CN111153978A - Rh2蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了RH2蛋白及其编码基因与应用。RH2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。向蒺藜苜蓿R108中导入RH2基因，得到T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿；之后经过自交，得到T1代转RH2基因蒺藜苜蓿。实验证明，与蒺藜苜蓿R108相比，T1代转RH2基因蒺藜苜蓿叶片中的花青素含量显著降低。RH2蛋白及其编码基因在调控植物花青素合成中具有重要的理论意义和实用价值。本发明具有重要价值。

Description

RH2蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及RH2蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
花青素(anthocyanins)是一类重要的类黄酮(flavonoids)化合物，广泛存在于植物的花、果实、种子和营养组织中，使组织呈现从橙色、红色、紫色到蓝色等不同颜色。花青素通常在花和果实等生殖器官上形成斑点、条纹以及脉状特异性富集的图案，在吸引昆虫传粉、动物采食进而维持植物子代繁育方面具有重要的生态学功能。相对于花和果实等生殖器官，叶片上花青素的累积可保护植物免受生物和非生物胁迫；但叶片上特异性花青素积累呈现叶痕现象比较少见，一般出现于三叶草和蒺藜苜蓿，可应用于品种的分类和鉴定、检测品种在育种过程中是否杂交成功或花粉污染等。目前，控制叶片花青素特异性积累的分子基础还不明确，有待进一步研究。
蒺藜苜蓿是新兴的豆科模式植物，且拥有丰富的品种资源，与大豆和紫花苜蓿等重要豆科作物和牧草具有良好的共线性。随着蒺藜苜蓿功能基因组学的深入开展，一些花青素合成途径相关基因以及MYB、bHLH和WD40等家族转录因子在蒺藜苜蓿中被克隆，研究发现上述基因在蒺藜苜蓿的花青素生物合成和代谢调控中发挥重要的作用，但由于豆科植物特殊的生理结构特性，上述基因的表达模式和生物学功能与双子叶模式植物拟南芥中的研究报道存在差异，表明不同物种间花青素的合成和代谢调控途径存在遗传多样性。因此，在蒺藜苜蓿中挖掘控制花青素合成和代谢关键调控基因，解析其生物学功能，对于阐释豆科植物花青素合成代谢调控网络具有重要理论价值。
发明内容
本发明的目的为促进植物花青素合成。
本发明提供了一种蛋白质，来源于蒺藜苜蓿，命名为RH2蛋白，可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
a2)在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物花青素相关的蛋白质；
a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，来源于蒺藜苜蓿且与植物花青素相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO：2由200个氨基酸残基组成。
为了使蛋白质便于纯化和检测，可在由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的RH2蛋白的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述RH2蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述RH2蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO：1所示的DNA序列在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述RH2蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
编码所述RH2蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于蒺藜苜蓿且编码所述RH2蛋白的DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于蒺藜苜蓿且编码所述RH2蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO：1由603个核苷酸组成，SEQ ID NO：1所示的核苷酸编码SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述RH2蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述RH2蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述RH2蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的RH2蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
编码所述RH2蛋白的核酸分子具体可为编码所述RH2蛋白的基因，命名为RH2基因。
含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO：1所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒35S::RH2。
所述重组质粒35S::RH2的中构建过程如下：
(1)以蒺藜苜蓿R108的cDNA为模板，采用引物RH2-attB1-F：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGCGAATACGAGCGGCGT-3’和引物RH2-attB2-R：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcTAACCATTTGAAAAGCTTATATTTCC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(2)将步骤(1)得到的PCR扩增产物和载体pDONR207进行进行BP反应，得到中间载体；
(3)将步骤(2)得到的中间载体和pEarleyGate202质粒进行LR反应，得到重组质粒35S::RH2。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌AGL1。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为AGL1/35S::RH2。所述AGL1/35S::RH2为将重组质粒35S::RH2导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌。
所述转基因细胞系不包括繁殖材料。
本发明还保护上述任一所述RH2蛋白，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用，可为A1)或A2)：
A1)调控植物花青素合成；
A2)培育花青素含量改变的转基因植物。
上述应用中，所述调控植物花青素合成可为促进植物花青素合成或抑制植物花青素合成。
上述应用中，所述“培育花青素含量改变的转基因植物”可为培育花青素含量增加的转基因植物或培育花青素含量降低的转基因植物。
本发明还保护一种培育转基因植物甲的方法，可包括如下步骤：提高出发植物甲中上述任一所述RH2蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物甲相比，转基因植物甲的花青素含量降低。
上述方法中，所述“提高出发植物甲中上述任一所述RH2蛋白的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到提高RH2蛋白的表达量和/或活性的效果。
上述方法中，所述“提高出发植物甲中上述任一所述RH2蛋白的表达量和/或活性”可通过向出发植物甲中导入编码所述RH2蛋白的核酸分子实现。
上述任一所述的方法中，编码所述RH2蛋白的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于蒺藜苜蓿且编码所述RH2蛋白的DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于蒺藜苜蓿且编码所述RH2蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO：1由603个核苷酸组成，SEQ ID NO：1所示的核苷酸编码SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
所述“向出发植物甲中导入编码所述RH2蛋白的核酸分子”具体可通过向出发植物导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。所述“含有上述任一所述核酸分子的重组载体”具体可为所述重组质粒35S::RH2。
上述任一所述出发植物甲可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)豆科植物；c4)蒺藜苜蓿；c5)蒺藜苜蓿R108。
本发明还保护一种培育转基因植物乙的方法，可包括如下步骤：降低出发植物乙中上述任一所述RH2蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物乙相比，转基因植物乙的花青素含量增加。
上述方法中，所述“降低出发植物乙中上述任一所述RH2蛋白的表达量和/或活性”可通过DNA插入、RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制所述RH2蛋白的表达量或活性的目的。
上述任一所述出发植物乙可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)豆科植物；c4)蒺藜苜蓿；c5)蒺藜苜蓿R108。
所述转基因植物乙具体可为突变体rh2-1和突变体rh2-2。
本发明还保护H1)或H2)。
H1)植物育种方法甲，包括如下步骤：增加植物中上述任一所述RH2蛋白的含量和/或活性，从而降低植物的花青素含量。
H2)植物育种方法乙，包括如下步骤：降低植物中上述任一所述RH2蛋白的含量和/或活性，从而增加植物的花青素含量。
上述任一所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)豆科植物；c4)蒺藜苜蓿；c5)蒺藜苜蓿R108。
上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述核酸分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述核酸分子，也可用常规育种技术将所述核酸分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
向蒺藜苜蓿R108中导入RH2基因，得到T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿；之后经过自交，得到T1代转RH2基因蒺藜苜蓿。实验证明，与蒺藜苜蓿R108相比，T1代转RH2基因蒺藜苜蓿叶片中的花青素含量显著降低。RH2蛋白及其编码基因在调控植物花青素合成中具有重要的理论意义和实用价值。本发明具有重要价值。
附图说明
图1为蒺藜苜蓿R108、突变体rh2-1和突变体rh2-2的叶片表型。
图2为蒺藜苜蓿R108、突变体rh2-1和突变体rh2-2的花青素含量检测结果。
图3为实时荧光定量检测T1代转RH2基因蒺藜苜蓿中RH2基因的相对表达量的结果。
图4为T1代转RH2基因蒺藜苜蓿的叶片表型。
图5为T1代转RH2基因蒺藜苜蓿的花青素含量检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
蒺藜苜蓿R108由The NobelFoundation(网址为：https://www.nobelprize.org/the-nobel-prize-organisation/the-nobel-foundat ion/)提供。
pEarleyGate202质粒和根癌农杆菌AGL1均由中国农业科学院生物技术所(即申请人处)提供，公众可以从申请人处获得。
YEP液体培养基：将蛋白胨10g、酵母提取物10g和氯化钠5g用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌15min。
愈伤诱导液体培养基：将大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液20mL、肌醇100mg、蔗糖30g、生长素4mg和细胞分裂素0.5mg用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值至5.8，121℃高压灭菌15min。
愈伤诱导固体培养基：将大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液20mL、肌醇100mg、蔗糖30g、生长素4mg、细胞分裂素0.5mg、头孢200mg、特美汀250mg、草胺磷2mg和Phytagel 3.2g用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值至5.8，121℃高压灭菌15min。
分化培养基：将大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液20mL、肌醇100mg、蔗糖20g、头孢200mg、特美汀250mg、草胺磷2mg和Phytagel3.2g用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值至5.8，121℃高压灭菌15min。
生根培养基：将2.215g Murashige&Skoog Basal Medium with Vitamins(PhytoTechnology Laboratories公司的产品，货号为16B0519138A)用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L，调节pH值至5.8，121℃高压灭菌15min。
铁盐母液：将乙二胺四乙酸二钠37.3mg和七水合硫酸亚铁27.8mg用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L。
大量元素母液：将七水合硫酸镁1.85g、硝酸钾28.3g、硫酸铵4.63g、二水合氯化钙1.66g和磷酸二氢钾4g用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L。
微量元素母液：将一水合硫酸锰1g、硼酸500mg、七水合硫酸锌100mg、碘化钾100mg、二水合钼酸纳10mg、五水合硫酸铜20mg和六水合氯化钴10mg用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L。
有机元素母液：将烟酸500mg、盐酸硫胺素500mg和盐酸吡哆醇500mg用适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1L。
实施例1、RH2基因的克隆
一、突变体rh2-1和突变体rh2-2的表型分析
突变体rh2-1和突变体rh2-2均由The NobelFoundation(网址为：https://www.nobelprize.org/the-nobel-prize-organisation/the-nobel-foundat ion/)的蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体库提供，突变体rh2-1和突变体rh2-2在蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体库中的编号依次为NF21135和NF21515。根据蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体库记载的信息，突变体rh2-1为Tnt1插入RH2基因的第二个外显子上获得的蒺藜苜蓿突变体，突变体rh2-2为Tnt1插入RH2基因的第三个外显子上获得的蒺藜苜蓿突变体。
分别种植突变体rh2-1、突变体rh2-2和蒺藜苜蓿R108，观察叶片表型。
叶片表型见图1(A为蒺藜苜蓿R108的叶片正面(标尺为5mm)，B为突变体rh2-1的叶片正面(标尺为5mm)，C为突变体rh2-2的叶片正面(标尺为5mm)，D为蒺藜苜蓿R108叶片基部红圈放大图，E为突变体rh2-1叶片基部红心放大图，F为突变体rh2-2叶片基部红心放大图)。结果表明，蒺藜苜蓿R108的叶片基部为红圈，突变体rh2-1和突变体rh2-2中花青素在叶片基部特异性积累，叶片基部呈现红心。
二、花青素含量的检测
1、标准曲线的制备
(1)取矢车菊素3-O-葡萄糖苷氯化物标准品(Sigma-Aldrich公司的产品，货号为52976)，用水稀释，得到不同浓度的标准品溶液。
(2)用紫外可见分光光度计分别检测530nm处步骤(1)得到的标准品溶液的吸光度值(即A530值)。
(3)完成步骤(2)后，分别以标准品溶液的浓度为横坐标，相应的A530值为纵坐标，绘制标准曲线。
标准曲线为：y＝0.024x-0.0009；R2＝0.9988。其中x为A530值。
2、花青素含量的检测
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
(1)从生长状态基本一致的待测蒺藜苜蓿(蒺藜苜蓿R108、突变体rh2-1或突变体rh2-2)植株上取刚展开的成熟复叶(约50mg)，称重(记为m)；然后将叶片液氮冷冻20min，研磨成粉末；之后分别加入500μL盐酸/甲醇溶液(由999μL甲醇和1μL盐酸混合而成)，振荡混匀，4℃黑暗旋转过夜，获得待测蒺藜苜蓿的提取液。
(2)取待测蒺藜苜蓿的提取液，2500g离心15min，获得待测蒺藜苜蓿的上清液。
(3)用紫外可见分光光度计检测530nm处待测蒺藜苜蓿的上清液的吸光度值(即A530值)。
(4)将步骤(3)得到的吸光度值代入标准曲线，得到待测蒺藜苜蓿的上清液中花青素的含量；进一步得到待测蒺藜苜蓿叶片中花青素的含量。
检测结果见图2(R108为蒺藜苜蓿R108，rh2-1为突变体rh2-1，rh2-2为突变体rh2-2；数据为平均值±标准差，*表示p<0.05)。结果表明，与蒺藜苜蓿R108的叶片相比，突变体rh2-1和突变体rh2-2的叶片中花青素含量均显著增加。
三、RH2基因的克隆
1、提取蒺藜苜蓿R108植株上取刚展开的成熟复叶的总RNA，然后反转录，得到蒺藜苜蓿R108的cDNA。
2、完成步骤1后，以蒺藜苜蓿R108的cDNA为模板，采用引物RH2-attB1-F：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGCGAATACGAGCGGCGT-3’和引物RH2-attB2-R：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcTAACCATTTGAAAAGCTTATATTTCC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到约660bp的PCR扩增产物。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行测序。
测序结果表明，PCR扩增产物中含有SEQ ID NO：1所示的DNA分子。SEQ ID NO：1所示的DNA分子即RH2基因，编码SEQ ID NO：2所示的RH2蛋白。
实施例2、T1代转RH2基因蒺藜苜蓿的获得、表型鉴定及花青素含量的检测
一、重组质粒35S::RH2的构建
1、将实施例1步骤三中2得到的PCR扩增产物和载体pDONR207(Invitrogen)进行进行BP反应，得到中间载体。
2、完成步骤1后，将中间载体和pEarleyGate202质粒进行LR反应，得到重组质粒35S::RH2。
3、将重组质粒35S::RH2进行测序。
测序结果表明，重组质粒35S::RH2中含有SEQ ID NO：1所示的DNA分子(即RH2基因)，且由35S启动子启动RH2基因的表达。
二、重组农杆菌的获得
将重组质粒35S::RH2导入根癌农杆菌AGL1，得到重组农杆菌，命名为AGL1/35S::RH2。
三、T1代转RH2基因蒺藜苜蓿的获得
1、侵染液的制备
(1)将AGL1/35S::RH2单菌落接种于含50mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素的YEP液体培养基，28℃、200rpm振荡培养过夜，得到培养菌液1。
(2)完成步骤(1)后，将500μL培养菌液1接种于5mL YEP液体培养基，再加入5μL浓度为100mg/mL的乙酰丁香酮水溶液，28℃、200rpm振荡培养，得到OD600nm值为0.8的培养菌液2。
(3)完成步骤(2)后，取培养菌液2，3800rpm离心15min，收集菌体。
(4)完成步骤(3)后，取菌体，用含100mg/L乙酰丁香酮的愈伤诱导液体培养基重悬，得到OD600nm值为0.2的侵染液。
2、T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿的获得
(1)取生长至4周的蒺藜苜蓿R108植株的第一片复叶，先用75％(v/v)乙醇水溶液漂洗10s，再用5％(m/v)次氯酸钠溶液浸泡5min，之后在超净台用无菌水洗涤至少5次，最后将叶片切割4-5个切口。
(2)完成步骤(1)后，将所述叶片小块置于侵染液，静置15min。
(3)完成步骤(2)后，将所述叶片小块转移至愈伤诱导固体培养基，24℃暗培养4周(每隔2周更换一次培养基)，得到白色胚性愈伤组织。
(4)完成步骤(3)后，将白色胚性愈伤组织转移至分化培养基，24℃光暗交替培养4周(每隔2周更换一次培养基)，分化出绿色胚状体。
(5)完成步骤(4)后，将绿色胚状体转移至生根培养基，24℃光暗交替培养(每隔2周更换一次培养基)，生根长叶后移至蛭石中，直至成苗，即T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿。
共获得12株T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿。
3、实时荧光定量检测T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿中RH2基因的相对表达量
待测蒺藜苜蓿分别为12株T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿和蒺藜苜蓿R108。
(1)分别提取待测蒺藜苜蓿叶片的总RNA，然后反转录，得到待测蒺藜苜蓿的cDNA。
(2)分别以待测蒺藜苜蓿的cDNA为模板，实时定量PCR检测RH2基因的相对表达量(Actin基因为内参基因)。
反应体系为20μL，由10μL TransStart Tip Green qPCR SuperMix、0.5μL上游引物水溶液(浓度为10μM)、0.5μL下游引物水溶液(浓度为10μM)、0.5μL待测蒺藜苜蓿的cDNA和8.5μL ddH2O组成。
TransStart Tip Green qPCR SuperMix(2×)为全式金公司的产品。
反应程序为：94℃5min；94℃10s，60℃20s，72℃20s，40个循环。
检测RH2基因的上游引物为5’-CATTTGGTGATGTTTCCAGAGATC-3’，下游引物为5’-GTGATGAAGAGCAACCAGATTG-3’。
检测Actin基因的上游引物为5’-TCAATGTGCCTGCCATGTATGT-3’，下游引物为5’-ACTCACACCGTCACCAGAATCC-3’。
结果表明，与蒺藜苜蓿R108相比，各个T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿中RH2基因的相对表达量均有不同程度的增加，其中3个T0代拟转RH2基因蒺藜苜蓿中RH2基因的相对表达量最高，将其依次命名为OE-1-T0、OE-2-T0和OE-3-T0。
4、T1代转RH2基因蒺藜苜蓿的获得
将OE-1-T0进行自交，获得T1代转RH2基因蒺藜苜蓿，命名为OE-1-T1。
将OE-2-T0进行自交，获得T1代转RH2基因蒺藜苜蓿，命名为OE-2-T1。
将OE-3-T0进行自交，获得T1代转RH2基因蒺藜苜蓿，命名为OE-3-T1。
5、实时荧光定量检测T1代转RH2基因蒺藜苜蓿(OE-1-T1、OE-2-T1和OE-3-T1)中RH2基因的相对表达量
待测蒺藜苜蓿为蒺藜苜蓿R108、OE-1-T1、OE-2-T1或OE-3-T1。
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
(1)提取待测蒺藜苜蓿叶片的总RNA，然后反转录，得到待测蒺藜苜蓿的cDNA。
(2)分别以待测蒺藜苜蓿的cDNA为模板，实时定量PCR检测RH2基因的相对表达量(Actin基因为内参基因)。
反应体系为20μL，由TransStart Tip Green qPCR SuperMix(2×)、0.5μL上游引物水溶液(浓度为10μM)、0.5μL下游引物水溶液(浓度为10μM)、0.5μL待测蒺藜苜蓿的cDNA和8.5μL ddH2O组成。
TransStart Tip Green qPCR SuperMix(2×)为全式金公司的产品。
反应程序为：94℃5min；94℃10s，60℃20s，72℃20s，40个循环。
检测RH2基因的上游引物为5’-CATTTGGTGATGTTTCCAGAGATC-3’，下游引物为5’-GTGATGAAGAGCAACCAGATTG-3’。
检测Actin基因的上游引物为5’-TCAATGTGCCTGCCATGTATGT-3’，下游引物为5’-ACTCACACCGTCACCAGAATCC-3’。
检测结果见图3(R108为蒺藜苜蓿R108；数据为平均值±标准差，**表示p<0.01)。结果表明，与蒺藜苜蓿R108相比，OE-1-T1、OE-2-T1和OE-3-T1中RH2基因的相对表达量均显著增加。
四、T1代转RH2基因蒺藜苜蓿的表型鉴定
观察待测蒺藜苜蓿(蒺藜苜蓿R108、OE-1-T1、OE-2-T1或OE-3-T1)的叶片表型。
叶片表型见图4(A为蒺藜苜蓿R108的叶片正面(标尺为5mm)，B为OE-1-T1的叶片正面(标尺为5mm)，C为OE-2-T1的叶片正面(标尺为5mm)，D为OE-3-T1的叶片正面(标尺为5mm)，E为蒺藜苜蓿R108叶片基部红圈放大图，F为OE-1-T1叶片基部放大图，G为OE-2-T1叶片基部放大图，H为OE-3-T1叶片基部放大图)。结果表明，蒺藜苜蓿R108的叶片基部为红圈，OE-1-T1、OE-2-T1和OE-3-T1的叶片基部呈绿色，即红圈消失。
五、T1代转RH2基因蒺藜苜蓿叶片中的花青素含量检测
按照实施例1中步骤二的方法，检测蒺藜苜蓿R108、OE-1-T1、OE-2-T1和OE-3-T1叶片中花青素的含量。
检测结果见图5(R108为蒺藜苜蓿R108；数据为平均值±标准差，*表示p<0.05)。结果表明，与蒺藜苜蓿R108相比，OE-1-T1、OE-2-T1和OE-3-T1的叶片中花青素含量均显著降低。
由此可见，RH2蛋白可以调控花青素的合成。
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> RH2蛋白及其编码基因与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> Medicago truncatula
<400> 1
atggcgaata cgagcggcgt tagaaaaggt gcatggacat atgaagaaga caactgtctc 60
aaggcttaca ttctcaagca tggtgtagga aaatggcatt taattcctga aagaacagga 120
ttgaataggt gtcgaaaaag ttgtagatta agatgggtaa attatttaaa cccttacatc 180
aacagggagg acttttctaa ggatgaagct gatttgattt taaggttaca caatctccta 240
gggaatagat ggacattgat tgctgcaaga cttcagggta gatcagctaa tgatgtgaaa 300
aactattgga acacccattt gagaaaaaat gttgttttag gagcaaaaga aaacacagaa 360
aaagagaaac ctaatgaaat cattaaagct cttgatctta ttaaagagcc tcgattgaat 420
gttaaaccta atgaacatcc attattgact tcaaaaacat ttggtgatgt ttccagagat 480
caaattgata gcaattgtgc ttctgattca caaccaaatc tggataatgc cccgatacta 540
tgtttgcaat ctggttgctc ttcatcacaa gatgggaaat ataagctttt caaatggtta 600
tga 603
<210> 2
<211> 200
<212> PRT
<213> Medicago truncatula
<400> 2
Met Ala Asn Thr Ser Gly Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr Tyr Glu Glu
1 5 10 15
Asp Asn Cys Leu Lys Ala Tyr Ile Leu Lys His Gly Val Gly Lys Trp
20 25 30
His Leu Ile Pro Glu Arg Thr Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser Cys
35 40 45
Arg Leu Arg Trp Val Asn Tyr Leu Asn Pro Tyr Ile Asn Arg Glu Asp
50 55 60
Phe Ser Lys Asp Glu Ala Asp Leu Ile Leu Arg Leu His Asn Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asn Arg Trp Thr Leu Ile Ala Ala Arg Leu Gln Gly Arg Ser Ala
85 90 95
Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Arg Lys Asn Val Val
100 105 110
Leu Gly Ala Lys Glu Asn Thr Glu Lys Glu Lys Pro Asn Glu Ile Ile
115 120 125
Lys Ala Leu Asp Leu Ile Lys Glu Pro Arg Leu Asn Val Lys Pro Asn
130 135 140
Glu His Pro Leu Leu Thr Ser Lys Thr Phe Gly Asp Val Ser Arg Asp
145 150 155 160
Gln Ile Asp Ser Asn Cys Ala Ser Asp Ser Gln Pro Asn Leu Asp Asn
165 170 175
Ala Pro Ile Leu Cys Leu Gln Ser Gly Cys Ser Ser Ser Gln Asp Gly
180 185 190
Lys Tyr Lys Leu Phe Lys Trp Leu
195 200

Claims (10)

1.RH2蛋白，为如下a1)或a2)或a3)或a4)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
a2)在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物花青素相关的蛋白质；
a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，来源于蒺藜苜蓿且与植物花青素相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述RH2蛋白的核酸分子。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于蒺藜苜蓿且编码权利要求1所述RH2蛋白的DNA分子；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于蒺藜苜蓿且编码权利要求1所述RH2蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
5.权利要求1所述RH2蛋白，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用，为A1)或A2)：
A1)调控植物花青素合成；
A2)培育花青素含量改变的转基因植物。
6.一种培育转基因植物甲的方法，包括如下步骤：提高出发植物甲中权利要求1所述RH2蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物甲相比，转基因植物甲的花青素含量降低。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“提高出发植物甲中RH2蛋白的表达量和/或活性”通过向出发植物甲中导入编码所述RH2蛋白的核酸分子实现。
8.一种培育转基因植物乙的方法，包括如下步骤：降低出发植物乙中权利要求1所述RH2蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物乙相比，转基因植物乙的花青素含量增加。
9.H1)或H2)：
H1)植物育种方法甲，包括如下步骤：增加植物中权利要求1所述RH2蛋白的含量和/或活性，从而降低植物的花青素含量；
H2)植物育种方法乙，包括如下步骤：降低植物中权利要求1所述RH2蛋白的含量和/或活性，从而增加植物的花青素含量。
10.如权利要求1所述RH2蛋白、权利要求5所述的应用或权利要求6至9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)豆科植物；c4)蒺藜苜蓿；c5)蒺藜苜蓿R108。
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