WO2007029854A1 - 催涙成分生成酵素阻害剤 - Google Patents

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Nobuaki Tsuge
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House Foods Corporation
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    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present inventors also made PeCSO present in onions and the like in the presence of the enzyme aliinase. Elucidated the structure of the lacrimase-forming enzyme, which has the action of generating the lacrimatory component from (Patent Document 2).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-0 2 9 5 3 7 3 • Patent Document 2 International Publication No. 0 2 Z 2 0 8 0 8 Pamphlet
  • Non-Patent Document 1 J. Agr. Food Chem. 42, 2085, 1994
  • Non-Patent Document 2 J. Amer. Soc Hort. Sc i. 120, 1075, 1995
  • lacrimogenic component-producing enzyme various natural enzymes and their genes have been studied, but the enzyme mutants and the characteristics of the genes have not been studied.
  • Figure 1 shows the LFS activity measurement results for the 69th Cys converted to Ser and the 71st Arg converted to Leu.
  • Figure 2 shows the results of confirming the protein composition by SDS-PAGE.
  • a band corresponding to the GST fusion protein A of LFS was observed (arrow on the left).
  • Fig. 4 shows the construction method of pHOUSE-i3 ⁇ 4 vector.
  • Fig. 5 shows the construction method of pHOUSE-J23 ⁇ 4 mutant- ⁇ -5ER.
  • Enzymatic enzyme acts on the precursor Pe CSO (Sl-propenyl-cysteine sulfoxide) to form sulfenic acid (( ⁇ -1-propensulfenic acid). It produces a tearing component LF (Lachrymatory Factor) when it is converted into a tearing component LF (ie, aroma component) or another flavor component depending on the action of the enzyme.
  • Pe CSO Sl-propenyl-cysteine sulfoxide
  • sulfenic acid ( ⁇ -1-propensulfenic acid). It produces a tearing component LF (Lachrymatory Factor) when it is converted into a tearing component LF (ie, aroma component) or another flavor component depending on the action of the enzyme.
  • LFS Lactrymatory Factor Synthase
  • mutants were prepared and experiments were conducted to measure LFS activity.
  • the mutant can be prepared, for example, by using GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System commercially available from Invitrogen for the natural LFS gene. Specifically, mutagenesis can be performed as follows using the above gene tailor.
  • an inactivated LFS mutant that lacks LFS activity due to the introduction of a mutation at the active center but retains the affinity for the LFS substrate can be used as an LFS inhibitor.
  • LFS inhibitors include the following LFS variants: (1) A mutant of natural LFS represented by SEQ ID NO: 1, wherein at least the 71st arginine is replaced with another amino acid, or the region containing the 71st arginine is deleted. An LFS mutant having a mutation, preferably an LFS mutant in which the 71st arginine is replaced with leucine is included. (2) A mutant of the natural LFS represented by SEQ ID NO: 1, which has a mutation that deletes at least the region containing glutamic acid at position ⁇ , which has the ability to replace glutamic acid at position 88 with another amino acid. A modified LFS mutant, preferably an LFS mutant in which glutamic acid at position 88 is substituted with glutamine is included.
  • LFS mutant in which the amino acid region from 109th to 114th B of natural LFS represented by SEQ ID NO: 1 was deleted, and the 109th, 112th, 114th amino acid were replaced. More specifically, LFS mutant S in which Thr at 109th No. 5 is converted to Ala, Glu at 112th to Gin, and Tyr at 114th to Phe is included.
  • all of the above mutants can be substituted with amino acids at other positions as long as the mutant can inhibit LFS activity.
  • Z or deletions may be included.
  • SEQ ID NO: 1 in addition to the mutation of amino acid No. 71 and amino acid Z or 88, a mutation that replaces amino acid No. 94 from aspartic acid to asparagine, or from the first to the eighth Deletion of amino acids. More specifically, in SEQ ID NO: 1, there is a mutant having a mutation in which the 88th amino acid is substituted from glutamic acid to glutamine and the 94th amino acid is substituted from aspartic acid to asparagine.
  • a gene encoding an LFS variant can be recombined into an expression vector and expressed in an appropriate host, and the LFS variant can be recovered.
  • a well-known expression vector can be used for each host.
  • PGEX-4T-3 manufactured by Amersham Biosciences
  • GST dartathione S transferase
  • a method for introducing a vector into a host well-known methods can be used. For example, various methods such as a competent cell method, a protoplast method, a calcium phosphate coprecipitation method, an electo-poration method, a microinjection method, a liposome fusion method, etc. These are exemplified, but any method can be adopted depending on the host to be used.
  • the produced inhibitor is produced as a fusion protein with a well-known tag, for example, a fusion protein with GST, it can be purified with glutathione sepharose or the like.
  • the LFS inhibitor containing the produced LFS variant as an active ingredient can be used as a drug that suppresses tearing in the field of food production.
  • an LFS inhibitor can be dissolved in an appropriate edible solvent and sprayed on a food production site where onion is broken or the like, thereby preventing tearing of workers on the site.
  • the particle gun method for example, PDS 1000 helium particle gun
  • an agro-actuary method can be used.
  • Gene transfer target Gene transfer can be performed in culture systems, calli, embryos, growth points, etc.
  • the immature embryos from the seeds can be left to stand at 4 ° C and then subjected to transformation without pre-culture. After vortexing with agrobacterium solution, cleave and decompress, transfer to P5 medium, co-culture for 6 days, and select transformants with P5 medium (contains screening reagents such as geneticin and timentin). These germs are cultured in the dark to produce secondary germs. It can then be used for regeneration.
  • the embryo transformed in (3) above can be treated with a regeneration medium, for example, rooted.
  • a regeneration medium for example, rooted.
  • 30 g / l sucrose-containing solidified MS medium containing no phytohormone according to Molecular Breeding Vol.7 pp.101-115 can be used.
  • the target mutation has been introduced into the LFS gene by means of well-known methods, such as a mutant aluminum plant into which the mutation has been introduced, for example, onion in the seedling stage, such as PCR.
  • a mutant aluminum plant into which the mutation has been introduced for example, onion in the seedling stage, such as PCR.
  • Extracted DNA mutations can be detected by well-known mutant detection methods such as PCR, IC
  • LFS-3 which is the longest of natural LFS (a sequence lacking 12 amino acids at the N-terminal side from the full-length sequence of LFS)
  • GST- P GEX-4T-3-LFS-3 which is expressed as an LFS fusion protein
  • This expression vector was obtained by culturing Escherichia coli incorporating the vector, and purifying the obtained Escherichia coli using a QIAprep Spin Miniprep Kit manufactured by Qiagen.
  • the methylation treatment of the vector was carried out using the Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System's pro-conoret, which was made by Invitrogen (anti-ii ⁇ night thread) as shown in Table 1. Place in a tube (200 / ⁇ 1 volume), incubate for 1 hour at 37 ° C, then store frozen (-20 ° C)
  • mutagenesis primers (69 forward: GCCAATGTTGTTGGTAGTGTTCGCTACG, 69 reno source: ACCAACAACATTGGCCTCACCTTCTAC, 71 forward: GCCAATGTTGTTGGTTGTGTTCTGTACGTTAAAGG Source: ACCAACAACATTGGCCTCACCTTCTAC) 5 ⁇ 1 of each 100 M solution was taken, and 40 1 of sterile distilled water was added to prepare each primer mixture.
  • Each PCR reaction solution was prepared in a PCR tube with the yarns shown in Table 2 by using a gene tailored site-directed mutagenesis system. The above reaction solution was used as the methylated DNA solution.
  • One-Shot MAX Efficiency DH-5 ⁇ _ ⁇ 1 a Competent Cell manufactured by Irwitrogen, was used for insertion of the mutated vector.
  • the protocol described in the Competent Cell and the protocol of the Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System were used. Therefore, the 69th mutant and 71st mutant were performed. Details are shown below.
  • the cap of the pial was tightened and incubated at 37 ° C for 1 hour with shaking (225 rpm).
  • the resulting Escherichia coli colonies were each checked by Koguchi PCR to confirm that the target DNA was incorporated into E. coli.
  • the basic PCR reaction mixture composition shown in Table 4 was used.
  • a primer set (PGEX5, GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT and pGEX3, CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG) that can detect the full length of the incorporated LFS sequence on the vector was used as the primer.
  • Colonies obtained by transformation were picked up with a sterile toothpick, inoculated into a PCR reaction solution, and then inoculated on a replica plate (LB plate).
  • the replica plate was cultured at 37 ° C for 1 cm.
  • the PCR reaction conditions were as follows. 94 ° C 9min lmin ⁇ 55 ° C lmin ⁇ 72 ° C lmin 72 ° C 5min ⁇ held at 4 ° C
  • PCR product obtained was confirmed for purity and size of the amplified product by electrophoresis performed as usual using a 2% agarose gel.
  • a representative sample was selected for each amplification product of the desired size from the colony PCR product, and a sequence analysis was performed to confirm that the DNA sequence was as intended.
  • Vectors were obtained for the confirmed sequences in which mutations were introduced into the 69th S or 71st B amino acids. Inoculate 2 ml of LB medium (50; containing g / ml ampicillin) into each Falcon 2059 tube from each colony of E. coli strains containing the introduced expression vector. Then, ⁇ -shaking culture (250 rpm) was performed. 1.5 ml of the obtained culture solution was put into an Eppendorf tube and centrifuged at 15,000 rpm to collect the cells. From the obtained Escherichia coli body, the vector into which the mutation was introduced was purified using Qiagen's Plasmid Purification Kit (QIAprep Spin Miniprep Kit (50)).
  • the resulting mutagenized vector was incorporated into Escherichia coli for protein expression.
  • Escherichia coli for protein production STRATEGENE's competent cell BL21-Gold (DE3) was used. 100 ⁇ was taken into a Falcon tube (2059) that had been previously cooled in ice after dissolving the competent cell in ice.
  • the mutagenesis vector solution (6.5 ng / l) 3 ⁇ 1 was added to the competent cell, allowed to stand in ice for 30 minutes, and then heat-treated for 20 to 25 seconds in a 42 ° C constant temperature water bath. Immediately after the treatment, the mixture was ice-cooled for 2 minutes, 0.9 ml of S0C medium was added, and the mixture was cultured with shaking at 37 ° C for 1 hour. A certain amount of the culture broth was spread on the LB plate, and cultured at 37 ° C for 1 mm to obtain each of the transformed mouths.
  • colony PCR was performed to select the target E. coli. Colony PCR conditions are the same as those shown in 4). Colony PCR Thus, the PCR product was used to determine the sequence of the insert sequence that was determined to be correct. Based on the results of colony PCR and sequence analysis, recombinant E. coli for protein production of amino acid mutations was selected.
  • freeze-thawed cells are centrifuged for 30 minutes under the condition of 4 D C 18000 rpm, separated into treated supernatant and cells, and the supernatant is subjected to SDS-PAGE according to a standard method to obtain the GST-LFS fusion protein.
  • SDS-PAGE according to a standard method to obtain the GST-LFS fusion protein.
  • the mutated LFS protein is produced as a GST (Dartathione S transferase) fusion protein, so the GST-affinity column adsorbs the GST-LFS fusion protein and separates it from impurities in the supernatant.
  • the thrombin recognition site previously introduced between GST and LFS was cleaved by thrombin treatment on the column to obtain a mutagenized LFS protein. The detailed method is shown below.
  • a minicolumn was filled with 0.5 ml of Glutathion Sepharose 4B manufactured by Falmasia, and the force ram was washed with 3 ml of PBS.
  • the mixture was centrifuged (5000 rpm ⁇ 30 seconds) to precipitate Benzamidine Sepharose 6B and collect the supernatant.
  • the collected liquid was used as a purified mutagenesis LFS solution.
  • an LFS mutant with the 69th Cys as Ser and an LFS mutant with the 71st Arg as Leu were prepared.
  • the LFS activity of the obtained mutagen was carried out using the following method.
  • Garlic qualinase 40 1 adjusted to 50 unit / ml and purified mutagenized LFS solution 10 Ail diluted to an arbitrary magnification were added to a 1.5 ml Eppendorf tube. Furthermore, 1-propenyl-cysteine sulfoxide (PRENCS0) 20 ⁇ 1 adjusted to 20 mg / ml was added, sealed, and allowed to react at room temperature for 3 minutes. This reaction solution was injected 1 // 1 into HPLC stabilized under the following conditions, and the area of the peak of the tear component at a retention time of about 9 minutes was determined. The amount of lacrimatory component produced was used as an index of LFS activity.
  • PRENCS0 1-propenyl-cysteine sulfoxide
  • the 33-35 transformant in which mutations were introduced at two positions of the 33rd to 35th amino acids (the 33rd Lys was converted to Leu and the 35th Glu to Gin) (Hereinafter referred to as 33-35 or 3335).
  • Two primers were used as the primers for mutagenesis: Forward: TGCTTTGCTTCCAAATACACTGCCACAGCAAGCATGGAC, Reno: TGTATTTGGAAGCAAAGCATGGACTTTGC.
  • the 88-94 converter (hereinafter referred to as 88-94 or 8894) in which mutations are introduced at two positions of the amino acid from the 88th to the 94th amino acid (the 88th Glu is converted to Gin and the 94th Asp is converted to Asn) Also created.
  • Two primers were used as the primer for mutagenesis: forward: GAATTTTGGGCCAAGCAGAAGCTGGTGGCGCTGAACAATAAGAACATG, reverse: CTTGGCCCAAAATTCCTCTTCTATTG.
  • 109-114 transformants (hereinafter 109) were mutated in 109 to 114 th (converted 109th Thr to Ala, 112th Glu to Gin, 114th Tyr to Phe).
  • Two primers were used as the primers for mutagenesis: Forward: TTTACTGAGTGTTTTGCTGGGTACCAGGATTTCACGGCTACCATG, Reno: AAAACACTCAGTAAAAATATAACTGTAGC.
  • the final 33-35 had LFS activity, whereas 88-94 had completely lost LFS, and 109-114 had a significant decrease in activity.
  • the results of confirming the protein composition by SDS-PAGE of the soluble fraction obtained from Escherichia coli obtained in this example are shown in FIG. 2, and the LFS activity measurement results are shown in Table 5.
  • the LFS activity was measured using the method shown in Example 1. LFS activity can also be measured in the GST fusion protein state.
  • E2-3 represents the LFS of the control.
  • the 88th or 94th amino acid that introduced the mutation was the active center, either alone or both.
  • the introduced converter was prepared and confirmed using the same method as in Example 1.
  • the primers used for mutagenesis were the 88th mutagen (hereinafter referred to as 88), forward: GAATTTTGGGCCAAGCAGAAGCTGGTGG, reverse: CTTGGCCCAAAATTCCTCTTCTATTG, and the 94th transformant (hereinafter referred to as 94).
  • the activity of each finally obtained purified mutagen was obtained using the method shown in Example 1.
  • Table 7 shows the results of measuring LFS activity with the same protein mass for each purified product of 88-94, which lost LFS activity, and 109-114, and 88 and 94, each with reduced LFS activity. It was shown to. The amount of protein in the solution was measured using the Bradford method, and the protein concentration is shown in Table 6.
  • LFS was regarded as control activity in the range of quantification (4. 3 ng) It was found that 88-94 and 88 showed no activity when the same protein mass was used, and no activity at all even when the protein mass was increased up to 200 times. This proves that 88 and 88-94 are not active in the presence of LFS protein.
  • the reaction system As the reaction system, the usual LFS activity measurement system shown in Example 1 was used, and an active substitutional LFS (94 purified product) was used as LFS.
  • C + BSA (1420 ng) is 94 purified product 10 (94 is 4 ng) plus BSA solution 10 ⁇ 1 (BSA1420 ng)
  • C + 88 is 94 purified product 10 / i 1 (94 is 4 ng) plus 88 refined products 10 / il (88 is approximately 950 ng)
  • C + 889 4 is 94 refined products 10 / _ ⁇ 1 4 is 4 ng) to 88- 94 refined products ⁇ ⁇ ⁇ (88- 94 shows about 950 ng) added.
  • lfs PCR products were prepared using two types of primers, TVcoI-LFS- ⁇ and 3 ⁇ 4? 1-LFSanalog_rl, using the reaction solution shown in Table 9 below and the onion gene under the PCR conditions shown in Table 10 below. DNA was obtained in a cage shape.
  • the PCR amplification product of lfs was purified using the Kuchish High Pure PCR Product Purification Kit and treated with two restriction enzymes, Ncol and PtnR, to obtain the introduced fragment.
  • Ncol-LFS-fl (sequence) 5 '-CAT GCC ATG GAG CTA AAT CCT GGT GC-3'
  • pHOUSE was treated with two restriction enzymes, Ncol and ⁇ , and the pHOUSE from which mgf P 5 had been cut out was separated on a gel and purified using QIAquick's QIAquick Gel Extraction Kit.
  • the two restriction enzyme-treated fragments obtained in this way were ligated with Invitrogen's T4 DNA Ligase and transformed into Invirogen's Subcloning Efficity DH5 Competent Cell (E. coli). Converted. Furthermore, transformed colonies were selected by culturing in LB medium containing 50 g / ml kanamycin. From the selected colony strength, the plasmid was purified using QIAprep S in Miniprep Kit and confirmed to have the structure as designed by restriction enzyme treatment and PCR.
  • the purified plasmid was transformed into electrocompetent Agrobacterium LBA4404, and transformants were selected in YM medium containing 50 g / ml kanamycin and 100 ig / ml streptomycin. Furthermore, it was confirmed by PCR that a plasmid was introduced into the selected transformant.
  • the transformants of Agrobac teriu selected in this way were preserved by placing cells in the logarithmic growth phase suspended in 30% glycerol solution at 80 ° C.
  • Leaf Discs were prepared from tobacco grown in a sterile incubator and used as transformed forest material. Immerse a leaf disc of about 1 cm in a straight line in agrobataterum broth for 2 minutes, and then use a filter paper to absorb the leaf disc and dry it to contain 1 mg / ml of BAP (6-Benzylaminopurine). Co-culture was performed for 3 days in MS30 medium (see Table 13). After co-culture, the discs were transplanted to MS30 medium containing 1 mg / ml BAP, 200 mg / ml timentin, and 10 mg / 1 hygromycin.
  • BAP 6-Benzylaminopurine
  • a pHOUSE-73 ⁇ 4 mutant-5ER vector was constructed in order to introduce the mutant LFS gene further into Tabacco that had LFS activity by introducing pHOUSE-i 5 vector.
  • this vector is a pHOUSE-Jfs mutant with a 486 bp 3 ⁇ 4 mutant gene prepared by PCR amplification between the Ncol site and Pnd ⁇ site of pHOUSE.
  • mgfp5ER cut out from ph121-lfs hi-h-mgfp5ER (3copy) was further introduced between the Hindlll site and the site of pH0USE-JZ3 ⁇ 4 mutant.
  • the PCR product of the If s mutant was used for the 88th mutagen introduced in Example 2 using the primer called yVcoI-LFSanalog-f 1 and 3 ⁇ 4 I-LFSanalog-rl and incorporating the LFSmutant sequence.
  • the expression plasmid was obtained in a saddle type.
  • the procedure for constructing the pHOUSE-mutant by introducing the LFSmutant amplification product between the pHOUSE TcoI site and the PmR site is the same as that for the pHOUSE-3 ⁇ 4 vector.
  • pHOUSE-s mutant was digested with restriction enzymes with / II, digested with multi-site, and then purified with High Pure PCR Product Purification Kit.
  • the purified pHOUSE- ⁇ mutant and y »5ER were ligated with T4 DM Ligase to construct pHOUSE-7 5 mutant-mgfp5ER.
  • Agrobacterium LBA4404 was transformed, selected and stored as a glycerol solution in the same manner as for pHOUSE-J vector.
  • VcoI-LFSanalog-fl (sequence) 5 '-CAT GCC ATG GAT TCG GCG AAT GGG GCG CGG AA-3, 3 ⁇ 47I-LFSanalog-rl (sequence) 5 '_TCA CAC GTG TCA AGC ACT GCA AAC CTC TT-3
  • Leaf Discs were prepared from LFS-expressing tobacco grown in a sterile incubator and used as transformation material.
  • pHOUSE-Jfs mutant- ⁇ 5ER-introduced agropacterium is infected to about lcm leaf disc, and selective culture is performed to obtain healthy and well-grown shoots and rooted tobacco plants
  • the procedure is the same as the preparation of LFS expressing tobacco (2-1-2). However, the expression of GFP was used as an index for selection.
  • the transgene was confirmed by PCR targeting gfp and lfs mutant.
  • non-transformed control tobacco C
  • tobacco with lfs introduced L
  • tobacco with lfs mutant introduced into (L) L + M
  • the LFS activity and protein mass were measured, and the specific activity was calculated to determine the difference between samples.
  • the method for measuring LFS activity was the same as in Example 1, and the protein was measured by the Bradford method.
  • a mutant-type tearing component-producing enzyme for the first time, a mutant-type tearing component-producing enzyme is provided, and the functional analysis of the tearing component-producing enzyme has become possible.
  • the present invention provides an inhibitor of the present enzyme comprising a mutant-type tear-producing component-producing enzyme as an active ingredient, thereby making it possible to control the activity of the enzyme for the first time. I was able to control my pain and tears.

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Abstract

　本願発明は、従来品種のタマネギに存在する催涙成分生成酵素を抑制する阻害剤などを提供すること、更にはこれにより、タマネギの調理/破砕における目の痛み、涙を抑える十分な手段の提供を課題とする。　催涙成分生成酵素変異体を多数開発し、天然型催涙成分生成酵素の阻害剤として機能するものを見出して、本願発明を完成させた。

Description

催涙成分生成酵素阻害剤 技術分野
本発明は、 タマネギ等を粉砕又は切断した時に発生する催涙成分の生成に関与 する 1-プロぺニルスルフェン酸を催涙成分 （Lachrymatory Factor、 以下 L Fと いうことがある） に変換する作用を明示す （催涙成分生成酵素活性を有する） 蛋白 質又はポリべプチドを阻害する蛋白質若しくはポリべプチド並びに、 それらをコ ードする DNA又はその断片 （催涙成分生成酵素遺伝子） に関する。
書
本発明の催涙成分生成酵素阻害ポリペプチドは、 例えば、 タマネギなどを、 破 砕又は切断した時に発生する催涙成分の量を低減化させることができる。 更に、 本発明の遺伝子は、 タマネギの粉砕又は破断時に発生する催涙性成分が低減した 植物の開発において、 材料や交配物などの選別指標として使用すること、 当該酵 素の発現量を抑制するための情報を提供すること、 当該酵素を大量に生産するこ と、 催涙成分を大量に生産すること、 等を実現化するものとして有用である。 背景技術
本発明者らは、 既に、 タマネギを粉碎又は切断した時に発生する催涙成分
(Lachrymatory Factor： LF) の形成及びその分解については、 （1 ) 前駆物質で ある S-1-プロぺニル -システインスルフォキシド （PeCSO) がァリイナーゼによつ て分解された 1-プロべニルスルフェン酸を生じただけでは非酵素的には催涙成 分は生じず、 他の酵素 （催涙成分生成酵素） の関与が不可欠であ δこと、 （2 ) そ して、 当該他の酵素は上記スルフ ン酸を異性化して催涙成分を生成すること、
( 3 ) 上記前駆物質は、 当該酵素の作用の如何によつて、 催涙成分あるいはこれ と別の風味成分になることを見出している。 さらに、 この催涙成分生成酵素の製 造方法を開発すると共に、 催涙成分生成酵素の理化学的性質をも明らかにして、 特許出願をした （特許文献 1 ：特開平 10-295373号公報）。
又、 本発明者らは、 酵素ァリイナーゼの存在下でタマネギ等に存在する PeCSO から催涙成分を生成する作用を有する催涙成分生成酵素の構造を解明し、 催涙成 分生成酵素の複数のァイソザィム、 そのアミノ酸配列及びタマネギに関してそれ をコードする遺伝子配列の解明に成功し、 特許出願をした （特許文献 2 )。
更に、 本願発明者らは、 タマネギ以外の他のァリウム （Al l ium :ネギ属） 植物 に含まれる催涙成分生成酵素及びそれをコードする遺伝子についても既に明らか としている（特許文献 3 )。
又、 催涙成分生成酵素遺伝子の発現抑制用 DNA及びベクター、 更に、 それらを 用いた催涙成分生成酵素遺伝子の発現抑制方法についても、 既に明らかとしてい る（特許文献 4 )。
また、 涙がでにくいタマネギの作出としては、 従来は PeCSOがァリイナーゼで 分解されれば、 LFが生成すると考えられていたこと力ゝら、 LFの発生量の少ないタ マネギを作出する為には、 PeCSO 含量の少ないタマネギを作出するか、 ァリイナ ーゼ活性の少ないタマネギを作出する方法が考えられていた。
例えば、 栽培条件を変える事でタマネギ中の PeCSOの蓄積量を変化させる研究 が行われて来ており、例えば、硫黄が少ない条件で栽培すると、 LFが減少する （非 特許文献 1 ： Randle, W. M.ら J. Agr. Food Chem. 42, 2085, 1994) 事や、 ァリ イナ一ゼの基質に占める PeCSOの割合も減る （非特許文献 2： Randl e, W. M. ら J. Amer. Soc Hort. Sc i . 120， 1075， 1995) 事等が報告されている。
しかし、 PeCSO 含量を減らした条件で栽培されたタマネギは、 香りの強度が弱 くなり （非特許文献 3 : p. 41-52. In : S. J. Ri sch and C. Ho (eds. ) . Spices : Flavor chemi stry and antioxidant properties. Amer. Chem. Soc. , Wash. , D.し.ノ、 ま たァリイナーゼの基質に占める PeCSOの割合も変化してしまう事から、 香りの質 自体も変化してしまう問題があった。 従って、 この様に栽培条件を変えただけで は、 根本的な解決策とはなっていない。 これは、 PeCSO がァリイナーゼによる分 解を受けて生じる 1 -プロべニルスルフェン酸が、 LFだけでなく、香り成分の元に なるチォスルフイネ一ト化合物にも変化するためである。
また、 タマネギを調理する際に、 電子レンジで加熱し、 ァリイナーゼの活性を 低減することにより LFの生成を抑制する経験的な調理方法もある。
特許文献 1 特開平 1 0— 2 9 5 3 7 3 • 特許文献 2 国際公開第 0 2 Z 2 0 8 0 8号パンフレッ ト
特許文献 3 国際公開第 0 3 / 0 7 4 7 0 6号パンフレツト
特許文献 4 国際公開第 0 3 / 0 7 4 7 0 7号パンフレツト
非特許文献 1 J. Agr. Food Chem. 42， 2085， 1994
非特許文献 2 J. Amer. Soc Hort. Sc i . 120, 1075, 1995
非特許文献 3 p. 41-52. In : S. J. Ri sch and C. Ho (eds. ) . Spi ces : Flavor chemistry and anti oxidant properti es. Amer. Chem. Soc. , Wash. , D. C 発明の開示
タマネギのみじん切り等でタマネギ調理において、 目の痛み、 涙の流出を防ぐ ことは種々試みられている。最近では、催涙成分生成酵素遺伝子の発現抑制用 DNA 等を用いて、 タマネギ自体に遺伝子操作をし、 涙の出ないタマネギ新品種を開発 する研究が行われている。 しかしながら、 従来品種のタマネギについては、 例え ば、 上述した PeCSO含量を減らした条件で栽培されたタマネギは、 香りの強度が 弱くなり、 またァリイナ一ゼの基質に占める PeCSOの割合も変化してしまう事か ら、香りの質自体も変化してしまう問題があった。また、タマネギ調理において、 電子レンジで加熱し、ァリイナーゼの活性を低減することにより LFの生成を抑制 する方法も、 同様にタマネギの香りの強度及び質を損なうもので、 目の痛み、 涙 の流出を防ぐ適切な手段がいまだ見出されていない。
また、 催涙成分生成酵素については、 種々の天然酵素及びその遺伝子の研究は なされてきたが、 酵素変異体及び遺伝子の特性についての研究はされていなかつ た。
さらに、 催涙成分生成酵素の活性を阻害する阻害剤についてもいまだ知られて いない。
そこで、 本願発明は、 酵素変異体及びその遺伝子を提供することを第 1の課題 とする。 更に、 従来品種のタマネギに存在する催涙成分生成酵素を抑制する阻害 剤などを提供することを第 2の課題とする。更にはこれにより、タマネギの調理/ 破砕における目の痛み、 涙を抑える十分な手段の提供を第 3の課題とする。
本願発明者らが既に解明したタマネギの催涙成分生成酵素をコードする遺伝子 配列を利用して、 種々の変異型催涙成分生成酵素を新たに開発した。 そして、 こ の新たに開発した変異型催涙成分生成酵素が、 天然型催涙成分生成酵素の阻害剤 として機能することを見出して、 本願発明を完成させたものである。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-256720号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 69番目の Cysを Serに変えた変換体及び 71番目の Argを Leuに変え た変換体の LFS活性測定結果
図 2は、 SDS- PAGEによるたんぱく質組成確認結果。可溶性画分には、 LFSの GST 融合蛋 A質に相当するバンドが認められた （左図矢印）。
図 3は、 88番 0アミノ酸をダルタミン酸からグルタミンに置換した失活型の置 換 L F S (88精製品）及び 88番目アミノ酸をグルタミン酸からグルタミンに 94番 目のアミノ酸をァスパラギン酸からァスパラギンに置換した失活型置換 L F S (8894精製品）の多量存在下における、活性を保持した変異型 L F Sの酵素活性の 測定。
図 4は、 pHOUSE- i¾ vectorの構築方法を示す。
図 5は、 pHOUSE- J2¾ mutant-^ ?5ERの構築方法を示す。 発明を実施するための最良の形態
1 . {まじめに
1 - 1 . 催涙成分の生成経路及び香味成分の生成経路
化 1
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
E-propanethiol S-oxide (lachrymatory factor)
前駆物質の P e C S O (S-l-プロぺニル -システインスルフォキシド） に酵素ァ リイナーゼが作用し、 スルフェン酸 （（Ε-1-propensulfenic acid)となる。 スルフ ニン酸が催涙成分生成酵素により異性化されると催涙成分 L F (Lachrymatory Factor) を生成するが、 当該酵素の作用の如何によつて、 催涙成分 L F (即ち、 香り成分） あるいはこれと別の風味成分になることが分かっている。
• そのため、 前駆物質からの催涙成分の生成減少を狙いァリイナーゼを失活させ ると、 タマネギの風味成分をも失うこととなる。 そこで、 ァリイナーゼ活性を維 持しつつ、 催涙成分生成酵素を失活させる手段の探索が重要となる。
そこで、 まず、 催涙成分生成酵素の特性を変異型催涙成分生成酵素を調製する ことにより解明し、これを用いて催涙成分生成酵素の阻寄剤の設計の検討を行う。 1 - 2 . 催涙成分生成酵素変異体の開発
催涙因子合成酵素 （Lachrymatory Factor Synthase , 以下 LFSとの呼ぶ） の活 性発現に必要な部位を特定し、 LFS抑制タマネギ作成研究や LFS作用機作の解明 に役立つ知見を得ることを目的として、 催涙成分生成酵素変異体 （変異型催涙成 分生成酵素） を開発した。
1 一 3 . LFSの活性部位
LFS の活性部位については、 ァリウムに属する植物間でその遺伝子の相同性が 高いため、 ホモロジ一から活性部位を特定することが困難であった。 そこで、 タ マネギの LFS (配列番号 1 )の両末端から一定の長さの配列を除いた deletion mutantを作成し、 活性に必要な範囲を絞り込んだ後、 活性中心になり得る可能性 のあるアミノ酸について、 その相同性の情報をもとに、 いくつかのアミノ酸を変 換した LFSのアミノ酸変換体を作成して LFSの活性に重要な働きをするアミノ酸 の特定を試みた。 これにより、 両末端共に、 LFS の立体構造の維持に関わってい るらしいことが分かった。 具体的には、 LFSの C末側 9アミノ酸は、 削除しても 活性をある程度保持していた。 N 末側は、 2 1アミノ酸削除しても活性を保持し たが、 30アミノ酸削除すると活性を失った。 しかしながら、 N末側 21アミノ酸か ら 3 0アミノ酸に存在する 9アミノ酸は、 j3シート構造をとるもので、 ここに活 性中心があるとは考えにくいので、 結局、 N末側 31アミノ酸以降で C末 1 0アミ ノ酸より手前に活性中心が存在するものと考えられた。
さらに、 種々の変異体を調製し、 LFS 活性を測定する実験をおこなった。 変異 体の調製は、 例えば、 天然型の LFS遺伝子に Invitrogen社から市販されている GeneTailor Site-Directed Mutagenesi s System を使用すること力 できる。 具体 的には、変異導入は、上記ジーンテーラーを用いて次のように行うことができる。
(ィ） LFS遺伝子（配列番号 2)を導入したベクターをメチル化酵素で処理して、 ベクターの DNAをメチル化する。 （口） 変異を入れる箇所の 5 ' 側でオーバーラッ プさせたプライマーを作成する。 この時、片側のプライマーに変異を入れる。 （ハ） メチル化したベクタ一 DNAを鎵型として、 先のプライマーで PCRを行う。 (二） 得 られた DNAを大腸菌 （mcrBC野生型） にトランスフォームする。 （ホ） メチル化し た DNAは大腸菌内で分解される。（へ）変異導入されたものを薬剤耐性で選抜する。 このようにして調製した LFS変異体の LFS活性を測定することにより、 （1 )
69-74番目のアミノ酸における欠失、 置換または付加する変異、 好適には 71番目 のァノレギニンを変異させる、 または （2 ) 88 - 94 番目のアミノ酸における欠失又 は置換の変異、 特に好適には、 88番 Θのグルタミン酸 （E) を変異させると、 LFS 活性を完全に失うことから、 これらのアミノ酸が活性に重要な働きを有し、 おそ らく活性中心にある可能性を示すデータが得られた。また、 （3 ) 109T、 112E、 114Y の変異を生じさせることにより、 LFS 活性を顕著に低減できたが、 活性が完全は 消失しないことから、 活性中心ではないであろうと考えられる。
2 . 変異型催涙成分生成酵素の特徴： 阻害剤の探求
活性を失った LFS変異体について、 LFSと共在下で、 LFSの活性を測定したとこ ろ、 LFS活性を阻害することを見出した。 すなわち、 失活した LFS変異体、 好適 には、 活性中心に変異が導入されたため LFS活性を欠失したが、 LFSの基質に対 する親和性を保持する、 失活 LFS変異体を、 LFS阻害剤として用いることが可能 である。
具体的には、 LFS阻害剤は、 次の LFS変異体を包含する。 （1 ) 配列番号 1で示 される天然型 L F Sの変異体であって、少なく とも 71番目のアルギニンを他のァ ミノ酸に置換させるか、 又は、 71番目のアルギニンを含む領域を欠失した変異を 有する LFS変異体，好適には、 71番目のアルギニンをロイシンに置換させた LFS 変異体を包含する。 （2 ) 配列番号 1で示される天然型 L F Sの変異体であって、 少なく とも 88番目のグルタミン酸を他のアミノ酸に置換させる力 88番 Θのグ ルタミン酸を含む領域を欠失した変異を有する変 LFS変異体、 好適には、 88番目 のグルタミン酸をグルタミンに置換させた LFS変異体を包含する。 更に、 （3 ) 配 列番号 1で示される天然型 L F Sの 109番目から 114番 Bまでのァミノ酸領域を 欠失させた LFS変異体、 及び 109番3、 112番目又は 114番目のアミノ酸を置換 した LFS変異体が包含され、 更に具体的には、 109番 5の Thrを Ala、 112番目の Gluを Ginに、 114番目の Tyrを Pheに変換した LFS変異体 Sを包含する。
なお、 上記変異体は、 いずれも、 71番目、 88番目、 109番目、 112番目又は 114 番目アミノ酸以外にも、 上記変異体が L F S活性を阻害することができる限り、 他の位置のアミノ酸の置換、 及び Zまたは欠失を包含し得る。 例えば、 配列番号 1において、 71番 0のアミノ酸及び Z又は 88番目のアミノ酸への変異に加えて、 94番 0のアミノ酸をァスパラギン酸からァスパラギンへ置換させる変異、又は第 1番目から第 8番目までのァミノ酸の欠失などが挙げられる。 より具体的には、 配列番号 1において、 88番ョのァミノ酸がグルタミン酸からグルタミンに置換し、 更に、 94番 Θのアミノ酸をァスパラギン酸からァスパラギンへ置換させる変異を 有する変異体が挙げられる。
3 . LFS阻害剤の生産及び使用
3 - 1 . 本願発明には、 上記 2 . で特定された LFS阻害活性を有する LFS変異体 を遺伝子組換え法により生産することも包含される。
例えば、 LFS 変異体をコードする遺伝子を発現ベクターに組換え、 適当な宿主 で発現させ、 LFS変異体を回収することができる。 発現ベクターとしては、 宿主ごとに、 周知の発現ベクターを用いることができ る。 例えば、 発現ベクターとしては、 ダルタチオン S トランスフェラーゼ (GST) 遺伝子の配列の下流にマルチクロー-ングサイ トを持つ、 PGEX-4T-3 (アマシャム バイオサイエンス社製) 等を用いることができる。
また、 宿主として、 大腸菌を用いる場合には、 pBR322、 pBR325、 枯草菌を宿主 とする場合は、 枯草菌由来の pUBl lO等を用いることができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、 周知の方法を利用できるが、 例えば、 コンビテントセル法、 プロ トプラスト法、 リン酸カルシウム共沈法、 エレク ト口 ポレーシヨン法、 マイクロインジェクション法、 リポソーム融合法等、 種々のも のが例示されるが、 用いる宿主に応じてそれぞれ任意の方法を採用することがで さる。
生産された阻害剤は、 例えば、 周知のタグとの融合蛋白質、 例えば GSTとの融 合蛋白質として生産すれば、 グルタチオン セファロース等で精製することがで さる。
3 - 2 . 製造された LFS変異体を有効成分として含有する LFS阻害剤は、 食品製 造などの現場で、 催涙性を抑制する薬剤として使用することができる。
例えば、 LFS 阻害剤は、 適宜な可食性溶媒に溶解し、 これをタマネギの破碎等 を行う食品製造現場に噴霧することにより、 現場での労 )者の催涙を防止するこ とができる。
4 . 催涙性を抑制したタマネギを作出する方法
本願発明の LFS阻害活性を有する失活した LFS変異体をァリウム植物、例えば、 タマネギで大量に発現することで、 催涙性を抑制したァリ ウム植物、 例えば催涙 性が抑制されたタマネギを作出することができる。 例えば、 LFS 阻害活性を有す る LFS変異体をコードする LFS変異体遺伝子をまず調製する。 次に調製した LFS 変異体遺伝子は、 適宜な植物用発現ベクターに組み込むことができる。 具体的に は、 ァグロバタテリ ゥム ッメファシエンス由来の発現べクタ.一を用いることが できる。 組換え植物発現用ベクターは、 周知の遺伝子導入法により、 タマネギに 導入し、 変異型 LFSを多量に含有する変異タマネギを育種することができる。 タマネギの遺伝子組換え植物調製方法は、 既に手法が確立しており、 総合的方 法 ίこつレヽて fま、 ί列え fま、、 Allium Crop Science Recent Advances CAB International edited by Rabinowitch and L. Currah, pp.119-137, (2002)に説明され、 具体的に は、 Plant cell reports Vol.19, pp.376— 381，及ぴ Molecular Breeding Vol.7 pp.101-115 に記載の方法を用いることができる。
( 1 ) 遺伝子導入法：パーティクルガン法 （例えば、 PDS 1000 ヘリゥムパー ティクルガン） を用いることができる。 好適には、 ァグロパクテリ ゥム法を用い ることができる。
(2) 遺伝子制御 （発現） ：種々の発現ベクター例えば、 pBIN系列のバイナリ 一ベクター、 pCambia系列のベクターを用いることができる。 プロモーター配列 としては、 CaMV 3 5 Sプロモーターを用いることが好ましい。
(3) 遺伝子導入対象：培養系、 カルス、 胚芽、 成長点などに遺伝子導入する ことができる。
例えば、 Plant cell reports Vol.19, pp.376- 381 に従い、 次のように行うこ ともできる。 種子からの未熟胚芽を 4 °Cでー晚放置した後、 前培養なしで形質転 換に供することができる。 ァグロパクテリ ゥム溶液とボーテックス後、 切断し減 圧処理後、 P5 培地に移し、 6日間共培養後、 （スクリーニング用の試薬例えば、 geneticin及び timentin含有） P5培地で形質転換体を選抜する。 これらの胚芽は 暗所で培養され、 2次胚芽を生産する。 その後、 再生に用いることができる。
(4) 植物の再生：上記（3)で形質転換した胚芽を再生培地で処理し、 例えば、 発根させるこ とができる。 再生培地と しては、 Molecular Breeding Vol.7 pp.101-115によるフィ トホルモンを含有しない 30g/lのショ糖含有固化 MS培地 を使用することができる。
本件方法により作出されたタマネギは、催涙成分生成酵素を抑制するので、 1 - プロべニルスルフェン酸が催涙成分に変換されないため、 チォスルフイネ一トの 生成量が増大する。
チォスルフイネ一トは、 タマネギの主要な匂い成分で、 抗喘息作用が in vivo で確認さ;^ており、 in vitro ではシクロォキシゲナーゼ (cyclooxygenase) と
5-リポオキシゲナーゼ（5-lipooxygenase)の阻害剤でもある（Wagner, H. , Dorsch,
W. , Bayer, Τ.， Breu, W. & Wilier, F. Antiasti葡 tic effects of onions: inhibition of 5- lipoxygenase and cyclooxygenase in vitro by thiosulf inates and "Cepaenes". Prost. Leuk. Essential Fatty Acids 39, 59-62 (1990))。 更 に、 チォスノレフ ィネー トはジスノレフィ ド （disulfides)、 ト リ スノレフィ ド (trisulfides) に変換され、 これらはそれぞれ血液中の脂質低下 （Adanm, I.， Joseph, P. K. & Augusti, K. Τ. Hypolipidemic action of onion and garlic unsaturated oils in sucrose fed rats over a two-month period. Experientia 38， 899-901 (1982) )、血小板凝集阻害作用を有することが報告されている（Ariga, T. , Oshiba, S. & Tamada, T. Platelet aggregation inhibitor in garlic. Lancet 1, 150-151 (1981)及び Makhe ja， A. N. & Bailey, J. M. Antiplatelet constituents of garlic and onion. Agents Actions 29, 360-363 (l990))o し たがって、 上記のチォスルフィネート乃至その反応物の生成量が増大した、 機能 性タマネギを作出することも可能である。
5. 本発明の遺伝子情報を用いた変異体植物を選抜 （スクリーニング） する方法 5— 1. 本願発明により、 LFS に上記した変異がある変異体遺伝子を有するァリ ゥム植物、 例えば、 タマネギは、 催涙性が減じられている変異タマネギの候補と して選抜することができる。
そこで、 周知の方法で、 変異を導入した変異体ァリ ウム植物、 例えば、 タマネ ギを幼植物の段階で、 例えば PCRなどの手段で、 LFS遺伝子に、 目的とする変異 が導入されているかどうかを確認することにより、 催涙性が低減したァリウム植 物を飛躍的に早く育種することが可能となる。 以下タマネギについて、 説明する が、他のァリゥム植物についても同様に行うことができることは言うまでもなレ、。
( 1 ) 変異体タマネギの作出は、 周知の方法、 例えば、 X 線、 ガンマ線などの 放射線や重イオンビームを照射する、又は化学的処理、例えば、エチレンィミン、 ェチルメタンスルフォネート、 N—二ト口ソー N—メチルウレタン DNA 塩基アナ ログ、 DNA代謝阻害剤、 アタリジン色素、 などで、 処理することができる。
(2) 調製した変異体タマネギから、 試料を採取し、 該試料から DNAを常法に より抽出する。
( 3 ) 抽出した DNAの変異は、 周知の変異体検出方法、 例えば、 P C R、 I C
AN、 L a m , インベーダー法、 などの方法を用いて検出する。 例えば、 P C Rであれば、 目的とする L F S阻害活性を有する変異体 LFSに特異的なプライマ 一を用いる PCRにより、 検出し、 L F S阻害活性を有する変異体 LFSをコードし ている変異体タマネギを催涙性が低下したタマネギ候補として選抜する。
更に、 必要に応じ、 上記した Θ的とする変異体 LFSを含む催涙性が低下したタ マネギ候補を栽培し、 催涙性を確認し、 催涙性が抑制され、 催涙性が低減した変 異体タマネギを選抜育種することができる。 必要に応じ、 催涙性にあわせて、 及 びその他タマネギとしての性質、 例えば、 タマネギ特有のにおい、 味わいをもと に、 タマネギとしては優れた変異体を選抜することにより、 催涙性が低下し且つ タマネギとしては優れた性質を有する変異体タマネギを育種することもできる。 5— 2 . 上記（3)の工程における S的とする変異体 LFS とは、 LFS阻害活性を有す る変異体 LFSであれば、 任意の変異体 LFSを包含する。 より具体的には、 LFSの 71番目のアルギニンをロイシンに置換させた置換型 LFS及び LFSの 88番目のグ ルタミン酸（E)を他のァミノ酸、例えば、 グルタミン （Q) に置換させた置換型 LFS を挙げることができる。 上記 （3 ) の工程のためプライマーとしては、 上記目的 の変異体をコードする遺伝子中の変異部分を末端に含むようなプライマーを設計 することができ、 当該変異を生ずるコ ドンが複数ある場合は、 デジエネレートプ ライマー乃至その混合物とすることができる。
本工程を用いることにより、 完全な植物体に再生させ.る以前に、 催涙性が低減 している可能性のある変異体タマネギを簡便に選抜することができる。 ' 実施例 1
LFS変異体の調製
69番 Cysおよび 71番 Arg変換体の作成
LFSへのアミノ酸変異の導入は、 Invitrogen社製 Gene Ta i lor Site-Directed
Mutagenesi s Systemを利用し、 このシステムのプロ トコルに従って行った。 この システムは、 LFS の遺伝子を組み込んだ蛋白質発現用ベクターを鎵型とし、 変異 導入箇所の 5 ' 側でオーバーラップさせたプライマーを用いて PCRすることによ つて、 変異導入した LFSをベクターごと複製することを特徴とするものである。 以下に 69番目の Cysを Serに、 又は、 71番ョの Argを Leuに変換した LFSの作 成例を示した（以下、 それぞれ、 6 9番変異体， 若しくは 7 1番変異体、 又は、 ：申- に、 6 9若しくは 7 1 と呼ぶ）。
1 ) 鍀型 DNAのメチル化
錶型 DNAには、 天然型 LFS の内最も長いもの （LFS の全長配列から、 N末端側 12アミノ酸を欠いた配列） である LFS - 3の配列を組み込んだ蛋白質発現用べクタ 一 （GST - LFS融合蛋白質として発現） である p GEX- 4T-3- LFS - 3を用いた。 この発 現ベクターは、 このベクターを組込んだ大腸菌を培養し、 得られた大腸菌体から キアゲン社製、 プラスミ ド精製キッ ト （QIAprep Spin Miniprep Kit) を使用して 精製したものを用いた。ベクターのメチル化処理は、 Inv itrogen社製 Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis Systemのプロ 卜コノレ（こ従って実施した。 反 ii^夜の糸且 成は表 1に示した通りである。 反応液を PCRチューブ （200 /^ 1容） に入れ、 37°C で 1時間ィンキュベートし、 その後冷凍 （- 20°C) で保管した
表 1 メチル丫 觸滅
Figure imgf000013_0001
2 ) 変異導入ベクターの作成
それぞれの対象変異導入体において、 変異導入用のプライマー 2種 （69用フォ ワ ー ド ： GCCAATGTTGTTGGTAGTGTTCGCTACG 、 69 用 リ ノく ー ス ： ACCAACAACATTGGCCTCACCTTCTAC 、 71 用 フ ォ ワ ー ド ： GCCAATGTTGTTGGTTGTGTTCTGTACGTTAAAGG 、 71 用 リ ノく ー ス ： ACCAACAACATTGGCCTCACCTTCTAC) それぞれの 100 M溶液を 5 μ 1ずつ取り、滅菌蒸 留水 40 1を加えてプライマー混合液 each) を作成した。 Gene Tai l or Site-Directed Mutagenes is Systemのプロ 卜コノレ ίこ ¾έつて、 表 2の糸且成でそ ぞ れ PCR反応液を PCRチューブ内で作成した。 メチル化 DNA溶液は上記反応液を用 いた。
表 2 表 2 変異導入 PCR 滅
Component νοΐιπηε(μΐ) Final Concentration
1 OX High Fidelity PCR Buffer 5 IX
lOmMdNTP 1.5 0.3 mM each
50niMMgSO4 】.0 ImM
Primers (ΙΟμΜ each) 1.5 0.3 μΜ each
Methylated DNA(12.5 - 32.5ng) 2.0 As reauired
Platinum Taq High Fidelity 0.5 2.5 unit
Autoclaved, distiled water 38.5
Total 50
PCR反応は表 3 の条件で実施した。 得られた PCR産物は、 ¾ちにトランスフォ 一メーシヨンに使用した。 . 表 3 表 3 変異導入 PCR条件
Temperature Time Cycle
94°C . 2min 1
94°C 30 sec
S5°C 30 sec 20
68°C 5 min 36 sec
68°C lOmin 1
3) 大腸菌のトランスフォーメーション （変異導入ベクターの組込み）
変異導入したベクターの糸且込みには、 Irwitrogen社製の Competent Cellであ る One- Shot MAX Efficiency DH- 5α_Τ1を使用した。 トランスフォーメーショ ンの手 1頃は Competent Cell に記載されたプロ トコノレおよび Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis Systemのプロトコノレ ίこ従って 69番変異体、 71番変 異体それぞれ実施した。 詳細は以下に示した。
1.50 1バイアルに入った DH-5o:- Tl cells 1本を、 氷上で溶解した。
2.2μ 1の変異導入 PCR産物をバイアルに直接加え、 ゆっく りとゆすって混合し た。
3.キャップをして、 氷上で 7〜10分間ィンキュベートした。
4. 2°Cで 30秒間処理した。
5.直ちに氷中に移して、 1分間保温した後、 室温にした S0C培地 200μ 1を加え た。
6 .パイアルのキャップを締め、 37°Cで 1時間振盪培養した （225rpm)。
7 . 10〜125 μ 1の培養液を LB平板に広げた。
8 . 37。Cの恒温機に入れ、 16〜20時間培養して、 コロニーをカウントした。
4 ) 変異導入ベクターを組込んだコロニーの選抜 （コロニー PCR)
得られた大腸菌コロニーについて、 目的の DNAが大腸菌に取りこまれているか を、 それぞれコ口エー PCRで確認した。 PCRの基本反応液組成は、表 4に示したも のを用いた。 プライマーには、 ベクター上の組み込んだ LFS配列の全長が検出で きるプライマーセッ ト ( P GEX5， ： GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT と p GEX3， ： CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG) を用いた。
表 4 表 4 コロニー PCR Ki»W
Figure imgf000015_0001
(使用試薬）
10X PCR buffer II (- MgCl2) ： Appl ied Biosystems
25mg MgCl2： Appl ied Biosystems
2mM dNTP Mix： Gene Amp dNTP Mix, Appl ied Biosystems
Taqポリメラ一'ゼ (5U/ml) ： Appl ied Biosystems
トランスフォーメーションで得られたコロニーを滅菌爪楊枝でピックアップし、 PCR反応液に接種した後、 レプリカプレート （LB平板） にも接種した。 レプリカ プレートは 37°Cで 1晚培養した。 PCR反応条件は、 次の条件を用いた。 94°C 9min lmin→ 55°C lmin→ 72°C lmin 72°C 5min → 4°C保持
38 or 40サイクル 得られた PCR産物は、 2 %ァガロースゲルを用い、定法通りに実施した電気泳動 で増幅産物の純度と大きさを確認した。
5 ) シークェンス解析
コロニー PCR 産物の中で、 目的のサイズの増幅産物についてそれぞれ代表サン プルを選び、 シークェンス解析を実施して、 DNA配列が目的通りか確認した。
6 ) 変異導入したベクターの取得
69番 S又は 71番 Bのアミノ酸に変異が導入された配列を確認したものについ て、 ベクターの取得を行った。 変異を導入した発現ベクターを組込んだそれぞれ の大腸菌株のコロニーから、 Falcon 2059 tubeに 2ml分注した LB培地 （50 ; g/ml のアンピシリンを含有） に植菌し、 LB培地を 37°Cで、 ー晚振盪培養 （250rpm) し た。 得られた培養液 1. 5mlをエツペンドルフチューブに入れ、 15，000rpmで遠心 分離して菌体を回収した。 得られた大腸菌体から、 キアゲン社 プラスミ ド精製 キット （QIAprep Spin Miniprep Kit (50) ) を用いて、 変異が導入されたベクター をそれぞれ精製した。
7 ) 蛋白質生産用大腸菌の作成 .
得られた変異導入済みのベクターを、 蛋白質発現用の大腸菌にそれぞれ組み込 んだ。蛋白質生産用の大腸菌は、 STRATEGENE社製 コンビテントセル BL21- Gold (DE3) を用いた。 コンビテントセルを氷中で溶解後、 あらかじめ氷冷してあった Falcon tube (2059) に 100 μ ΐ 取った。 変異導入ベクター溶液 （6. 5ng/ l) 3 μ 1 をコンビテントセルに加え、 氷中で 30分静置後、 42°Cの恒温水槽で 20〜25 秒の熱処理を行った。処理後は直ちに 2分間氷冷後、 0. 9mlの S0C培地を添加し、 37°Cで 1時間振盪培養した。 LB平板に一定量の培養液を広げ、 37°Cで 1晚培養し て形質転換コ口ニーをそれぞれ得た。
8 ) 変異導入 LFS蛋白質生産用大腸菌の選抜
7 ) で得られたコロニーをもとに、 コロニー PCR を実施して目的の大腸菌を選 抜した。 コロニー PCR の条件は、 4 ) で示した条件と同じである。 コロニー PCR で、 組み込んだインサート配列の長さが正しいと判断されたものについて、 その PCR産物を使用して、 シークェンス解析を実施した。 コロニー PCRとシークェンス 解析の結果を元に、アミノ酸変異導入体の蛋白質生産用組換え大腸菌を選抜した。
9 ) 変異導入 LFS 蛋白質 （L F S変異体） の生産
アンピシリン （SO g/ml) を含有した LB培地 2mlを Falcon tube (2059) に 取り、 8) で選抜した大腸菌をそれぞれ滅菌爪楊枝で植菌して 37°Cで一晩前培養 した。その後、アンピシリン（50 μ ε/ηι1)を含有した LB培地 100m 1が入った 500ral 容三角フラスコに、 前培養液を 2〜2· 5ml添加し、 37°Cで振盪培養 （250rpm) を行 つた。 培養開始時から、 培養液の 600nmにおける吸光度をモニターし、 吸光度が 0. 5を越えたあたりで lOOmMの IPTG (i sopropyl- β -D-thiogalactoside) をフラ スコ当たり 1ml添加した （GST融合蛋白質の発現誘導）。 吸光度が 2を越え、 安 定してくるまで 3〜4時間培養を続けた。 培養終了後、 4°C 6000rpmで 10分間遠 心分離し、 大腸菌体を回収した。 得られた大腸菌体に 4mlの Sonication buffer (50mM Tris, 50mM NaCl, lmM EDTA, Im DTT, pH8. 0) を添加し、 凍結融解 (- 80°C) 処理を 3回以上行った。 凍結融解処理した菌体を、 4DC 18000rpmの条 件で 30 分間遠心分離し、 処理上清と菌体に分離し、 上清液を定法に従って SDS-PAGEに供して、 GST - LFS融合蛋白質が可溶性画分に生産されていることをそ れぞれ確認した。 ，
1 0 ) 変異導入 LFSの精製
変異導入された LFS蛋白質は、 GST (ダルタチオン S トランスフェラーゼ) 融合 蛋白として生産されるので、 GSTのァフィ二ティーカラムに GST-LFS融合蛋 質 を吸着させ、 上清液中の不純物と分離した後に、 GST と LFSの間にあらかじめ導 入してあるトロンビン認識部位を、 カラム上でトロンビン処理を行うことによつ て切断し、 変異導入 LFS蛋白質を得た。 詳細な方法は以下に示した。
ミニカラムに、 フアルマシア社製 Glutathion Sepharose 4Bを 0. 5ml充填し、 PBS 3mlで力ラムを洗浄した。
カラムに変異導入 LFSの GST融合蛋 [^質を含む大腸菌抽出液 2. 5mlをアプライ し、 自然落下で吸着処理した後、 4 ml の PBS でカラムを洗浄した。 Thrombin
Protease (アマシャムフアルマシアバイオテック社製： 27- 0846- 01) 溶液（0. 5U/ μ 1 ) 60 μ 1に、 0. 69mlの PBSを加えて混合後、この混合液 0. 5mlをカラムに入れ、 静かに混合液をカラムに流し入れた。 全量流し終えたらカラムの入出口ともにキ ヤップを取り付けて、 室温で 5 時間放置した。 フアルマシア社製 Benzami di ne Sepharose 6B (Thrombin Proteas eの吸着剤） を入れた 1. 5mlチューブをカラム の先端に取りつけ、 0. 5mlの PBSをカラムに流して溶出液をチューブに回収した。 冷蔵庫内で、 1 時間放置後、 遠心分離 （5000rpm x 30 秒） し、 Benzami d ine Sepharose 6Bを沈殿させて上澄み液を回収した。 回収した液を精製変異導入 LFS 溶液とした。
以上のような方法によって 69番目の Cysを Serにした LFS変異体と、 71番目 の Argを Leuにした LFS変異体を作成した。 得られた変異導入体の LFS活性は、 以下の方法を用いて実施した。
50un i t/ml に調整したニンニクァリイナーゼ 40 1 と、 任意の倍率に希釈した 精製変異導入 LFS溶液 10 Ai lを 1. 5ml容エツペンドルフチューブに加えた。 さら に、 20mg/ml に調整した 1—propenyl— cys te ine sulfox ide (PRENCS0) 20 μ 1 をカロ え、 密栓して室温で 3分間反応させた。 この反応液を、 以下の条件で安定させた HPLCに 1 // 1注入し、 リテンションタイム 9分前後の、 催涙成分のピークの面積 を求めた。 催涙成分の生成量を LFS活性の指標とした。
(HPLC条件）
HPLC：島津 LC10 —式
カラム ：ぺガシノレ 0DS φ 4、 250mm
溶出溶媒： 30 % 酸性メタノール （ p H3. 3 TFA水）
流速： 0. 6ral/min
カラムオーブン温度： 35°C、 検出波長： 254nm
その結果、 69番目の Cysを Serに変えた LFS変異体は無変換体と同等の LFS活 性を有していたが、 71番の Argを Leuに変換した LFS変異体は完全に LFS活性を 消失していた （図- 1 参照）。
これは、 変異導入していない LFS (コントロール） で、 LFS活性を持つことが確 認できた蛋白質量の、 480倍の蛋白質量に増やした場合においても同じであった。 すなわち、 71番 Bの Argを Leuに変換することによって、 LFS活性を完全に失う ことを示している。 以上の結果から、 LFSの 71番目の Argは活性中心の 1つであ る可能性が高いと判断された。
実施例 2
実施例 1 と同じ方法を使って、 33番目から 35番 0のアミノ酸の 2箇所 （33番 目の Lysを Leuに、 35番目の Gluを Ginに変換） に変異を導入した 33-35変換体 (以降 33 - 35又は 3335と呼ぶ） を作成した。 変異導入の際のプライマーには、 フ ォ ワ ー ド ： TGCTTTGCTTCCAAATACACTGCCACAGCAAGCATGGAC 、 リ ノ ー ス ： TGTATTTGGAAGCAAAGCATGGACTTTGCの 2種類を用レヽた。 また 88番目から.94番目の アミノ酸の 2箇所 （88番目の Gluを Ginに、 94番目の Aspを Asnに変換） に変異 を導入した 88-94変換体 （以降 88-94又は 8894と呼ぶ） も作成した。 変異導入の 際 の プ ラ イ マ ー に は 、 フ ォ ワ ー ド ： GAATTTTGGGCCAAGCAGAAGCTGGTGGCGCTGAACAATAAGAACATG 、 リ バ ー ス ： CTTGGCCCAAAATTCCTCTTCTATTGの 2種類を用いた。 さらに、 109番目から 114番目 に 3箇所 （109番 0の Thrを Alaに、 112番目の Gluを Ginに、 114番目の Tyrを Pheに変換）に変異を導入した 109- 114変換体（以降 109-114又は 109114と呼ぶ） も 作成 した。 変異導入の際のプラ イ マー に は、 フ ォ ワ ー ド ： TTTACTGAGTGTTTTGCTGGGTACCAGGATTTCACGGCTACCATG 、 リ ノく ー ス ： AAAACACTCAGTAAAAATATAACTGTAGCの 2種類を用いた。
最終的に得られた 33-35は LFS活性を有していたのに対して、 88-94は完全に LFSを消失しており、 109-114は大きく活性が減少していた。
本実施例で得られた大腸菌から得られた可溶性画分の SDS- PAGE による蛋白質 組成確認結果を図 2に、 LFS活性測定結果を表 5に示した。 LFS活性測定は実施例 1に示した方法を用いた。なお、 LFS活性は GST融合蛋! ^質の状態でも測定可能で ある。
図 2に示されるように可溶性画分には、 LFSの GST融合蛋白質に相当するバン ドが認められた（左図矢印）。 このように 88-94の可溶性画分には変異導入された LFSが存在するが、 LFS活性はまったく認められないことが判明した。
表 5 LFS活性菌結果 (HPLC)
Figure imgf000020_0001
なお、 上記表 5中 E2-3は、 コントロールの LFSを表す。
この 88— 94変異導入体が活性を完全に失う結果から、 変異を導入した 88番目 あるいは 94番目のアミノ酸が、単独あるいはその両方が活性中心である可能性が えられたので、 個々に変異を導入した変換体を実施例 1 と同等の方法を用いて作 成し確認した。 この時、 変異導入に使用したプライマーは、 88番目の変異導入体 (以下 88と呼ぶ）では、 フォワード： GAATTTTGGGCCAAGCAGAAGCTGGTGG、 リバース ： CTTGGCCCAAAATTCCTCTTCTATTGを用い、 94番目の変換体（以下 94と呼ぶ）では、 フ ォ ワ ー ド ： GAAGCTGGTGGCGCTGAACAATAAGAACATG 、 リ ノ ー ス ： CAGCGCCACCAGCTTCTCCTTGGCCCを使用した。最終的に得られたそれぞれの精製変異 導入体の活性は、 実施例 1に示した方法を用いて行った。
その結果、 94番目のアミノ酸への変異導入は、 LFS活性に影響がないものの、 88番 5のアミノ酸への導入は、完全に LFS活性を消失させ、 88番 Bのアミノ酸で ある Gl uが活性中心である可能性が得られた。以下に LFS活性の消失した 88-94、 及び LFS活性の減少した 109-114並びに 88及び 94それぞれの単独変異体の各精 製物について、 蛋白質量を揃えて LFS活性を測定した結果を表 7に示した。 なお 溶液の蛋白質量は、 Bradford法を用いて測定し、 その蛋白濃度を表 6に示した。
表 6 表 6 精製 LFS蛋白濃度
Figure imgf000020_0002
この蛋白質濃度の測定結果を元に、 何段階かの希釈したサンプルをそれぞれ作 成し、 LFS活性の測定を実施した。 また、 用いる変異導入 LFSの蛋白質量を十分多く しての活性測定も実施例 1同 様に実施した。 結果を表 7に示した。
表 7
表 7 精製変異導入 LFSの活性測 果 （Xは職率)
Figure imgf000021_0001
表に示したように、 コントロールとみなした LFS ( 精製 94は変異が導入さ れているが活性に影響のないのでコントロールとして用いた。）が定量範囲で活性 を示す量（4. 3ng) と同等の蛋白質量を用いた場合、 88- 94や 88は活性を示さず、 蛋白質量を 200倍まで多く しても全く活性がないことがわかった。これによつて、 確実に LFS蛋白が存在する場合において 88や 88-94は活性がないことが証明され た。
また、 活性が減少していた 109-114のコントロールに対する活性を比較した。 94の比活性 ： 52231Area/4. 25 ng = 12290 Area/ng
1091 14の比活 'I生： 41354 Area/1040 ng = 39. 8 Area/ng
比活性の比較 ： 12290/39. 8 = 308. 8
1091 14の比活性はコントロールの約 1/300'に減少していることが判明した。 実施例 3
88 番目アミノ酸をダルタミン酸からダルタミンに置換した失活型の置換 L F
S (88精製品）及び 88番目アミノ酸をグルタミン酸からグルタミンに 94番目のァ ミノ酸をァスパラギン酸からァスパラギンに置換した失活型置換 L F S (88-94 精製品）の多量存在下における、活性を保持した変異型 L F Sの酵素活性に対する 影響を調べた。
反応系は、 実施例 1に示した通常の L F S活性測定系を用い、 L F Sとして活 性型の置換 L F S ( 9 4精製品）を用いた。
具体的には、 94精製品 10 μ 1 (94が 4ng) を用い、 これに 88精製品及び 88 - 94 精製品 10 / l (88、 88-94が約 950ng) を加えて反応させ、 生成する LF の面積値 を HPLCで求めた。 比較対照として、 BSA溶液 1 0 1 (BSA1420ng) を用いた。 結果を表 8及び図 3に示す。
表 8
Sample 1 2 Ave
control (94(4.23 ng)) 58315 50275 54295
G+BSA(1420ng) 38171 38397 38284
C+88(976ng) 27277 24285 25781
0+8894(964ng) 21862 18120 19991
なお、 表 8及び図 3中 C+BSA (1420ng)は、 94精製品 10 (94が 4ng) に BSA 溶液 1 0 μ 1 (BSA1420ng) を加えたもの、 C+88は 94精製品 10 /i 1 (94が 4ng) に 88精製品 10 /i l (88が約 950ng) 加えたもの、 C+8894は 94精製品 10 /_ί 1 4が 4ng) に 88- 94精製品 ΙΟ μ Ι (88-94が約 950ng) を加えたものをそれぞれ示す。
88精製品及び 88 - 94精製品により顕著に LF活性が阻害されることが分かった。
<実施例 4 >
LFS活性を有する植物に、 変異型 LFS遺伝子を導入した形質転換植物
LFS活性を有するタバコを作出し、 この植物に変異型 LFS の遺伝子を導入して、 LFS活性の抑制効果を確認した。
2-1 LFS活性を有するタバコの作出
2-1-1. pH0USE-i 5 vectorの構築
活性のある LFSを生産するタバコを作る Θ的で、 pHOUSE- vector と言うべク ターを構築した。 このベクターは、 図 4に示す構造を持った、 pHOUSEを col と
Pmllの 2種類の制限酵素で処理し、 749bpの mgfp5領域を切り出し、 代わりに、 PCRで増幅して調製した 519bpの Ifs遺伝子を導入する事により調製した。 まず、 lfsの PCR産物は、 TVcoI - LFS - Π と ¾? 1- LFSanalog_rl と言う 2種類のプラ イマ一を用い、 下記表 9の反応液を用いて、 下記表 10の PCR条件で、 タマネギゲ ノム DNAを錄型にして得た。 lfsの PCR増幅産物を口ッシュ社の High Pure PCR Product Purification Kitで精製し、 Ncol と PtnRの 2種類の制限酵素で処理し て導入断片を得た。
Ncol-LFS-fl (配列） 5' -CAT GCC ATG GAG CTA AAT CCT GGT GC-3'
¾iI-LFSanalog-rl (配列） 5' - TCA CAC GTG TCA AGC ACT GCA AAC CTC TT— 3' 表 9
PCR反応組成：
Figure imgf000023_0001
Template DNA:20ng， Reaction volume:
表 1 o
PCR条件：
Figure imgf000024_0001
次に、 pHOUSEを Ncolと ΡηιΆの 2種類の制限酵素で処理し、 mgfP5を切り取つ た pHOUSEをゲルで分離し、 キアゲン社の QIAquick Gel Extraction Ki tを用いて 精製した。
こうして得られた 2つの制限酵素処理断片である lfs 導入断片と、 pHOUSE 断 片を、 インビトロジェン社の T4 DNA Ligaseでライゲーシヨンし、 インビロジェ ン社の Subcloning Effic i ency DH5 · Competent Cel l s (大腸菌） を形質転換し た。 さらに、 50 g/mlのカナマイシンを含む LB培地で培養する事で、 形質転換 コロニーを選抜した。 選抜したコロニー力 ら、 QIAprep S in Miniprep Ki t を使 つてプラスミ ドを精製し、 制限酵素処理と PCRで設計どおりの構造を持っている 事を確認した。 精製されたプラスミ ドで、 electrocompetent な Agrobac terium LBA4404を形質転換し、 50 g/ml のカナマイシンと、 100 i g/ml ス トレプトマ イシンを含む YM培地で形質転換体の選抜を行なった。 さらに、選抜した形質転換 体にプラスミ ドが導入されている事は、 PCR で確認した。 この様にして選抜した Agrobac teriu の形質転換体の保存は、 30%のグリセ口ール溶液に懸濁した対数増 殖期の菌体を、 一 80°Cに置く事で行なった。
なお、 抗生物質添加前の LB培地及び. MS培地の組成を以下に示す。 表 1 1
Luria-Bertani (LB)—Medium
Figure imgf000025_0001
Adjust pH to 7.0 with NaOH then autoclave to sterilize. 表 1 2
YM Medium
Figure imgf000025_0002
Adjust pH to 7.0 then autoclave to sterilize.
2-1-2. pHOUSE- ii¾ vectorのタノくコへの導入
無菌の培養器内で育てたタバコから Leaf Discを調製し これを形質転換林料に 使用した。 直系約 lcmの leaf discをァグロバタテリゥムの培養液に 2分間浸し た後、 ろ紙を使って leaf disc に付いた液を吸い取って乾かし、 1 mg/ml の BAP (6-Benzylaminopurine)を含む MS30培地（表 13参照）で 3日間、 共存培養を行 つた。共存培養後、 discは、 1 mg/ml の BAPと 200 mg/ml の timentin及び、 10 mg/1 の hygromycinを含む MS30培地へ移植した。 3から 4週間後、 カルスから再分化 して来た shootを分離し、 200 mg/ml の timentin及び、 10 mg/1 の hygroraycin を含む MS30培地へ移植した。 その後、健康的でよく成長した shootは、 発根を促 進するため、 100 mg/ml timentin 及び、 10 mg/1 の hygromycinを含む MS30培 地へ移植し、 LFS活性を有するタバコを作出した。 表 1 3
MS30 Medium (for tobacco)
Figure imgf000026_0001
Adjust pH to 5.8， add 3.5 g/1 Phytagel (gelrite, SIGMA) then autoclave. Cool to 60°C before adding the appropriate antibiotics. なお、 MS macro、 MS micro, MS iron, 及び MS vitaminsの糸且成は次のとおりであ る
表 14
20 X MS Medium (Macro)
[Murashige & Skoog (1962), Physiol. Plant. , 15:473 - 497]
Figure imgf000026_0002
表 1 5
200 X MS Medium (Micro)
[Murashige & Skoog (1962), Physiol. Plant. , 15:473-497]
Figure imgf000027_0001
表 1 6
200 X MS Iron
[Murashige & Skoog (1962), Physiol. Plant. , 15:473 - 497]
Figure imgf000027_0002
表 1 7
200 X MS vitamins [Murashige & Skoog (1962), Physiol. Plant. , 15:473 - 497]
Figure imgf000027_0003
2-2. LFSと、 変異型 LFSの両方の遺伝子を導入したタバコ
2 - 2-1. pHOUSE-7 5 mutant- /» 5ERの構築
pHOUSE-i 5 vector を導入した事によって、 LFS 活性を持つようになったタバ コに、 変異型 LFS の遺伝子をさらに導入するため、 pHOUSE - 7¾ mutant - 5ER と言うベクターを構築した。 このベクターは、 pH0USE-7 vector を構築した時 と同様に、 pHOUSEの Ncolサイ トと Pnd\サイ トの間に、 PCRで増幅して調製した 486bpの ¾ mutant遺伝子を導入した pHOUSE-Jfs mutantを構築した後、さらに、 ph 121-lfs hi-h-mgfp5ER (3copy)から切り出した mgfp5ERを、 pH0USE-JZ¾ mutant の Hindlll サイ トと サイ トの間に導入する事によって作成した。 まず、 If s mutantの PCR産物は、 yVcoI-LFSanalog-f 1 と ¾ I-LFSanalog-rl と言 うプライマ一を用い、 LFSmutantの配列を組み込んだ実施例 2で作成した 88番目 の変異導入体用の発現プラスミ ドを錄型にして得た。 pHOUSEの TcoIサイ トと PmRサイ トの間に LFSmutantの増幅産物を導入し、 pHOUSE- mutantを構築す る手順は、 pHOUSE - ¾ vectorの場合と同じである。
Figure imgf000028_0001
(3copy)を、 Τ¾' ΙΙ と S elの制限酵素処理する事で、 mgfp通を切り出し、 ゲノレ電気泳動後、 QIAquick Gel Extraction Kitで、 これを 精製した。
また、 pHOUSE - s mutantを / II と で制限酵素処理し、 マルチクロ 一ユングサイ トを消化した後、 High Pure PCR Product Purification Kitで精製 した。
精製した pHOUSE- ^ mutant と y» 5ERは、 T4 DM Ligaseでライゲーシヨンし、 pHOUSE- 7 5 mutant- mgfp5ERを構築した。
pH0USE-i 5
Figure imgf000028_0002
Subclonmg Efficiency DH5 · · Competent Cells
(大腸菌） を形質転換し、 形質転換されたコロニーを選抜し、 グリセロール溶液 にして保存する操作や、 精製されたプラス ミ ドで、 electrocompetent な
Agrobacterium LBA4404 を形質転換し、 選抜を行なってグリセロール溶液にして 保存する操作は、 pHOUSE- J vectorの場合と同様に行った。
/VcoI-LFSanalog-fl (配列） 5' -CAT GCC ATG GAT TCG GCG AAT GGG GCG CGG AA - 3， ¾7I-LFSanalog-rl (配列） 5 ' _TCA CAC GTG TCA AGC ACT GCA AAC CTC TT- 3
2-2-2. pHOUSE-i 5 mutant - ^ io5ERの LFS発現タバコへの導入
無菌の培養器内で育てた LFS発現タバコから Leaf Discを調製し、 これを形質転 換材料に使用した。 pHOUSE-Jfs mutant- ^ 5ER を導入したァグロパクテリゥム を底系約 lcmの leaf disc へ感染させ、 選抜培養を行い、 健康的でよく成長した shootと根を持ったタバコの植物体を得る手順は、 LFS発現タバコの調製（2- 1-2) と同じ手順である。 ただし、 GFPが発現している事を、選抜の指標にした。 また、 導入遺伝子の確認は、 gfpと lfs mutantを標的にした PCRで行なった。
2-3. LFS活性の比較
形質転換をしていないコントロールのタバコ （C)、 lfs を導入したタバコ （L)、 並びに、 （L) に lfs mutantを導入したタバコ （L+M) の 3種類のタバコについて、
LFS活性と蛋白質量を測定し、 比活性を算出して試料間の差を求めた。
無菌の培養器内で育てたタバコから、 健康な葉 （生重量約 60〜90mg) を採種し、 重量を測定した後、 10倍の液量に相当するリン酸緩衝液 PBS pH7. 4) を加え、 粉 砕した後、 遠心分離 （15, 000rpm X 5min) して上澄みを得た。 上澄みを上記リン酸 緩衝液でさらに 2倍に希釈して、 蛋白量と LFS活性を測定した。
LFS活性の測定法は、 実施例 1と同じであり、 蛋白の測定は、 Bradford法で測定 した。
LFS比活性を測定した結果、 試料 （C) には LFS活性がなく、 lfsを導入した試料 (L) には、 LFS活性があり、 さらに、 lfs mutantを導入した （L+M) では LFS活 性が抑制される事が示唆された。 表 1 8
Figure imgf000030_0001
産業上の利用可能性
本願発明により、 初めて、 変異型の催涙成分生成酵素が提供され、 催涙成分生 成酵素の機能解析が可能となった。 また、 本願発明により、 変異型の催涙成分生 成酵素を有効成分とする本酵素の阻害剤が提供されたことにより、 本酵素活性の 制御がはじめて可能となり、 さらに、 タマネギの調理において、 Bの痛み、 涙を 抑えることができるようになった。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 1に示される催涙成分生成酵素 （以下 L F Sとも言う） の変異 体であって、 当該変異体は、 少なくとも、 7 1番目のアミノ酸 （アルギニン） 及 び/又は、 8 8番目のアミノ酸 （グルタミン酸） を他のアミノ酸に置換した変異 を含む、 L F S活性が欠失した催涙成分生成酵素変異体。
2 . 配列番号 1で示される L F Sにおいて 71番目のァミノ酸をアルギニンか らロイシンに置換させた請求項 1記載の催涙成分生成酵素変異体。
3 . 配列番号 1で示される L F Sにおいて 88番目のァミノ酸をグルタミン酸 からグルタミンに置換させた請求項 1記載の催涙成分生成酵素変異体。
4 . 請求項 1〜3いずれか 1項記載の催涙成分生成酵素変異体を有効成分とし て含有する催涙成分生成酵素阻害剤。 ·
5 . 配列番号 2に示される催涙成分生成酵素 （以下 L F Sとも言う） をコー ドする遺伝子において、 第 2 6 5〜2 6 7番目の塩基、 及び Z又は、 第 3 1 6〜 3 1 8番目の塩基に変異を有する、 L F S阻害活性を有する催涙成分生成酵素変 異体をコードする遺伝子。
6 . 第 2 6 5〜 2 6 7番目の塩基がロイシンをコードするコドンである請求 項 5記載の L F S阻害活性を有する催涙成分生成酵素変異体をコードする遺伝子。
7 . 第 3 1 6〜3 1 8番目の塩基がグルタミンをコ一ドするコ 'ドンである請 求項 5記載の L F S阻害活性を有する催涙成分生成酵素変異体をコードする遺伝 子。
8 . 請求項 5〜7いずれか 1項記載の L F S阻害活性を有する催涙成分生成 酵素変異体をコードする遺伝子を導入されたァリゥムに属する形質転換植物。
9 . ァリゥムに属する植物が、タマネギである請求項 8記載の形質転換植物。
1 0 . 以下 （ィ） から （ハ） の工程を含む、 ァリウムに属する変異植物から催 涙性が低下した変異植物候補を選抜する方法。
(ィ） 突然変異処理により、 ァリ ウムに属する植物に突然変異を導入する工程、
(口） 突然変異したァリウムに属する植物から、 DNAを抽出する工程、
(ハ） 抽出した DNAが、 L F S活性を欠失した変異体 LFSをコードしているか否 か検出することにより催涙性が低下した変異植物候補を選抜する工程。
1 1. 催涙成分生成酵素の基質との親和性を有する L F S活性を欠失した催 涙成分生成酵素変異体を有効成分として含有する催涙成分生成酵素阻害剤。
1 2. 活性中心に変異を導入することにより LF S活性を欠失した催涙成分 生成酵素変異体を有効成分として含有する催涙成分生成酵素阻害剤。
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