-插入位置5’端8个碱基的载体序列-EcoRI、SmaI、SalI酶切位点-LhG4-NOS-HindIII酶切位点-插入位置3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成激活载体的激活表达框(SEQID NO.6)；通过重组连接，将激活表达框连入载体LF2，得到加载激活表达框的载体LF2；

S6.根据已知的35S启动子、GUS-NPTII融合基因、35S终止子序列，以5’端-插入位置5’端15个碱基的载体序列-KpnI酶切位点-35S-GUS-NPTII-3’35S-SpeI、HindIII酶切位点-插入位置3’端8个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成激活载体的标记基因表达框2(SEQ IDNO.7)；通过重组连接，将激活载体的标记基因表达框2连入加载激活表达框的载体LF2，得到激活载体。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S4获得的效应载体上标记基因表达框1的限制性内切酶SpeI、SacI酶切位点之间，插入与目标作物所需优势性状对应的外源基因片段。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S6获得的激活载体上标记基因表达框2的限制性内切酶HindIII、SpeI酶切位点之间，插入与目标作物所需优势性状对应的外源基因片段；所述S6获得的激活载体上激活表达框的限制性内切酶SmaI、SalI酶切位点之间，插入特异性启动子序列。

6.根据权利要求1所述的一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体在清除有性生殖异交作物目标部位和/或时期中全部外源基因的中的应用，其特征在于，所述外源基因清除技术基础载体的效应载体中导入目标外源基因片段，激活载体中导入目标外源基因片段和目标部位和/或时期的特异性启动子。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述效应载体和激活载体分别导入有性生殖异交作物的不同亲本，亲本相互杂交，获得清除目标部位和/或时期中全部外源基因的有性生殖异交作物。

8.根据权利要求1所述的一种基于pOp/LhG二元表达系统的外源基因清除技术基础载体在清除抗虫有性生殖异交单子叶作物的花粉和种子中全部外源基因的中的应用，其特征在于，所述外源基因清除技术基础载体的效应载体中导入抗虫BT基因序列，获得抗虫效应载体；激活载体中导入有性生殖异交单子叶作物花特异性启动子和抗虫BT基因序列，获得花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

S1.根据已知的35S启动子、抗虫BT基因序列、35S终止子序列，以5’端-35S-BT-3’35S-3’端的顺序，直接基因合成抗虫基因片段(SEQ ID NO.8)；

S2.通过重组连接，将抗虫基因片段连入效应载体上的限制性内切酶SpeI、SacI酶切位点之间，得到抗虫效应载体；

S3.通过重组连接，将抗虫基因片段连入激活载体上的限制性内切酶HindIII、SpeI酶切位点之间，得到抗虫激活载体；

S4.根据已知的有性生殖异交单子叶作物花特异性启动子MADS35序列、以5’端-SmaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-SmaI酶切位点-MADS35-SalI酶切位点-SalI酶切位点3’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成MADS35启动子序列(SEQ ID NO.9)；

S5.通过重组连接，将MADS35启动子连入抗虫激活载体上的限制性内切酶SmaI、SalI酶切位点之间，得到花专一启动子抗虫有性生殖异交单子叶作物的激活载体。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用还包括以下步骤：

将S2获得的效应载体导入有性生殖异交单子叶作物的亲本1；将S5获得的激活载体导入有性生殖异交单子叶作物的亲本2；将得到的亲本1和亲本2相互杂交，获得清除花粉和种子中全部外源基因的抗虫有性生殖异交单子叶作物。