CN113549135B - 二色补血草基因LbCPC及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供二色补血草基因LbCPC及其应用。本发明从二色补血草中克隆基因LbCPC，其开放阅读框大小为321bp，编码106个氨基酸。经分析，LbCPC编码R3MYB转录因子，其对表皮毛的起始均起到抑制作用，而对根毛的形成起到促进作用。通过对LbCPC基因和启动子进行了克隆及生物信息学分析表明LbCPC在二色补血草的生长发育的过程中可能起到重要作用。进一步获得二色补血草LbCPC过量表达株系，表现为叶片部分盐腺结构显著改变，组成细胞数明显成组增加，出现大量5、6、7、8发光点盐腺，由此推测LbCPC起到正向调控盐腺发育的作用。本发明为进一步探究揭示盐腺的发育机制奠定基础。

Description

二色补血草基因LbCPC及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及二色补血草基因LbCPC及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是全球面临的环境问题，影响着地球表面6.5％左右的土地。在大约2.3亿公顷的灌溉农田中，有20％左右的土地面积受到盐渍化的影响，由于不当的灌溉习惯，这一比例逐年增加。要扩大耕地面积必须改造和充分利用大面积的盐碱地。极少有农作物可以在盐渍化严重的地区生存，导致农产量大幅下降，还会导致土壤退化和荒漠化。因此，为了应对盐渍化对农业的挑战，有必要通过用耐盐基因转化非盐生植物来提高其耐盐性。盐生植物具有耐盐的关键特性，可以在≥200mM NaCl的环境中生存并完成其生命周期，并在生态保护和盐渍土壤的恢复中发挥重要作用。了解盐生植物的耐盐机理将有助于探索抗盐基因，以增强作物等非盐生植物对高盐度环境的适应性，这不仅对于盐碱地的开发和利用有重要意义，对农业生产和环境的可持续发展也起着至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供二色补血草基因LbCPC及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供二色补血草基因LbCPC，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

本发明从二色补血草中克隆得到基因LbCPC，其开放阅读框大小为321bp，编码106个氨基酸(SEQ ID NO:1)。经分析，LbCPC编码R3MYB转录因子。

第二方面，本发明提供二色补血草基因LbCPC启动子，其序列为：

i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供含有所述基因LbCPC或所述启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第四方面，本发明提供所述启动子在调控下游基因表达中的应用，所述下游基因包括但不限于基因LbCPC，报告基因GFP等。

第五方面，本发明提供所述基因LbCPC、所述启动子或含有所述基因LbCPC或所述启动子的生物材料在制备转基因植物中的应用。

第六方面，本发明提供所述基因LbCPC或含有基因LbCPC的生物材料的以下任一应用：

(1)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；

(2)用于植物品种改良；

(3)用于盐碱地改良。

优选地，所述植物为二色补血草。

所述调控为正调控，例如正调控盐腺细胞数目，促进盐腺生长发育等。

第七方面，本发明提供一种使二色补血草盐腺细胞数目增加、促进盐腺生长发育的方法，所述方法选自如下①或②：

①使植物表达权利要求1所述基因LbCPC编码的蛋白；

②在植物中过表达权利要求1所述基因LbCPC；

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

5)通过导入增强子；

优选地，所述植物包括泌盐盐生植物，如二色补血草。

第八方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因植物的以下任一应用：

i.用于植物育种；

ii.用于盐碱地种植。

所述育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

本发明首次从二色补血草中克隆得到基因LbCPC，其编码R3MYB转录因子，对表皮毛的起始均起到抑制作用，而对根毛的形成起到促进作用。通过对LbCPC基因和启动子进行了克隆及生物信息学分析表明LbCPC在二色补血草的生长发育的过程中可能起到重要作用。进一步获得二色补血草LbCPC过量表达株系，表现为叶片部分盐腺结构显著改变，组成细胞数明显成组增加，出现大量5、6、7、8发光点盐腺，由此推测LbCPC起到正向调控盐腺发育的作用。本发明为进一步探究揭示盐腺的发育机制奠定基础。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中LbCPC基因CDS全长电泳图。M为DL2,000DNA marker。

图2为本发明较佳实施例中LbCPC基因的核酸序列和蛋白质氨基酸序列。

图3为本发明较佳实施例中LbCPC蛋白的三级结构预测结果。

图4为本发明较佳实施例中LbCPC的系统进化树分析结果。

图5为本发明较佳实施例中LbCPC、LbTRY、AtCPC和AtTRY基因编码的氨基酸序列同源性比对情况。A：全长氨基酸序列比对；B：保守序列氨基酸比对。

图6为本发明较佳实施例中LbCPC基因在叶片发育不同时期的相对表达量。

图7为本发明较佳实施例中以LbCPC 5SPs和APs为引物的1st、2nd、3rd PCR产物电泳图。箭头示目的条带。M，λ-HindⅢdigest；1-3，AP1 1st 2nd 3rd PCR产物；4-6，AP2 1st2nd 3rd PCR产物；7-9，AP3 1st 2nd 3rd PCR产物；10-12，AP4 1st 2nd 3rd PCR产物。

图8为本发明较佳实施例中LbCPC过量表达株系DNA水平上的鉴定。WT,野生型；M，相对分子量2000的marker；1-7,过量表达株系。

图9为本发明较佳实施例中二色补血草过量表达株系LbCPC基因相对表达量，二色补血草TUBULIN基因作为内参。图中数据为3个重复的平均值±SD，不同字母(a,b,c)表示在P＜0.05水平上的差异显著。

图10为本发明较佳实施例中DIC和荧光显微镜下二色补血草野生型植株盐腺，标尺＝20μm。

图11为本发明较佳实施例中无菌培养15天的二色补血草叶片酶解所得盐腺，标尺＝50μm。

图12为本发明较佳实施例中DIC和荧光显微镜下6天龄植株第一片真叶，标尺＝50μm。

图13为本发明较佳实施例中DIC和荧光下过量表达LbCPC基因后叶片发育初期二色补血草盐腺发育情况，标尺＝50μm，箭头所指为异常细胞团。

图14为本发明较佳实施例中DIC和荧光下过量表达LbCPC基因后二色补血草盐腺发育情况，标尺＝20μm，箭头所指为异常盐腺。

图15为本发明较佳实施例中DIC显微镜下成熟叶片结构。SG，盐腺；ST，气孔；EP，表皮细胞。

图16为本发明较佳实施例中DIC和荧光下过量表达LbCPC基因后二色补血草叶片上不同类型八发光点盐腺，A：正常毗邻盐腺；B：8字结构毗邻盐腺；C：葫芦形毗邻盐腺，标尺＝10μm。sc，分泌细胞；ac，毗邻细胞。

图17为本发明较佳实施例中激光共聚焦显微镜下过量表达LbCPC基因后二色补血草的八发光点盐腺。标尺＝25μm。sc，分泌细胞；ac，毗邻细胞；ic，内分泌细胞。

图18为本发明较佳实施例中过量表达LbCPC基因后二色补血草5、6、7发光点盐腺，A：五发光点盐腺；B：六发光点盐腺；C：七发光点盐腺，标尺＝10μm。sc，分泌细胞；ac，毗邻细胞。

图19为本发明较佳实施例中八发光点盐腺的八细胞初始盐腺结构细胞分化方向示意图。A：突变体lb23-3八细胞初始结构；B：LbCPC过量表达株系八细胞初始结构。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 LbCPC基因的克隆及生物信息学分析

1材料

二色补血草[Limonium bicolor(Bunge)O.Kuntze]种子，采自中国山东东营市黄河三角洲盐碱地。充分干燥后，放入冰箱4℃保存。选择大小一致、籽粒充盈的种子进行辐照诱变处理。

2实验方法

2.1 LbCPC克隆及生信分析

利用二色补血草盐腺发育时期(A时期)的叶片提取其总RNA，利用反转录试剂盒，反转得到cDNA。根据前期二代转录组数据，结合3’RACE和5’RACE技术，设计引物克隆二色补血草LbCPC基因，并进行生物信息学分析。

2.1.1二色补血草种子的消毒与培养

将二色补血草种子置于75％乙醇中震荡5min，进行表面消毒，然后置于6％的次氯酸钠中充分震荡18min，之后无菌水冲洗4次，室温静置25min后无菌水冲洗3次，最后将种子均匀播种在MS培养基上，置于光照培养室中培养。培养室温度设为26℃/22℃(昼/夜)，光周期16h/8h(昼/夜)，光照强度为600μmol/m²/s。

2.1.2总RNA的提取和纯化

对二色补血草叶片发育的五个时期进行取材，解剖镜下将第一片真叶取下，迅速置于盛有液氮的研钵中，五个时期(A-E)分别富集约7000、5000、3000、1000、1000片真叶后，进行总RNA的提取和纯化。利用植物总RNA提取的试剂盒Karroten Total PlantRNAExtraction kit(Karroten,Beijing,China)，按照说明书操作。

2.1.3 RNA的逆转录PCR

RT-PCR使用ReverTra

qPCR RT Kit(Japan TOYOBO CO.,LTD)，反应体系为20μl，按照说明书操作。

2.1.4二色补血草表皮毛发育同源基因LbCPC基因的克隆

根据二色补血草叶片发育的转录组文库中LbCPC基因的拼接序列，利用Primerpremier 5软件，设计克隆基因特异性片段、3’RACE、5’RACE和CDS全长的引物，引物序列如表1所示，使用cDNA为模板，对基因CDS序列进行克隆：

表1二色补血草LbCPC基因全长克隆所用引物

(1)中间片段克隆：

普通PCR反应体系(25μl)：

(2)3’RACE扩增基因3’末端：

用A时期RNA，QT代替oligo dT利用ReverTra

qPCR RT Kit进行反转录，获得cDNA，以其为模板，3RACE GSP1和QO为引物进行第一轮PCR，然后再用嵌套引物3RACE GSP2和QI为引物进行第二轮PCR循环。

(3)5’RACE扩增基因5’末端：

利用5’RACE system for rapid amplification of cDNA ends,Version 2.0(Invitrogen)试剂盒，

①进行反转录，具体步骤如下：

反转录体系(25μl)：

5RACE GSP1(10μmol/L) 0.25μl

RNA 1-5μg

DEPC处理水 补齐到15.5μl

置于PCR仪中，70℃，10min使RNA变性，然后冰浴2min，再依次加入：

置于PCR仪中，42℃，1min，然后加入1μl SuperScript^TM II RT；

42℃，50min

70℃，15min

37℃，20s

然后加入1μl RNase mix，37℃，30min。

②cDNA加尾，步骤如下(25μl)：

94℃，3min，然后冰浴1min，加入1μl TdT，37℃，10min，然后65℃，10min，反应结束。

③PCR扩增，体系如下(50μl)：

④巢式扩增

将PCR体系中引物换成5RACE GSP2和AUAP，方法同上。

(4)基因全长克隆

利用引物CDS S和CDS A，克隆基因CDS序列，方法同特异性片段的克隆。

2.1.5二色补血草LbCPC基因克隆载体的构建

(1)对基因全长克隆的PCR产物进行切胶回收，胶回收使用Gel Extraction Kit(200)(OMEGA bio tech,USA)。

(2)回收产物连接克隆载体pEASY T3。

(3)热激法转化Trans T1大肠杆菌感受态细胞。

(4)质粒提取，使用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒。

2.1.6荧光定量PCR

荧光定量PCR所用引物见表2：

表2荧光定量PCR实验所用引物

采用ChamQ^TM Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)试剂盒配置反应体系，进行Real-time PCR，计算方法是相对定量法。在保证内参基因(LbTUBULIN)在各组中表达量中都保持稳定的前提下，统计C(T)值。定量PCR的计算公式：Relative expression level＝2^-△△C(T)。

2.1.7生物信息学分析

使用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)数据库对二色补血草LbCPC基因序列和所编码的蛋白进行同源分析；Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的一级理化性质；Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_hnn.pl)对蛋白质的二级结构进行预测；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)对蛋白进行三级结构分析；ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)工具预测蛋白疏水性和亲水性；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测和分析蛋白的跨膜结构域；SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白的保守结构域和蛋白类型；MegA6和ClustalX等软件进行同源序列比对和系统进化树构建。

3实验结果

3.1 LbCPC基因的CDS全长克隆

利用二色补血草叶片发育A时期的cDNA为模板，克隆特异性片段，然后进行3’RACE和5’RACE，最终拼接后分别获得三个基因的全长，琼脂糖凝胶电泳见图1。

3.2 LbCPC基因的生物信息学分析

3.2.1 LbCPC蛋白的结构

根据二色补血草叶片发育转录组数据中LbCPC基因的拼接序列，结合RACE技术，克隆得到321bp的开放阅读框，编码106个氨基酸(图2)。通过ExPASY分析，蛋白质相对分子量12755.52Da，等电点(PI)9.62，该蛋白质分子式(Fomula)为：C₅₅₀H₈₈₃N₁₇₉O₁₆₀S₆，原子总数1778个，其中带负电的氨基酸(Asp+Glu)16个，带正电的氨基酸(Arg+Lys)21个；不稳定指数(Instability index)为92.08，属于不稳定的蛋白质；脂肪酸指数(Aliphatic index)为66.32。

Prabi软件预测显示，LbCPC蛋白的二级结构含有三种二级结构元件，所占比例分别为α-螺旋(Alpha helix)50.94％，延伸链(Extended strand)9.43％，无规卷曲(Randomcoil)39.62％，其中α-螺旋所占比例最多。

利用ProtScale进行亲疏水性预测，分析结果中分值越低亲水性越强，LbCPC蛋白的氨基酸大部分是分布在负值区域，亲水区域显著大于疏水区域，因此整个氨基酸序列表现为亲水性，LbCPC蛋白为亲水蛋白。

通过TMHMM软件对跨膜区进行预测，显示LbCPC蛋白位于膜内，没有跨膜区的存在。进一步用SMART软件预测LbCPC蛋白的保守结构域，发现在氨基酸序列中有1个SANT保守序列，位于31-79个氨基酸之间。

利用在线软件SWISS-MODEL对LbCPC的三级结构进行了预测，给出了可能的三级结构预测图，结果可见α-螺旋、延伸链和无规卷曲等蛋白质的二级结构元件在三维空间排列情况(图3)。

3.2.2LbCPC蛋白的进化分析

将LbCPC蛋白进行NCBI Blast，与结果中的来自其他15个物种的CPC蛋白进行比对并绘制系统进化树(图4)，分析表明，二色补血草CPC与巨桉的CPC具有相对较高的同源性，其次是陆地棉，克莱门柚。

3.2.3 LbCPC、LbTRY与AtCPC、AtTRY基因的保守结构域的分析

LbCPC、LbTRY、AtCPC和AtTRY基因编码的氨基酸进行比对，具有59.21％的同源性，具有典型的MYB结构域的三个色氨酸(图5A)，将四个基因的保守SANT结构域进行比对，同源性达到86.88％(图5B)，说明这四个基因相对比较保守。

3.3 LbCPC基因在叶片发育的五个时期的表达量变化

根据二代转录组测序结果，LbCPC基因在不同时期的表达量存在差异，为了进一步验证三个基因在叶片发育不同时期的表达量变化，对叶片发育不同时期三个基因的表达量进行Real-time PCR，结果显示(图6)，LbCPC在A时期表达量较高，但在D和E时期表达量显著增加。

实施例2基因LbCPC启动子的克隆及功能分析

1二色补血草LbCPC基因启动子的克隆

根据基因DNA序列，设计克隆基因5'端DNA侧翼序列的引物(表3)。

表3 LbCPC基因5'端DNA侧翼序列克隆所用引物

使用TaKaRa Genome Walking Kit(Code No.6108)进行反应，以叶片基因组DNA为模板，反应步骤如下：

(1)1st PCR反应：

以AP 1(AP2、AP3、AP4同时进行)作为上游引物，5SP1为下游引物，进行第一次PCR反应。

①按下列组份配制1st PCR反应液。

②1st PCR反应条件如下：

(2)2nd PCR反应：

将1st PCR反应液稀释1～1000倍后，取1μl作为2nd PCR反应的模板，以AP1Primer为上游引物，5SP2 Primer为下游引物，进行2nd PCR反应。

①按下列组份配制2nd PCR反应液：

②2nd PCR反应条件如下：

72℃10min。

(3)3rd PCR反应：

将2nd PCR反应液稀释1～1000倍后，取1μl作为3rd PCR反应的模板，以AP1Primer为上游引物，5SP3 Primer为下游引物，进行3rd PCR反应。

①按下列组份配制3rd PCR反应液：

②3rd PCR反应条件如下：

72℃10min。

(4)取1st，2nd，3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。

(5)切胶回收清晰的电泳条带，以5SP3 Primer为引物对PCR产物进行DNA测序。

(6)取1st，2nd，3rd PCR反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。

(7)切胶回收清晰的电泳条带，切胶回收，将回收产物转化到PMD19T克隆载体，然后通过热激法转化到大肠杆菌Trans-T1感受态中，挑取单菌落，划线，摇菌，提取质粒进行测序，pMD18 F、P1、pMD18 R、5SP3 Primer为引物对PCR产物进行DNA测序。

2 LbCPC基因启动子的分析

使用PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp./htdocs/PLACE)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网上在线工具对LbCPC的启动子序列顺式作用元件进行分析。

3结果

以嵌套引物LbCPC 5SP1、LbCPC 5SP2、LbCPC 5SP3和兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4为引物，使用TaKaRa Genome Walking Kit试剂盒，利用染色体步移法，进行PCR后，取第一、二、三次的PCR产物各5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，三次所得的条带如图7所示，根据嵌套引物的位置，3次克隆得到的条带呈梯度减短，对不同条带进行切胶回收，利用LbCPC 5SP3引物测序，与LbCPC基因序列进行比对，结果找到与LbCPC基因序列已知片段高度同源的目的条带。

将此目的条带的回收产物连接到PMD 19T克隆载体上，转化大肠杆菌后，使用LbCPC PF1和LbCPC PR1为引物基因菌落PCR鉴定，挑取鉴定出来的菌株放入液体LB培养基中，加入Amp进行摇菌，提取质粒后使用通用引物pMD18 F、pMD18 R和LbCPC PF1、LbCPC PR2引物进行序列测定，测序结果显示，所得DNA片段对应LbCPC基因，在测序结果中可以找到基因序列部分。最终获得LbCPC基因5’端序列1952bp。

LbCPC启动子元件分析：

LbCPC基因的启动子序列，除了有多个TATA-box和CAAT-box外，还存在光反应性顺式作用元件(G-box)，对厌氧诱导必不可少的顺式调节元件(ARE)，生长素反应的顺式作用调控元件(AuxRR-core)，ABA调控元件(ABRE)，赤霉素反应元件(GARE-motif)，MeJA反应元件(CGTCA-motif)(表4)。

表4 LbCPC启动子序列顺式作用元件分析

这些结果表明LbCPC的5’序列均含有启动子的基本顺式作用元件，除此之外，LbCPC基因的启动子序列上还含有许多与非生物胁迫相关的元件，如ABRE，GARE-motif，CGTCA-motif，LbTRY基因的启动子序列上含有CGTCA-motif，表明它们可能参与植物非生物胁迫。

LbCPC的启动子上除了基本顺式元件外，还有诸多参与植物生长发育的作用元件，如光反应的元件，以及生长素、脱落酸、赤霉素和茉莉酸甲酯的反应元件，说明该基因在二色补血草的生长发育过程中可能起到重要的作用，该基因启动子可能受到生长素、脱落酸、赤霉素和茉莉酸甲酯的诱导。

实施例3 LbCPC过表载体及转基因植物的构建

1LbCPC过表载体的构建

(1)使用Takra高保真酶克隆基因的CDS序列，引物两端分别加KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点和相应保护碱基(表5)，切胶回收后连接到pEASY T3克隆载体，转化大肠杆后提取质粒，与pCAMBIA 1300-35S-sGFP表达载体进行双酶切，反应体系如下：KpnⅠ(BamHⅠ)1μl，载体或质粒1μg，CutSmart Buffer 5μl，H₂O补齐至50μl。37℃反应30min。

(2)酶切完成后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，之后切取琼脂糖凝胶中与目的片段，然后利用胶回收试剂盒回收DNA片段，使用T4连接酶连接酶切后的载体及片段，连接反应体系(20μl)如下：片段8μl，载体9μl，10×T4 DNA连接酶反应缓冲液2μl，T4 DNA连接酶1μl。16℃过夜。

(3)连接产物转化大肠杆菌，提取质粒后转换农杆菌EHA105，具体步骤如下：

①取出农杆菌感受态(-80℃冰箱中保存)，冰浴中待其完全融化。

②取4μl质粒加入到100μl农杆菌感受态中，立即冰浴30min。

③冰浴后，液氮中速冻5min，迅速取出置于37℃水浴5min，然后再冰浴5min。

④向管中加入900μl液体YEB培养基，28℃摇床中180rpm震荡3h。

⑤菌液室温6000rpm离心1min，去上清，保留菌体沉淀。加入50μl液体YEB重悬菌体。

⑥将悬浮菌液均匀涂布到加有Kana和Rif的固体YEB培养基上，倒置，28℃培养两天，筛选阳性克隆。

表5带有酶切位点的LbCPC基因克隆的引物

2 LbCPC过表株系的表型分析

2.4.1农杆菌介导的二色补血草遗传转化

(1)菌液制备

取出-80℃冰箱保存的农杆菌菌液，冰浴融化化后涂布于加有50mg/L Kana和Rif的YEB固体培养基上，28℃黑暗培养。挑取单克隆菌落，接种于YEB液体培养基，28℃摇床中180rpm培养24小时，取出1ml菌液，重新加入到含有50mg/L Kana和Rif的YEB液体培养基中，加入乙酰丁香酮AS(终浓度20μM)，28℃摇床中180rpm培养6小时。将菌液倒入50ml大离心管中，4℃ 6,000rpm离心5min，去上清，加入液体MS重悬菌体沉淀，加入AS(终浓度200μM)，紫外分光光度计测浓度为0.7-1.0(OD₆₀₀)，用于浸染二色补血草预培养的叶片。

(2)切叶片预培养

二色补血草培养60天无菌苗，切成1cm×1cm大小，置于N2(MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA)培养基上，24℃暗培养两天，侵染过程中培养基配制参照袁芳，二色补血草盐腺发育机制的初步研究(2014)。

(3)侵染

预培养两天的叶片浸入到准备好的菌液中，充分侵染20min，用镊子取出叶片，用滤纸将多余的菌液吸干后，将叶片置于放有一层滤纸的芽诱导共培养的培养基(含有10mg/ml葡萄糖)上，黑暗条件下，24℃共培养4天，之后将叶片转移到筛选培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+600mg/L哌拉西林钠+8mg/L潮霉素)。24℃，光照培养，每隔15天将叶片转移到新的筛选培养基上，待生芽后，掰芽，置于生根培养基(MS+0.5mg/L IBA+8mg/L潮霉素)中。

3结果

实验中采用pCAMBIA 1300-35S-sGFP过表达载体(购自Invitrogen)，具有潮霉素抗性，报告基因GFP。

LbCPC基因与表达载体的连接：使用带有KpnⅠ和BamHⅠ内切酶酶切位点的引物进行PCR克隆LbTTG1、LbCPC和LbTRY基因全长，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物切胶回收后连接到pEASY T3载体上，菌落PCR鉴定后，提取质粒，将带有目的基因片段的克隆载体和空的表达载体进行双酶切，LbCPC基因片段318bp，克隆载体约为3000bp，表达载体酶切后片段长度为10kb，结果完全正确，酶切后连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆菌落，划线后进行菌落PCR验证，提质粒进行测序，测序结果完全正确，然后转化农杆菌，最后进行菌落PCR鉴定阳性菌株。

过表株系表型分析：

(1)潮霉素筛选过量表达株系

利用潮霉素作为筛选压筛选转基因植株，预培养叶片经过筛选培养脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成芽，芽产生后将芽掰下来置于生根培养基中生根，最终长成成熟苗。

过量表达载体pCAMBIA1300-35S-sGFP具有潮霉素抗性，转基因植株在带有潮霉素筛选压的培养基上能够正常生长，而非转基因植株受到潮霉素的胁迫最终导致黄化死亡。

(2)过量表达株系DNA水平上的鉴定

将获得的LbCPC基因过量表达株系，用LbCPC基因上的引物为上游引物和GFP上的引物为下游引物，以基因组DNA作为模板，对LbCPC基因的过量表达株系进行PCR克隆和阳性株系的鉴定，经过琼脂糖凝胶电泳，得到目的片段(图8)。

(3)过量表达株系RNA水平上的鉴定

提取野生型和LbCPC过量表达株系叶片的总RNA，反转录获得cDNA后，使用LbCPC基因real-time PCR引物对1-7号不同株系的LbCPC基因的表达量进行荧光定量PCR的测定，结果显示，株系2的表达量最高，株系7次之，其他株系与野生型差异不太显著(图9)。

(4)LbCPC基因过量表达二色补血草株系表型鉴定

野生型二色补血草盐腺在330-380nm的紫外激发光下具有蓝色的自发荧光，呈花环状结构，可以看到由于细胞间角质层加厚而形成的明显的四个发光点盐腺，正常成熟盐腺的直径一般在20-40μm左右，经过酶解的盐腺整体结构的直径大小也在此范围内，野生型植株成熟盐腺和MS培养基上培养6天的植株的第一片真叶上刚发育完成的盐腺的直径均在此范围内，并且叶片上通常只存在一种具有四发光点的自发荧光盐腺结构(图10～图12)。

二色补血草野生型植株叶片经过农杆菌侵染，潮霉素筛选后，获得了LbCPC基因的过量表达株系，我们对再生产生的发育时期的小芽进行观察发现，过量表达后叶片表面产生大量异常的细胞团，细胞团中细胞数目不等，细胞团大小不一。为了研究这些细胞团究竟是否会发育成盐腺，发育成熟的盐腺是否会发生变化。我们选择表达量最高的过量表达株系L2为观察对象，对盐腺的表型进行观察(图13)。

叶片成熟后，利用DIC和紫外激发光对叶片表面进行观察，发现大量成簇的盐腺的产生，可以看到毗邻盐腺的存在，毗邻的盐腺又分为多个盐腺成堆分布和两个盐腺相邻分布的类别，另外还有多发光点的盐腺存在。待植株叶片表皮结构发育完善，取成熟叶片制作装片进行观察，此时盐腺，气孔、不规则形状的表皮细胞都已经形成。经过统计发现，叶片表面出现最多的突变情况是毗邻的盐腺，如图14～图18所示，毗邻的盐腺大概有两种类型，一种是两个盐腺只是相邻，呈现8字结构，两个盐腺连接处角质层没有紧密连接，两个盐腺还是单独的个体；另一种是盐腺毗邻处紧密连接，呈葫芦形，看上去类似八组细胞的一个整体，对盐腺结构的影响不是很大，毗邻的两个盐腺显示出八发光点的结构，但是两个盐腺复合体之间是单独存在还是紧密相连并不确定。利用激光共聚焦显微镜观察发现，LbCPC基因的过量表达株系叶片上葫芦形的突变盐腺，结构上更像是两个相邻的细胞在发育早期形成盐腺的拟分生母细胞，然后在接下来的盐腺发育的过程中，两个盐腺一直相邻，但是盐腺的细胞组成类型和排列规律没有发生改变，仍然是由内向外的分泌细胞、毗邻细胞、内杯状细胞和外杯状细胞。除了两细胞毗邻的盐腺，叶片上还观察到了具有5、6、7个发光点的盐腺，形状各异。

以上实验结果表明，LbCPC基因在盐腺发育过程中起到重要作用，过量表达该基因后，出现盐腺的毗邻以及多发光点盐腺，说明LbCPC基因对于盐腺的发育可能起到促进作用，可能在初期盐腺拟分生母细胞分化时促进细胞分裂及分化，导致最终产生5个、6个、7个或8个细胞的盐腺初始结构，然后经过后期分化，形成相应的20、24、28、32个细胞的盐腺结构，需做进一步深入研究。

本发明首先对LbCPC基因编码的蛋白进行了生物信息学分析。通过分析预测了其蛋白的一、二、三级结构，LbCPC编码R3MYB转录因子。拟南芥中AtCPC编码R3MYB转录因子，除了参与调控表皮毛和根毛的发育外，有研究表明AtCPC还正向调控气孔的形成，并且参与到花青素的形成过程。不同的物种中R3MYB转录因子行使的功能也有所不同。LbCPC基因在二色补血草叶片发育不同时期的表达量显著差异，为了进一步探究LbCPC基因在多细胞盐腺复合体发育过程中的作用，又构建了LbCPC基因的过表株系，发现三个基因在二色补血草盐腺发育中起到重要的作用。过量表达LbCPC基因后，二色补血草叶片上出现大量的毗邻的盐腺，毗邻盐腺分为两种类型，一种是8字形，只是两个盐腺相邻，中间没有表皮细胞隔开，两个盐腺紧挨着存在，另外一种类型为葫芦形结构，两个盐腺之间有部分的连接，看上去像是一个八发光点盐腺复合体，而通过激光共聚焦显微镜观察，两个盐腺表面细胞存在加厚的角质层，但是盐腺内部没有角质层的存在，所以更像是一个盐腺整体。除了毗邻的盐腺还有部分多发光点的盐腺的产生，说明LbCPC基因在盐腺发育的过程中可能起到正向调控的作用，过量表达LbCPC基因后，发育成为盐腺的拟分生母细胞在分裂的初期，经过两次分裂后形成四细胞的初始盐腺结构，但是初始盐腺结构中的四个细胞没有进行下一步的分化，而是又进行了一次分裂，其中几个细胞多进行一次分裂，就会产生相应的毗邻的8字型盐腺。而八发光点盐腺的类似两个盐腺相邻，可能是四细胞初始结构再分裂一次后形成八细胞盐腺初始结构，然后八细胞初始结构开始进行分化，而分化的方向不同于正常盐腺，正常盐腺四细胞初始结构的四个细胞呈向外辐射型的分化，突变体lb23-3的八细胞初始结构中的八个细胞同时向外辐射分化，而LbCPC过量表达株系的八细胞初始盐腺结构的八个细胞中，中间的四个细胞向内分化，两边的细胞向外辐射分化，所以最终形成类似两个盐腺相邻的八发光点盐腺(图19)。

通过过量表达和敲除株系的盐腺的结构变化可以确定LbCPC基因在二色补血草盐腺的发育过程中均起到作用。启动子是植物基因表达不可缺少的顺式作用元件，作为转录水平的重要顺式调控元件，在调控基因表达的过程中起到十分重要的作用。LbCPC的启动子上除了基本顺式元件外，还有诸多参与植物生长发育的作用元件，如光反应的元件，以及生长素、脱落酸、赤霉素和茉莉酸甲酯的反应元件，说明该基因在二色补血草的生长发育过程中可能起到重要的作用，该基因启动子可能受到生长素、脱落酸、赤霉素和茉莉酸甲酯的诱导。通过启动子分析，LbCP在二色补血草的生长发育的过程中可能起到重要作用，推测LbCPC起到正向调控盐腺发育的作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东师范大学

<120> 二色补血草基因LbCPC及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 106

<212> PRT

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 1

Met Asp Lys Arg Arg Arg Lys Leu His Ala Thr Thr Thr Ala Lys Thr

1               5                   10                  15

Glu Ser Ser Ser Cys Ser Asp Glu Val Ser Ser Ile Glu Trp Glu Phe

            20                  25                  30

Ile Asn Met Thr Glu Glu Glu Glu Asp Leu Ile Cys Arg Met Tyr Lys

        35                  40                  45

Leu Val Gly Asn Arg Trp Ala Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg

    50                  55                  60

Lys Ala Glu Glu Ile Glu Arg Phe Trp Leu Met Lys His Gly Glu Ile

65                  70                  75                  80

Phe Ala Ala Arg Arg Arg Glu Leu Asn Lys Leu Arg Arg Gln Gln Gln

                85                  90                  95

Gln His Val Ser Arg Thr His His His His

            100                 105

<210> 2

<211> 1937

<212> DNA

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 2

taatggactt ttattctatt ctctgttcta attaatttaa caccaacaac agccttctaa 60

tctaaaaccc tttcataaat aaaaactatc cctactgtca gcctcctatt agacctcgct 120

caccgcatca aatatatata tccctgcatc ttatcttaat atcttcattt ttataggtga 180

tcttactatt atatatgttt tcaagtgtat ccccgcataa atgatatcca tttcatacac 240

attgtccctg aaatcacgac tttagtgagt atcttgtctt catcaaacaa cttatttata 300

acctgtgcgt tgaatcatcc tctagattta ttttattaac aatgcctcat caaagagctc 360

aaggtcatta accttaatcc aaacatagta aggtcatggc agaagtgtgt actttgtgtg 420

aaccccctaa taatattcaa ctattataac ccccgtcata atactaacat ataggagtag 480

taacttgtta gtgctccatc gtagcatgca caattctttt tagacaaatt ataaagaggg 540

atagagattg tgatgccttg gagcggtaat ttaaccaaga taacatgtca ccagctttaa 600

ataatccaat ttcttggcta caaccacatg tagctataga tagctacata catgtacatt 660

tggtcattga aaactgtaca tgtgatcatt caaaactgta cggatgtata tgtacatgta 720

tacagtgaat tgtgatattt ctgaatttgt actgaatgta catactaact ttataaactg 780

tacaacaaac ttataaaata tgtacattta ctctacacaa actgtaccat gaaaaatgta 840

gccaaagatg actacatatg attatagcta agactcattg acttctcgat ccctttccta 900

atcaggataa gctattagtt aaataaacga tattattatt tttcataavg ggtagtcaat 960

gatgttctga gataagcctc ttgtcgacaa atgcagctta attaggcaag atgatatttg 1020

gaaatcacct ataaaaagac attttagcca actagcttct ttgaaccata tacctaagaa 1080

gtcccgaact actactagat aagagaatta gatcatacta gtagatttct tcaaaaagaa 1140

aaaaaagaaa tggaggacaa ctagaagtca actaacgaag ggattttgtt tgtttggtag 1200

gacctgccgt tccccctcgc gtctctgatt tttagggacc caagcagaca aaaccaggcc 1260

agaacggttc aatcaaatca cgaactgcaa ttcttacttt atttatctaa caaatagtat 1320

gtccctttgt tcgatgaaag actgccggag tacagtaaca gcaaagaaaa agagaatata 1380

tgtaacgtga gctggccctg aaatgtaatc agcagctaac agaaagggaa aaggataacc 1440

catttctcct tcccttccct tccgttgtgt tactgttagc agaagctcat aagtatatat 1500

cctggaacgt gaacaggaag aagaagacca cgacgaccac aatatgataa tattaggctg 1560

gaaagaaaga aagaaataaa aaggaaaggc ttttccgaga cggagagtaa aggcttccat 1620

tgtttactct ttcaggtaat tgtcattaaa tgattcctgc tcctgctgat tctccccttt 1680

tagtttaccc ctttttttct ttctttctct ggtttcacct ttacatttct tcatctgttg 1740

ggattgagtc cggttctcta atttccgtct ctctctctca agccgtataa tagtatatat 1800

ataagagctt agcgttaagc cagcgaggat tccactgtga aagaagaaag gcactgaaag 1860

cggaagccaa agaaaaagag gagagaagaa gagcgaaggc tacatcgaca tccatcaata 1920

cttaatttcg tagttaa 1937

Claims (7)

1.二色补血草基因LbCPC，其特征在于，所述基因编码由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.含有权利要求1所述基因LbCPC的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

3.权利要求1所述基因LbCPC或权利要求2所述生物材料在制备转基因植物中的应用。

4.权利要求1所述基因LbCPC或含有基因LbCPC的生物材料在以下中的应用：

用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育，其中，所述植物为二色补血草，所述调控为所述基因过表达后，所述二色补血草出现盐腺的毗邻以及多发光点盐腺。

5.使二色补血草出现盐腺的毗邻以及多发光点盐腺的方法，其特征在于，所述方法为，在所述二色补血草中过表达权利要求1所述基因LbCPC；

所述过表达的方式选自以下1)～4)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

4)通过导入增强子。

6.根据权利要求5所述方法获得的转基因植物在二色补血草育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

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