CN115073575B - 一种促进木本植物扦插成活的多功能肽及促进扦插生根的方法 - Google Patents

一种促进木本植物扦插成活的多功能肽及促进扦插生根的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促进木本植物扦插成活的多功能肽及促进扦插生根的方法，涉及植物扦插技术领域。本发明SPPRA可作为信号分子，不仅可以调控植物生根，还拥有调控植物叶片生长、促进林木吸收利用能量的功能。本发明将发根农杆菌和多功能肽SPPRA先后结合使用，两种高效的促进生根效果相结合能大大提高经济林木的扦插生根效率，对提高杜仲种植成活率，以及促进杜仲造林、快速扩繁、提高人工林培育的成活率有着积极作用，并且可应用于其他难以生根的木本植物，对于推动木本植物大面积人工种植有着重要意义，为目前经济林木快速扩繁存在的困难提供了有效解决方法。

Description

一种促进木本植物扦插成活的多功能肽及促进扦插生根的 方法
技术领域
本发明属于植物扦插技术领域，具体涉及一种促进木本植物扦插成活的多功能肽及促进扦插生根的方法。
背景技术
杜仲作为具有千年栽培史的落叶乔木，在美化环境、保持水土、防风固沙等方面发挥重要作用，是绿化城市及山区造林大力发展的特用经济树种。除了美化和保护环境的功能作用外，杜仲的树皮和叶片均可入药治疗高血压等疾病。在杜仲成材后，每株每年约可收获10kg药材。此外，杜仲的叶、皮、果肉含有丰富的杜仲胶，杜仲胶有极佳的工业材料性质，是制作海底电缆、航空工业等产品的重要材料。杜仲还是良好的建筑材料，常用来造船、家具、农具等。杜仲作为经济效益和生态效益极佳的经济林木，有着扩繁困难的问题。杜仲种子在采集之后要经过长时间催芽处理才能进一步育苗，而幼苗受环境因素、自身因素等影响，生根困难且成活率较低。而且杜仲植株自幼苗到开花结实最少需6年左右时间，林内木则需10年之久。可见杜仲仅依靠种子种植很难达到快速扩繁的应用需求。
为了解决种子繁殖速度慢、幼苗成活率低等问题，扦插技术得到了广泛的推广应用。扦插技术可以不依靠种子繁殖而达到植物扩繁目的，其优点第一是取材容易，在母株上能够便宜的得到大量扦插材料；其次是生根快，可以在短时间内得到大量独立植株；再之是优秀遗传品质易保留，由于扦插为无性繁殖技术，经由扦插得到的植株一般不易变异，能够很好地保持母株的优良性状，对于经济林木的快速扩繁有着重要意义。为了促进扦插枝条生根，常规的扦插方式主要利用了生长激素来促进扦插苗根部的生长。在经济林木扦插过程中，NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、6-BA(6-苄氨基嘌呤)等激素的施用，在一定程度上对植物生根有着促进作用。激素的施用相对于直接扦插提高了部分植物的生根效果，但在一些难以生根的经济木本树种中，如药用木本植物杜仲、红豆杉等，通过以上生根处理方式还远远不能达到相应扩植目标，且上述方法扦插植物生根周期较长，需要进一步寻找合适的方法提高生根效率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促进木本植物扦插成活的多功能肽及促进扦插生根的方法，利用多功能肽促进扦插植株快速生根的功能，缩短植株扦插生根的时间以及提高生根数量，有助于大面积种植难生根木本植物的人工林木。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种促进木本植物扦插成活的多功能肽，所述多功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，编码所述多功能肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种促进木本植物扦插成活的组合物，包括独立包装的上述多功能肽，和发根农杆菌的菌液。
本发明还提供了上述多功能肽或上述组合物在促进木本植物扦插成活中的应用。
本发明还提供了一种促进扦插木本植物生根的方法，包括以下步骤：将经预处理的插穗在发根农杆菌的工作菌液中浸泡后，扦插于基质，扦插后一周，浇灌包含上述多功能肽的水溶液。
优选的，所述预处理包括选取木本植物枝条，裁剪成插穗后，在水中浸泡18～26h。
优选的，经预处理的插穗在所述工作菌液中浸泡1h。
优选的，所述工作菌液的OD600值为0.1～0.2。
优选的，所述基质的组成包括有机营养土、蛭石和珍珠岩，且所述有机营养土、蛭石和珍珠岩的体积比为1:1:1～2:1:1。
优选的，所述浇灌包括在培养一周后使用所述多功能肽的水溶液浇灌一次，浇灌量为40～60ml/株。
有益效果：本发明提供了一种促进木本植物扦插成活的多功能肽(简称SPPRA)，所述SPPRA可作为信号分子，不仅可以调控植物生根，还拥有调控植物叶片生长、促进林木吸收利用能量的功能。本发明将发根农杆菌和多功能肽SPPRA先后结合使用，两种高效的促进生根效果相结合能大大提高经济林木的扦插生根效率，对提高杜仲种植成活率，以及促进杜仲造林、快速扩繁、提高人工林培育的成活率有着积极作用，并且可应用于其他难以生根的木本植物，对于推动木本植物大面积人工种植有着重要意义，为目前经济林木快速扩繁存在的困难提供了有效解决方法。本发明实施例中，利用杜仲(Eucommia ulmoidesOliver)进行上述生根实验，10天左右即可生根，生根率为65.2％±3.8％、愈伤出现时间为8天、出根数为8.7条、平均根长为7.8cm。
附图说明
图1为本发明菌肽处理杜仲扦插快速生根过程模式图；
图2为不同方式处理的杜仲枝条生根对照图；
图3为杜仲枝条不同切割方式的生根率、出愈伤时间、出根数、平均根长、平均鲜重数据对比图；
图4为不同方式处理的杜仲枝条根部和叶部生长数据对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种促进木本植物扦插成活的多功能肽，所述多功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：Met Glu Ile Asn Leu Gly Gln Leu Pro Phe Asp Ile Asp PheHis Pro Leu Asp Lys Leu Val AlaAla Gly Leu Ile Thr Gly Asp Leu Leu Leu TyrArgTyr SerAlaAsp Ser Ser，且编码所述多功能肽的基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：atggagattaatttaggacagcttccgtttgacattgattttcatcctttggacaagctagttgctgctgggctcatcacaggagaccttttactatatcgttattccgctgattcatca。
本发明所述多功能肽SPPRA作为信号分子，不仅可以调控植物生根，还拥有调控植物叶片生长、促进林木吸收利用能量的功能。本发明所述木本植物优选包括难生根的木本植物，如杜仲和红豆杉，实施例中以杜仲为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明还提供了上述多功能肽的制备方法，包括以木本植物RNA反转录得到的cDNA为模板，利用特异性扩增引物进行PCR扩增，依据扩增产物的序列进行氨基酸合成，得所述多功能肽；
所述特异性引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明以木本植物RNA反转录得到的cDNA为模板，所述RNA优选提取自杜仲的茎和根部，本发明对所述RNA的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂盒法进行RNA提取即可。本发明对提取得到的RNA进行反转录，所述反转录的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂盒进行反转录即可。
本发明对得到的cDNA进行PCR扩增，产物纯化后得到目的片段，经由公司鉴定序列无误后，进行氨基酸多功能肽合成。本发明所设计的正向引物如SEQ ID NO.3所示：ATGGAGATTAATTTAGGACAGCTTCC；反向引物如SEQ ID NO.4所示：TGATGAATCAGCGGAATAACGA。本发明所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括：2×Pfu MasterMix(Dye)10μL、正向引物10μM 1μlL、反向引物10μM 1μL、Template cDNA 1μL、和ddH2O7μL。本发明所述PCR扩增的程序优选为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60.1℃退火20s，72℃延伸30s，34个循环；72℃终延伸1min。
本发明对经公司人工合成的多功能肽SPPRA粉末进行溶解，配制工作液，所述配制优选包括将所述多功能肽SPPRA均匀溶于16℃蒸馏水中，达到0.04～0.06mol/L即可作为工作液，也可配制更高浓度的母液，使用时稀释到工作液浓度即可，配置完成后放置4℃冰箱待用。
本发明还提供了一种促进木本植物扦插成活的组合物，包括独立包装的上述多功能肽，和发根农杆菌的菌液。
本发明还提供了上述多功能肽或上述组合物在促进木本植物扦插成活中的应用。
本发明还提供了一种促进扦插木本植物生根的方法，流程如图1所示，包括以下步骤：将经预处理的插穗在发根农杆菌的工作菌液中浸泡后，扦插于基质，扦插后一周，浇灌包含上述多功能肽的水溶液。
本发明所述预处理包括选取木本植物枝条，裁剪成插穗后，在水中浸泡18～26h。本发明所述枝条优选为一年生枝条、两年生枝条或多年生枝条，实施例中杜仲更优选两年生枝条作为插穗。本发明将选取的枝条，按长度9～10厘米、直径1～3.5厘米以及保留2～3个芽口，形态学上端切口水平，下端切口15°左右斜切或横切的方式进行裁剪，得所述插穗。本发明对所述斜切的枝条，优选还包括对基部穿孔，更优选包括在基部以上3cm处穿一个直径1cm的孔。
本发明将经预处理的插穗在所述工作菌液中优选浸泡1h，所述工作菌液的OD600值优选为0.1～0.2，所述浸泡时，优选使切面以上三公分位置全部浸没，期间需要翻动搅匀，确保浸染均匀。本发明实施例中，所述发根农杆菌优选采用K599株，该菌株由北京林业大学提供。本发明优选对所述发根农杆菌进行培养，所述培养用培养基优选为含有利福平(15～25mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEP培养基，所述培养的温度优选为26～30℃，培养时优选伴随震荡，共培养10～16h。本发明对所述YEP培养基的来源并没有特殊限定，可根据常规组成进行配制，配方为酵母提取物10g/L+胰蛋白胨粉10g/L+NaCl 5g/L。
本发明将经过发根农杆菌的工作菌液浸泡后的插穗扦插至基质中，所述基质的组成优选包括有机营养土、蛭石和珍珠岩，且所述有机营养土、蛭石和珍珠岩的体积比优选为1:1:1～2:1:1。本发明所述扦插行距为30cm左右，株距为10～13cm，扦插深度为3～5cm。
本发明在所述扦插后浇灌所述多功能肽SPPRA的工作液，所述浇灌优选包括在培养一周后使用所述工作液浇灌一次，浇灌量为40～60ml/株，更优选50ml/株。
下面结合实施例对本发明提供的一种促进木本植物扦插成活的多功能肽及促进扦插生根的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1枝条生长年限的筛选
(1)在北京林业大学的三顷园基地中采剪杜仲枝条，根据其枝条生长的年限分为三组，分别为一年生(1cm≤直径＜1.5cm)、两年生(1.5cm≤直径＜2cm)、多年生(2cm≤直径＜3.5cm)。
(2)所取枝条的平均长度均为10cm，切割方式均为横切，确保每一枝条生长状况基本一致。
(3)土壤的配置，土壤由有机营养土、蛭石、珍珠岩灭菌消毒后按照1：1：1的体积配比配制而成。
(4)将枝条放置于水中24h进行预处理，随后将枝条插入土壤中于温室中进行培养，期间定时定量进行浇水保湿，并拍照记录出根和枝条生长情况。
(5)筛选的杜仲枝条，两年生枝条出根率大于一年生和多年生。
表1不同年限枝条生根率
表2不同生长年限叶片鲜重数据
由表1、表2和图2可知，在三组不同生长年龄的枝条中，不同生长年限的枝条的在空对照中生根率分别为两年生枝条(2.5％±0.2％)＞一年生(1.1％±0.03％＞多年生(0.5％±0.03％)，且两年生枝条地上部分叶片的叶片平均鲜重平均每株鲜重数也较其他两者高，因此两年生的杜仲扦插枝条为优选枝条。
实施例2枝条不同切割方式的筛选
(1)在北京中科亚光生物科技公司人工合成多功能肽SPPRA，根据配比加入蒸馏水，稀释成0.05mol/L的工作溶液。
(2)将发根农杆菌K599接种于1.5～2L的含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，28～30℃震荡培养16～20h，得到OD600＝0.4的K599的工作溶液。
(3)平切剪取北京林业大学的三顷园基地中生长的两年生(直径约1.5-2cm)枝条360枝，剪取时保留枝条上部顶芽或叶片，将枝条剪成程度约10cm的相同大小，将两年生的枝条进行平切、斜切(15°左右斜切)、斜切后基部穿孔(基部1cm处穿孔处理)，均匀分成三组，每组120枝。
(4)将每种处理的枝条分成2组，每组60枝，分别进行对照处理以及菌肽结合处理。
其中对照处理：枝条在水中浸泡24h后扦插到土壤中；
菌肽结合处理：先用K599农杆菌菌液(OD600＝0.1～0.2)浸蘸处理枝条24h后扦插到土壤中，一周后再用含多功能肽SPPRA(0.04～0.06mg/L)的工作液浇灌处理。
土壤为有机营养土、蛭石、珍珠岩，在灭菌消毒后按照1：1：1体积配置。扦插的枝条放置室温恒定的温室内，每隔两天观察并统计其生长数据，期间注意操持湿度和通气状况。
表3枝条不同切割方式的生根率
表4枝条不同切割方式的愈伤出现时间(天)
表5枝条不同切割方式的出根数(条)
表6枝条不同切割方式的平均根长(厘米)
表7枝条不同切割方式和不同处理方式的叶片平均鲜重(克)
结果如表3～7和图3所示，在进行不同的枝条预处理三种方式中，其中两年生嫩枝斜切后并在基部1cm处穿孔后再插土里这一处理生根率最高，达到了5.5％±0.15％，出愈伤时间为11d；出根数为3.5条；平均根长为3.1cm；叶片鲜重为4.5g；菌肽结合处理枝条的生根率为65.2％±3.8％；在8d的时候出现了愈伤，出根数为6.7条；平均根长约5.7cm；叶片鲜重为11.1g。由以上数据可知，在三种不同修条处理上，斜切并在基部穿孔的方式在出根率、生根长度、出现愈伤时间、出根数量、叶片鲜重上有着明显的优势，而在K599菌液浸蘸后用多功能肽工作液浇灌上，也表现这一特征，且相较于对照，此处理有着明显提高扦插枝条的生长作用。
实施例3枝条不同生根处理方式的筛选
(1)在北京中科亚光生物科技公司人工合成多功能肽SPPRA，根据配比加入蒸馏水，稀释成0.04～0.06mol/L的工作溶液。
(2)将发根农杆菌K599接种于1.5～2L的含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的YEP液体培养基中，28～30℃震荡培养16～20h，得到K599的工作溶液。
(3)平切剪取北京林业大学附近的三顷园基地中生长的两年生(直径约1.5-2cm)枝条360枝，剪取时保留枝条上部顶芽或叶片，将枝条长度剪成约10cm，枝条基部进行斜切后基部穿孔处理。
(4)将处理好的枝条分成6组，每组60枝，分别进行生根粉浸蘸、菌液浸蘸、多功能肽浸蘸、多功能肽浇灌、菌肽结合。
对照处理：水浸泡，菌液浸蘸为将枝条浸泡在K599菌液中，多功能肽浸蘸为将枝条置入多功能肽工作液中浸泡，其处理时间均为24h，浸泡枝条基部长度均为4cm。
具体的，对照组处理为将枝条在水溶液浸蘸24h后插入土壤中；生根粉浸蘸为，生根粉选购久润牌生根粉按1：1000的比例配置成工作溶液，将枝条浸蘸其中24h后插入土中；
菌液浸蘸为：将枝条浸蘸K599菌液24h后，插入土中；
多功能肽浸蘸：将枝条浸蘸多功能肽SPPRA工作液24h后插入土中；
多功能肽浇灌：在水浸泡24h预处理后将枝条插入土中，一周后对枝条浇灌多功能肽SPPRA工作液；
菌肽结合处理：使枝条浸蘸K599菌液24h后，插入土中，一周后对枝条进行浇灌。
土壤为有机营养土、蛭石、珍珠岩，在灭菌消毒后按照1：1：1体积配置。扦插的枝条放置室温恒定的温室内，每隔两天观察并统计其生长数据，期间注意操持湿度和通气状况。
表8枝条不同处理方式的根部数据
表9枝条不同处理方式的叶片生长数据
结果如表8～9和图4所示，在六种不同的生根处理中，先用K599(OD600＝0.1)处理后一周后再用多功能肽SPPRA(0.04-0.06mol/L)浇灌这一处理，从生根数据和叶片生长数据两方面来看，生根率为65.2％±3.8％、愈伤出现时间为8天、出根数为8.7条、平均根长为7.8cm，较为显著的高于其他五种处理方式；叶片生长数据通过统计叶片平均鲜重、完整叶片出现时间和叶片数，说明在K599菌液浸蘸后用多功能肽SPPRA工作液浇灌对于叶片生长有着促进作用。相较于其他五种处理，在K599菌液浸蘸后用多功能肽SPPRA工作液浇灌中，对于扦插枝条的生根和叶片生长都有着明显的促进作用。
利用两年生嫩枝在斜切15°并在基部穿孔后先用K599处理后用多功能肽SPPRA工作液浇灌实现了木本植物快速生根，整个处理到生根的时间大概在十天左右，相较于其他扦插方法大大的缩短了杜仲扦插生根的时间。在生产实践中，利用此方法能够促进杜仲造林、快速扩繁，并且可应用于其他难以生根的木本植物，对于推动木本植物大面积人工种植有着重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 一种促进木本植物扦插成活的多功能肽及促进扦插生根的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Ile Asn Leu Gly Gln Leu Pro Phe Asp Ile Asp Phe His Pro
1 5 10 15
Leu Asp Lys Leu Val Ala Ala Gly Leu Ile Thr Gly Asp Leu Leu Leu
20 25 30
Tyr Arg Tyr Ser Ala Asp Ser Ser
35 40
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagatta atttaggaca gcttccgttt gacattgatt ttcatccttt ggacaagcta 60
gttgctgctg ggctcatcac aggagacctt ttactatatc gttattccgc tgattcatca 120
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagatta atttaggaca gcttcc 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgatgaatca gcggaataac ga 22

Claims (10)

1.一种促进木本植物扦插成活的多功能肽，其特征在于，所述多功能肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述多功能肽的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种促进杜仲扦插成活的组合物，其特征在于，包括独立包装的权利要求1所述多功能肽，和发根农杆菌的菌液。
4.权利要求1所述多功能肽或权利要求3所述组合物在促进杜仲扦插成活中的应用。
5.一种促进扦插杜仲生根的方法，其特征在于，包括以下步骤：将经预处理的插穗在发根农杆菌的工作菌液中浸泡后，扦插于基质，扦插后一周，浇灌包含权利要求1所述多功能肽的水溶液。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述预处理包括选取杜仲枝条，裁剪成插穗后，在水中浸泡18~26h。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，经预处理的插穗在所述工作菌液中浸泡1h。
8.根据权利要求5或7所述方法，其特征在于，所述工作菌液的OD600值为0.1~0.2。
9.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述基质的组成包括有机营养土、蛭石和珍珠岩，且所述有机营养土、蛭石和珍珠岩的体积比为1:1:1~2:1:1。
10.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述浇灌包括在培养一周后使用所述多功能肽的水溶液浇灌一次，浇灌量为40~60ml/株。
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