CN115772536B - 一种SsRMT4基因在调控植物抗旱性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种SsRMT4基因在调控植物抗旱性中的应用，SsRMT4基因发现于具有较强抗旱特性的甘蔗割手密种材料，SsRMT4基因序列如SEQIDNO.1所示；SsRMT4基因所编码的蛋白序列如SEQIDNO.2所示。本发明揭示SsRMT4基因的表达提升可降低植物抗旱性，从而证明该基因可直接影响植物抗旱性，显示SsRMT4基因可用于植物抗旱性调节的重要基因资源，对作物抗旱育种应用有重要应用潜力。

Description

一种SsRMT4基因在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种SsRMT4基因在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

全球约有35％的陆地面积为干旱和半干旱地区，且随着气候变化，降水分配不均等逐年加重，导致旱害发生更加频繁，涉及地域更加广泛，严重影响农作物生产和全球粮食安全。挖掘优异抗旱基因资源，通过基因工程手段创制耐旱新种质、新品种是有效抵御干旱危害的重要手段和途径，但目前可应用的有效基因资源仍然十分有限。

植物响应干旱的机制十分复杂，涉及众多生理途径。如生理生化变化方面，干旱胁迫条件下，植物可通过降低光合作用、减弱气孔运动、促进根系生长、减少叶面积、抑制生长发育、减缓细胞失水、提高渗透调节和增强细胞解毒作用等来抵御干旱胁迫。其中，干旱对光合效率方面的影响较为显著。干旱胁迫可导致气孔关闭，气孔导度下降，降低CO₂的同化，并影响光合作用相关酶类活性，从而影响光合作用效率。Rubisco是光合途径关键酶，参与叶绿体中CO₂的固定，因此对光合作用速率调节起重要作用。Rubisco可被Rubisco甲基转移酶(Rubisco large subunit methyltransferase，RMT)在特定的赖氨酸残基上发生三甲基化从而导致光合速率改变，借以影响植物干旱响应。我们通过克隆具有较强抗旱特性的甘蔗割手密材料中的RMT同源编码基因，并经功能验证，筛选出其中一个可影响植物抗旱性的基因SsRMT4。SsRMT4基因在影响植物抗旱性方面的研究还没有报道。分析发现，该基因的提升该基因的表达可使植株对干旱变得更加敏感，从而证明该基因参与植物抗旱性调节，印证其可用于植物抗旱育种应用的重要基因资源，具有重要应用前景。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种SsRMT4基因在调控植物抗旱性中的应用，该SsRMT4基因可用于植物抗旱性调节的重要基因资源，对作物抗旱育种应用有重要应用潜力。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种SsRMT4基因在调控植物抗旱性中的应用。

优选地，所述SsRMT4基因为割手密SES208的SsRMT4基因。

优选地，所述SsRMT4基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述SsRMT4基因所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

通过采用上述技术方案：使SsRMT4基因在植物中高表达的方法是将含有所述SsRMT4基因的重组表达载体导入所述植物中。

其中，所述重组表达载体具体是将SsRMT4基因的cDNA序列插入pSUPER-eGFP的克隆位点得到的。

其中，上述植物为割手密，转基因材料为拟南芥。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明采用SsRMT4基因参与植物干旱响应中发挥重要作用的光合作用途径，是证明其影响植物抗旱性方面的首次报道。

2、本发明通过分析具有较强抗旱特性的甘蔗野生种割手密挖掘SsRMT4基因，传统分析通常采用生产应用品种，其抗旱基因由于长期栽培驯化往往减弱或丢失，因此本基因更具有抗旱应用潜力。

3、本发明的SsRMT4基因除响应干旱胁迫，还响应盐胁迫和温度胁迫，可作为植物耐旱、盐与温度胁迫能力的指标基因，为筛选耐旱、耐盐与温度胁迫资源提供了一个新位点，提高资源筛选效率。

附图说明

图1为本发明中干旱胁迫下SsRMT4基因的表达情况图；表达量以eEF作为内参基因，基因在未处理植株中的表达量作为对照，三个生物学重复。数值表示3次重复的平均值±标准误差(n＝3)，*的个数代表在LSD统计方法下P<0.05水平差异显著情况。

图2为本发明中不同干旱胁迫程度下SsRMT4基因的表达情况图；Mild Drought为轻度干旱，Severe Drought为重度干旱。

图3为本发明中不同干旱胁迫因素及盐与温度胁迫下SsRMT4基因的表达情况图；(A)100mM Mannitol；(B)100μmABA；(C)30％PEG 6000；(D)200mM NaCl；(E)100mM MeJA；(F)4℃和(G)38℃胁迫。

图4为本发明中SsRMT4基因的克隆结果图；M为2000bp Maker，SsRMT4为PCR扩增的该基因的编码序列产物，长度为1479bp。

图5为本发明中转基因拟南芥的筛选图；(A)SsRMT4转基因拟南芥鉴定的PCR检测，pSUPER:SsRMT4-eGFP为转基因拟南芥株系，Col-0为拟南芥哥伦比亚型，pSUPER-eGFP为空载体转基因植株，M为2000bp Maker。(B)SsRMT4转基因拟南芥的qRT-PCR检测，以UBC基因作为内参基因，以SsRMT4在Col-0中的表达量作为对照。(C)SsRMT4转基因拟南芥的蛋白表达检测。以Anti-GFP为标签，检测拟南芥哥伦比亚型、pSUPER-eGFP、pSUPER:SsRMT4-eGFP蛋白在转基因拟南芥中的表达情况，H3组蛋白为内参蛋白。

图6为本发明中转基因拟南芥的抗旱功能验证图；(A)转基因植株经历自然干旱胁迫处理的生长状况。植株从左往右依次代表pSUPER-eGFP转基因植株，SsRMT4过表达株系19和株系22。第一行为自然干旱19天的状态，第二行为自然干旱21天的状态，第三行为复水2天后的状态。(B)pSUPER-eGFP转基因植株，SsRMT4转基因拟南芥株系19和株系22复水后的存活率。数据代表均值±SE(n＝6)。(C)pSUPER-eGFP转基因植株，SsRMT4转基因拟南芥株系19和株系22离体叶片失水速率的检测。

具体实施方式

下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、干旱胁迫下SsRMT4基因的表达情况

一、qRT-PCR引物的设计和合成

根据基因的CDS序列设计实时定量荧光PCR引物，引物序列为：

正向引物：

5'-TGTCAGGATGAAGAACTGTCG-3'

正向引物：

5'-TTTTCACCGGCCCTTACTCC-3'

二、qRT-PCR检测SsRMT4基因的表达情况

对长势一致的三叶期割手密幼苗进行重度干旱胁迫处理，用qRT-PCR检测基因的表达量。如图1所示，发现在干旱胁迫处理后SsRMT4的表达量降低，相较于对照极为显著，对照组的表达量约是SsRMT4表达量的8.06倍。上述结果表明，SsRMT4基因对干旱胁迫最为敏感，在割手密响应干旱胁迫过程中扮演重要作用。

实施例2、不同干旱程度及其它胁迫的SsRMT4基因的表达分析

为了能够贴近生产实际，分别采用不同干旱程度处理检验该SsRMT4基因的表达情况，以证实该基因对干旱响应的真实性和可靠性。以长势一致的三叶期割手密幼苗为材料，对其进行轻度和重度干旱处理，以未处理的幼苗为对照，检测SsRMT4的表达量。结果如图2所示，割手密受不同程度的干旱胁迫后，SsRMT4基因均下调表达，其中重度干旱胁迫时基因下调极为显著，说明SsRMT4基因能够响应干旱胁迫，尤其是对于严重干旱响应更为显著。

为了了解该基因对干旱相关因素及盐分和温度胁迫响应情况，分别采用100mMMannitol、100μmABA、30％PEG 6000、200mM NaCl、100mM MeJA、4℃低温和38℃高温等胁迫处理割手密植株，开展SsRMT4的表达分析。结果如图3所示，SsRMT4对Mannitol、ABA、PEG6000、NaCl和4℃胁迫的响应较为明显。在割手密幼苗经过ABA和PEG 6000胁迫后，SsRMT4的响应模式为先下降后上升，在胁迫3h时表达量最低。而经NaCl和4℃胁迫处理后，SsRMT4的表达模式为表达量随着胁迫时间的延长而降低，且差异显著，其中冷胁迫处理12h时，差异极为显著，说明SsRMT4能够响应干旱胁迫外，还迅速响应盐和低温胁迫。

实施例3、SsRMT4基因的克隆

一、引物的设计和合成

根据SsRMT4基因的CDS序列，利用无缝克隆的方法设计引物，引物序列为：

正向引物：

5'-AAATCGACTCTAGAAAGCTTATGGCCACGCTCCACCACCACC-3'

反向引物：

5'-TGCTCACCATGGTACCGGACTCCCAAAAAATAATTTCA-3'

二、提取割手密SES208的总RNA，通过反转录得到cDNA，以cDNA为模板，以上述所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(图4)，cDNA序列如SEQ ID No.1所示，SsRMT4蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

三、利用诺唯赞的连接酶EZ-Flex SeamLess Assembly and Cloning Kit将SEQID No.1所示的DNA分子与中间载体pSUPER-eGFP进行重组反应，得到重组质粒，将其命名为pSUPER：SsRMT4-eGFP，将其转入大肠杆菌感受态中，获得重组阳性克隆并测序，结果正确。

实施例4、SsRMT4基因过表达植株的鉴定

将实施例3得到的pSUPER：SsRMT4-eGFP转化入GV3101农杆菌中，采用农杆菌侵染的方法将pSUPER：SsRMT4-eGFP质粒转入Col-0，将转染后的植株在含30mg/L潮霉素的1/2MS培养基上筛选。提取在含有30mg/L Hyg的培养基上正常生长的T1代植株的DNA，进行PCR检测，PCR结果表明：24个转基因拟南芥株系中有22个株系含有一条大小一致的目的条带，而野生型和空载体转基因株系中没有此条带(如图5A所示)，共获得22株阳性苗，命名为SsRMT4-#1-#22。

对拟南芥Col-0生态型、空载体和目的基因转基因株系中的SsRMT4基因的表达量进行了qRT-PCR检测，如图5B所示，其中SsRMT4转基因拟南芥株系9、19和22中SsRMT4的表达量明显高于野生型和空载转基因株系，又因为SsRMT4蛋白在株系19和22中可以稳定表达，因此选择株系19和22进行后续功能验证(图5C)。

实施例5、SsRMT4过表达植株的抗旱表型分析

SsRMT4转基因株系19，22和空载体转基因株系pSUPER-eGFP在1/2MS固体培养基上培养。待种子在培养皿上生长7DAG(days after germination)时，将拟南芥幼苗小心地转移至相同质量的营养土中。待幼苗在土中生长5DAG后再次使其吸饱水，接着经历自然干旱的过程，比较植株的抗旱性。结果如图6A所示，在干旱处理19天时，对照组、株系19和22植株出现不同程度的萎蔫，其中株系22叶片卷曲最严重，株系19次之，空载状态最优。干旱至21天时，对其进行复水，两天后观察植株表型并统计存活率。株系19和株系22受干旱胁迫损伤较为严重，复水后恢复能力较弱(图6A)，对照组pSUPER-eGFP复水后的存活率达到90％，而株系19和株系22复水后的存活率只有20-40％(图6B)，说明SsRMT4的过表达体对干旱胁迫更加敏感。

实施例7、SsRMT4基因过表达对转基因株系离体叶片失水的影响

SsRMT4转基因拟南芥株系19、22和空载体转基因株系在土中生长4周后，分别选取生长状况良好且一致的拟南芥植株，剪去植株整个地上部分，用纸轻轻去除叶片上的水和土，将其倒扣在滤纸上，每张滤纸上4棵植株，每个样品5组重复。置于室温中进行自然失水处理，每小时记录一次重量，连续记录10小时。根据实时记录的数据计算叶片的失水速率。失水速率＝(初始重量—测定重量)/初始重量*100％。失水速率结果如图6C所示，株系19和株系22叶片失水速率较对照组更快，说明SsRMT4转基因拟南芥对水分胁迫耐受性更弱，SsRMT4负调控植物对干旱胁迫的响应。

综上所述，本发明通过分析具有较强抗旱特性的甘蔗野生种割手密，鉴定出可响应干旱胁迫的SsRMT4基因。克隆并将过表达SsRMT4基因转化拟南芥发现，提升该基因的表达可使植株对干旱变得更加敏感，从而证明该基因参与植物抗旱性调节，印证其可用于植物抗旱育种应用的重要基因资源，具有重要应用前景。

本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种SsRMT4基因在调控植物抗旱性中的应用，其特征在于：在植物中过表达SsRMT4基因，植物对干旱胁迫更加敏感，所述植物为拟南芥，所述SsRMT4基因所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SsRMT4基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。