CN102787123B - 湖北海棠MhSGT1a基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了湖北海棠MhSGT1a基因及其应用。‘湖北海棠’MhSGT1a基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1。所述的MhSGT1a基因在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中的应用。本发明首次从‘湖北海棠’克隆得到了一个新的MhSGT1a基因，该基因与大麦、烟草、水稻、马铃薯、小麦、中间偃麦草、拟南芥的同源性分别为66.34%、71%、63.59%、69.38%、61.36%、62.93%、62.98%。MhSGT1a转基因烟草具有较强的抵御低温胁迫的能力，植株可在4℃低温条件下正常生长长达24h，同时也证明了MhSGT1a基因具有提高植物抗寒能力的功能。

Description

湖北海棠MhSGT1a基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及湖北海棠MhSGT1a基因及其应用。

背景技术

植物在生长过程中会遭遇多种逆境条件的胁迫，通过对植物抗逆反应的研究发现SGT1基因是植物抗病抗逆信号传递过程的重要调控基因。SGT1(suppressor of G2 allele of Skp1)起先发现于酵母细胞，后来又发现存在于动物和一些微生物中，不久前才发现植物中也存在与酵母同源的SGT1基因。酵母中SGT1是细胞周期抑制子Skp1的等位基因，它和Skp1一样，其蛋白能作用于细胞周期中Gl/S和G2/S间期(Kitagawa et al.,1999)。Azevedo等(2002)发现在拟南芥中存在两种不同形式的SGT1：SGT1a和SGT1b，但只有SGT1b在传导防卫信号过程中有重要作用(Azevedo et al.,2002；Austin et al.,2002；Tor et al.,2002)。并且与酵母中的作用不同，拟南芥SGT1b突变体并不表现有丝分裂的不规则性，SGT1b突变体也可以成活，这可能是因为SGT1a能够补偿SGT1b的功能，在非允许生长温度下，拟南芥AtSGT1a与AtSGT1b能够弥补酵母温度敏感SGT1b突变体的功能。然而对果树中的SGT1a和SGT1b却少有报道，而苹果中的SGT1a尚未见报道，对它们的相互关系也有待进一步研究。

果树生命周期长，生长发育过程中常受到多种环境胁迫影响，面对不断恶化的生态环境，为从根本上解决低温、干旱和盐碱等非生物胁迫对果树生长发育的不良影响，培育抗逆性强的果树品种是中国果树育种研究的一个重要方向。但由于果树童期长、自交不亲和、杂合程度高等原因，通过常规杂交育种对其改良相当困难，而采用遗传转化的手段则可克服上述缺点，打破生殖隔离，在向现有品种引进期望性状的同时，不会出现基因的大量重组，也避开了童期的干扰。如转SOD基因的葡萄和转CBF1基因的草莓在田间试验中均表现出比未转化植株具有更强的抗冷能力(Christopher OL et al.,2002)，通过促进甜菜碱或山梨醇的积累也获得了抗盐的转基因柿和草莓植株(Gao M et al.,2000，2001；刘凤华等，1997)，Cervera等(2000)将酵母HAL2基因导入柑橘也获得了抗盐植株。

柑橘在冷胁迫条件下会产生大量乙烯，导致叶片脱落，严重影响了植株的生长和发育。香港大学的Wong等(2001)从冷诱导的柑橘中分离出ACC合成酶基因(CS-ACS1)并将其反义导入甜橙和枳，转化植株经冷激后产生大量反义RNA，与此同时ACC含量升高受到抑制，乙烯生成减少，消除了冷诱导乙烯对果实留树和贮藏的不利影响。

总体来看，中国果树转基因研究已经进入国际先进行列，在抗病、抗虫、抗逆性等转基因研究领域已经取得了重要进展，但是对于中国未来转基因果树研究影响最大的是中国克隆的具有自主知识产权的功能基因较少，往往是一个基因在十几个物种中开展遗传转化；此外遗传转化效率较低，也在一定程度上制约了中国转基因果树研究取得更大进展。因此，当前的研究重点应放在利用中国丰富的果树种质资源克隆果树自身重要功能基因，提高基因转化效率以及开发转基因新技术上。‘湖北海棠’[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.]是中国特有的种质资源，由于其抗逆性较强，被广泛用作苹果砧木。从湖北海棠上克隆相关抗逆基因导入苹果，因两者具有较高同源性故可提高其转化效率，开发具有中国自主知识产权的果树抗逆基因。

发明内容

本发明的目的是提供一个新的‘湖北海棠’MhSGT1a基因。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

‘湖北海棠’MhSGT1a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

含有所述的MhSGT1a基因的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将所述的MhSGT1a基因插入到表达载体pCAMBIA-S1300+的SpeI和KpnI切酶切位点之间所得。

含有所述的MhSGT1a基因的宿主。

所述的宿主优选农杆菌。

所述的MhSGT1a基因在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中的应用。

所述的含有MhSGT1a基因的重组表达载体在创制耐低温新种质和/或植物品种改良中的应用。

有益效果：

本发明首次从‘湖北海棠’克隆得到了一个新的MhSGT1a基因，通过DNAMAN软件将‘湖北海棠’MhSGT1a氨基酸序列与NCBI上登录的其它物种进行序列比对，MhSGT1a与大麦、烟草、水稻、马铃薯、小麦、中间偃麦草、拟南芥的同源性分别为66.34%、71%、63.59%、69.38%、61.36%、62.93%和62.98%。MhSGT1a在植物中过量表达；在植物受到低温胁迫时，过量表达的MhSGT1a可诱导NtRbohD基因、NtDREB基因在植株中高水平表达、增强NtPIN1基因和NtSOD基因表达、短暂增强NtSPS的表达水平，从而共同抵御胁迫。MhSGT1a转基因烟草具有较强的抵御低温胁迫的能力，植株可在4℃低温条件下正常生长长达24h，同时也证明了MhSGT1a基因具有提高植物抗寒能力的功能。

附图说明

图1转MhSGT1a基因烟草PCR检测

其中M表示marker，WT表示非转基因对照植株，H₂O表示阴性对照（水），P表示阳性对照（质粒），A1-A20表示MhSGT1a转基因烟草株系

图2转MhSGT1a基因烟草RT-PCR检测

其中M表示marker，WT表示非转基因对照植株，H₂O表示阴性对照（水），P表示阳性对照（质粒），A1-A7表示MhSGT1a转基因烟草株系

图3 4℃处理不同时间后烟草的表型观察。

图4转基因烟草中4℃处理不同时间后MhSGT1a基因的表达差异。

图5野生烟草（WT）和转基因烟草（MhSGT1a）4℃处理不同时间后NtRbohD基因的表达差异

其中，WT表示野生型烟草，MhSGT1a表示转MhSGT1a基因烟草。

图6野生烟草（WT）和转基因烟草（MhSGT1a）4℃处理不同时间后NtPIN1基因的表达差异

其中，WT表示野生型烟草，MhSGT1a表示转MhSGT1a基因烟草。

图7野生烟草（WT）和转基因烟草（MhSGT1a）4℃处理不同时间后NtDREB基因的表达差异

其中，WT表示野生型烟草，MhSGT1a表示转MhSGT1a基因烟草。

图8野生烟草（WT）和转基因烟草（MhSGT1a）4℃处理不同时间后NtSPS基因的表达差异

其中，WT表示野生型烟草，MhSGT1a表示转MhSGT1a基因烟草。

图9野生烟草（WT）和转基因烟草（MhSGT1a）4℃处理不同时间后NtSOD基因的表达差异

其中，WT表示野生型烟草，MhSGT1a表示转MhSGT1a基因烟草。

具体实施方式

实施例1

取‘湖北海棠’组培苗叶片，参考蔡斌华等改进的CTAB法（蔡斌华，张计育，高志红，渠慎春，佟兆国，靡林，乔玉山，章镇.一种改良的提取草莓属叶片总RNA的方法[J].江苏农业学报，2008，24(6)：875-877）提取RNA，反转录以及ds DNA的合成参考SMART^TM PCR cDNA Synthesis KitUser Manual进行。根究已经报道物种的序列，在SGT1最大开放阅读框两端分别设计引物sgt1-F：ACTAGTATGGCTTCCGATCTCG（SEQ ID NO.2）及引物sgt1-R：CGGTACCCTAGAACTCCCATT（SEQ ID NO.3）。反应体系为ds DNA模板，1μL；10×PCRBuffer，2.5；上游引物sgt1-F、下游引物sgt1-R各1μL，MgCl₂，1.5μL，dNTP,2μL，rTaq，0.125μL，其余用水补齐至25μL。反应程序为94℃，4min；94℃，30s，55℃，45s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min；将扩增得到的片段经回收、克隆和测序。经过PCR扩增后得到两条不同的序列，分别编码360或359个氨基酸残基的蛋白，核苷酸同源性为92.17%，氨基酸同源性为89.17%，分别命名为MhSGT1a(序列如SEQ ID NO.1所示）和MhSGT1b(Genebank登录号GU183101）。MhSGT1a和MhSGT1b蛋白含有5个保守域，从氨基端至羧基端依次为：TPR(tetratricopeptide repeat domain)、VR1(variable region 1)、CS(CHORD and SGT1)、VR2(variable region 2)和SGS(SGT1 special sequence)。其中TPR、CS和SGS的序列较为保守，而VR1和VR2的序列保守性较差。通过DNAMAN软件将‘湖北海棠’MhSGT1a和MhSGT1b基因编码的氨基酸序列与NCBI上登录的其它物种进行序列比对，MhSGT1a与大麦、烟草、水稻、马铃薯、小麦、中间偃麦草、拟南芥的同源性分别为66.34%、71%、63.59%、69.38%、61.36%、62.93%和62.98%。

实施例2

根据载体和MhSGT1a基因的酶切位点，设计含有SpeI和KepI基因特异引物，上游引物sgt1-F：5’-ACTAGTATGGCTTCCGATCTCG-3’（SEQ ID NO.2）；下游引物sgt1-R：5’-CGGTACCCTAGAACTCCCATT-3’（SEQ ID NO.3）。以MhSGT1a全长cDNA文库为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系为：

PCR反应程序为：94℃，4min；94℃，30s，59℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃延伸10min。将20μl的PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。将扩增的目的片段回收，连接于pMD19simple T克隆载体，并进行克隆测序。

将原始的pCAMBIA-S1300+载体(张计育南京农业大学博士学位论文湖北海棠抗病相关基因的克隆及其功能分析2011，06)进行SpeI和KpnI双酶切，体系（40μl）如下：

酶切产物于1.2％的琼脂糖凝胶上检测，割胶回收大片段，再将经测序验证后的pMD18-T载体中MhSGT1a基因用SpeI和KpnI内切酶切下回收，将两者用T4连接酶连接后，转化大肠杆菌，菌液PCR鉴定阳性克隆。提取质粒，PCR和酶切鉴定。将大肠杆菌质粒用冻融法转入农杆菌EHA105感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性克隆。

实施例3

冻融法将重组质粒转化农杆菌EHA105，挑取单菌落于50ml含Km 50mg/L、Rif 50mg/L的YEB液体培养基中28℃，200r/min振荡过夜培养，菌液PCR鉴定阳性克隆，待菌体OD600值达0.5，5000rpm离心10min，沉淀用50ml的无菌MS液体培养基(不含激素，不调PH)重新悬浮。烟草组培苗在生根培养基（1/2MS+IBA 0.3mg/L）上培养，20-30d继代一次，选择生长发育良好，整齐一致的植株为试材，以其幼嫩叶片作为转化的外植体材料。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，具体方法如下：将烟草叶片的叶缘切去，避开主叶脉将叶片剪成1cm²的叶块，放入上述用无菌液体MS培养基稀释过的农杆菌中，浸泡5min，期间不断轻摇几次；取出叶块，放在无菌吸水纸上吸去多余菌液，接种于共培养培养基（MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L）中，28℃共培养2-3天；共培养结束后将叶块转入筛选培养基（MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+Cb 200mg/L+Hyg30mg/L）中，直接置于28℃下光照培养，每两周换一次筛选培养基，直至分化出抗性植株，待抗性植株长至3-5cm时，剪下，转入筛选生根培养基（1/2 MS+IBA0.3mg/L+Cb 200mg/L+Hyg30mg/L）中诱导生根。

实施例4 转基因烟草株系的检测

4.1基因组DNA和总RNA的提取

基因组DNA和总RNA的提取参考蔡斌华等（2008）和张计育等（2010）的方法，并稍作修改，具体方法如下：取幼苗叶片约0.3g于液氮中迅速研磨成粉末，加入含有900uL CTAB裂解液的2mL离心管中，65℃水浴30min（每10min轻轻颠倒混匀一次），加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻上下颠倒混匀；4℃，12000rpm离心15min，取上清，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻上下颠倒混匀；4℃，12000rpm离心15min，取上清，重复抽提一次；转移上清至新的1.5mL离心管中，加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇和1/10的3M的NaAc(pH5.2)（提取DNA）或者加入等体积的10M LiCl（提取总RNA），-20℃静置直至絮状沉淀出现，4℃，12000rpm离心15min；70％乙醇洗涤沉淀1-2次，超净工作台上干燥，溶于50uL DEPC处理过的ddH₂O中。取1uL的总核酸，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

4.2 PCR检测

取上述提取的总核酸20uL进行基因组中RNA的消化，具体参照佟照国等（2008）的方法。将消化后的基因组DNA溶解于20uL的ddH₂O中，取1uL的核酸，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。DNA在Bio-photometer上检测浓度，体系为1uL DNA样加入49uL ddH₂O，DNA浓度、OD280/OD260直接从仪器上读取。

PCR检测模板：转基因植株DNA、阳性质粒样品、非转基因对照植株DNA；PCR引物参照表1；扩增反应体系：模板0.5uL，sgt1-F、sgt1-R引物各0.5uL，10×buffer 2.5uL，dNTP 2.0uL，Mg²⁺ 2uL，rTaq酶0.15uL，补无菌ddH₂O至总体积25uL；反应程序：95℃预变性4min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环，72℃延伸5min，4℃30min；电泳检测：扩增产物在1×TAE缓冲条件下，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

4.3 RT-PCR检测

将提取的总RNA在Bio-photometer上检测浓度，体系为1uL RNA样加入49uL ddH₂O，RNA浓度、OD280/OD260、OD260/OD230直接从仪器上读取；取1uL的总RNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，剩余的总RNA进行DNA消化后反转录成cDNA，具体方法参考说明书（TaKaRaDRR047A）进行，合成后的cDNA于-20℃保存备用。

RT-PCR检测模板：转基因植株cDNA、阳性质粒样品、非转基因对照植株cDNA；其余同PCR检测，结果见图2。

实施例5 转基因烟草T0代对4℃低温胁迫的表达分析

将生长较一致的转基因植株以及对照植株（WT）的组培苗置于4℃光照培养箱低温处理，给予16/8的光/暗循环，分别于0，3，6，12，24h后拍照统计并取样进行荧光定量分析。

由图3可观察到野生型烟草（WT）在低温处理12h（WT-12）后部分叶片边缘开始出现脱水萎蔫的现象，低温处理24h（WT-24）后脱水萎蔫现象扩散至整张叶片，并且叶片开始失绿泛黄，说明野生型烟草缺乏对低温胁迫的抵抗力；MhSGT1a转基因烟草（A）无论是低温处理12h(A-12)还是24h(A-24)，植株的表型都与正常条件下（A-0）MhSGT1a转基因烟草植株的表型一致，未出现任何受低温伤害的现象，说明MhSGT1a转基因烟草具有较强的抵御低温胁迫的能力，植株可在4℃低温条件下正常生长长达24h，同时也证明了MhSGT1a基因具有提高植物抗寒能力的功能。

提取4℃处理后转基因烟草及对照烟草叶片的总RNA（方法同4.1）进行DNA消化后反转录成cDNA，具体方法参考说明书（TaKaRa DRR047A）进行，合成后的cDNA按照Real Master Mix(SYBR Green)PCR试剂盒操作指导意见，采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)方法，检测基因的相对表达量。qRT-PCR反应在Applied Biosystems 7300 Real Time PCRSystem上进行，反应总体系为20μL，其中1ng（0.5μL）cDNA，上、下引物分别为0.2μL(10pM)（所用引物请参照表1，内参为NtTubullin），10μL SYBR

Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)(TaKaRa Code：DRR041A)and 9.1L双蒸水.反应条件为95℃预变性1min；95℃ 15s，60℃60s，72℃ 60s，40个循环；机器默认溶解曲线分析。使用7300system软件和2^-DDCt方法处理数据(Livak & Schmittgen 2001).

表1 转基因验证及相关基因表达分析的引物序列

由图4可知，在转基因烟草中，MhSGT1a在正常条件下已经开始表达，4℃低温处理3h后表达量达到最大，随后急剧下降，24h后恢复到与0h一致的表达水平，说明MhSGT1a受低温胁迫的诱导，在植物中过量表达防御低温冷害。

NtRbohD编码烟草呼吸暴发氧化酶类似物，类似于NADPH氧化酶，产生活性氧(Simon-Plas et al.，2002；Morel et al.，2004)。由图5可知，在正常条件下（0h）MhSGT1a转基因烟草中NtRbohD的表达量高于野生型烟草，4℃处理后NtRbohD在野生型烟草中的表达量逐渐升高，在处理后12h达到最高水平，随后急剧下降（低于0h）。在MhSGT1a转基因烟草中4℃处理3h后NtRbohD的表达量达到最高，是同时期野生型烟草的2.93倍，是野生型最高表达水平的1.52倍，随后开始下降，但始终保持着较高的表达水平。由此可知，在植物受到低温胁迫时，过量表达的MhSGT1a可诱导NtRbohD在植株中高水平表达共同抵御胁迫。

最近的研究表明，生长素参与压力或防御反应，并且已报道了相当数量的生长素反应基因参与这些反应（Goldsworthy A.et al.,1985；Jain M.et al.，2009）。化学渗透性扩散假说认为，生长素极性运输是由于在细胞质膜上有极性分布的生长素输出载体。一些研究结果还表明，生长素输出载体是一种复合物，至少包括两个组分：一种是生长素输出载体的调节亚基-NPA结合蛋白，起调节活性作用；另一种是生长素输出载体的催化亚基(输出蛋白)EIR1(PIN)蛋白，负责运输生长素(Lomax et al.，1992；Luschnig et al.，1998；Gil et al.，2001；Joshua et al.，2004)。由图6可知，在野生植株中（WT）NtPIN1在未进行低温处理时(0h)即开始表达并在低温处理3h后达到峰值，随后其表达水平逐渐下降，在24h达到最低(低于0h)。而MhSGT1a转基因植株中NtPIN1同样在未处理时即表达并随着低温处理逐渐升高在处理后6h达到峰值（是未处理的WT植株的2.95倍），随后急剧下降到最低值。由此可知，在植物受到低温胁迫时，过量表达的MhSGT1a可诱导NtPIN1在植株中的表达抵御低温胁迫。

DREB（dehydration responsive element binding protein）转录因子是一个干旱应答元件的结合蛋白，在逆境胁迫下诱导产生后可激活其他多达12个依赖DRE元件（5′-TACCGACAT-3′，dehydration responsive element，脱水响应元件）的抗逆功能基因，从而在转录水平上调控与低温干旱和高盐抗性相关的功能基因的表达，引起脯氨酸及蔗糖含量提高，从而增强植株对多种逆境的抵抗性（押辉远，等，2004；李妍，等，2009）。由图7可知，在正常条件下，野生型烟草中NtDREB已开始表达，但是随着低温处理的时间的延长表达量逐渐降低，在24h后达到最低。在MhSGT1a转基因烟草中NtDREB的表达水平始终高于野生型烟草，说明在正常或胁迫的条件下，过量表达的MhSGT1a均可上调植株中NtDREB的表达量，这种上调作用在低温胁迫6h后表现最明显，由此可知，在植物受到低温冷害时，过量表达的MhSGT1a可诱导NtDREB高水平表达抵御胁迫。

NtSPS编码蔗糖磷酸合成酶(

2005)，受冷害诱导。由图8可知，在野生型烟草中（WT），NtSPS在正常条件下（0h）已有相对较高的表达量，低温处理3h后降到最低，而后随着低温胁迫时间的增加表达量缓慢增加，最后与0h持平，说明NtSPS在野生型植株抵御低温胁迫的过程中没有明显的作用。与野生型相比，MhSGT1a转基因烟草只在低温处理3h后表达量最高，是同时期的野生型烟草的3.36倍，与0h野生型烟草持平，其余的处理时期表达量都低于同时期的野生型烟草。说明，过量表达的MhSGT1a只能在低温胁迫约3h时短暂增强NtSPS的表达水平以减轻低温对植株的伤害。

NtSOD编码超氧化物歧化酶，该酶在烟草中具有抗氧化胁迫能力(Slooten et al.，1995)；由图9可知，在野生型植株（WT）中，NtSOD在正常条件（0h）下表达量最高，随着低温胁迫后开始降低并长时间维持该表达水平，24h后降到最低，说明NtSOD在野生型植株抵御低温胁迫的过程中没有明显的作用。在MhSGT1a转基因烟草中，NtSOD在正常条件（0h）下已表达但未达到最高，随着低温胁迫后开始降低，低温处理12h后出现小幅上升，并超过正常条件下的表达水平达到最高值，随后急剧下降，降至最低。由此可知过量表达的MhSGT1a能在植株受到低温胁迫时小幅增强NtSOD的表达水平以减轻低温对植株的伤害。

<110>  南京农业大学

<120>  湖北海棠MhSGT1a基因及其应用

<160>  17

 

 

<210>  1

<211>  1083   

<212>  DNA

<213>  ‘湖北海棠’

<220>

<223> MhSGT1a基因序列

<400>  1

atggcttccg atctcgaaca gcgtgccaag gaggtgttca tggacgacca cttcgagttg 60

gccgtcgacc tctacaccca ggccatcgac ctcaaccccc agaacgccga gctctactcc 120

gaccgcgccc aggccaacat caaagccggc aatctcactg aggctgttgc ggatgcgaac 180

aaggcgattg agttcgaccc gtcattgtac aaagcgtatt ttcgaaaggg aattgcctgc 240

atcaagctcg aggaatatca gactgcaaag gcggccctgg aaaccggtgc tcctttggcc 300

ccgcaggaga caagatttgc tagtttgata aaagagtgtg atgagaaaat tgcagaggaa 360

actattgttc taccaacacc tccagtggag aaagacatta cagagaatgt tttacctgca 420

aaagatgttg agcctgtgag tcaaccttcc aatcaggtga ccgtagcaac cgtcaaacca 480

aaatacaggc atgaattcta ccagaagcca gaagaagtgg ttgtgactat attcgccaag 540

ggcataccag ccaaagatgt tcatgttgac tttggtgaac aaatactaag tgttagcatc 600

gatgttgctg gtgaagatac atatcatttt caacctcgct tatttggaaa gataatacct 660

gaaaaatgca ggttcgacgt tctgtccacc aaagttgaaa ttcgcctggc taaagctgaa 720

ccgatacagt gggcatctct tgaattcagc aaggacagcc ttgttccata taggggcagt 780

ggcccagttg ttggagcgcc aaggccatcc tacccatcct caaaaccaaa aagggactgg 840

gataagctgg aggctcaagt gaagaaggag gaaaaagaag agaagcttga tggtgatgca 900

gctctgaaca aattcttcca ggacatatac aaggatgctg atgaggacac aagaagggcc 960

atgagaaaat cttttgtgga gtcaaacggg acagtgcttt cgacaaactg gaaagaagtg 1020

ggaaacaaaa aggttgaggg aagtgctccc gacggcatgg agatgaagaa atgggagttc 1080

tag                                                               1083

 

 

<210>  2

<211>  22   

<212>  DNA

<213>  人工序列

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<223>  引物sgt1-F

<400>  2

actagtatgg cttccgatct cg               22

 

 

<210>  3

<211>  21   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物sgt1-R

<400>  3

cggtacccta gaactcccat t                21

 

 

<210>  4

<211>  23   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物sgt1a-F

<400>  4

gcaggttcga cgttctgtcc acc              23

 

 

<210>  5

<211>  20   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物sgt1a-R

<400>  5

tggcgctcca acaactgggc                  20

 

 

<210>  6

<211>  21   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物TUB-F

<400>  6

agatgttccg tcgtgtcagt g                21

 

 

<210>  7

<211>  24   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物TUB-R

<400>  7

tgcttcctct tcatcctcat atcc             24

 

 

<210>  8

<211>  20   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物PIN-F

<400>  8

tgccaccggc gagtgttatg                  20

 

 

<210>  9

<211>  25   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物PIN-R

<400>  9

caagaccagc gtctgagaga gtaga            25

 

 

<210>  10

<211>  23   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物DREB2-F

<400>  10

caggcactac tcctgaaacg cca              23

 

 

<210>  11

<211>  22   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物DREB2-R

<400>  11

ggcagcatta gtccttccgc ca               22

 

 

<210>  12

<211>  19   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物Rbo-F

<400>  12

accagcactg accaaagaa                   19

 

 

<210>  13

<211>  20   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物Rbo-R

<400>  13

tagcatcaca accacaacta                  20

 

 

<210>  14

<211>  22   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物SPS-F

<400>  14

gaattcaggc gcttcgttgt ca               22

 

 

<210>  15

<211>  20   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物SPS-R

<400>  15

acccctagtt tctccagtga                  20

 

 

<210>  16

<211>  24   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物SOD-F

<400>  16

ccattaccga caagcagatt cctc             24

 

 

<210>  17

<211>  22   

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物SOD-R

<400>  17

caacccttcc accagcattt cc               22

 

Claims (1)

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的MhSGT1a基因在创制耐低温品种中的应用。

2、含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的MhSGT1a基因的重组表达载体在创制耐低温品种中的应用。

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