CN104004848B - 一种早期旱胁迫诱导高羊茅dreb2基因的筛选试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种早期旱胁迫高羊茅DREB2基因的筛选试剂盒及方法。本发明以PEG6000旱胁迫处理(0h、6h、12h、18h和24h)的高羊茅为实验材料，利用Illumina/Solexa测序平台的RNA-seq技术进行混合转录组测序分析，以已登记的DREB2基因序列为探针进行本地Blast(Local Blast)，筛选早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2基因。本发明方法可以快速、全面的筛选旱胁迫诱导的高羊茅DREB2候选基因，对抗旱机制研究和植株抗性分子育种具有重要指导意义。

Description

一种早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2基因的筛选试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2候选基因的筛选试剂盒及方法。

背景技术

DREB2s(Dehydration Responsive Element Binding Protein2)是一类植物特有的转录因子，隶属于AP2/EREBP转录因子家族，在植物逆境信号转导途径中有重要作用。Liu等和Kasuga等首次从拟南芥[Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.]中克隆得到了DREB2A转录因子，发现其与干旱应答元件CRT/DRE(C-Repeat/Dehydration-Responsive Element，核心序列：A/GCCGAC)或GCC-BOX(核心序列：TAGCCGCCA)特异性结合，参与调控干旱、高盐和低温等耐性相关基因的表达，在植物的非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。在GenBank数据库注册的编码DREB2s序列涉及20多个物种，这其中包括模式植物、重要的大田作物和旱盐胁迫生境条件下生长的植物，目前人们更热衷于在逆境适应性强的植物材料中挖掘新的DREB2基因，DREB2s基因功能及调控机制的研究则主要以模式植物拟南芥为研究对象。DREB2s促使下游含DRE元件的胁迫诱导基因发挥作用，使植物的抗逆性得到综合改良。Qin等将玉米ZmDREB2A转化到拟南芥，发现其过量表达能够激活下游HSPs和HsfA3等热激相关基因的表达，转ZmDREB2A植物的耐旱和耐热性提高。PgDREB2A可以增加转基因烟草的耐盐和抗旱性，并且在渗透胁迫和热胁迫条件可以上调下游基因，转PgDREB2A烟草耐盐性、抗热性显著提高，而T0代种子产量和植株表型与野生型无异。但是，植物中过量表达有些来源的DREB2s，在提高植株抗逆性的同时，会对植物产生一定的毒害作用，导致转基因植物生长迟缓，影响植物的生长发育，表现为生长的延迟及植株的矮化。Sakuma等对转基因植株生长迟缓原因研究时发现，使用诱导型启动子RD29A可以避免AtDREB2A过量表达引起的生长迟缓。35S:AtDREB2ACA转基因植株生长矮化，而且矮化程度与AtDREB2A CA和其下游功能基因RD29A的表达水平成正比，而转全长基因的35S:AtDREB2A FL转基因植株的生长矮化现象不明显。

高羊茅(Festuca arundinacea＝Lolium arundinaceum)是禾本科羊茅属多年生草本植物，是我国目前使用量增长最快的草种，在我国大部分地区可以栽培，是南方地区绿期最长的冷季型草坪。高羊茅的夏季生长需水量较大，夏季干旱和高温环境条件是限制其生长的主要因素。提高环境的适应性，培育节水、耐旱抗高温型品种是目前高羊茅育种的主要目标之一。植物抗逆性状非常复杂，往往与数量性状位点连锁，而高羊茅的遗传背景复杂(PPG1G2G3G4，2n＝6x＝42)，基因组较大(5.27～5.83×10⁶kb)，且为种子繁殖为主的异花授粉植物，采用传统的选择育种获得的品种(品系)多为异质杂合群体，选育周期长，性状不稳定，获得优良抗性品种十分困难。随着植物分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，利用基因工程技术改良高羊茅性状成为可能。DREB2s转录因子可调控下游大量逆境胁迫基因的表达，利用该转录因子有望综合改良植物的抗逆性。因此，对具有产业化潜力的DREB2转录因子进行基因功能和抗逆调控机制研究，利用它们改造高羊茅，将有助于高羊茅等草坪植物的抗逆基因工程育种。

与转录组学研究的方法(基因芯片技术、SAGE技术和MPSS技术、EST技术、高密度全基因组芯片)相比，RNA-Seq技术是全新的转录组研究方法，可对任意物种的整体转录活动进行检测，用序列片段的数量表示基因的转录水平，能够检测可变剪接和新基因，对转录体结构的分析有了明显的提高，而且不同批次样品间基因表达的数据易于进行比较。这些独特的优势，使得RNA-Seq技术成为目前深入研究生物体转录组复杂性的强大工具。

利用RNA-seq技术系统分析高羊茅DREB2转录因子，为揭示高羊茅DREB2候选基因、剖析DREB2参与的植物抗逆调控分子网络提供了新的思路，将加快FapDREB2在高羊茅和其他植物的抗逆基因工程育种的步伐。

数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling，DGE)是利用高通量测序，系统、快速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况的技术。DGE已被广泛应用于基础科学研究领域。已有研究报道利用DGE对黄肉猕猴桃果实着色过程中相关差异基因、脂多糖活化巨噬细胞的基因表达、茎瘤芥根和茎组织转录组比较和小尾寒羊高繁性状相关基因的筛选和解析研究。

本地Blast(Local Basic Local Alignment Search Tool)是在本地化的蛋白质或DNA数据库中进行相似性序列比较的工具，已经被用于某一物种特定组织中某一个或家族的基因筛选。已有研究报道利用拟南芥WRKY转录因子家族基因序列为探针，对苹果全基因组序列执行本地Blast搜索，结合生物信息学方法来筛选苹果WRKY转录因子家族基因；以拟南芥和水稻ANK家族基因序列执行本地Blast搜索‘金冠’苹果全基因组序列，结合结构域搜索工具CD(conserved donmain)、perl程序等生物信息学方法，解析苹果锚蛋白基因ANK家族基因。

发明内容

本发明旨在针对目前高羊茅抗旱分子机制相关信息的匮乏，提供一种早期旱胁迫高羊茅DREB2基因的筛选试剂盒及方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2候选基因的筛选试剂盒，所述试剂盒包括表1所述的探针(共38条)：

表1

上述探针能用于制备早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2候选基因的筛选试剂。

本发明还提供了一种早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2候选基因的筛选方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将50d龄的高羊茅植株根系分别浸泡在质量百分比浓度为20％的PEG6000中0h，6h，12h，18h和24h；其中，0h为对照组，6h、12h、18h和24h为处理组；

(2)用Trizol法分别提取经步骤(1)旱胁迫处理后的高羊茅叶片的RNA，各处理和对照组的混合RNA作为总转录组测序的样本来源；采用高通量测序技术平台IlluminahiSeq^TM2000进行转录组深度测序，得到若干读段原始数据，将所得的读段原始数据进行过滤，过滤原则为：①去除包含接头的读段过滤时使用的接头序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；②去除含有未知碱基比例10％以上的读段；③去除低质量且碱基大于50％的读段，所示低质量是指质量值小于5的读段；④去除平均质量值小于15的读段，得到可用读段，然后对可用读段进行de novo拼接后组装得到高羊茅混合转录组库，高羊茅混合转录组库中独立基因的平均长度为691bp，N50长度为1279bp；

(3)采用表1所述的探针对高羊茅混合转录组库进行Local Blast分析，设置LocalBlast分析的输出结果e-value阈值为1e-5，筛选出优势表达的DREB2基因；

(4)将步骤(1)所述的4个处理组分别与对照组进行数字基因表达谱分析；独立基因表达量统计分析使用RPKM法，计算得到体现基因表达量的差异基因数据库，其计算公式为：

$\mathrm{RPKM}=\frac{{10}^{6}C}{\mathrm{NL}/{10}^3}$

设RPKM为独立基因的表达量，C为唯一比对到独立基因的读段数，N为唯一比对到所有独立基因的总读段数，L为独立基因的碱基数；RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异；

(5)以步骤(4)获得的各处理的差异基因数据库分析步骤(3)获得的DREB2独立基因，筛选特异表达的DREB2基因。

本申请综合运用RNA-Seq技术、DGE技术和Local Blast技术筛选早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2基因。在运用这些技术时，设计20％PEG6000胁迫0h，6h，12h，18h和24h的高羊茅叶片为转录组测序的RNA来源，目的是获得早期(24h内)旱胁迫下的高羊茅转录组，而在Local Blast技术使用时，利用以DREB2序列为探针，筛选早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2基因，并根据DGE进一步筛选在不同旱胁迫时间特异表达的DREB2基因，分析这些基因的上调和下调表达水平，以实现全面、快速的进行早期旱胁迫诱导的高羊茅DREB2基因的筛选。

本发明通过PEG6000旱胁迫处理(6h、12h、18h和24h)高羊茅，未处理(0h)植株为对照。首次采用Illumina/Solexa测序平台的RNA-seq技术获得早期旱胁迫高羊茅的混合转录组，并统计分析不同旱胁迫时间的差异基因(different expression genes，DEGs)及其表达水平，最后Local Blast来筛选高羊茅DREB2候选基因。Local Blast分析发现，相似度(Identity)设置为≥70％时，获得可靠的9个高羊茅DREB2，其中3个独立基因(unigene_89992、unigene_86070和unigene_147894)是高羊茅早期旱胁迫诱导表达的特异基因，为早期旱胁迫高羊茅中优势表达的DREB2候选基因。筛选的DREB2基因可以用于研究高羊茅的抗旱机制和分子抗性育种的研究与开发。

附图说明

图1表示不同旱胁迫处理时间点高羊茅DREB2的上调和下调表达基因数；

图2表示不同旱胁迫处理时间点高羊茅DREB2基因分布的韦恩图。

具体实施方式

1、高羊茅旱胁迫样品处理

根据PEG胁迫的幼苗叶绿素荧光动力学参数和相对电导率等抗性指标的前期实验结果，确定分别以质量百分比浓度为20％的PEG6000胁迫0h，6h，12h，18h和24h的高羊茅叶片为转录组测序RNA来源。

2、高通量转录组测序分析

按照常规Trizol法提取上述旱胁迫处理后的高羊茅叶片RNA，各处理和对照组的混合RNA作为总转录组测序的样本来源，利用常规高通量测序技术平台IlluminahiSeq^TM2000进行转录组深度测序，用Trinity软件进行de novo拼接，对测序得到的短读段(reads)拼接成一个转录组，以此作为后续分析的参考序列。然后对组装得到的转录本聚类得到unigene序列。原始数据质量控制使用的软件是FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)，fastqc软件在linux下采用命令行的使用方法为：fastqc-o sample-FastQC sample_1.fq.gz sample_2.fq.gz。数据过滤原则为：1)去除包含接头(adaptor)的读段过滤时使用的接头序列5’接头序列为：GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(SEQ ID NO.1)，3’接头序列为：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO.2)；2)去除未知碱基(N)比例10％以上的读段，一条读段中未知碱基的比例超过10％，表示质量较差的读段；3)去除低质量(质量值小于5)的碱基大于50％的读段；4)去除平均质量值小于15的读段根据统计结果，数量统计数据(clean data)比例良好，原始数据过滤得到过滤后测序序列(可用读段，clean reads)57023248条，组装得到158385个独立基因的高羊茅混合转录组库unigene(unigene是UniversalGene的英文缩写，意为广泛通用的基因数据库，通过电脑对相同基因座(Locus)的收集整理集合形成一个非冗余的基因数据库。)，平均长度为691bp，N50长度为1279bp。

3、DREB2序列探针的选取

以DREB2为关键词在NCBI蛋白库

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/？term＝DREB2+Transcription+factor)中搜索序列，选取探针序列如文件前述的表1。

4、利用DREB2序列探针local BLAST筛选高羊茅DREB2基因

利用获得的DREB2探针序列对高羊茅混合转录组库(步骤2构建的)进行Local Blast(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/LATEST-BLAST/)分析，设置输出结果e-value阈值为1e-5用来过滤比对较差的结果，筛选优势表达的DREB2基因。E-Value及identity两个数值作为序列和序列之间相似的评估条件。有价值的高羊茅DREB2候选基因与NCBI的non redundant(Nr)蛋白数据库进行Blast比对。

5、数字基因表达谱分析

4个高羊茅PEG胁迫处理(6h，12h，18h和24h)的样本分别与0h对照进行数字基因表达谱分析(Digital Gene Expression Tag Profiling，DGE)。Unigene表达量统计分析使用RPKM法(Reads Per kb per Million reads)计算得到体现基因表达量的差异基因数据库，其计算公式为：

$\mathrm{RPKM}=\frac{{10}^{6}C}{\mathrm{NL}/{10}^3}$

设RPKM为独立基因(Unigene)的表达量，C为唯一比对到独立基因的读段(reads)数，N为唯一比对到所有独立基因的总读段数，L为独立基因的碱基数。RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。对差异检验的p值(p value)作多重假设检验校正，通过控制FDR(False Discovery Rate)来决定p value的域值。差异表达基因定义为错误发现率(FDR)≤0.001且倍数差异在2倍以上的基因。

6、根据DGE进一步筛选在不同旱胁迫时间的DREB2基因

根据DGE结果(步骤5)分析Blast数据结果(步骤4)，具体操作是将Local Blast筛选到的高羊茅DREB2基因分别在DGE数据库中搜索，判定每个基因是否在DGE中存在，来进一步筛选早期旱胁迫诱导特异表达的高羊茅DREB2基因。如果存在于DGE中，则根据DGE进一步确定在不同旱胁迫时间(0h，6h，12h，18h和24h)的DREB2基因的表达水平。结合步骤5的数字基因表达谱分析和基因本体(gene ontology，GO)功能显著性富集分析、京都基因和基因组百科全书(KEGG，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路显著性富集，分析高羊茅DREB2基因的上调和下调表达。

筛选结果如下：

1、旱胁迫诱导下高羊茅DREB2转录本的筛选和表达

对高羊茅混合转录组库进行Local BLAST分析发现，获得53个DREB2基因，选取差异表达2倍以上的基因，与数据库比较分析发现，发现41个DREB2基因与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、高羊茅(Festuca arundinacea)、高粱(Sorghum bicolor)、小麦(Triticum aestivum)、羊草(Leymus chinensis)的DREB2序列同源性较高(表1)。

PEG6000处理6h、12h、18h和24h与0h转录组数据库(0h vs.6h、0h vs.12h、0h vs.18h和0h vs.24h)的差异表达基因结构进行比较分析发现，0h(对照)库中有34个unigene，4个差异基因库中有12个上调基因，7个下调基因。图1代表4个旱胁迫处理时间点高羊茅DREB2基因数量的分布，分别在6h DEGs(0h vs.6h)、12h DEGs(0h vs.12h)、18h DEGs(0h vs.18h)和24h DEGs(0h vs.24h)鉴定出13，13，8和10个DREB2基因，其中上调DREB2基因在上述4个阶段分别为7，6，5和8个，而下调DREB2基因在上述4个阶段分别为6，7，3和2个(图1)。在4个旱胁迫处理时间点高羊茅DREB2基因中，共有上调DREB2基因3个(unigene_71634，unigene_73901，unigene_89992)，6h DEGs特有上调基因仅1个(unigene_82344)，24h DEGs特有上调基因3个(unigene_112998，unigene_86070和unigene_3946)，12h DEGs和18h DEGs中没有特有上调表达基因。共有的下调基因是unigene_24859；unigene_62650和unigene_147894在6h，12h和18h库中特异表达；unigene_75725，unigene_144233和unigene_139722在6h和12h库中特异表达；unigene_97652在12h和24h库中特异表达(图2)。

2.高羊茅旱胁迫诱导的DREB2候选基因的筛选

对高羊茅混合转录组库进行Local BLAST分析发现，相似度(Identity)≥70％时，发现高羊茅的9个unigene分别匹配到高羊茅、拟南芥、羊草和小麦的32个已知的DREB2(见表2)。其中3个高羊茅unigene是旱胁迫诱导特异表达基因：unigene_89992(gi|357124945|ref|XP_003564157.1|PREDICTED:ethylene-responsive transcription factor1-like[Brachypodium distachyon])是各旱胁迫不同DEGs共有的上调基因，其表达倍数分别为18，12，8和7倍；unigene_86070(gi|242049458|ref|XP_002462473.1|hypothetical proteinSORBIDRAFT_02g026260[Sorghum bicolor])是24h DEGs中特异表达的上调基因(2倍)，而unigene_147894(gi|357130953|ref|XP_003567108.1|PREDICTED:GATA transcriptionfactor9-like[Brachypodium distachyon])是下调基因，在6，12和18h DEGs中表达，表达倍数分别为4，3和4倍，结果表明3个unigene(unigene_89992、unigene_86070和unigene_147894)为早期旱胁迫高羊茅中优势表达的DREB2候选基因。

表2 Local Blast高羊茅混合干旱胁迫转录组筛选的部分DREB2基因(Identity≥70％)

Claims (3)

1.一种早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2候选基因的筛选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括具有如下登录号的探针：

AT1G06770

AT1G21910

AT1G75490

AT2G30580

AT2G38340

AT2G40340

AT2G40350

AT3G11020

AT3G23060

AT3G57600

AT5G03720

AT5G05410

AT5G18450

GI:38099059

GI:66710525

GI:71534115

GI:71534117

GI:169786768

GI:169786766

GI:169786764

GI:169786762

GI:169786760

GI:169786758

GI:169786756

GI:169786754

GI:169786752

GI:169786750

GI:169786748

GI:169786746

GI:169786744

GI:331123577

GI:331123576

GI:331123574

GI:331123571

GI:374721234

GI:374721232

GI:374721228

GI:374721226。

2.如权利要求1所述探针在制备早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2候选基因的筛选试剂中的应用。

3.一种早期旱胁迫诱导高羊茅DREB2候选基因的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将50d龄的高羊茅植株根系分别浸泡在质量百分比浓度为20％的PEG 6000中0h，6h，12h，18h和24h；其中，0h为对照组，6h、12h、18h和24h为处理组；

(2)用Trizol法分别提取经步骤(1)模拟旱胁迫处理后的高羊茅叶片的RNA，各处理和对照组的混合RNA作为总转录组测序的样本来源；采用高通量测序技术平台IlluminahiSeq^TM 2000进行转录组深度测序，得到若干读段原始数据，将所得的读段原始数据进行过滤，过滤原则为：①去除包含接头的读段过滤时使用的接头序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；②去除含有未知碱基比例10％以上的读段；③去除低质量且碱基大于50％的读段，所示低质量是指质量值小于5的读段；④去除平均质量值小于15的读段，得到可用读段，然后对可用读段进行de novo拼接后组装得到高羊茅混合转录组库，高羊茅混合转录组库中独立基因的平均长度为691bp，N50长度为1279bp；

(3)采用权利要求1所述的探针对高羊茅混合转录组库进行Local Blast分析，设置Local Blast分析的输出结果e-value阈值为1e-5，筛选DREB2独立基因；

(4)将步骤(1)所述的4个处理组分别与对照组进行数字基因表达谱分析；独立基因表达量统计分析使用RPKM法，计算得到体现基因表达量的差异基因数据库，其计算公式为：

$\mathrm{RPKM}=\frac{{10}^{6}C}{\mathrm{NL}/{10}^3}$

设RPKM为独立基因的表达量，C为唯一比对到独立基因的读段数，N为唯一比对到所有独立基因的总读段数，L为独立基因的碱基数；RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异；

(5)以步骤(4)获得的各处理的差异基因数据库分析步骤(3)获得的DREB2独立基因，筛选特异表达的DREB2基因。