KR20230172970A - 재설계된 크리소에리올 대사경로를 포함하는 기능성 플라보노이드 생산 시스템 - Google Patents

재설계된 크리소에리올 대사경로를 포함하는 기능성 플라보노이드 생산 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재설계된 크리소에리올 대사경로를 포함하는 크리소에리올 생산 시스템에 대한 것으로, 보다 상세하게는, AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트 및 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물, 그리고 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조방법과 크리소에리올의 대량 생산 방법에 의해 고부가 산업·의료용 소재인 크리소에리올을 대량 생산할 수 있다.

Description

재설계된 크리소에리올 대사경로를 포함하는 기능성 플라보노이드 생산 시스템 {Functional flavnoid production system with redesigned chrysoeriol metabolic pathway}
본 발명은 재설계된 크리소에리올(chrysoeriol) 대사경로를 포함하는 플라보노이드 생산 시스템에 대한 것으로, 보다 상세하게는 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트 및 이를 이용한 크리소에리올 생산 방법에 관한 것이다.
식물체는 다양한 기능성(항암, 항염, 항산화 성분)을 지니는 수만종의 파이토케미컬(phytochemical)을 생산하는 것으로 알려져 있다. 이러한 파이토케미컬 중에서도 플라보노이드계 물질은 뛰어난 항산화 기능 외에도 다양한 기능성을 지니는 것으로 알려져 있다. 식물체에서 플라보노이드 물질은 식물의 잎, 종자, 과실, 꽃등에 축적되어 UV광으 로부터 식물을 보호하는 역할을 수행하며, 미생병원균, 곤충과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 플라보노이드계 물질들은 항암, 항염, 항산화등의 다양한 기능성이 보고되어 여러 산업분야(건강증진 및 의료분야)에서 이용되고 있다.
크리소에리올(chrysoeriol; C16H12O6)은 주로 알팔파(alfalfa)에서 발견되는 식물계에 많이 분포하는 플라보노이드의 하나로 전통의학에서 소화불량, 천식, 비뇨기계 이상의 치료에 사용되어왔다. 최근 연구결과 지질농도 저하 활성, 항산화, 항염 등의 효과를 갖는 것으로 알려져 부가가치가 높은 크리소에리올은 소량 존재하며 인위적 합성이 어려워 이를 대량생산할 수 있는 기술에 대한 필요성이 대두되었다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 합성생물학 기술을 이용하여 식물의 기능성 플라보노이드인 크리소에리올 대사경로를 간소화하고 재설계하여 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2를 포함하는 다중 유전자 발현 모듈(OPCFF)의 사용이 루테올린 투입과 CrOMT2 단일 유전자 발현에 의한 크리소에리올 생산보다 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 10-2026764
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H, CrOMT2 유전자 및 프로모터를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 재조합 벡터 또는 상기 형질전환체로 형질전환된 형질전환 식물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 (a) AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H, CrOMT2 유전자 및 프로모터를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 형질전환 식물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 (a) AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H, CrOMT2 유전자 및 프로모터를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터로 식물을 형질전환하는 단계; (b) 상기 형질전환된 식물을 재배하여 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득한 식물로부터 크리소에리올을 추출하는 단계를 포함하는 크리소에리올의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H, CrOMT2 유전자 및 프로모터를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자는 크리소에리올 생합성에 관여하는 유전자로, 구체적으로는 AtPAL 유전자는 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 선발하고, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 유전자는 벼(Oryza sativa)에서 선발하며 CrOMT2 유전자는 감귤(Citrus reticulata)에서 선발한 것이고, AtPAL을 제외한 OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자는 담배에서 효율적인 발현을 유도하고자 담배가 선호하는 코돈으로 변경하여 담배에서 발현이 최적화된 재조합 유전자 염기서열을 포함한다. 구체적으로 상기 유전자 염기서열은 서열번호 1(AtPAL), 서열번호 2(OsCHS), 서열번호 3(OsFNS), 서열번호4(OsF3'H) 및 서열번호 5(CrOMT2)로 표시되는 염기서열로 구성된 것이다.
본 발명의 일 예시로써, 상기 OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자는 식물에서의 발현이 최적화된 것일 수 있다.
본 발명에서 '재조합(recombinant)'은 '유전자 조작(genetic manipulation)'과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트는 크리소에리올의 생산을 증진시키거나 감소시키는 것을 포함하며, 구체적으로 크리소에리올 생산의 증진을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 크리소에리올 생산의 증진은 크리소에리올을 생산하지 않는 식물에서 크리소에리올을 생산하게 하거나, 크리소에리올을 생산하는 식물에서 크리소에리올 생산량을 증가시키는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, '프로모터'란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. '식물 프로모터'는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. '구성적(constitutive) 프로모터'는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다.
본 발명에 있어서, 프로모터는 통상의 프로모터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 CaMV 35S promoter, RPS5A(ribosomal protein subunit 5a), Agrobacterium tumefaciens Nopaline synthase(NOS) promoter, Agrobacterium tumefaciens octopine synthase gene (OCS) promoter, small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RBCS) promoter 등이며 구체적으로 CaMV 35S promoter 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 유전자 발현 카세트를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 구체적으로 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 'OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자'는 식물에서의 발현을 위해 코돈을 최적화(optimization)한 것일 수 있다.
본 발명에서 '식물에서 발현이 최적화' 의미는 특정 식물에서 유래하지 않은 유전자가 특정 식물의 세포에서 최대한 발현될 수 있도록 유전자를 재조합하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 특정 식물에서 유래하지 않은 유전자의 코돈을 특정 식물이 선호하는 코돈으로 변환하는 것을 의미한다. 상기‘코돈(codon)'은 특정 아미노산을 지정하는 연속된 세 개의 염기 서열을 의미한다. 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 시토신(C)으로 구성되는 61 종류의 코돈이 20 개의 아미노산을 지정하게 되므로 특정 아미노산을 지정하는 코돈은 복수로 존재하며, 생물종마다 선호하는 코돈, 즉 서로 다른 생물종의 유전자에서의 코돈의 발생 빈도가 모두 다르다는 것이 알려져 있다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 '발현 벡터'로, 이러한 발현 벡터는 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현 할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미하며, 대체로 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.
‘작동가능하게 연결된(operably linked)’이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 ‘발현조절서열(expression control sequence)’이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.
본 발명의 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H, CrOMT2 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터 제조를 위한 숙주 벡터로는 구체적으로 pAGM8043 벡터이며, 본 발명에서 사용되는 아그로박테리움은 식물 형질전환용으로 통상 사용되는 것이면 어느 것이라도 이용할 수 있고, 구체적으로 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101을 사용할 수 있다.
발현 벡터는 구체적으로 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 예시로, 본 발명의 재조합 벡터는 도 6의 개열지도를 갖는 벡터일 수 있다. 구체적으로 재조합 벡터는 스펙티노마이신 저항성 마커 유전자를 포함하고 있으며, 식물 염색체 DNA에 삽입될 수 있도록 T-DNA의 LB(T-DNA left border)와 RB(T-DNA right border)를 포함하고 있다. T-DNA 내부에는 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H, CrOMT2 유전자의 코딩염기서열(CDS)가 각기 다른 프로모터와 터미네이터 조합하에 발현될 수 있도록 제작되어 있고, AtPAL은 haemagglutinin(HA)의 일부서열인 "Y P Y D V P D Y A"의 9개 아미노산으로 구성된 HA tag peptide가 6개 융합되어 있다(도 6).
'프로모터'란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. '식물 프로모터'는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. '구성적(constitutive) 프로모터'는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다.
본 발명에 있어서, 프로모터는 통상의 프로모터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 CaMV 35S promoter, RPS5A(ribosomal protein subunit 5a), Agrobacterium tumefaciens Nopaline synthase(NOS) promoter, Agrobacterium tumefaciens octopine synthase gene (OCS) promoter, small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (RBCS) promoter 등이며 구체적으로 CaMV 35S promoter 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 A. tumefaciens octopine synthase gene (Ocs) terminator, A. tumefaciens mannopine synthase (Mas) terminator, 35S Cauliflower Mosaic Virus (35S CaMV) terminator, 7th gene isolated from Agrobacterium tumefaciens L. (Atug7) terminator, actin2 terminator, tomato ATPase terminator, potato Histone H4 temonator 등이며 구체적으로 A. tumefaciens octopine synthase gene (Ocs) terminator, 7th gene isolated from Agrobacterium tumefaciens L. (Atug7) terminator 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질 전환체를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는, 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주세포도 이용가능하며, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)이고, 일 예시로, 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 위한 배지로 일 예시로, 침윤배지(infiltration media, IM : 5% D-glucose, 10mM MES, 10mM MgCl2, 200uM Acetosyringone) 일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 이러한 벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용하여 형질전환된 크리소에리올 생산을 위한 형질전환 식물을 제공한다.
본 발명에서의 식물은 바람직하게는 씨(종자)를 만들고 퍼뜨려 번식하는 식물인 종자식물일 수 있으며, 겉씨식물과 속씨식물을 모두 포함하며, 속씨식물은 쌍떡잎식물과 외떡잎식물을 모두 포함한다. 종자식물은 크게 영양기관인 뿌리, 줄기, 잎, 그리고 생식기관인 꽃으로 구성되어 있고, 발달하지 않은 배아 상태의 식물인 종자가 있다. 본 발명에서의 식물은 완전한 구조를 갖는 전체 식물이거나 상기 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 등 식물의 기관, 조직 또는 다수의 식물 세포로 이루어진 식물의 일부일 수 있다. 식물의 일부는 전체 식물에 연결된 상태일 수도 있고, 분리된 것일 수도 있다.
또한 본 발명에 따른 형질전환된 식물의 세포 또는 조직은 식물에서 유래한 것이라면 종류가 제한되지 않는다. 식물의 조직으로는 예를 들어 식물의 표면을 구성하는 표피 세포로 구성된 표피 조직, 표피에서 2개의 공변세포 가 구성하는 기공 조직, 표피 세포로부터 형성되는 털, 뿌리의 표피세포로부터 형성되는 뿌리털, 줄기나 뿌리의 관다발을 제외한 부분과 광합성을 하는 엽육 조직(울타리 조직, 해면 조직)을 포함하는 유조직, 줄기나 잎자루 의 유조직에서 비대해진 후각 조직, 세포벽이 비대해진 후막 조직, 식물체 내에서 물의 이동에 관여하는 물관 또는 헛물관, 물관부 유조직, 물관부 섬유를 포함하는 물관부, 유기 물질의 운반을 담당하는 체관부 유조직, 체관부 섬유, 반세포 등을 포함하는 체관부 조직 등이 있다.
본 발명의 식물은 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자 발현에 의해 크리소에리올을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 알팔파, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 구체적으로 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지않으며, 형질전환 방법과 크리소에리올 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 Nicotiana benthamiana L.나 Nicotiana tabacum cv. Xanthi 등의 품종을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 이러한 벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용하여 형질전환된 식물은 당업계에 공지된 식물의 형질전환 방법을 제한 없이 사용하여 제조할 수 있다. 식물의 형질전환 방법으로는 예를 들어, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 리포좀과 식물 원형질체를 융합하는 방법, PEG를 이용하여 재조합 벡터를 식물 원형질체로 주입하는 방법, 상기 재조합 벡터의 식물 세포로의 직접주입법, 미세입자충격법, 유전자총, 전기천공법 (electroporation), 바이러스를 이용한 형질전환법, 진공을 이용한 형질전환법 (vaccum infiltration method), 화아침지법 (floral meristem dipping method) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H, CrOMT2 유전자 및 프로모터를 포함하는, 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물의 제조 방법을 제공한다.
상기 재조합 벡터, 식물 및 형질전환은 전술한 바와 같다.
(a) 단계는 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계이다.
상기 OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자는 숙주(host)가 될 식물의 코돈 선호도를 분석하여 식물에서 발현하고자 하는 유전자의 코돈을 숙주가 될 식물이 선호하는 코돈으로 변환하고, 해당 재조합 염기서열을 갖는 유전자를 당업계에 공지된 방법으로 합성함으로써 제작할 수 있다. 바람직하게는 각각 서열번호 2 내지 4로 표시되는 담배가 선호하는 코돈으로 변환된 재조합 OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 식물에서의 발현이 최적화된 재조합 OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자는 당업계에 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 식물 세포에서 활성을 갖는 프로모터와 전사 또는 번역(translation) 효율을 높이기 위한 발현조절서열을 작동가능하게 연결하고, 재조합 벡터에 삽입함으로써 제조될 수 있다. 식물 세포에서 활성을 갖는 프로모터와 발현 조절 서열에 대하여서는 본 발명에 따른 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터에서 상술한 바와 같다.
(b) 단계는 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 단계이다.
본 발명에서의 식물은 바람직하게는 씨(종자)를 만들고 퍼뜨려 번식하는 식물인 종자식물일 수 있으며, 겉씨식물 또는 쌍떡잎식물과 외떡잎식물을 모두 포함하는 속씨식물일 수 있다. 종자식물은 크게 영양기관인 뿌리, 줄기, 잎 그리고 생식기관인 꽃으로 구성되어 있고, 발달하지 않은 배아 상태의 식물인 종자가 있다. 본 발명에서의 식물은 완전한 구조를 갖는 전체 식물이거나 상기 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 등 식물의 기관, 조직 등 식물의 일부일 수 있다. 식물의 조직에 대하여서는 본 발명의 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물 부분에서 서술한 바와 같다.
또한 본 발명에서의 식물은 식물 세포 또는 조직의 배양물일 수도 있다.
상기 식물을 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 식물의 형질전환 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 당업자는 숙주로 선택한 식물의 특성을 고려하여 특정 식물에 적절한 공지의 형질전환 방법을 선택하여 실시할 수 있다. 식물의 형질전환 방법으로는 예를 들어 재조합 벡터를 포함하는 리포좀과 식물 원형질체를 융합하는 방법, PEG를 이용하여 재조합 벡터를 식물 원형질체로 주입하는 방법, 상기 재조합 벡터의 식물 세포로의 직접주입법, 미세입자충격법, 유전자총, 전기천공법(electroporation), 바이러스를 이용한 형질전환법, 진공을 이용한 형질전환법(vaccum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 사용할 수 있다.
상기 ‘아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법’은 식물의 뿌리와 줄기에 종양을 일으키는 토양의 그람 음성 세균인 아그로박테리움을 이용하여 식물 세포에 외부 유전자를 전달하는 방법이다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등의 아그로박테리움에서 발견되는 종양 유발 플라스미드(tumor-inducing plasmid, Ti plasmid)의 T-DNA(transfer DNA)가 식물의 유전체(genome)에 삽입되는 현상을 이용한 방법이다.
본 발명에서의 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 이용하여 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 일과성 발현(transient expression)할 수도 있고, 안정적 발현(stable expression)할 수도 있다. 일과성 발현을 위해서는 식물의 일부, 예를 들어 식물의 잎을 재조합 벡터를 포함하는 아그로박테리움으로 감염시켜 형질전환하고, 목적하는 유전자가 충분히 발현될 수 있는 시간이 지난 뒤 식물에서 감염된 부분을 수득할 수 있다. 안정적 발현을 위하여 식물의 세포나 조직을 배양하여 아그로박테리움으로 감염시켜 형질전환한 뒤, 추가 배양하여 적합한 형질전환체를 선별하고 재분화 과정을 거친 뒤 완전한 구조를 갖는 형질전환 식물체로 배양할 수 있다. 상기 형질전환된 식물체에서 종자를 수득하고 발아시킴으로써 다음 세대에서도 안정적으로 형질전환 식물체를 수득할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물을 형질전환하는 단계; (b) 상기 형질전환된 식물을 재배하여 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득한 식물로부터 크리소에리올을 추출하는 단계를 포함하는 크리소에리올의 생산 방법을 제공한다.
(a) 단계는 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물을 형질전환하는 단계이다.
상기 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 식물의 형질전환 방법, 그리고 형질전환의 대상이 되는 식물의 범위와 종류에 대하여서는 앞서 상술한 바와 같다.
(b) 단계는 상기 형질전환된 식물을 재배하여 수득하는 단계이다.
상기 식물을 재배하는 단계는 식물을 형질전환한 후, 목적하는 바에 부합하는 양의 유전자를 발현하는 시간 동안 식물의 성장에 필요한 빛, 온도, 습도 등의 환경 조건과 물, 무기염류, 영양소, 호르몬 등 식물 성장에 필요한 요소들을 제공하는 것을 의미한다. 식물에서 분리된 세포, 조직 또는 이들의 배양물을 형질전환한 경우, 상기 물, 영양소, 무기염류, 생장조절제 등 식물 조직 배양에 필요한 요소들은 배양 배지(culture media)를 통해 전달될 수 있다. 또한 유도성 프로모터를 이용하여 식물에서 본 발명에 따른 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 발현시킨 경우, 상기 유도성 프로모터를 활성화하는데 필요한 해당 자극, 예를 들어 빛, 열 또는 호르몬 등을 가하면서 재배할 수 있다.
상기 식물을 수득하는 단계는 형질전환되어 목적하는 유전자를 과발현하는 식물의 전체 또는 일부를 수득하는 것을 의미한다. 본 발명의 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 과발현하는 뿌리, 줄기, 잎 등의 형질전환된 부분 또는 형질 전환된 식물체의 종자를 수득하는 것일 수 있으며, 식물 세포나 조직의 배양물, 예를 들어 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자로 형질전환된 캘러스나 원형질체 등을 수득하는 것일 수도 있다.
(c) 단계는 상기 수득한 식물로부터 크리소에리올을 추출하는 단계이다.
상기 단계는 형질전환 식물로부터 크리소에리올을 분리하는 단계로, 형질전환 식물을 분쇄하고 여과하여 크리소에리올을 추출한다. 크로마토그래피 등의 공지의 방법으로 여과하여 크리소에리올을 고순도로 분리해낼 수 있다. 크리소에리올을 추출하기 위하여 식물을 냉동, 건조시키는 등의 전처리를 할 수 있다. 본 발명의 생산 방법에 의해 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 다중발현하는 형질전환 식물을 대량으로 급속 증식시켜 크리소에리올을 대량 생산할 수 있다.
본 발명은 재설계된 크리소에리올 대사경로를 포함하는 크리소에리올 생산 시스템으로써, 특히 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트 및 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물, 그리고 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 식물의 제조방법과 크리소에리올의 생산 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명은 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자를 담배와 같은 작물에서 다중발현시킴으로써 별도의 기질 제공없이 고부가 산업·의료용 소재인 크리소에리올(chrysoeriol)을 대량 생산할 수 있다.
도 1은 크리소에리올 대사경로를 나타낸 것이다.
도 2는 단일 유전자 발현 카세트(도 2A) 및 다중유전자 발현 카세트(도 2B)의 모식도와 다중유전자 발현 카세트의 유전자발현 결과(도 2C)를 나타낸 것이다.
도 3은 HPLC 분석을 통해 단일 유전자 발현 카세트 플라보노이드 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HPLC 분석을 통해 다중 유전자 발현 카세트 크리소에리올 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 단일 및 다중 유전자 발현 카세트 발현결과 플라보노이드 함량 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H 및 CrOMT2 유전자 동시 발현 합성모듈 모식도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 크리소에리올 생합성 유전자 선발 및 담배 코돈 최적화 서열 확보
크리소에리올(chrysoeriol)의 대사경로를 재설계하기 위해 기존에 나린제닌(naringenin), 아피제닌(apigenin), 루테올린(luteolin)과 크리소에리올 생성에 관여한다고 기능이 보고된 5개 유전자들을 애기장대(AtPAL), 벼(OsCHS, OsFNS, OsF3’H), 감귤(CrOMT2)에서 선발하였다(표 1).
나린제닌은 phenylalanine ammonia lyase (PAL)과 chalcone synthase (CHS) 유전자에 의해서 생합성이 가능하다고 보고되었으며(Ogo et al. 2013), 나린제닌은 flavone synthase(FNS)에 의하여 아피제닌으로 전환되며(Lam et al. 2014), 아피제닌은 Flavonoid 3'-Hydroxylase (F3'H)에 의하여 루테올린으로(Lam et al. 2015; Park et al. 2016), 그리고 루테올린은 O-methyltransferase gene (CrOMT2)에 의하여 크리소에리올로 전환된다고 보고되었다(Liu et al. 2020).
No 경로 이름 명명 Locus CDS size (bp)
1 Phenylalanine → p-Cinnamic acid PAL AtPAL At2g37040 2,178
2 p-Coumaroyl-CoA → Naringenin chalcone CHS OsCHS LOC_Os11g32650 1,197
3 Naringenin → Apigenin FNS OsFNS/OsCYP93G1 AK100972 1,551
4 Apigenin → Luteolin F3'H OsF3'H/OsCYP75B3 AK064736.1 1,581
5 Luteolin → Chrysoeriol OMT CrOMT2 CICLE_v100208141mg 1,101
선발된 유전자들이 담배 식물체에서 효율적으로 발현될 수 있도록 AtPAL을 제외한 유전자들의 코딩서열(coding sequence, CDS)을 GenSmartTM Codon Optimization tool을 이용하여 담배 코돈 최적화 서열로 전환시켰다(표 2).
No Name 염기서열
서열번호 1 AtPAL ATGGAGATTAACGGGGCACACAAGAGCAACGGAGGAGGAGTGGACGCTATGTTATGCGGCGGAGACATCAAGACAAAGAACATGGTGATCAACGCGGAGGATCCTCTCAACTGGGGAGCTGCAGCGGAGCAAATGAAAGGTAGCCATTTGGATGAAGTGAAGAGAATGGTTGCTGAGTTTAGGAAGCCAGTTGTGAATCTTGGTGGTGAGACTCTGACCATTGGACAAGTGGCTGCGATCTCAACTATTGGTAACAGTGTGAAGGTGGAGCTATCGGAGACAGCTAGAGCCGGTGTGAATGCTAGTAGTGATTGGGTTATGGAGAGTATGAACAAAGGCACTGATAGTTATGGTGTTACTACTGGTTTTGGTGCTACTTCTCATCGGAGAACCAAAAACGGTGTCGCACTTCAGAAGGAACTTATTAGATTCCTTAACGCCGGAATATTCGGAAGCACGAAAGAAACAAGCCACACATTGCCACACTCCGCCACAAGAGCCGCCATGCTTGTACGAATCAACACTCTCCTCCAAGGATTTTCCGGTATCCGATTTGAGATTCTCGAAGCAATTACCAGTTTCCTCAACAACAACATCACTCCATCTCTCCCCCTCCGTGGTACAATCACCGCCTCCGGAGATCTCGTTCCTCTCTCCTACATCGCCGGACTTCTCACCGGTCGTCCCAATTCCAAAGCTACTGGTCCCAACGGTGAAGCTTTAACAGCAGAGGAAGCTTTCAAATTAGCAGGAATCAGCTCCGGATTCTTTGATCTCCAGCCTAAGGAAGGACTCGCGCTAGTCAATGGCACGGCGGTTGGATCTGGAATGGCGTCAATGGTGTTATTCGAAACGAATGTTCTCTCTGTTTTGGCTGAGATTTTGTCGGCGGTTTTCGCAGAGGTGATGAGTGGTAAGCCTGAGTTCACCGATCATCTCACTCACAGACTTAAACATCATCCCGGTCAAATCGAAGCGGCGGCGATAATGGAGCATATCCTCGACGGAAGCTCGTACATGAAATTAGCTCAGAAGCTTCACGAGATGGATCCGTTACAGAAACCTAAACAAGATCGTTACGCTCTTCGTACTTCTCCTCAATGGTTAGGTCCTCAAATCGAAGTGATCCGTTACGCAACGAAATCGATCGAGCGTGAGATTAACTCCGTCAACGATAATCCGTTGATCGATGTTTCGAGGAACAAGGCGATTCACGGTGGTAACTTCCAAGGAACACCAATCGGAGTTTCAATGGATAACACGAGATTGGCGATAGCAGCGATTGGTAAACTCATGTTTGCTCAATTCTCAGAGCTTGTGAATGATTTCTACAACAATGGTTTACCCTCGAATCTAACCGCTTCGAGGAATCCAAGTTTGGATTATGGATTCAAGGGAGCTGAGATTGCAATGGCTTCTTATTGTTCAGAGCTTCAATACTTAGCTAATCCTGTGACTAGCCATGTTCAATCAGCAGAGCAACATAACCAAGATGTCAACTCTTTGGGACTAATCTCGTCTCGCAAAACTTCTGAAGCTGTTGATATTCTCAAGCTTATGTCAACAACGTTCCTCGTTGCGATTTGTCAAGCTGTGGATTTGAGACATTTGGAGGAGAATTTGAGACAGACTGTGAAGAACACTGTCTCTCAAGTGGCGAAGAAAGTTCTTACTACTGGAGTCAATGGTGAGCTTCATCCTTCTCGCTTCTGCGAAAAGGATTTACTCAAAGTTGTAGACCGTGAACAAGTCTACACATACGCGGATGATCCTTGTAGCGCAACGTACCCGTTGATTCAGAAGCTGAGACAAGTTATTGTTGACCATGCTTTGATCAATGGTGAGAGTGAGAAGAATGCAGTGACTTCAATCTTCCATAAGATTGGAGCTTTCGAGGAGGAGCTTAAGGCAGTGCTACCGAAAGAAGTGGAAGCAGCAAGAGCAGCCTACGATAACGGAACATCGGCTATCCCGAACAGGATCAAGGAATGTAGGTCGTATCCATTGTATAGATTCGTGAGGGAAGAGCTTGGAACAGAGCTTTTGACCGGAGAGAAAGTGACGTCGCCTGGAGAAGAGTTCGACAAGGTTTTCACGGCGATTTGTGAAGGTAAAATCATTGATCCGATGATGGAATGTCTCAACGAGTGGAACGGAGCTCCCATTCCAATATGTTAA
서열번호 2 OsCHS ATGGCTGCTGCAGTTACGGTGGAAGAAGTACGACGTGCTCAAAGAGCTGAGGGACCAGCAACGGTTTTAGCCATCGGCACAGCCACTCCTGCTAATTGTGTTTATCAAGCAGACTATCCAGATTATTACTTCAGAATAACAAAAAGCGAACACATGGTCGAACTCAAAGAAAAATTCAAAAGGATGTGTGATAAGTCTCAGATAAGAAAAAGATACATGCATTTAACAGAGGAGATTTTGCAAGAAAATCCAAATATGTGCGCTTATATGGCACCTTCCTTAGATGCAAGGCAAGATATTGTTGTAGTTGAGGTGCCGAAGTTGGGGAAGGCTGCCGCTCAGAAAGCTATAAAGGAATGGGGACAGCCTAGGTCACGCATCACCCACCTAGTGTTTTGTACTACAAGTGGTGTAGATATGCCAGGGGCTGATTACCAACTTGCAAAAATGCTCGGTCTAAGACCAAACGTGAACCGGTTGATGATGTATCAGCAGGGATGCTTTGCAGGAGGAACTGTTCTTCGCGTAGCTAAGGACTTGGCAGAGAATAATCGGGGTGCGCGAGTGCTGGCGGTTTGTTCGGAAATAACAGCAGTCACCTTTCGAGGACCTTCAGAGTCTCACCTGGACTCCATGGTTGGTCAAGCTCTTTTTGGAGATGGGGCAGCAGCTGTTATTGTGGGGTCTGATCCTGATGAGGCTGTAGAGAGGCCCTTGTTTCAAATGGTATCAGCAAGCCAGACTATCCTTCCGGACTCTGAGGGCGCAATTGATGGACATTTAAGAGAAGTTGGGCTGACATTTCATCTATTGAAAGATGTACCCGGGCTCATATCAAAGAATATTGAAAGGGCCCTTGGTGATGCTTTCACTCCACTAGGGATTAGTGACTGGAATTCAATTTTTTGGGTTGCTCATCCTGGAGGTCCAGCTATTCTTGATCAAGTTGAAGCTAAGGTCGGCCTTGACAAAGAGAGAATGAGAGCAACACGTCATGTTTTGTCTGAATATGGAAACATGAGCAGTGCCTGCGTTCTGTTCATTCTGGATGAAATGAGGAAGCGTAGTGCAGAAGATGGTCATGCTACCACTGGTGAAGGAATGGATTGGGGAGTGCTTTTCGGCTTTGGTCCAGGCTTGACCGTTGAGACTGTCGTCTTACATTCTGTGCCTATCACTGCTGGTGCCGCGGCATGA
서열번호 3 OsFNS ATGGCATCATTGATGGAGGTCCAAGTACCCCTACTCGGCATGGGTACAACAATGGGGGCTTTGGCTCTAGCATTAGTCGTAGTAGTTGTGGTGCATGTTGCCGTGAATGCATTTGGGCGGCGCAGGTTACCGCCATCGCCGGCCAGCCTCCCGGTTATTGGCCACCTACATTTACTTAGGCCTCCTGTTCACCGCACATTTCATGAACTTGCAGCACGGTTGGGACCTTTAATGCATGTAAGATTGGGCTCGACACATTGTGTGGTGGCATCCTCCGCAGAAGTTGCGGCAGAGCTCATCAGATCTCATGAGGCAAAAATATCAGAGAGGCCACTTACGGCTGTAGCAAGACAATTTGCGTATGAGTCTGCTGGTTTCGCTTTTGCTCCTTACAGTCCTCATTGGAGATTTATGAAGAGGCTATGCATGAGTGAGCTACTTGGTCCAAGGACAGTTGAACAATTGCGACCTGTCAGAAGAGCAGGTCTAGTCTCCCTTCTGCGACACGTGCTTTCACAGCCTGAAGCGGAGGCTGTTGATTTAACACGTGAGTTGATTAGAATGTCTAACACTTCAATAATAAGGATGGCTGCTAGTACTGTACCAAGTTCTGTTACTGAGGAAGCTCAAGAATTAGTGAAGGTCGTGGCCGAATTGGTTGGGGCATTCAATGCTGATGATTATATTGCACTATGTAGAGGATGGGATTTACAAGGATTGGGCCGAAGGGCTGCGGACGTTCATAAAAGATTCGACGCCTTGTTAGAAGAAATGATTCGACACAAGGAGGAGGCTCGTATGAGGAAGAAAACTGATACAGATGTAGGAAGCAAAGATCTTCTTGATATACTTTTAGACAAGGCTGAAGATGGAGCTGCGGAGGTAAAGTTGACCCGGGACAACATCAAAGCTTTCATTATAGATGTCGTCACTGCTGGATCTGACACCTCAGCCGCAATGGTGGAATGGATGGTTGCTGAACTGATGAATCATCCAGAAGCTCTTAGAAAAGTTAGAGAGGAAATTGAGGCGGTAGTTGGTCGTGACAGAATAGCTGGGGAAGGTGATCTGCCTCGTCTGCCTTATTTGCAGGCTGCCTACAAGGAAACCCTTAGGTTACGGCCAGCAGCTCCTATTGCTCACAGGCAGTCAACTGAAGAGATTCAAATTCGTGGTTTCAGAGTTCCAGCTCAGACTGCAGTTTTCATCAATGTTTGGGCTATCGGACGTGATCCTGCTTATTGGGAAGAACCATTGGAATTTCGACCCGAGAGGTTTCTGGCCGGGGGAGGTGGAGAAGGCGTTGAGCCAAGAGGGCAACATTTTCAGTTCATGCCATTTGGATCTGGAAGGAGAGGTTGCCCTGGAATGGGATTGGCACTGCAGAGTGTTCCCGCCGTCGTTGCAGCCTTACTCCAATGCTTTGATTGGCAATGTATGGATAATAAACTTATTGATATGGAAGAAGCAGATGGTTTGGTGTGTGCTAGGAAACATAGACTCTTGCTTCATGCACATCCAAGACTTCATCCATTTCCACCTCTCCTGTGA
서열번호 4 OsF3'H ATGGACGTAGTGCCATTACCCCTTCTGCTTGGATCTCTGGCCGTTTCTGCGGCTGTCTGGTATCTTGTCTATTTCCTGAGAGGAGGATCGGGTGGTGATGCTGCAAGGAAACGTCGACCTCTACCACCTGGTCCAAGGGGCTGGCCTGTATTGGGAAACTTGCCACAGTTGGGAGACAAACCTCACCATACAATGTGTGCACTTGCACGGCAATATGGACCGTTGTTCAGGCTGCGTTTTGGATGCGCTGAAGTAGTTGTCGCAGCTAGCGCACCTGTTGCTGCGCAGTTTTTACGCGGTCATGATGCTAATTTTTCAAACAGACCTCCTAATAGTGGCGCAGAGCACGTAGCTTACAATTATCAAGATCTGGTCTTTGCACCTTACGGTGCGCGGTGGAGAGCTTTAAGAAAGCTCTGTGCTCTTCACCTTTTCTCTGCCAAGGCATTGGATGACTTGCGTGCTGTGAGAGAAGGAGAGGTCGCTCTGATGGTGAGAAACTTAGCCAGGCAACAAGCCGCTAGTGTTGCACTTGGACAAGAGGCAAATGTTTGCGCCACAAATACCTTAGCAAGAGCAACGATTGGGCACAGGGTATTTGCCGTGGATGGAGGAGAAGGGGCGCGTGAATTTAAAGAGATGGTGGTTGAGCTAATGCAGTTAGCAGGAGTATTCAATGTCGGAGACTTCGTTCCGGCACTGAGATGGCTAGACCCACAAGGCGTTGTTGCAAAAATGAAGAGGTTGCATAGGAGATATGATAATATGATGAATGGTTTCATCAATGAAAGAAAAGCTGGTGCTCAGCCCGATGGAGTAGCGGCCGGCGAACATGGAAATGATTTACTCTCTGTTCTTCTCGCTCGCATGCAAGAAGAGCAGAAGTTGGACGGTGACGGGGAGAAGATCACAGAAACCGATATTAAGGCTCTACTTCTCAACCTGTTTACTGCTGGGACAGATACGACCTCATCGACTGTTGAATGGGCACTAGCGGAGTTGATTAGACATCCAGATGTTTTGAAAGAAGCTCAACATGAACTTGATACTGTTGTTGGCCGTGGGAGATTAGTGTCTGAAAGCGATCTCCCTCGTCTCCCATACCTTACAGCAGTAATAAAGGAAACATTTAGGTTACATCCGTCCACCCCGCTGTCACTCCCCCGAGAGGCAGCTGAGGAGTGTGAAGTCGATGGTTACCGCATTCCAAAAGGCGCTACTCTCCTTGTAAATGTGTGGGCAATTGCTAGGGATCCAACTCAATGGCCAGATCCTCTTCAGTATCAGCCTTCAAGATTCTTGCCAGGTAGGATGCATGCTGATGTCGACGTGAAAGGTGCAGATTTTGGGCTTATACCTTTTGGTGCTGGTCGGCGAATATGTGCTGGGCTAAGTTGGGGTTTAAGAATGGTGACACTAATGACTGCCACTCTTGTTCATGGCTTTGATTGGACTTTGGCTAACGGAGCAACACCTGATAAGCTCAACATGGAAGAAGCATATGGCTTGACTCTACAGAGGGCAGTTCCCTTGATGGTTCAACCAGTGCCACGGTTGTTACCGTCCGCTTATGGTGTTTGA
서열번호 5 CrOMT2 ATGGGAAGCACTTCCTCCGAAACTCAGATATCACCTGCTCAAGGATCAGATGAGGAAGCAAATTTGCTAGCAATGCAACTGACATCTGCTTCAGTGCTTCCTATGGTTCTCAAGTCTGCAATTGAACTCGATCTACTAGAGATTATTGCAAAAGCAGGGCCAGATGCATTCATGTCTCCAAAGGATATAGCATCTCAGTTGCCAACAAAGAACCCCGACGCTCATATTGTATTAGACCGTATCCTTCGACTTCTCGCGAGTTACAGTGTCTTAAACTGTTCATTAAGAAATCTGCCTGATGGCAAGGTTGAGAGATTGTACGGCCTCGCTCCAGTTTGTAAATTTCTTACCAAAAATGAAGATGGAGTGACGCTAAGTGATTTATGCTTGATGAACCAAGACAAAGTTCTCATGGAGAGCTGGTATTACCTGAAAGATGCTGTACTTGAGGGAGGCATACCATTTAACAAAGCTTATGGAATGAATGCATTTGATTATCATGGAAAAGACTTGAGGTTCAACAAGATATTTAATAATGGTATGAGTTCTCACTCGACAATTACCATGAAGAAAATCTTAGAAAATTACAAGGGCTTTGAGGGGTTAAACTCTGTGGTCGATGTCGGTGGAGGTATTGGTGCAACTCTTAATATGATCATATCCAAGTATCCATCAATCAAAGGAATAAATTTTGACCTTCCTCACGTGATTCAAGATGCTCCAGCCTTTCCTGGGGTAGAGCATGTAGGTGGAGATATGTTCGTGAGCGTTCCCAAAGGTGATGCCATCTTCATAAAATGGATTTGTCATGATTGGTCTGATGAACATTGTGTTAAGTTTTTGAAGAATTGCTATGAAGCTTTGCCTGTCAATGGAAAGGTGATTGTTGCTGAAAGCATTCTGCCGGTTACTCCGGACACTAGTTTGGCATCAAAGGTTGTTATTCATGTTGATTGCATCATGCTTGCTCACAATCCTGGTGGTAAAGAAAGAACAGAGCAAGAATTTAGGGCTCTTGCCAAGGCTGCTGGGTTTCAGGGTTTCCAGGTAGTGTCGTCAGCTTTCAATACATATATTATGGAATTCTTGAAAAGTGCGTGA
실시예 2. 재조합 벡터 제작 및 형질전환체 유전자발현 조사
앞서 선발한 5개 유전자들을 이용하여 대사경로를 간소화하기 위하여 담배 코돈 최적화된 염기서열들을 합성을 통해 확보하고, MoClo Tool kit(Addgene, #1000000044)에서 제공된 level 0 벡터(pICH41308)로 Type IIS 제한효소 BpiI 절단과 T4 ligase 처리에 의한 5'-, 3'-DNA 말단 서열들의 재결합을 통해서 제작하였다.
조립이 완성된 level 0 모듈(10㎕)은 DH5a 셀(100㎕)에 넣고 얼음에서 30분 반응, 42℃에서 30초, 얼음에서 2분 반응시킨 다음 LB 액체 배지를 400㎕ 첨가하여 37℃ 혼합배양기에 1시간 배양시켰다. 배양후 셀 100㎕를 스펙티노마이신(Spectinomycin, 50㎍/㎖)이 첨가된 LB 고체 배지에 도말하고 37℃ 배양기에서 1일 배양시켰다. 그리고 대장균 콜로니 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 클로닝 유무를 1차 확인하고, 플라스미드 DNA를 추출하여 제한효소 처리와 염기서열 분석을 통해 정확한 level 0 모듈을 확보하였다.
확보한 유전자들의 CDS를 포함하는 level 0 모듈은 도 2A에 표기된 각각의 프로모터와 터미네이터들을 포함하는 level 0 모듈들(MoClo Plant Parts Kit, Addgene, #1000000047와 MoClo Plant Parts II and Infrastructure Kit, Addgene, #1000000135)과의 조립(Type IIS 제한효소 BsaI 절단)을 통해 식물체에 도입되어 발현될 수 있는 level 1 카세트(모듈)를 제작(도 2A)하고 DH5a 셀에 형질전환시킨 다음 암피실린(Ampicillin, 100㎍/㎖) 고체 배지에서 형질전환체를 선발하고, 콜로니 PCR, 플라스미드 제한효소 처리와 염기서열 분석 방법으로 level 1 모듈의 정확성을 확인하였다.
제작된 5개의 level 1 모듈들을 다시 BpiI 제한효소로 절단하고, 각각 DNA 절편의 프로모터 앞과 터미네이터 뒤에 존재하는 4개의 염기서열(linker 서열) 조립을 통해 5개 유전자가 한 개의 벡터에서 동시에 발현될 수 있는 level M 카세트(모듈)을 제작하였으며(도 2B), 음성 대조군으로는 침윤 배지(infiltration media, IM : 5% D-glucose, 10mM MES, 10mM MgCl2, 200uM Acetosyringone)를 사용하였다
제작한 모듈들을 아그로박테리움 셀(GV3101)에 동결건조(freeze-thaw) 방법을 이용하여 형질전환시킨 후 아그로박테리움 셀들을 침윤배지(infiltration media, IM : 5% D-glucose, 10mM MES, 10mM MgCl2, 200uM Acetosyringone)에 OD600=0.8의 농도로 희석한 다음, 바늘이 없는 주사기를 이용하여 담뱃잎 뒷면에 형질주입 시켰다.
구체적으로, 제작한 모듈의 플라스미드 벡터(1㎍)를 아그로박테리움 셀(A. tumefaciens strain GV3101) 100㎕에 넣고 액체질소에 2분 동결시키고, 37℃에서 5분 녹인 다음, 2분 재동결 시킨다음 얼음에 30분 반응시키고 YEP 액체 배지를 900㎕ 첨가하여 28℃ 혼합배양기에 2시간 배양시킨다. 배양후 셀은 5,000rpm으로 원심분리한 다음, 상등액 900㎕를 제거하고 침전된 셀을 재현탁시켜 모듈에 적합한 항생제(level 0, M: 스펙티노마이신, Spectinomycin, 50㎍/㎖; level 1: 카르베니실린, Carbenicillin, 100㎍/㎖)가 첨가된 YEP 고체 배지에 도말하고 28℃ 배양기에서 2일 배양시켰다. 형질전환된 아그로박테리움 셀은 항생제가 첨가된 YEP 액체 배지에서 24시간 배양하고, 다시 OD값이 0.8~1.0이 되도록 키워서 침윤배지에 희석하였다. 이때, 유전자 침묵을 억제시켜 발현을 최적화시킬 수 있도록 도와주는 p19 유전자가 도입된 아그로박테리움 셀이 같은 농도로 공동 발현되도록 하였다.
각각의 합성 모듈들을 포함하고 있는 아그로박테리움 셀들을 담뱃잎 뒷면에 형질주입 시키고, 6일 후에 샘플링하여 유전자 발현 여부를 조사하였다.
그 결과, 도 2C에 보이는 바와 같이, 해당 유전자들 모두 IM만 형질주입 시킨 대조구 잎에서는 거의 발현되지 않지만 level M 모듈을 담뱃잎에 일시발현시킨 경우에는 발현이 강하게 증가되었음을 확인하였다(도 2C).
실시예 3. 유전자 발현 카세트(모듈) 별 플라보노이드 물질생산 확인
담뱃잎에 도입된 단일 유전자 발현 모듈(도 2A)에 의하여 플라보노이드가 생성될 수 있는지를 조사하기위해 단일 유전자 발현 모듈들이 일시 발현된 담뱃잎에서 플라보노이드를 추출하고 HPLC 분석을 통해 각 단계의 플라보노이드 성분들이 생성되었는지를 확인하였다.
모듈 유전자 기질 생산물 양(ng/mg DW)
level 1 OsCHS 나린제닌 2.38
AtPAL+OsCHS 나린제닌 3.05
OsFNS 나린제닌 아피제닌 3.65
OsF3'H 아피제닌 루테올린 4.91
CrOMT2 루테올린 크리소에리올 4.88
level M AtPAL+OsCHS+OsFNS+OsF3'H+CrOMT2 크리소에리올 14.39
그 결과, 표 3 및 도 5와 같이 OsCHS만 형질주입시킨 경우 2.38 ng/mg(건조중량)의 나린제닌이 생성되는 것을 확인(도 3A)할 수 있었으며, AtPAL과 OsCHS를 같이 형질주입시켰을 경우에도 3.05 ng/mg(건조중량)의 나린제닌이 생성되는 것을 확인하였다. OsFNS는 나린제닌을 기질로 이용하여 3.65 ng/mg(건조중량)의 아피제닌을 생성(도 3B)하였으며, OsF3'H는 아피제닌을 기질로 4.91 ng/mg(건조중량)의 루테올린을(도 3C), CrOMT2는 루테올린을 기질로 4.88 ng/mg(건조중량)의 크리소에리올을 생성(도 3D)함을 확인하였다.
반면 AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3‘H 및 CrOMT2를 포함하는 다중 유전자 발현 모듈을 담뱃잎에 일시 발현시킨 경우, 별도의 기질 투입 없이 크리소에리올을 14.39 ng/mg(건조중량)까지 생산할 수 있음을 확인(도 4)하였다. 이는 본 발명의 다중유전자 발현 모듈이 루테올린 투입과 CrOMT2 단일 유전자 발현에 의한 크리소에리올 생산보다 약 3배 이상 생산을 증가시키므로 본 발명이 크리소에리올 생산에 효율적임을 보여준다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Functional flavnoid production system with redesigned chrysoeriol metabolic pathway <130> KPA2022-116 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2178 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggagatta acggggcaca caagagcaac ggaggaggag tggacgctat gttatgcggc 60 ggagacatca agacaaagaa catggtgatc aacgcggagg atcctctcaa ctggggagct 120 gcagcggagc aaatgaaagg tagccatttg gatgaagtga agagaatggt tgctgagttt 180 aggaagccag ttgtgaatct tggtggtgag actctgacca ttggacaagt ggctgcgatc 240 tcaactattg gtaacagtgt gaaggtggag ctatcggaga cagctagagc cggtgtgaat 300 gctagtagtg attgggttat ggagagtatg aacaaaggca ctgatagtta tggtgttact 360 actggttttg gtgctacttc tcatcggaga accaaaaacg gtgtcgcact tcagaaggaa 420 cttattagat tccttaacgc cggaatattc ggaagcacga aagaaacaag ccacacattg 480 ccacactccg ccacaagagc cgccatgctt gtacgaatca acactctcct ccaaggattt 540 tccggtatcc gatttgagat tctcgaagca attaccagtt tcctcaacaa caacatcact 600 ccatctctcc ccctccgtgg 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Claims (17)

  1. AtPAL, OsCHS, OsFNS, OsF3'H, CrOMT2 유전자 및 프로모터를 포함하는 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 AtPAL 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 OsCHS 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 OsFNS 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것인, 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 OsF3'H 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것인, 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CrOMT2 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것인, 크리소에리올 생산을 위한 유전자 발현 카세트.
  7. 제1항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제7항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환체는 아그로박테리움인 것인 형질전환체.
  10. 제7항의 재조합 벡터 또는 제8항의 형질전환체로 형질전환된, 형질전환 식물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 식물은 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물.
  12. (a) 제7항의 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하는, 크리소에리올 생산을 위한 형질전환 식물의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 형질전환은, 상기 재조합 벡터를 도입한 아그로박테리움에 의해 이루어지는 것인, 형질전환 식물의 제조 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 식물은 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물의 제조 방법.
  15. (a) 제7항의 재조합 벡터로 식물을 형질전환하는 단계;
    (b) 상기 형질전환된 식물을 재배하여 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 수득한 식물로부터 크리소에리올을 추출하는 단계를 포함하는 크리소에리올의 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 형질전환은 상기 재조합 벡터를 도입한 아그로박테리움에 의해 이루어지는 것인, 크리소에리올의 생산 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 식물은 담배, 애기장대, 옥수수, 벼, 대두, 카놀라, 알팔파, 해바라기, 수수, 밀, 목화, 땅콩, 토마토, 감자, 상추 및 고추로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 크리소에리올의 생산 방법.

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