CN103484442A - 结瘤因子水解酶、其编码基因及应用 - Google Patents

结瘤因子水解酶、其编码基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种结瘤因子水解酶、其编码基因及应用。所述结瘤因子水解酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，利用大肠杆菌表达体系重组表达得到的重组结瘤因子水解酶MtChit5能够高效地将结瘤因子水解为脂质几丁质二糖NodSm-II(C16:2)和带硫酸基团的几丁质寡聚糖，它们是新型的研究植物与微生物互作的重要化合物，这对于豆科植物与根瘤菌互作过程中的机制研究具有重要的意义。

Description

结瘤因子水解酶、其编码基因及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种结瘤因子水解酶、其编码基因及应用。
背景技术
氮是植物生长和发育必不可少的营养元素，农作物的产量在一定程度上依赖于植物可利用氮（NH4 + 及NO3 -）的获取量。最近半个世纪以来，化学合成氮肥被广泛应用于农业增产。但是过量使用氮肥不仅需要消耗大量的化学能源，引起土壤酸化和水体富营养化，也会导致相当量的氮流失以及由细菌反硝化作用引起的N2O增加，从而导致温室效应及臭氧层破坏，进而严重破坏生态平衡。不利于我国的国民经济可持续发展。
相对于化学合成固氮，生物固氮是一种高效且环境友好型的固氮方式。根瘤菌是一种典型的生物固氮菌，它能够与豆科宿主植物共生并形成根瘤，将N2固定并转化为植物可利用的氮素。此生物固氮体系能极大程度地提高氮的利用效率，增加粮食作物的产量，减少能源的消耗和减少对环境的污染，是一种可持续的发展方式。
根瘤菌与豆科植物共生互作的过程中，植物根部会形成“根瘤”这种复杂和独特的器官。根瘤菌在根瘤里利用固氮酶将N2转化为植物可利用的NH4 +。同时，植物会为根瘤菌提供由光合作用产生的碳水化合物，两者互利共生。然而这种固氮机制具有宿主特异性，根瘤菌的入侵以及植物根瘤的形成涉及到两者之间复杂而微妙的应答机制，由许多因子共同决定。由根瘤菌分泌的结瘤因子（Nod factors）是最重要的共生决定因子，它是一种脂质几丁质寡聚糖，其结构会因根瘤菌的菌株差异而有所不同。例如，中华苜蓿根瘤菌产生的结瘤因子通常由一条含二个不饱和键的十六碳脂肪酸链连在一个四糖或五糖的碳骨架上，此外还会有一个硫酸基团结合在糖骨架的还原性末端，部分类型的结瘤因子还会有一个乙酰基团结合在糖骨架的非还原性末端。
来自糖基水解酶家族18的类V型几丁质酶——结瘤因子水解酶（MtChit5）不具备任何几丁质酶特征但却能够高效地水解中华苜蓿根瘤菌分泌的结瘤因子，表明该水解酶在结瘤共生中具有重要作用。因此，研究生物固氮相关基因及其所编码水解酶对建立农业的可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的结瘤因子水解酶。
本发明的另一个目的在于提供编码上述结瘤因子水解酶的基因。
本发明的另一个目的在于提供含有上述结瘤因子水解酶编码基因的克隆载体和表达载体。
本发明的另一个目的在于提供一种生产上述结瘤因子水解酶重组蛋白的方法。
本发明的另一个目的在于提供上述结瘤因子水解酶及其编码蛋白的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种结瘤因子水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后仍具有结瘤因子水解酶活性的衍生蛋白。
编码上述结瘤因子水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种克隆载体，其含有编码上述结瘤因子水解酶的基因。
一种表达载体，其含有编码上述结瘤因子水解酶的基因。
一种生产结瘤因子水解酶的方法，包括将含有编码结瘤因子水解酶基因的表达载体导入宿主细胞中，表达得到结瘤因子水解酶。
所述宿主细胞为大肠杆菌。
以上所述的结瘤因子水解酶在水解结瘤因子上的应用。
以上所述的结瘤因子水解酶在研究豆科植物与根瘤菌互作机制或在研究豆科转基因植物上的应用。
以上所述的编码结瘤因子水解酶的基因在研究豆科植物与根瘤菌互作机制上的应用。
本发明的有益效果是：本发明发现了一种新的苜蓿结瘤因子水解酶（MtChit5）及其编码基因，重组表达得到的结瘤因子水解酶能够高效地将结瘤因子水解为脂质几丁质二糖和带硫酸基团的几丁质寡聚糖，这为进一步研究豆科植物与根瘤菌互作过程中的机制提供了新的理论与实践基础。
附图说明
图1为截形苜蓿MtChit5基因的PCR扩增产物的电泳图 (1为MtChit5，2为DNA分子量标准品)；
图2为重组结瘤因子水解酶MtChit5的SDS-PAGE检测图（1为标准蛋白样品，2为未引入MtChit5基因的空载体对照，3为蛋白粗提取物，4为纯化后的重组蛋白MtChit5，分子量为39 kDa）；
图3为重组结瘤因子水解酶MtChit5的Western blot检测图（1为未加入IPTG诱导的大肠杆菌蛋白对照，2为加入诱导剂IPTG后大肠杆菌蛋白，3为未插入目的基因并经过IPTG诱导后的大肠杆菌蛋白对照，4为纯化后的MtChit5蛋白）；
图4为高效液相色谱检测重组蛋白MtChit5水解结瘤因子产物结果图，其中结瘤因子NodSm-V(C16:2, S)和NodSm-IV(C16:2, S)均可以被重组蛋白MtChit5水解为脂质几丁质二糖NodSm-II(C16:2)和带有硫酸基团的几丁质二糖或者三糖；
图5为野生型截形苜蓿与过表达MtChit5的转基因截形苜蓿将NodSm-IV(C16:2, S) 水解为脂质几丁质二糖NodSm-II(C16:2)的结果图，其中WT-1～WT5为野生型截形苜蓿，1-1～2-7为过表达MtChit5的转基因植物；
图6为野生型截形苜蓿与RNAi沉默MtChit5的转基因截形苜蓿将NodSm-IV(C16:2, S) 水解为脂质几丁质二糖NodSm-II(C16:2)的结果图，其中WT-1、WT-2为野生型截形苜蓿，Line1-Line5为RNAi沉默MtChit5的转基因株系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1、植物总DNA的提取
称取0.3 g截形苜蓿（Medicago truncatula）叶片于碾钵中，加入液氮后用杵碾磨至粉末状。将粉末转移至2 ml塑料管内并加入1 ml预热的CTAB缓冲液（50 mM 三羟甲基氨基甲烷, pH 8.0，0.6 M 氯化钠, 10 mM 乙二胺四乙酸， 1%  十六烷基三甲基溴化铵, 0.1% β-巯基乙醇），置于65℃水浴中30 min，期间每10 min轻柔地颠倒混匀几次。然后再加入0.8 ml氯仿/异戊醇（体积比24:1）并混匀，10000 g室温离心10 min后吸取上清液并转移至新的塑料管内，加入等体积的异戊醇后将管子轻柔地颠倒几次混匀直至出现白色絮状沉淀。用灭菌的牙签将沉淀挑出并置于含70%乙醇的溶液内洗两次，最后将沉淀出的DNA溶于双蒸水并用分光光度计（Amersham）测量其浓度。
2、基因片段的克隆
设计引物MtChit5-F和MtChit5-R，并在引物两端引入NdeI和XhoI酶切位点（划线部分），以方便其插入pET-28b载体。引物序列如下：
MtChit5-F：5’-CAAAAGTCATATGAGCACAACATCACCATCATCAAC-3’（SEQ ID NO:3）；
MtChit5-R：5’-GCCTCGAGTTAAGAAAGTGTGTTAATTTTACC-3’ （SEQ ID NO:4）。
以截形苜蓿基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增反应，反应体系如表1所示：
表1 PCR反应体系
溶液 体积（μl）
模板（50 ng） 1
dNTP Mix（2.5 mM） 4
引物F（10 μM） 1
引物R（10 μM） 1
PrimerStar DNA Polymerase (2.5 U/μl) 1
5 × PrimerStar reaction buffer 10
dd H2O 32
总体积 50
PCR反应条件为：94℃ 5min，95℃ 30s，54℃ 90s，72℃ 1min，32 个循环，72℃ 10min。
图1为PCR扩增产物的电泳图。用胶回收试剂盒回收1152 bp的PCR产物，提交测序，得到截形苜蓿结瘤因子水解酶的基因序列如SEQ ID NO:1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。PCR产物用NdeI和XhoI于37℃双酶切3 h，与同样用NdeI和XhoI双酶切的pET-28b表达载体连接。取10 μl连接产物转化大肠杆菌DH5α并将转化后的菌悬液涂布于含有卡那霉素（100 μg/ml）的LB固体培养基表面，37℃ 培养12-16 h后随机挑取6株单菌落接种到3 ml含有卡那霉素（100 μg/ml）的LB液体培养基中培养过夜。将菌液离心后提取质粒做双酶切检测，并交测序验证。 
取5 μl酶切和测序检测都正确的重组质粒转化表达型大肠杆菌BL21（DE3），同样按照上述方法筛选出含有重组质粒的宿主菌BL21（DE3：MtChit5）。
3. 重组蛋白的诱导表达及纯化
将重组后的工程菌BL21（DE3：MtChit5）划线到含有卡那霉素（50 ug/ml）的LB固体培养基中，37℃培养12-16 h。随机挑出一个单菌落接种到3 ml含有卡那霉素（50 ug/ml）的LB液体培养基中，37℃、220 rpm震荡培养12 h。培养好的菌液按1:100比例接种到500 ml含有卡那霉素（50 ug/ml）的LB液体培养基中，37℃震荡培养大约2 h至OD600 = 0.6时加入IPTG至终浓度为0.5 mM，再转于18℃、220 rpm条件下震荡培养20 h。
诱导后的菌液于7500 g条件下离心5 min后弃去上清液，将收集的菌体重悬于预冷的10 ml的裂解缓冲液（50 mM 磷酸二氢钾，1 M 氯化钠，10 mM 咪唑）中，置于冰上并在脱色摇床上轻柔颠倒45 min。用超生波破碎仪（MISONIX）破碎细胞后，15000 g离心20 min，收集的上清液即为含重组蛋白的粗制酶液。此粗提物再用Ni-NTA 树脂凝胶柱（Qiagen）纯化，具体步骤可以参见产品说明书。
获得的粗制酶蛋白及纯化后的重组蛋白用SDS-PAGE（12%）和Western blot检测后发现，此重组蛋白可以在大肠杆菌体内大量表达并能够用亲和层析进行纯化（如图2和图3所示）。
Western blot步骤如下：蛋白样品使用12% SDS-PAGE进行分离，之后电转移到NC膜上。使用丽春红染色来检测膜上蛋白的含量，并标记不同的蛋白分子量。使用双蒸水洗去残留的染料。再使用封闭液封闭NC膜30分钟。抗体是由大肠杆菌BL21（DE3：MtChit5）表达纯化的MtChit5蛋白免疫兔子后取兔子血清并初步分化而来。一抗稀释在封闭液中与NC膜温育1小时，使用TBST洗去一抗。之后加入稀释于封闭液的二抗，温育1小时，再用TBST洗去二抗。最后使用3,3’-diamino-benzidine（DAB）显色。 
4、重组蛋白酶MtChit5活性研究
在50 μl的反应体系中加入结瘤因子NodSm-V(C16:2, S)或NodSm-IV(C16:2, S)至终浓度为40 μM，再加入25 μl 50 mM的乙酸钠缓冲液及0.18 g纯化后的重组蛋白酶MtChit5，混匀后置于37℃反应3 h。反应后的产物用高效液相色谱检测，发现重组蛋白酶MtChit5能够高效地将结瘤因子水解为脂质几丁质二糖NodSm-II(C16:2) 和带硫酸基团的几丁质寡聚糖（如图4所示）。这对于豆科植物与根瘤菌互作过程中的机制研究具有重要的意义。
5、转基因MtChit5截形苜蓿水解结瘤因子的能力有显著变化
将MtChit5的全长用XbaI和XhoI连入双元载体pISV2678，得到重组载体pISV-MtChit5用于构建MtChit5过量表达的转基因截形苜蓿。为了构建用于MtChit5基因沉默转基因截形苜蓿的RNAi载体，667-bp的MtChit5片段（MtChit5Δ1-94/Δ761-1152）按两种方式（sense 和 anti-sense）插入pBS-RNAi载体，得到重组载体pBS-RNAi-MtChit5i。然后再将该载体中的2604-bp片段（包括烟草花叶病毒35S启动子、667-bp的sense链MtChit5片段、一段间隔序列、667-bp的anti-sense链MtChit5片段、终止子）用HindIII和SacI切下并连入双元载体pCAMBIA1305.1，得到载体pCAMBIA-MtChit5i用于构建MtChit5基因沉默的转基因截形苜蓿。
将上述得到的重组双元载体pISV-MtChit5和pCAMBIA-MtChit5i利用根癌农杆菌介导的方法构建转基因截形苜蓿。具体方法为：先将该两种重组双元载体利用电转移导入根癌农杆菌EHA105，再用该菌侵染野生型截形苜蓿的叶片。被侵染的叶片在含有乙酰丁香酮的SHMab培养基中暗处培养三天后，再转移到新鲜的含有500 μg ml-1 头孢霉素和40 μg ml-1潮霉素的SHMab培养基上生长。新形成的愈伤组织继续转移到含有40 μg ml-1潮霉素的SHM2培养基上筛选直到出现胚芽，然后将胚芽转移至1/2SHM2培养基中促进其生根。最后将形成的转基因截形苜蓿幼苗转移至含有灭菌蛭石和陶土（1:3）的培养瓶中生长，该批植物即为T0代转基因截形苜蓿。
继续繁育并筛选T0代转基因截形苜蓿至T2代，得到的T2代转基因截形苜蓿用于做水解结瘤因子实验。步骤具体如下：先将转基因幼苗置于一个倒置的1毫升注射器内，该注射器内0.4毫升培养基预先含0.5% (v/v) DMSO 和 0.1 μM NodSm-IV(C16:2, S)，然后置于24℃暗处处理一天以诱导MtChit5的表达。再将幼苗转移到新鲜的含同样成分的注射器内培养18小时用以检测结瘤因子水解。最后将植物取出后的培养基用等体积正丁醇萃取、蒸干并用HPLC检测结瘤因子水解情况。
水解实验结果表明，多数过表达组转基因植物的水解活性明显提高（图5），而沉默组的转基因植物的水解活性降低（图6）。这些结果表明了截形苜蓿根际中结瘤因子水解酶的活性与MtChit5密切相关。
综上所述，本发明所述的来源于豆科模式植物截形苜蓿的结瘤因子水解酶MtChit5能够在大肠杆菌表达体系中高效表达具有生物活性的蛋白酶，该重组蛋白酶能够高效且特异地将豆科植物与根瘤菌互作过程中最重要的信号分子（结瘤因子）水解成脂质几丁质二糖和带硫酸基团的几丁质寡聚糖，它们是新型的研究植物与微生物互作的重要化合物。因此，利用此重组蛋白酶可以大量制备该新型化合物并应用于植物学和微生物学的研究。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
<110>  中山大学
 
<120>  结瘤因子水解酶、其编码基因及应用
 
<130> 
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  1152
<212>  DNA
<213>  Medicago truncatula
 
<400>  1
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<211>  383
<212>  PRT
<213>  Medicago truncatula
 
<400>  2
 
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Leu Leu Ala Leu Ala Ala Lys Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ser Pro Ser
            20                  25                  30         
 
 
Ser Thr Thr Arg Val Lys Gly Ile Tyr Trp Ile Glu Asn Pro Leu Phe
        35                  40                  45             
 
 
Pro Pro Ala Ser Ile Asp Thr Ser Leu Phe Thr His Ile Phe Tyr Ala
    50                  55                  60                 
 
 
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145                 150                 155                 160
 
 
Asn Asp Leu Gly Glu Leu Leu Phe Gln Trp Arg Arg Ala Ile Ser Asp
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        195                 200                 205            
 
 
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225                 230                 235                 240
 
 
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            260                 265                 270        
 
 
Tyr Gly Lys Ser Trp Lys Leu Gln Asp Pro Asn Val His Gly Ile Gly
        275                 280                 285            
 
 
Ala Pro Asn Val Gly Pro Gly Pro Gly Val Asp Gly Gly Met Ala Tyr
    290                 295                 300                
 
 
Phe Gln Val Val Asp Phe Asn Lys Gln Met Gly Ala Lys Val Val Tyr
305                 310                 315                 320
 
 
Asp Lys Glu Thr Gly Ser Val Tyr Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Trp Ile
                325                 330                 335    
 
 
Gly Tyr Asp Asp Pro Phe Thr Val Ser Val Lys Val Gly Phe Ala Gln
            340                 345                 350        
 
 
Ala Leu Lys Leu Gly Gly Tyr Phe Phe Trp Ala Ala Gly Tyr Asp Thr
        355                 360                 365            
 
 
Ser Asp Trp Lys Val Ser Thr Gln Gly Lys Ile Asn Thr Leu Ser
    370                 375                 380            
 
 
<210>  3
<211>  36
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
caaaagtcat atgagcacaa catcaccatc atcaac                                 36
 
 
<210>  4
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
gcctcgagtt aagaaagtgt gttaatttta cc                                     32

Claims (10)

1.一种结瘤因子水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后仍具有结瘤因子水解酶活性的衍生蛋白。
2.编码权利要求1所述结瘤因子水解酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种克隆载体，含有权利要求2或3所述的基因。
5.一种表达载体，含有权利要求2或3所述的基因。
6.一种生产结瘤因子水解酶的方法，包括将权利要求5所述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到结瘤因子水解酶。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.权利要求1所述的结瘤因子水解酶在水解结瘤因子上的应用。
9.权利要求1所述的结瘤因子水解酶在研究豆科植物与根瘤菌互作机制或在研究豆科转基因植物上的应用。
10.权利要求2或3所述的基因在研究豆科植物与根瘤菌互作机制上的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YE TIAN,ET AL.: "The noddulation factor hydrolase of Medicago truncatula: Characterization of an enzyme specifically cleaning rhizobial nodulation signals", 《PLANT PHYSIOLOGY》 *
田野: "截形苜蓿中结瘤因子水解酶的生化特性分析", 《中山大学博士毕业论文》 *

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