ES2339515T3 - Resistencia de la vid al nepovirus. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para seleccionar y producir una vid o componente de la vid transgénicos con aumento de resistencia a la enfermedad de arrepollado en comparación con una vid o un componente de la vid transgénicos, comprendiendo dicho procedimiento: (a) transformar una célula vegetal de uva con una molécula de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva o fragmento de la misma que es capaz de expresarse en una orientación de sentido en dicha célula vegetal; (b) regenerar una vid o componente de la vid transgénicos a partir de la célula vegetal; y (c) seleccionar una vid o componente de la vid transgénicos basándose en su expresión de dicha molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma en el que dicha molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma expresa una proteína de la cubierta de nepovirus de la uva o fragmento de la misma y es negativa para la expresión de dicha proteína de la cubierta de nepovirus de la uva o fragmento de la misma tal como se detectó por inmunoanálisis con enzima ligada y en el que dicha expresión aumenta la resistencia a dicho arrepollado de la vid o un componente de la vid transgénicos en comparación con una vid o componente de la vid no transgénicos.
Description
Resistencia de la vid al nepovirus.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para seleccionar y producir una vid transgénica o un
componente de la vid con aumento de la resistencia a una enfermedad
de arrepollado.
El virus del arrepollado de la vid (GFLV) es un
nepovirus de la uva, que es transmitido de planta a planta por el
nemátodo, Xiphinema index. GFLV es el agente responsable del
arrepollado de la vid, que se produce en todo el mundo. La
enfermedad se denomina por el aspecto de la forma de hoja en abanico
de las hojas infectadas por el GFLV. Es una de las enfermedades más
dañinas y extendidas de la vid. Los síntomas de la infección por
GFLV incluyen la morfología anómala del brote y las decoloraciones
de las hojas, que conducen a un aspecto como de abanico (Agrios,
Plant Pathology, 3^{a} Edición, Academic Press, 1998, págs.
687-688). Además, la producción del fruto de las
viñas infectadas es baja, con vides que producen pequeñas ramas que
tienen el conjunto del fruto anormal y la maduración. Por último,
las vides infectadas degeneran y mueren.
Se cree que existe una variedad muy extendida de
GFLV por la utilización del material de plantación infectado.
Aunque la variedad de hospedador natural se cree que está
restringida a la uva, el GFLV es también transmisible a una amplia
variedad de especies herbáceas por inoculación de sabia con
fricción. Chenopodium quinoa es una especie para diagnóstico
útil para el virus. En general, las cepas de GFLV son
antigénicamente uniformes y el diagnóstico por ELISA es un
procedimiento habitual.
La estrategias actuales para controlar el
arrepollado de la vid y otras enfermedades provocadas por nepovirus
en los viñedos incluyen el control de nematodos (por ejemplo, la
fumigación del suelo y la utilización de otros plaguicidas),
rizomas de reproducción para resistencia a la alimentación de
nematodos, vides de reproducción para la resistencia al GFLV y
plantación de vides sin enfermedad certificadas.
En general, la invención proporciona un
procedimiento para producir y seleccionar una vid o un componente
de la vid transgénicos con aumento de resistencia al arrepollado
como se indica en la reivindicación 1. El procedimiento
generalmente implica: (a) transformar una célula vegetal de uva con
una molécula o fragmento de la misma de ácido nucleico de la
proteína de la cubierta del nepovirus de la uva (por ejemplo, una
molécula o fragmento de la misma de ácido nucleico de la proteína
de la cubierta del nepovirus de la uva que tiene aproximadamente
50% o más de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº: 1) que es
capaz de expresarse en una célula vegetal; (b) regenerar una vid o
componente de la vid transgénicos procedente de la célula vegetal;
y (c) seleccionar una vid o componente de la vid transgénicos que
expresa la molécula de ácido nucleico o componente de la misma a un
nivel que es negativo para la expresión de la proteína o fragmento
de la misma de la cubierta de nepovirus de la uva como se detecta
por ELISA, en el que la expresión aumenta la resistencia de la vid
o un componente de la vid transgénicos al arrepollado en comparación
con las plantas que expresan la molécula de ácido nucleico a alto
nivel. La baja expresión de nivel del ARNm del nepovirus de la uva o
de la propia proteína de la cubierta expresada en la planta
transgénica se mide por ELISA así como la inoculación de las
plantas transgénicas con el virus y la selección de las vides
resistentes. En las formas de realización preferidas, la molécula o
fragmento de la misma de ácido nucleico es codificada por un
transgén hallado en la vid transgénica. La molécula de ácido
nucleico o fragmento de la misma se expresa como en una orientación
de la cadena transcrita. Todavía en otras formas de realización
preferidas, dichas moléculas o fragmento de las mismas de ácido
nucleico de la proteína del revestimiento del nepovirus de la uva se
expresa en la vid o un componente de la vid transgénicos.
Tal como se expuso anteriormente, la invención
incluye también fragmentos de una molécula de ácido nucleico de la
proteína de la cubierta del nepovirus de la uva que facilita, cuando
se expresa a un nivel que es negativo para la expresión de la
proteína o un fragmento de la misma de la cubierta del nepovirus de
la uva tal como se detecta por ELISA, un aumento de la resistencia
de una vid o de un componente de la vid transgénica, a un
arrepollado. Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico de la
proteína de la cubierta del nepovirus de la uva descritas en la
presente memoria o las partes de las mismas pueden expresarse en una
planta para facilitar la resistencia a la enfermedad. Las
secuencias que median un aumento de resistencia a un arrepollado se
consideran útiles en la invención. Tal como se utiliza en la
presente memoria, el término "fragmento", tal como se aplica a
las secuencias de una molécula de ácido nucleico, significa por lo
menos 5 nucleótidos contiguos, preferentemente por lo menos 10
nucleótidos contiguos, más preferentemente por lo menos 20 a 30
nucleótidos contiguos y aún más preferentemente por lo menos 40 a 80
o más nucleótidos contiguos. Los fragmentos de una molécula de
ácido nucleico de nepovirus de la uva puede producirse y,
posteriormente, integrarse en un vector de expresión habitual (por
ejemplo, los descritos en la presente memoria) según los
procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
Preferentemente, la vid útil en la invención es
un miembro del género Vitis; y el componente de la vid es un
embrión somático, un esqueje, un rizoma o un bloque madre. El
arrepollado es una enfermedad de arrepollado de la vid producida
por un nepovirus de la uva. Todavía en otras formas de realización
preferidas, el nepovirus de la uva es un virus de arrepollado de la
vid o un virus del mosaico en arabis.
Los procedimientos y las secuencias de GFLV
descritos en la presente memoria son útiles para proporcionar
resistencia o tolerancia a la enfermedad o ambas en una variedad de
vides (por ejemplo, Vitis spp., híbridos de Vitis
spp. y todos los miembros de un subgénero Euvitis y
Muscadinia), incluyendo cultivos por esqueje o rizoma. Los
cultivos por esqueje ilustrativos incluyen, sin limitación, los que
se denominan como uvas de mesa o en racimo y los utilizados en la
producción de vino tales como Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon,
Chardonnay (por ejemplo, CH 01, CH 02, CH Dijon), Merlot, Pinot Noir
(PN, PN Dijon), Semillon, White Riesling, Lambrusco, Thompson
Seedless, Autumn Seedless, Niagrara Seedless, y Seval Blanc. Los
cultivos por rizoma que son útiles en la invención, incluyen, sin
limitación, Vitis rupestris Constantia, Vitis
rupestris St. George, Vitis california, Vitis
girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia
Carlos, Richter 110 (Vitis berlandieri x rupestris),
101-14 Millarder et de Grasset (Vitis riparia x
rupestris), Teleki 5C (Vitis berlandieri x riparia), 3309
Courderc (Vitis riparia x rupestris), Riparia Gloire de
Montpellier (Vitis riparia), 5BB Teleki (selección Kober,
Vitis berlandieri x riparia), SO_{4} (Vitis berlandieri
x rupestris), 41B Millardet (Vitis vinífera x
berlandieri), y 039-16 (Vitis vinífera x
Muscadinia).
El término "Intraducible" significa una
secuencia de ARNm que no está traducida en una proteína. Ejemplos
de dichas secuencias intraducibles incluyen, sin limitación, las
secuencias que incluyen un codón ATG de iniciación seguidas de una
mutación de desplazamiento del marco modificada genéticamente y un
codón de terminación para impedir la traducción del ARNm en una
proteína. Los genes de la cubierta del nepovirus de la uva que
expresan dichas secuencias de ARNm intraducibles pueden construirse
según los procedimientos normalizados (por ejemplo, los descritos
en la presente memoria).
El procedimiento para analizar la expresión de
un gen de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva es la
técnica inmunológica ELISA para la detección de una proteína.
La expresión "Sustancialmente idéntico"
significa una molécula de proteína o ácido nucleico que presenta por
lo menos 97%, y preferentemente 98%, o aún más preferentemente 99%
de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por
ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1; SEC.
ID. nº: 2) o en la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, las
secuencias de ácido nucleico mostradas en la Fig. 1; SEC. ID. nº:
1). Para las proteínas, la longitud de las secuencias de
comparación generalmente será de por lo menos 16 aminoácidos,
preferentemente por lo menos de 20 aminoácidos, más preferentemente
por lo menos de 25 aminoácidos y aún más preferentemente de 35
aminoácidos o mayor. Para los ácidos nucleicos, la longitud de las
secuencias de comparación generalmente será de por lo menos 50
nucleótidos, preferentemente de por lo menos de 60 nucleótidos, más
preferentemente de por lo menos de 75 nucleótidos y aún más
preferentemente de 110 nucleótidos o superior.
La identidad de secuencia, a los niveles de
aminoácido o de ácido nucleico, se mide por lo general utilizando
el programa informático para análisis de secuencias (por ejemplo,
Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,
Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710
University Avenue, Madison, WI 53705, programas BLAST, o
PILEUP/PRETTYBOX). Dicho programa informático iguala las secuencias
idénticas o similares asignando grados de homologías a varias
substituciones, eliminaciones y/u otras modificaciones. Las
substituciones de aminoácidos conservadoras por lo general incluyen
substituciones con los siguientes grupos: glicina, alanina; valina,
isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina,
glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina,
tirosina.
La expresión "proteína sustancialmente
pura" significa una proteína de la cubierta del nepovirus de la
uva (por ejemplo, la proteína de la cubierta de la cepa de
nepovirus de la uva Geneva, N.Y. (Fig. 1; SEC. ID. nº: 2)) que se
había separado de los componentes que la acompañan en la naturaleza.
Por lo general, la proteína está sustancialmente pura cuando está
por lo menos 60%, en peso, exenta de las proteínas y de moléculas
orgánicas naturales con las que se asocia en la naturaleza.
Preferentemente, la preparación está por lo menos 75%, más
preferentemente por lo menos 90%, y aún más preferentemente por lo
menos 99%, en peso, proteína. Una proteína sustancialmente pura
(por ejemplo, la proteína de la cubierta de la cepa de nepovirus de
la uva "Geneva") puede obtenerse, por ejemplo, por extracción
de la fuente natural (por ejemplo, una planta infectada con
GFLV-CP tal como C. quinoa); mediante la
expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica una
proteína; o sintetizando químicamente la proteína. La pureza puede
medirse por cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo,
cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o
por análisis de HPLC.
La expresión "molécula aislada de ácido
nucleico" significa una molécula de ácido nucleico (por ejemplo,
ADN) que está exenta de los ácidos nucleicos que, en el genoma
natural del organismo del que procede la molécula de ácido nucleico
de la invención, flanquean la molécula de ácido nucleico. La
expresión incluye por consiguiente, por ejemplo, un ADN
recombinante que está incorporado en un vector; en un plásmido o
virus que se replica de manera autónoma; o en el ADN genómico de un
procariota o eucariota; o que existe como molécula aparte (por
ejemplo, un ADNc o un genómico o un fragmento de ADNc producido por
RCP o digestión con endonucleasa de restricción) independiente de
otras secuencias. Además incluye un ADN recombinante que forma parte
de un gen híbrido que codifica una secuencia de proteica
adicional.
La expresión "se hibrida específicamente"
significa que la molécula de ácido nucleico que es capaz de
hibridarse a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) por
lo menos en condiciones de baja severidad, y preferentemente en
condiciones de alta severidad.
\newpage
El término "proteínas" significa cualquier
cadena de aminoácidos, incluyendo polipéptidos, independientemente
de la longitud o de la modificación después de la traducción (por
ejemplo, glucosilación o fosforilación), incluyendo
polipéptidos.
La expresión "colocada para la expresión"
significa que la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) está
colocada junto a una secuencia que dirige la transcripción de la
molécula de ácido nucleico.
La expresión "zona de control de expresión"
significa cualquier secuencia mínima suficiente para dirigir la
transcripción. En la invención están incluidos el activador y los
elementos potenciadores que son suficientes para hacer controlable
la expresión del gen dependiente del activador para la expresión del
gen específica para la célula, el tejido o el órgano, o los
elementos que son inducibles mediante señales o agentes
externos(por ejemplo, elementos inducibles por la luz, los
patógenos, la herida, el estrés o las hormonas; o elementos
constitutivos); dichos elementos pueden estar situados en las zonas
5' o 3' del gen natural o modificarse genéticamente en un montaje
transgénico.
La expresión "unido operativamente"
significa que un gen y una(s) secuencia(s)
reguladora(s) están conectadas de tal manera que permiten la
expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo,
proteínas activadoras de la transcripción) están unidas a
la(s) secuencia(s) reguladora(s).
La expresión "célula vegetal" significa
cualquier célula que se propaga por si misma unida por una membrana
semipermeable y que contiene un plástido. Una célula vegetal tal
como se utiliza en la presente memoria se obtiene a partir, sin
limitación, de semillas, cultivos en suspensión, embriones, zonas
meristemáticas, tejido calloso, protoplastos, hojas, raíces,
brotes, embriones somáticos y cigóticos, así como cualquier parte de
un tejido u órgano reproductivo o vegetativo.
La expresión "componente vegetal" significa
una parte, segmento u órgano extraído de una planta o célula vegetal
intacta. Componentes vegetales ilustrativos, incluyen, sin
limitación, embriones somáticos, hojas, frutos, esquejes y
rizomas.
El término "transgénico" significa
cualquier célula que incluye una molécula de ácido nucleico (por
ejemplo, una secuencia de ADN) que se inserta por artificio en una
célula y se convierte en parte del genoma del organismo (en un modo
integrado o extracromosómico por ejemplo, un montaje de expresión
vírica que incluye un activador subgenómico) que se desarrolla a
partir de esta célula. Tal como se utiliza en la presente memoria,
los organismos transgénicos son generalmente vides o componentes de
la vid transgénicos y la molécula de ácido nucleico (por ejemplo,
un transgén) se inserta por artificio en los compartimentos
nucleares o plastídicos de la célula vegetal. Dicha viña o
componente de la viña transgénico expresa por lo menos un transcrito
de nepovirus de la uva de secuencia traducible transcrita.
El término "transgén" significa cualquier
pieza de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que está
insertada por artificio en una célula, y se vuelve parte del
organismo (integrada en el genoma o mantenida
extracromosómicamente) que se desarrolla a partir de esta célula.
Dicho transgén puede incluir un gen que es en parte o enteramente
heterólogo (es decir, extraño) para el organismo transgénico, o
puede representar un gen homólogo para un gen endógeno del
organismo.
La expresión "aumento de resistencia al
arrepollado" significa un nivel superior de resistencia al
arrepollado (por ejemplo, cualquier enfermedad producida por un
nepovirus de la uva tal como las producidas por GFLV, virus de
mosaico en arabis y similares) en una vid transgénica (o componente
de la vid o célula o semilla de la misma) que el nivel de
resistencia en relación a una vid no transgénica. En las formas de
realización preferidas, el nivel de resistencia en una vid
transgénica es por lo menos del 5 al 10% (y preferentemente 20%,
30% o 40%) mayor que la resistencia de una vid de referencia. En
otras formas de realización preferidas, el nivel de resistencia al
arrepollado es 50% mayor, 60% mayor y más preferentemente incluso
75% o 90% mayor que el de una vid de referencia; con hasta el 100%
de resistencia en comparación con una vid de referencia que es la
más preferida. El nivel de resistencia se mide utilizando
procedimientos convencionales. Por ejemplo, el nivel de resistencia
al arrepollado puede determinarse comparando las propiedades físicas
y las características (por ejemplo, altura y peso de la planta, o
comparando los síntomas de la enfermedad, por ejemplo, desarrollo
retardado de la lesión, tamaño reducido de la lesión, marchitamiento
y rizado de la hoja, moteado y necrosis de las hojas, deformidad de
las cañas, número de internudos, anillos de mosaico en las hojas y
decoloración de las células) de las vides transgénicas. La
infecciosidad de un nepovirus de la uva (por ejemplo, un GFLV o un
virus del mosaico en arabis) puede controlarse también utilizando,
por ejemplo, ELISA convencional.
Tal como se expuso anteriormente, se ha
descubierto que la expresión de un gen de la proteína de la cubierta
traducible transcrita del nepovirus de la uva a un nivel que es
negativo para la expresión de dicha proteína de la cubierta de
nepovirus de la uva por ELISA proporciona vides transgénicas con
resistencia a las enfermedades producidas por un nepovirus de la
uva. Por consiguiente, la invención proporciona numerosos avances y
ventajas importantes para los viticultores. Por ejemplo,
seleccionando viñas transgénicas que expresan niveles de un gen de
proteína de la cubierta de nepovirus de la uva recombinante y es
negativo para la expresión de dicha proteína de la cubierta de
nepovirus de la uva del fragmento de la misma detectado por ELISA y
de este modo han aumentando la resistencia a la infección por el
nepovirus de la uva, la invención facilita un medio eficaz y
económico para la protección contra el arrepollado de la vid y otras
enfermedades provocadas por el nepovirus de la uva. Dicha
protección reduce o minimiza la necesidad de las prácticas químicas
tradicionales (por ejemplo, fumigación del suelo) utilizadas
habitualmente por los viticultores para controlar la propagación de
un nepovirus de la uva y proporciona protección contra estos
patógenos que causan la enfermedad. Además, debido a que las
plantas de la uva expresan dichas secuencias de nepovirus de la uva
son menos vulnerables a la infección por el nepovirus de la uva y
al arrepollado, la invención proporciona además aumento de la
eficacia de producción, así como mejoras en la calidad, color,
aroma y rendimiento de las uvas. Además, debido a que la invención
reduce la necesidad de protección química contra los patógenos de la
vid, la invención también beneficia el entorno donde se plantan los
viñedos. La invención puede también utilizarse en combinación con
rizomas cultivados con resistencia a nematodos transmitidos por el
suelo.
Otras propiedades y ventajas de la invención se
pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción de las
formas de realización preferidas de la misma, y de las
reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se describirán los dibujos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 es una ilustración esquemática que
presenta la secuencia nucleotídica (SEC. ID: nº: 1) y la secuencia
de aminoácidos deducida (SEC. ID. nº: 2) de la proteína de la
cubierta de una cepa de nepovirus de la uva de Geneva, N.Y.
La Fig. 2 es una ilustración esquemática que
presenta las cartografías de los vectores de expresión de la planta
que contienen diferentes montajes génicos víricos.
La Fig. 3 presenta los resultados de los
experimentos que analizan los niveles de expresión de la proteína
de la cubierta de arrepollado de la vid en 3309C transgénico y
Gloire.
Sigue a continuación una descripción para la
producción de vides transgénicas resistentes a la enfermedad.
Plantas de uva transgénicas que expresan transcrito traducible de
genes con proteína de la cubierta de virus de arrepollado de la vid
(GFLV-CP) se regeneraron a partir de cultivos de
callo embriogénico procedentes de anteras de rizomas (3309 Couderc
("3309C"), Riparia Gloire ("Gloire"), Teleki 5C
("5C"), 110 Richter ("110R"), S04, y MGT
101-14 ("101-14")).
Inesperadamente, se observó que las plantas transgénicas que
expresan bajos niveles de un gen con proteína de la cubierta de
arrepollado de la vid recombinante eran resistentes al
arrepollado.
Los ejemplos proporcionados a continuación se
proporcionan para ilustrar la invención, y no deben considerarse
limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
El callo de inició a partir de cultivos de uva:
Gloire, 3309C, 5C, 110R, y 101-14 o medio MSE (más
adelante). Las anteras de brotes de flores de los cinco rizomas
comenzaron a brotar después de una semana de cultivo. Después de
cuatro semanas, se desarrolló un callo suave, gelatinoso, amarillo
brillante. En ese momento, algunos embriones de Gloire, 3309C, y
110R eran visibles en el tejido calloso. Después de ocho semanas,
todos los callos se transfirieron al medio HMG (más adelante) para
permitir el desarrollo posterior de los embriones. En la semana
octava en medio HMG muchos grupos de embriones se produjeron a
partir del tejido calloso.
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Tras el cultivo durante un periodo comprendido
entre ocho y dieciséis semanas en medio HMG, se observó que se
desarrollan racimos de embriones e hipocotiledones a partir de los
callos. Al mismo tiempo, se produjeron continuamente embriones
secundarios a partir de los embriones primarios. Los racimos de
embriones se transfirieron a continuación a medio MGC (más
adelante) para aumentar el tamaño del embrión y la velocidad de
crecimiento. Sin embargo, se produjeron menos embriones en medio
MGC en comparación con el medio HMG para todos los cultivos de
rizoma que se examinaron. Se observó que el desarrollo del embrión
del cultivo 110R dependía de la utilización de ambos medios; se
necesitaba medio HMG para provocar muchos embriones secundarios
pequeños y era necesario medio MGC para simular el crecimiento del
hipocótilo.
Se transfirieron posteriormente los hipocótilos
a un medio de planta leñosa (Lloyd y McCown, más adelante) y
aparecieron brotes en uno a dos meses. Los plantones se produjeron
generalmente con una frecuencia de treinta a sesenta y seis en
medio de planta leñosa.
Los plantones resultantes se trasplantaron al
suelo y se mantuvieron en el invernadero. Las plantas de Gloire,
5C, 110R, 101-14 y 3309C presentaban morfología
normal.
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Un aporte continuo de callos embriogénicos se
produjo utilizando un procedimiento de ciclo del embrión; las
piezas de hipocótilo produjeron callo embriogénico en el medio MSE
en dos a tres meses. Estos callos eran apropiados para la
transformación porque desarrollaban muchos embriones uniformes. Los
embriones de 5C requerían cultivo en medio MSE durante tres meses,
seguido de cultivo en medio HMG durante dos a tres meses para
provocar la formación de embriones. La duración requerida para el
ciclo embriogénico (callo embriogénico a hipocótilo y vuelta a
callo embriogénico) variaba para los diferentes cultivos; Riparia
Gloire requería dos a tres meses, 3309C y 101-14
requerían cinco a seis meses y 5C requería seis a siete meses.
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Utilizando técnicas ordinarias de biología
molecular, se aisló y caracterizó una secuencia nucleotídica que
codifica un gen de proteína de la cubierta de una cepa de nepovirus
de uva de Geneva, NY. La secuencia del ácido nucleico (SEC. ID. nº:
1) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEC. ID. nº: 2) del gen
de la proteína de la cubierta de la cepa "Geneva" se presentan
en la Fig. 1. Estas secuencias se compararon también con tres cepas
diferentes de GFLV de Francia (Serghini et al., J. Gen.
Virol. 71: 1433-1442, 1990), California
(Sanchez et al., Nucleic Acids Res. 19 5440, 1991) y
Austria (Brandt et al., Arch. Virol. 140:
157-164, 1995) utilizando un programa Prettybox. El
porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos de las
cepas francesa, californiana y austriaca con la cepa "Geneva"
fue 96,4%, 95,0% y 95,4%, respectivamente.
Se utilizaron tres montajes génicos diferentes
(traducible transcrito, no traducible transcrito y complementario)
para transformar la uva (Fig. 2). Embriones somáticos pequeños y
callos embriogénicos de los cinco rizomas Gloire, 3309C, 110R, 5C y
101-14 se cultivaron conjuntamente con la cepa
C58Z707 de A. tumefaciens que alberga vectores binarios que
llevan el gen de la proteína de la cubierta de la cepa
"Geneva". Después del cultivo conjunto, se transfirieron
embriones somáticos al medio HMG o MSE con cefotaxima,
carbenecilina, y kanamicina para seleccionar embriones transgénicos
y plantas. Se generaron de este modo plantas transgénicas.
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En un experimento con un transcrito traducible
GFLV-CP y montajes de expresión génica de
\beta-glucuronidasa (FLcpST+GUS, Fig. 2), en
supuestas plantas transgénicas de Gloire y de 110R se ensayó la
actividad de GUS, el gen NPTII y la expresión del gen
GFLV-CP por ELISA. Mediante análisis por RCP, se
encontró que aproximadamente el 93% de las plantas Gloire
transformadas tenían el gen GFLV-CP del tamaño
esperado, todavía estas plantas eran negativas para la expresión de
GFLV por ELISA.
Estos resultados indicaban que la expresión del
gen GLFV-CP en los transgénicos de Gloire era
demasiado baja para detectar utilizando ELISA. En cambio el cultivo
3309C se transformó con el montaje transcrito traducible
GFLV-CP en un vector sin GUS. Los autores analizaron
la expresión de la proteína de la cubierta de supuestas plantas
transgénicas y encontraron que el 97,7% de plantas positivas a
ELISA. Entre estas plantas, el 37,7% presentaba baja expresión
(0,1<DO_{405}>0,5), 30,7% presentaba expresión media
(0,5<DO_{405}>1,0), y 31,0% tenía expresión alta
(DO_{405}>1.0). Las plantas de referencia no transformadas eran
negativas (DO_{405}<0,020).
En otra serie de experimentos, los resultados de
ELISA también pusieron de manifiesto diferentes niveles de
expresión del gen la proteína de la cubierta del GFLV en plantas
transgénicas de 3309C y Gloire. La expresión génica de la proteína
de la cubierta baja se observó en el 61% y 53% de la 3309C
transformada y Gloire, respectivamente. La expresión génica media
de la proteína de la cubierta se observó en el 26% y el 22%,
respectivamente. La expresión génica alta de la proteína de la
cubierta se observó en el 13% y 25%, respectivamente, de la 3309C
transformada y Gloire (Fig. 3).
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Se determinó la resistencia a GFLV en plantas
transgénicas de la manera siguiente. Se inocularon plantas con GFLV
por heteroinjerto a C. quinoa infectada con GFLV o injertando
a cultivos infectados con GFLV no transgénico según procedimientos
normalizados. Las plantas se mantuvieron durante varios meses
después de la inoculación y a continuación se evaluó la resistencia
a la enfermedad. La resistencia a la enfermedad se evaluó por ELISA
normalizado. Los resultados de estos experimentos se muestran en las
Tablas I-V (a continuación). En particular, tal
como se muestra en la Tabla III, una estirpe transgénica que expresa
los montajes GFLVcpAntiS de expresión complementarios (Fig. 2)
utilizados para la comparación se observó que resisten la infección
por GFLV.
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Los resultados descritos anteriormente se
realizaron utilizando los siguientes materiales y
procedimientos.
Los cultivos de rizoma Couderc 3309
("3309C") (V. riparia x V. rupestris), Riparia Gloire
("Gloire") (V. riparia), Teleki 5C ("5C") (V.
berlandieri x V. riparia), MGT 101-14
("101-14") (V. riparia x V. rupestris)
y 110 Richter ("110R") (V. rupestris x V. berlandieri)
se utilizaron en los experimentos descritos anteriormente. Los
cultivos de callo se iniciaron en las anteras utilizando los
procedimientos de Rajasekaram y Mullins (J. Exp. Bot. 30:
399-407, 1979). Se recogieron capullos de flores de
3309C, 5C, 110R y 101-14 de una viña en la Estación
Experimental Geneva, Geneva, N.Y. Se recogieron cañas latentes
Gloire del mismo viñedo y se almacenaron en perlita húmeda en
bolsas de plástico a 4ºC. Dos a cinco secciones de nudos se
enraizaron en macetas con perlita en el invernadero; los capullos
florales se desarrollaron en cuatro semanas. Los capullos de las
flores se recogieron antes de la antesis de las vides cultivadas en
campo. Se recogieron los capullos de los racimos y se esterilizó la
superficie en EtOH al 70% durante uno a dos minutos. Los capullos se
transfirieron a hipoclorito sódico al 1% durante quince minutos, a
continuación se enjuagaron tres veces en agua destilada esterilizada
dos veces. Las anteras se separaron asépticamente de los capullos
de las flores utilizando a la vez un estereomicroscopio. Para
determinar qué estado era el más favorable para la producción del
callo, se machacó el polen en un microscopio bajo un cubreobjetos
con una gota de acetocarmina para observar el estado citológico
según procedimientos normalizados.
Se utilizaron cuatro medios sólidos diferentes
para producir embriones y regenerar las plantas.
Los cuatro medios utilizados son los siguientes.
(1) Medio de iniciación. Este medio era un medio MS corregido
(Murashige y Skoog, Physiol. Plant. 15:
473-497, 1962) y se denomina MSE (Mozsar y Sule,
Vitis 33: 245-245, 1994). (2) Medio de
diferenciación. Este medio se denomina medio HMG tal como describe
Mozsar y Sule (Vitis 33: 245-246, 1994); (3)
Medio de regeneración. Este medio se denomina medio MGC. Se compone
de sales de MS de intensidad completa corregidas con 20 g/l de
sacarosa, 4,6 g/l de glicerol, 1 g/l de hidrolizado de caseína y
agar-agar Noble al 0,8%; y (4) Medio de
enraizamiento. Este medio (pH 5,8) es un medio de planta leñosa
(Lloyd y McCown, Proc. Intl. Plant Prop. Soc. 30:
421-427, 1981) enriquecido con 0,1 mg/l de BA, 3
g/l de carbón activado y 1,5% de sacarosa.
Se aislaron anteras en condiciones estériles y
se colocaron en placas a una densidad de cuarenta a cincuenta
anteras por placa Petri de 9,0 cm de diámetro y se cultivaron a 28ºC
en la oscuridad. Se provocó callo en MSE. Después de sesenta 60
días, se produjeron embriones y a continuación se transfirieron a un
medio HMG para diferenciación exento de hormonas. Se transfirieron
embriones en etapa Torpedo desde el medio HMG a MGC para favorecer
la germinación del embrión. Se mantuvieron los cultivos en la
oscuridad entre 26 y 28ºC y se transfirieron a medio reciente a
intervalos de tres a cuatro semanas. Se transfirieron los
hipocótilos (embriones alargados) al medio de enraizamiento en
biberones (cinco a ocho embriones por biberón). Se cultivaron los
embriones a 25ºC con un fotoperiodo de dieciséis horas al día para
provocar la formación de yemas y raíces. Después del desarrollo de
la raíz las plantas se transplantaron al suelo y se colocaron en el
invernadero.
Los hipocótilos de embriones alargados que se
desarrollaron en medio HMG o MGC se cortaron en piezas de 3 a 4 mm
y se colocaron en medio MSE para favorecer el desarrollo de callos
embriogénicos secundarios. Los callos embriogénicos secundarios se
transfirieron a continuación a HMG para diferenciación y desarrollo
de nuevos hipocótilos. Estos hipocótilos secundarios del medio HMG
se transfirieron a continuación a medio MSE para obtener un tercer
ciclo de callos embriogénicos e hipocótilos. El cuarto y quinto
ciclos de callos embriogénicos se obtuvieron de manera similar.
Alternativamente, los callos embriogénicos que se desarrollan en las
anteras se propagaron en medio MSE para producir suficientes
embriones jóvenes para su transformación. Todos los cultivos de
embriones se transfirieron a intervalos de veinte a treinta días a
medio reciente para mantenimiento.
Se utilizaron tres montajes genéticos para
transformar genéticamente uvas en este estudio (Fig. 2). La cepa
C58Z707 de A. tumefaciens que contiene el plásmido binario
pGA482GG o pGA482G se utilizó para transformar las plantas de uvas
con CFLV-cp. El gen de la proteína de la cubierta de
un GFLV denominado cepa CF57 de "Geneva" NY se clonó y se
secuenció según procedimientos normalizados. La proteína de la
cubierta del nepovirus del arrepollado de la vid se produce por el
procedimiento después de la traducción de la poliproteína por la
proteinasa codificada por el virus. El gen de la proteína de la
cubierta, que está situado en la mitad 3' del genoma de RNA2, no
contiene un codón de iniciación ATG. Los cebadores
oligonucleotídicos que contienen la secuencia NcoI se utilizaron,
por consiguiente, para introducir el codón de iniciación traducible
en un montaje genético. Dos series de cebador diseñadas para
flanquear el gen de la proteína de la cubierta para la ampliación
por RCP se utilizaron según procedimientos normalizados. El
conjunto cebador (P2:
cgtcagTCTAGACCATGGTGAGAGGATTAGCTGGTAGAGGAG (SEC. ID. nº: 3)
y KSL95-10: ctgtaCCATGGTCTTTTAAAGTCAGATACC
(SEC. ID. nº: 4)) se utilizó para generar un montaje traducible.
Para modificar genéticamente un montaje no traducible transcrito,
los autores introdujeron un nucleótido (T) adicional sólo tres
nucleótidos corriente abajo del codón de iniciación (ATG) de la
traducción para construir una mutación con desplazamiento del
marco, así como para crear un codón de terminación. Esto se llevó a
cabo utilizando los cebadores KSL95-10 (SEC. ID. nº:
4) y KSL96-15
(acgttaCCATGGTGTAGAGGATTAGCTGGTAGA; SEC. ID. nº: 5).
Las letras de la casilla inferior (son secuencias sin sentido que se
utilizan para digestión de restricción eficaz. Las áreas subrayadas
son secuencias de restricción que se utilizan para una clonación
eficaz. Las letras en negrita representan el codón de terminación
que se utilizó para modificar genéticamente un montaje no
traducible transcrito). Los productos de RCP ampliados resultantes
se trataron con la enzima de restricción, NcoI, y se clonaron en el
vector de expresión pEPT8 de la planta. La orientación de la cadena
transcrita o complementaria se determinó utilizando cartografía de
restricción ordinaria y análisis por RCP haciendo uso del cebador
de posición específico para el activador 35S
(KSL96-12: agtgctCTCGAGCAATTGAGACTTTTCAACAA;
SEC. ID. nº: 6) y cebadores transgénicos. El casete de expresión que
contiene el transgén y los elementos de transcripción de la planta,
potenciadores 35S, activador 35S, secuencia no traducida 5' RNA4 del
virus del mosaico de la alfalfa y el terminador 35S se clonaron
posteriormente en el vector pGA482G de transformación de la
planta.
Se modificaron los protocolos de transformación
a partir de los descritos por Scorza y Cordts, (Plant Cell
Rep. 14: 589-592, 1995; Krastanova et
al., Plant Cell Rep. 24: 550-554, 1995).
Los cultivos de toda la noche de la cepa C58Z707 de
Agrobacterium se cultivaron en medio LB a 28ºC en una
incubadora con agitación. Las bacterias se centrifugaron durante
cinco minutos a 5.000 rpm (o 3.000 rpm) y se volvieron a poner en
suspensión en medio líquido MS (DO_{600} =
0,4-1,0). El callo con embriones con forma globular
o de corazón se sumergió en la suspensión bacteriana durante quince
a treinta minutos, se coaguló en seco y se transfirió al medio HMG
con o sin acetosiringona (100 \muM). Los callos embriogénicos se
cultivaron conjuntamente con las bacterias durante cuarenta y ocho
horas en la oscuridad a 28ºC. A continuación, el material vegetal se
lavó en líquido MS más cefotaxima (300 mg/ml) y carbenicilina (200
mg/ml) dos a tres veces. El material se transfirió a continuación a
medio HMG que contenía 20 ó 40 mg/l de kanamicina, 300 mg/l de
cefotaxima, y 200 mg/l de carbenicilina para seleccionar embriones
transgénicos. Alternativamente, después de cuarenta y ocho horas de
cultivo conjunto con Agrobacterium, los callos embriogénicos
se transfirieron al inicio del medio MSE que contenía 25 mg/l de
kanamicina más los mismos antibióticos enumerados anteriormente.
Todo el material vegetal se incubó en continuo en la oscuridad a
28ºC. Tras el cultivo en el medio de selección durante tres meses,
los embriones se transfirieron a HMG o MGC sin kanamicina para el
desarrollo de los hipocótilos. Los embriones se transfirieron a
continuación a medio de enraizamiento con antibióticos. Los callos
no transformados se cultivaron en el mismo medio con o sin
kanamicina para comprobar la eficacia de la selección de kanamicina
y la capacidad de la planta para regenerarse en presencia del
antibiótico.
Se analizaron las plantas transgénicas
utilizando análisis GUS de análisis normalizados (Jefferson,
Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405, 1987),
ELISA para la detección de NPTII (Cabanes-Bastos et
al., Gene 77: 69-176, 1989), ELISA para la
detección de cp (Clark et al., J. Gen. Virol. 34:
475-483), y RCP y análisis Southern (Ausubel et
al., más adelante).
Algunas cepas de nepovirus de uva (por ejemplo,
GFLV) pueden servir como fuente de ácido nucleico para la clonación
molecular de un gen de la proteína de la cubierta (CP) del nepovirus
de uva. Por ejemplo, el aislamiento de un gen
GFLV-CP conlleva el aislamiento de las secuencias de
ADN que codifican una proteína que presenta estructuras,
propiedades o actividades asociadas a CP. Basándose en las
secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de
GFLV-CP descritas en la presente memoria (Fig. 1;
SEC. ID. nº: 1 y nº: 2), el aislamiento de secuencias de
codificación adicionales de GFLV-CP se hace posible
utilizando estrategias y técnicas habituales que son muy conocidas
en la materia.
En un ejemplo específico, pueden utilizarse las
secuencias de GFLV-CP descritas en la presente
memoria, junto con procedimientos de identificación por hibridación
de ácido nucleico. Dichas técnicas de hibridación y procedimientos
de identificación son muy conocidos por los expertos en la materia y
están descritos, por ejemplo, en Benton y Davis, Science
196: 180, 1977; Grunstein y Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA 72: 3961, 1975; Ausubel et al. (supra); Berger y
Kimmel (supra); y Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Nueva York. En un ejemplo específico, toda o parte de la
secuencia nucleotídica de la cepa "Geneva" (descrita en la
presente memoria) puede utilizarse como sonda para identificar un
banco de ADN de GFLV recombinante para los genes con identidad de
secuencia con el gen de la proteína de la cubierta de la cepa
"Geneva". Las secuencias de hibridación se detectan por
hibridación de placas o colonias según procedimientos normalizados,
por ejemplo los descritos a continuación.
Alternativamente, utilizando toda o una parte de
la secuencia de aminoácidos del gen de la proteína de la cubierta
de la cepa "Geneva" se puede diseñar fácilmente sondas
oligonucleotídicas específicas para GFLV-CP
incluyendo sondas oligonucleotídicas degeneradas de
GFLV-CP (es decir, una mezcla de todas las posibles
secuencias de codificación para una secuencia de aminoácidos dada).
Estos oligonucleótidos pueden basarse en la secuencia de una de las
dos cadenas del ADN y cualquier porción apropiada de la secuencia de
GFLV-CP (Fig. 1; SEC. ID. nº: 1 y nº: 2). Los
procedimientos generales para diseñar y preparar dichas sondas se
proporcionan, por ejemplo, en Ausubel et al., 1996,
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience,
Nueva York, y Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning
Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York. Estos
oligonucleótidos son útiles para el aislamiento del gen
GFLV-CP, ya sea mediante su utilización como sondas
capaces de hibridar a las secuencias complementarias de
GFLV-CP o como cebadores para varias técnicas de
ampliación, por ejemplo, estrategia de clonación de la reacción en
cadena de la polimerasa (RCP). Si se desea, puede utilizarse una
combinación de diferentes sondas oligonucleotídicas para el cribado
de un banco de ADN recombinante. Los oligonucleótidos pueden
marcarse de forma detectable utilizando los procedimientos conocidos
en la materia y utilizarse para sondar réplicas en filtro de un
banco de ADN recombinante. Los bancos de ADN recombinante se
preparan según los procedimientos bien conocidos en la técnica, por
ejemplo, tal como se describe en Ausubel et al.,
(supra), o pueden adquirirse en los proveedores
comerciales.
Otras fuentes de secuencias de
GFLV-CP incluyen las descritas en Brandt et
al., Arch. Virol. 140: 157-164, 1995;
Margis et al., J. Gen. Virol. 74: 1919-1926,
1993; Fuchs et al., J. Gen Virol.
955-962, 1989; Serghini et al., J. Gen.
Virol. 71: 1433-1441, 1990; Bardonnet et
al., Plant Cell Rep. 13: 357-360, 1994;
Krastanova et al., Plant Cell Rep. 14:
550-554, 1995; Ritzenthaler et al., J.
Gen. Virol. 72: 2357-2365, 1991; Mauro et
al., Plant Science: 112: 97-106, 1995; y
Sanchez et al., Nucleic. Acids. Res. 9: 5440, 1992.
Una vez se identifica la secuencia de GFLV-CP se
clona según procedimientos normalizados y se utiliza para la
construcción de vectores de expresión vegetales tal como se
describe en la presente memoria.
Aún más preferentemente, una proteína de la
cubierta del nepovirus de la uva (por ejemplo, una
GFLV-CP) se expresa como ARNm transcrito de cadena
transcrita traducible mediante una estirpe celular de uva
transfectada establemente o mediante una vid o componente de la vid
transgénico. Numerosos vectores adecuados para la transfección
estable o extracromosómica de las células vegetales, o para el
establecimiento de plantas transgénicas están disponibles al
público; dichos vectores se describen en Weissbach y Weissbach
(Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989)
y Gelvin et al. (Plant Molecular Biology Manual,
Kluwer, Academic Publishers, 1990). Los procedimientos para
construir dichas estirpes celulares están descritos, por ejemplo,
en Weissbach y Weissbach (supra), y Gelvin et al.
(supra). Ejemplos de vectores útiles para la expresión de
trasngenes en vides están también descritos en Scorza et al.
(Plant Cell Rep. 14: 589-592, 1995),
Baribault et al. (J. Expt. Bot. 41:
1045-1049, 1990), Mullins et al.
(BioTechnology 8: 1041-1045, 1990), Nakano
et al. (J. Expt. Bot. 45: 649-656,
1994), Kikkert et al. (Plant. Cell Rep. 15:
311-316, 1995), Krastanova et al. (Plant
Cell Rep. 1: 550-554, 1995), Scorza et
al. (Plant Cell Rep. 14: 589-592, 1994),
Scorza et al. (J. Amer. Soc. Hort. Sci. 121:
616-619, 1996), Martinelli et al. (Theor.
Appl. Genet. 88: 621-628, 1994), y Legall et
al. (Plant Sci. 102. 161-170, 1994).
Por lo general, los vectores de expresión
vegetales incluyen (1) un gen clonado (por ejemplo, una molécula de
ácido nucleico que expresa un transcrito traducible) bajo el control
de transcripción de las secuencias de control de expresión 5' y 3'
y (2) un marcador dominante seleccionable. Dichos vectores de
expresión vegetales pueden contener además, si se desea, una zona
activadora reguladora (por ejemplo, la que confiere expresión
inducible o constitutiva, inducida por el patógeno o la herida,
regulada por el medio o por el desarrollo, o específica para la
célula o el tejido), una zona de partida de iniciación a la
transcripción, una zona de fijación al ribosoma, una señal de
tratamiento del ARN, una zona de terminación de la transcripción y/o
una señal de poliadenilación.
Una vez se obtiene la molécula de ácido nucleico
de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva deseada como
se describió anteriormente, puede manipularse de varias maneras
conocidas en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ADN de
GFLV-CP de la invención, si se desea, puede
combinarse con otras secuencias de ADN de varias maneras. La
secuencia de ADN de GFLV-CP puede emplearse con toda
o parte de las secuencias génicas normalmente asociadas a la
GFLV-CP. En sus partes del componente, una secuencia
de ADN que codifica una GFLV-CP se combina en un
montaje de ADN que tiene una zona de control de iniciación de la
transcripción capaz de favorecer la transcripción en una célula
hospedadora de la vid.
En general, los montajes conllevarán zonas
reguladoras funcionales en plantas que proporcionan la producción
modificada de una GFLV-CP como se expone en la
presente memoria. Por ejemplo, la secuencia transcrita no traducible
para una GFLV-CP o un fragmento de la misma estará
unida en su extremo 5' a una zona reguladora de iniciación de la
traducción, por ejemplo, tal como una secuencia hallada en la
naturaleza en la zona corriente arriba de 5' de un gen estructural
de la planta. Numerosas zonas de iniciación de la transcripción
están disponibles las cuales proporcionan regulación constitutiva o
inducible.
Para las aplicaciones en las que se desea
expresión de desarrollo, de la célula, del tejido, hormonal o
ambiental, se obtienen zonas no codificadoras corriente arriba de
5' apropiadas de otros genes, por ejemplo, de genes regulados
durante el desarrollo del meristemo, el desarrollo de la semilla, el
desarrollo del embrión, el desarrollo de la hoja, el desarrollo del
tronco o el desarrollo del zarcillo.
Pueden suministrarse además zonas reguladoras de
terminación del transcrito también en montajes de ADN de la
presente invención. Las zonas de terminación del transcrito pueden
ser suministradas por la secuencia de ADN que codifica la
GFLV-CP o cualquier zona de terminación de la
transcripción conveniente procedente de una fuente de genes
diferente (por ejemplo, los terminadores NOS o 35S CaMV). La zona de
terminación del transcrito contendrá preferentemente por lo menos 1
a 3 kb de la secuencia 3' para el gen estructural del que procede
la zona de terminación. Los montajes de expresión de la planta que
tienen GFLV-CP como secuencia de interés del ADN
para la expresión (en la producción de orientación traducible
transcrita de ARNm) pueden emplearse con una extensa variedad de
vides. Dichas plantas modificadas genéticamente son útiles para una
variedad de aplicaciones industriales y agrícolas.
Significativamente, la presente invención es aplicable a todas las
vides o componentes de la vid, y será fácilmente aplicable a
cualquiera de los nuevos o mejorados procedimientos de
transformación o regeneración de la uva.
Los montajes de expresión incluyen al menos un
activador operablemente unido a por lo menos una secuencia
transcrita de GFLV-CP traducible. Un ejemplo de
activador vegetal útil según la invención es un activador de
caulimovirus, por ejemplo, un activador del virus del mosaico de la
coliflor (CaMV). Estos activadores confieren altos niveles de
expresión en la mayoría de los tejidos vegetales, y la actividad de
estos activadores no depende de proteínas codificadas por virus. El
CaMV es una fuente tanto para los activadores 35S como 19S. En la
mayoría de los tejidos de las plantas transgénicas, el activador 35S
de CaMV es un activador potente (véase, por ejemplo, Odell et
al., Nature 313: 810, 1985). El activador CaMV es también muy
activo en monocotiledóneas (véase, por ejemplo, Dekeyser et al.,
Plant Cell 2: 591, 1990; Terada y Shimamoto, Mol. Gen.
Genet. 220: 389, 1990). Además, la actividad de este activador
puede aumentarse más ( es decir, entre 2 a 10 veces) por
duplicación del activador 35S de CaMV (véase, por ejemplo, Kay et
al., Science 236: 1299, 1987; Ow et al., Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 84: 4870, 1987; y Fang et al., Plant Cell 1:
141, 1989, y McPherson y Kay, patente US nº 5.378.142).
Otros activadores vegetales útiles incluyen, sin
limitación, el activador de síntesis de nopalina (NOS) (An et
al., Plant Physiol. 88: 547, 1988), el activador de síntesis de
octopina (Fromm et al., Plant Cell 1: 977, 1989), el
activador de la actina del arroz (Wu y McElroy, documento WO
91/09948), el activador de ciclasa (Chappell et al.,
documento WO 96/36697), y el activador del virus del mosaico de la
fibra de mandioca (Verdaguer et al., Plant Mol. Biol. 31:
1129-1139, 1996). Todavía otros activadores
ilustrativos útiles en la invención incluyen, sin limitación, el
activador del virus amarillo moteado de las commelinas, el
activador del virus baciliforme del tungro del arroz, elemento del
virus de la raya del maíz y el activador del virus del trigo
enano.
Para determinadas aplicaciones, puede ser
deseable producir la secuencia de GFLV-CP en un
tejido apropiado, a un nivel apropiado, o en un tiempo de
desarrollo apropiado. Con este objeto, existe una variedad de
activadores génicos, cada uno con sus distintas características
propias incorporadas en sus secuencias reguladoras, que se ha
demostrado que están reguladas en respuesta a señales inducibles
tales como las indicaciones del medio, hormonales y/o de
desarrollo. Éstas incluyen, sin limitación, activadores génicos que
son responsables de la expresión génica regulada térmicamente
(véase, por ejemplo, Callis et al., Plant Physiol. 88: 965,
1988; Takahashi y Komeda, Mol. Gen. Genet. 219: 365, 1989; y
Takahashi et al., Plant. J. 2: 751, 1992), de la expresión
génica regulada por la luz (por ejemplo, el
rbcS-3A del guisante descrito por Kuhlemeier
et al., Plant Cell 1: 471, 1989; el activador rbcS del
maíz descrito por Schäffner y Sheen, Plant Cell 3: 997,
1991; el gen de la proteína de unión a la clorofila a/b hallado en
el guisante descrito por Simpson et al., EMBO J. 4:
2723, 1985; el activador Arabssu; o el activador rbs del arroz), de
la expresión génica regulada por hormonas (por ejemplo, las
secuencias responsables del ácido abscísico (ABA) del gen Em
del trigo descrito por Marcotte et al., Plant Cell 1: 969,
1989; los activadores HVA1 y HVA22 inducibles por ABA, y rd29A
descritos para la cebada y Arabidopsis por Straub et al.,
Plant Cell 6: 617, 1994 y Shen et al., Plant Cell 7:
295, 1985; y la expresión génica inducida por heridas (por ejemplo,
de wunl descrito por Siebertz et al., Plant Cell 1:
961, 1989), la expresión génica específica para el órgano (por
ejemplo, del gen de la proteína de almacenamiento específico del
tubérculo descrita por Roshal et al., EMBO J. 6: 1155, 1987;
el gen de zeína de 23 kDa del maíz descrito por Schernthaner et
al., EMBO J. 7: 1249, 1988; o el gen de
\beta-faseolina de la alubia francesa descrito por
Bustos et al., Plant Cell 1: 839, 1989), o los activadores
inducibles por patógenos (por ejemplo, los activadores
PR-1, prp-1, o
\beta-1,3 glucanasa, el activador wirla del trigo
inducible por hongos y los activadores inducibles por nematodos,
TobRB7-5A y Hmg-1, del tabaco y del
perejil, respectivamente).
Los vectores de expresión vegetales pueden
incluir además opcionalmente señales de tratamiento del ARN, por
ejemplo, intrones, que se ha demostrado que son importantes para la
síntesis y acumulación eficaz del ARN (Callis et al., Genes and
Dev. 1: 1183, 1987). La posición de las secuencias de corte y
empalme del ARN pueden influir drásticamente en el nivel de
expresión transgénica en vegetales. En vista de este hecho, un
intrón puede colocarse corriente arriba o corriente debajo de la
secuencia de la GFLV-CP en el transgén para modular
los niveles de expresión génica.
Además de las secuencias reguladoras de control
de 5' mencionadas anteriormente, los vectores de expresión pueden
además incluir zonas de control reguladoras que están generalmente
presentes en las zonas 3' de los genes vegetales (Thornburg et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 744, 1987; An et
al., Plant Cell 1: 115, 1989). Por ejemplo, la zona del
terminador en 3' puede incluirse en el vector de expresión para
aumentar la estabilidad del ARNm. Dicha zona del terminador puede
proceder de la zona del terminador PI-II de la
patata. Además, otros terminadores normalmente utilizados proceden
de las señales de la octopina o nopalina sintasa.
El vector de expresión vegetal también contiene
por lo general un gen marcador dominante seleccionable utilizado
para identificar las células que han llegado a transformase. Los
genes seleccionables útiles para los sistemas vegetales incluyen
genes que codifican los genes con resistencia a antibióticos, por
ejemplo, los que codifican resistencia a la higromicina,
kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina o espectinomicina. Los
genes requeridos para la fotosíntesis pueden utilizarse también
como marcadores seleccionables en cepas fotosintéticas deficientes.
Por último, los genes que codifican la resistencia a herbicidas
pueden utilizarse como marcadores seleccionables; genes útiles con
resistencia a herbicidas incluyen el gen bar que codifica la
enzima fosfinotricina-acetiltransferasa y que
proporcionan resistencia al herbicida BASTA® de amplio espectro
(Hoechst AG; Frankfurt, Alemania).
Además, si se desea, el montaje de expresión
vegetal puede contener una secuencia de GFLV-CP
modificada o totalmente sintética que se ha cambiado para aumentar
el rendimiento del gen en las plantas.
Sería fácilmente evidente para un experto en la
materia de biología molecular, especialmente en el campo de la
biología molecular vegetal, que el nivel de la expresión génica
dependa, no solamente de la combinación de activadores, de las
señales del tratamiento del ARN y de los elementos terminadores,
sino también de cómo estos elementos se utilizan para aumentar los
niveles de expresión génica del marcador seleccionable.
En la construcción del vector de expresión
vegetal, varios procedimientos normalizados están disponibles para
la introducción del vector en un hospedador vegetal, generando de
este modo una planta transgénica. Estos procedimientos incluyen (1)
la transformación mediada por Agrobacterium (A.
tumefaciens o A. rhizogenes) (véase, por ejemplo,
Lichtenstein y Fuller en: Geneteic Engineering, vol. 6, PWJ
Rigby, ed., Londres, Academic Press, 1987; y Lichtenstein, C.P. y
Draper, J., en: DNA Cloning, Vol. II, D.M. Glover, ed.,
Oxford, IRI Press, 1985)), (2) el sistema de suministro de
partículas (véase, por ejemplo, Gordon-Kamm et
al., Plant Cell 2: 603 (1990); o Sanford et al. patente
US nº 4.945.050, nº 5.036.006 y nº 5.100.792), (3) protocolos de
microinyección (véase, por ejemplo, Green et al.,
supra), (4) procedimientos de polietilenglicol (PEG) (véase,
por ejemplo, Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:
451, 1982; o por ejemplo, Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet.
76: 835, 1988), (5) absorción de ADN mediada por liposomas (véase,
por ejemplo, Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25:
1353, 1984), (6) protocolos de electroporación (véase, por ejemplo,
Gelvin et al., anteriormente; Dekeyser et al.,
supra; Fromm et al., Nature 319: 791, 1986;
Sheen Plant Cell 2: 1027, 1990; o Jang y Sheen Plant
Cell 6: 1665, 1994), y (7) el procedimiento de generación de
torbellinos (véase, por ejemplo, Kindle supra). El
procedimiento de transformación no es crítico para la invención.
Puede emplearse cualquier procedimiento que proporcione
transformación eficaz. Algunos métodos a título de ejemplo para
transformar uvas se encuentran en Scorza et al. (Plant
Cell Reports 14: 589-592, 1995), Baribault
et al. (J. Expt. Bot. 41: 1045-1049,
1990), Mullins et al. (BioTechnology 8:
1041-1045, 1990), Nakano et al. (J. Expt.
Bot. 45: 649-656, 1994), Kikkert et al.
(Plant Cell Rep. 15: 311-316, 1995), Krastanova
et al. (Plant Cell Rep. 1: 550-554, 1995),
Scorza et al. (Plant Cell Rep. 14: 589-592,
1994), Scorza et al. (J. Amer. Soc. Hort. Sci. 121:
616-619, 1996), Martinelli et al. (Theor. Appl.
Genet. 88: 621-628, 1994), y Legall et al.
(Plant Sci. 102. 161-170, 1994). Ya que
procedimientos más recientes están disponibles para transformar los
cultivos u otras células hospedadoras, también pueden aplicarse
directamente.
Las plantas para su utilización en la puesta en
práctica de la invención son vides (por ejemplo, Vitis spp.,
híbridos de Vitis spp. y todos los miembros de los subgéneros
Euvitis y Muscadinia), incluyendo cultivos en esqueje
o de rizomas. A título de ejemplo, los cultivos en esqueje incluyen,
sin limitación, los que se denominan uvas de mesa o pasas y las
utilizadas en la producción de vino tales como Cabernet Franc,
Cabernet Sauvignon, Chardonnay (por ejemplo, CH 01, CH 02, CH
Dijon), Merlot, Pinot Noir (PN, PN Dijon), Semillon, White
Riesling, Lambrusco, Thompson Seedless, Autumn Seedless, Niagrara
Seedless y Seval Blanc. Otros cultivos en esqueje que pueden
utilizarse incluyen los denominados comúnmente como uvas de mesa o
pasas, tales como Alden, Almeria,
Anab-E-Shahi, Autumn Black, Beauty
Seedless, Black Corinth, Black Damascus, Black Malvoisie, Black
Prince, Blackrose, Bronx Seedless, Burgrave, Calmeria, Campbell
Early, Canner, Cardinal, Catawba, Christmas, Concord, Dattier,
Delight, Diamond, Dizmar, Duchess, Early Muscat, Emerald Seedless,
Emperor, Exotic, Ferdinand de Lesseps, Fiesta, Flame seedless, Fame
Tokay, Gasconade, Gold, Himrod, Hunisa, Hussiene, Isabella, Italia,
July Muscat, Khandahar, Katta, Kourgane, Kishmishi, Loose Perlette,
Málaga, Monukka, Muscat of Alexandria, Muscat Flame, Muscat
Hamburg, New York Muscat, Niabell, Niagara, Olivette blanche,
Ontario, Pierce, Queen, Red Malaga, Ribier, Rish Baba, Romulus,
Ruby Seedless, Schuyler, Seneca, Suavis (IP 365), Thompson seedless
y Thomuscat. También incluyen las utilizadas en la producción de
vino, tales como Aleatico, Alicante Bouschet, Aligote, Alvarelhao,
Aramon, Baco blanc (22A), Burger, Cabernet franc, Cabernet,
Sauvignon, Calzin, Carignane, Charbono, Chardonnay, Chasselas dore,
Chenin blanc, Clairette blanche, Early Burgundy, Emerald Riesling,
Feher Szagos, Fernao Pires, Flora, French Colombard, Fresia,
Furmint, Gamay, Gewurztraminer, Grand noir, Gray Riesling, Green
Hungarian, Green Veltliner, Grenache, Grillo, Helena, Inzolia,
Lagrein, Lambrusco de Salamino, Malbec, Malvasia bianca, Mataro,
Melon, Merlot, Meunier, Mission, Montua de Pilas, Muscadelle du
Bordelais, Muscat blanc, Muscat Ottonel, Muscat
Saint-Vallier, Nebbiolo, Nebbiolo fino, Nebbiolo
Lampia, Orange Muscat, Palomino, Pedro Ximenes, Petit Bouschet,
Petite Sirah, Peverella, Pinot noir, Pinot
Saint-George, Primitivo di Gioa, Red Veltliner,
Refosco, Rkatsiteli, Royalty, Rubired, Ruby Cabernet,
Saint-Emilion, Saint Macaire, Salvador, Sangiovese,
Sauvignon blanc, Sauvignon gris, Sauvignon vert, Scarlet, Seibel
5279, Seibel 9110, Seibel 13053, Semillon, Servant, Shiraz, Souzao,
Sultana Crimson, Sylvaner, Tannat, Teroldico, Tinta Madeira, Tinto
cao, Touriga, Traminer, Trebbiano Toscano, Trousseau, Valdepeñas,
Viognier, Walschriesling, White Riesling y Zinfandel.
Los cultivos en rizoma que son útiles en la
invención incluyen, sin limitación, Vitis rupestris
Constantia, Vitis rupestris St. George, Vitis california,
Vitis girdiana, Vitis rotundifolia, Vitis rotundifolia Carlos,
Richter 110 (Vitis berlandieri x rupestris),
101-14 Millarder et de Grasset (Vitis riparia x
rupestris), Teleki 5C (Vitis berlandieri x riparia), 3309
Couderc (Vitis riparia x rupestris), Riparia Gloire de
Montpellier (Vitis riparia), 5BB Teleki (selection Kober,
Vitis berlandieri x riparia), SO_{4} (Vitis berlandieri
x rupestris), 41B Millardet (Vitis vinifera x
berlandieri) y 039-16 (Vitis vinifera x
Muscadinia). Los cultivos en rizoma adicionales que pueden
utilizarse incluyen Couderc 1202, Couderc 1613, Couderc 1616,
Couderc 3309, Dog Ridge, Foex 33EM, Freedom, Ganzin 1 (A x R nº 1),
Harmony, Kober 5BB, LN33, Millardet & de Grasset 41B, Millardet
& de Grasset 420A, Millardet & de Grasset
101-14, Oppenheim 4 (SO4), Paulsen 775, Paulsen
1045, Paulsen 1103, Richter 99, Richter 110, Riparia Gloire, Ruggeri
225, Saint-George, Salt Creek, Teleki 5A, Vitis
rupestris Constantia, Vitis california y Vitis
girdiana.
En general, la transferencia y la expresión de
transgenes en células vegetales, incluyendo las plantas de la uva,
son actualmente prácticas rutinarias para los expertos en la
materia, y se han convertido en herramientas principales para
realizar los estudios de expresión génica en plantas y para producir
variedades mejoradas de plantas de interés agrícola o
comercial.
Células vegetales transformadas con un vector de
expresión vegetal pueden regenerarse, por ejemplo, a partir de
células aisladas, tejido calloso o discos foliares según las
técnicas habituales de cultivo de tejido vegetal. Es bien conocido
en la técnica que varias células, tejidos y órganos procedentes de
casi cualquier planta pueden cultivarse con éxito para regenerar
una planta entera; dichas técnicas están descritas, por ejemplo, en
Vasil supra; Green et al., supra; Weissbach y
Weissbach, supra; y Gelvin et al., supra.
En un ejemplo particular, una secuencia de
GFLV-CP no traducible transcrita clonada como
ejemplo comparativo o montaje traducible transcrito (por ejemplo,
una secuencia de GFLV-CP en la orientación
transcrita que tiene un ATG fuera del marco de lectura incluyendo
un codón de terminación después del codón de iniciación) bajo el
control del activador 35S de CaMV y del terminador de
nopalina-sintasa y que lleva un marcador
seleccionable (por ejemplo, resistencia a la kanamicina) se
transforma en Agrobacterium. La transformación de la vid con
Agrobacterium que contiene el vector se lleva a cabo tal como
describen Scorza y Cordts. Se seleccionan supuestos transformados
después de unas pocas semanas en el medio de cultivo tisular vegetal
que contiene kanamicina. El material de la planta resistente a la
kanamicina se coloca a continuación en el medio de cultivo tisular
vegetal sin hormonas para el inicio de la raíz.
Las plantas transgénicas que expresan el
marcador seleccionable se criban a continuación para la transmisión
del ADN transgénico por técnicas de detección habituales como se
describió anteriormente. Cada planta transgénica positiva y su
progenie transgénica son únicas en comparación con otras plantas
transgénicas creadas con el mismo transgén. La integración del ADN
transgénico en el ADN genómico de la planta es en la mayoría de los
casos aleatoria, y el punto de integración puede afectar
profundamente los niveles y el tejido y los patrones de desarrollo
de la expresión transgénica. En consecuencia, para identificar y
seleccionar las plantas con los perfiles de expresión más
apropiados se criban habitualmente numerosas estirpes transgénicas
para cada transgén.
Se evalúan en las estirpes transgénicas los
niveles de expresión transgénica. Las vides transformadas que
expresan una secuencia de GFLV-CP no traducible
transcrita que tienen resistencia al arrepollado en comparación con
las plantas de referencia se considera que son útiles en la
invención.
<110> Cornell Research Foundation,
Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> RESISTENCIA AL NEPOVIRUS EN
VIDES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 07678/023WO2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/060.384
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-09-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1542
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gen de la proteína de la cubierta
del virus del arrepollado de la vid
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7) ... (1518)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 504
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gen de la proteína de la cubierta
del virus del arrepollado de la vid
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtcagtcta gaccatggtg agaggattag ctggtagagg ag
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtaccatg gtcttttaaa gtcagatacc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgttaccat ggtgtagagg attagctggt aga
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgctctcg agcaattgag acttttcaac aa
\hfill32
Claims (9)
1. Procedimiento para seleccionar y producir una
vid o componente de la vid transgénicos con aumento de resistencia
a la enfermedad de arrepollado en comparación con una vid o un
componente de la vid transgénicos, comprendiendo dicho
procedimiento:
- (a)
- transformar una célula vegetal de uva con una molécula de ácido nucleico de la proteína de la cubierta del nepovirus de la uva o fragmento de la misma que es capaz de expresarse en una orientación de sentido en dicha célula vegetal;
- (b)
- regenerar una vid o componente de la vid transgénicos a partir de la célula vegetal; y
- (c)
- seleccionar una vid o componente de la vid transgénicos basándose en su expresión de dicha molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma en el que dicha molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma expresa una proteína de la cubierta de nepovirus de la uva o fragmento de la misma y es negativa para la expresión de dicha proteína de la cubierta de nepovirus de la uva o fragmento de la misma tal como se detectó por inmunoanálisis con enzima ligada y en el que dicha expresión aumenta la resistencia a dicho arrepollado de la vid o un componente de la vid transgénicos en comparación con una vid o componente de la vid no transgénicos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha molécula de ácido nucleico o fragmento de la misma
está codificada por un transgén integrado en un genoma de vid
transgénica.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha vid es un miembro del género Vitis.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho componente de la vid es un embrión somático.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho componente de la vid es un esqueje.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho componente de la vid es un cultivo de rizoma.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que dicho cultivo de rizoma se selecciona de entre el grupo
constituido por Vitis rupestris St. George, Vitis
california, Vitis girdiana, Vitis rotundifolia,
Vitis rotundifolia Carlos, Richter 110 (Vitis berlandieri
x rupestris), 101-14 Millarder et de Grasset
(Vitis riparia x rupestris), Teleki 5C (Vitis berlandieri
x riparia), 3309 Courderc (Vitis riparia x rupestris),
Riparia Gloire de Montpellier (Vitis riparia), 5BB Teleki
(selección Kober, Vitis berlandieri x riparia), SO_{4}
(Vitis berlandieri x rupestris), 41B Millardet (Vitis
vinifera x berlandieri), y 039-16 (Vitis
vinífera x Muscadinia).
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha molécula de ácido nucleico de la proteína de la
cubierta del nepovirus de la uva procede de un virus del
arrepollado de la vid.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que comprende además una molécula de ácido nucleico de la
proteína de la cubierta del nepovirus de la uva o un fragmento de
la misma que presenta aproximadamente el 50% o más de identidad de
secuencia con la SEC. ID. nº: 1.
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