DE10107843A1

DE10107843A1 - Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung

Info

Publication number: DE10107843A1
Application number: DE10107843A
Authority: DE
Inventors: Astrid Blau; Mathieu Klein; Gunnar Plesch
Original assignee: Metanomics GmbH
Current assignee: BASF Metabolome Solutions GmbH
Priority date: 2001-02-16
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2002-10-17

Abstract

In dieser Erfindung werden Gene und Verfahren zur Isolierung von Genen beschrieben, welche für Genprodukte kodieren, welche bei Ausfall zu einem stark verzögerten Wachstum und/oder völligem Wachstumsstop auf der Keimlingsebene von Arabidopsis thaliana kodieren. Die Erfindung beschreibt die Verwendung dieser Gene und dadurch kodierter Genprodukte für die Entdeckung neuer Herbizide. Darüber hinaus beschreibt diese Erfindung die Verwendung der hier identifizierten Gene und Genprodukte für die Herstellung von gegenüber Herbiziden resistenten Pflanzen. DOLLAR A Beschreibung DOLLAR A Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, Substanzen identifiziert nach diesem Verfahren sowie deren Verwendung als Herbizid. DOLLAR A Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren, Organismen, enthaltend die Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren, speziell transgene Pflanzen, enthaltend die Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren.

Description

In dieser Erfindung werden Gene und Verfahren zur Isolierung von Genen beschrieben, welche für Genprodukte kodieren, die bei Aus fall zu einem stark verzögertem Wachstum und/oder völligem Wach stumsstop auf der Keimlingsebene von Arabidopsis thaliana führen. Die Erfindung beschreibt die Verwendung dieser Gene und dadurch kodierter Genprodukte für die Entdeckung neuer Herbizide. Darüber hinaus beschreibt diese Erfindung die Verwendung der hier identi fizierten Gene und Genprodukte für die Herstellung von gegenüber Herbiziden resistenten Pflanzen.

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identi fizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, Substanzen identifiziert nach diesem Verfahren sowie deren Verwendung als Herbizid.

Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren, Organismen enthaltend die Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren speziell transgene Pflanzen enthalten die Nukleinsäurekonstrukte und/oder Vektoren.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Antagonisten und ihre Verwendung, Antikörper und Antisense- RNA-Moleküle sowie Mittel enthaltend eine herbizide Substanz isoliert nach den erfindungsgemäßen Verfahren.

Weiterhin betrifft die Erfindung Zusammensetzungen enthaltend den Antikörper, die Antisense-Nukleinsäure und oder den Antagonisten.

Eine moderne Landwirtschaft ist ohne den Einsatz von Herbiziden nicht denkbar. Gegenwärtig wird der Wert der auf der gesamten Welt eingesetzten Herbizide auf ca. 30 Mrd. DM geschätzt. Obwohl bereits eine ganze Reihe von hoch wirksamen und ökologisch un bedenklichen Herbiziden auf dem Markt sind, ergibt sich die Not wendigkeit für neue Herbizide zum einen aus der Tatsache, daß immer wieder Unkräuter eine Resistenz gegen bereits eingesetzte Herbizide entwickeln und diese somit zum Teil nicht mehr einge setzt werden können, zum anderen aus der Tatsache, dass ein Teil der Herbizide ökologische Nachteile aufweist und in der Zukunft zu erwartende Gesetzgebungsschritte dazu führen könnten, dass diese Herbizide ihre Zulassung verlieren werden. Darüber hinaus werden zum heutigen Zeitpunkt in vielen Fällen noch Herbizide als Mischungen eingesetzt werden, die mehrere aktive Wirkstoff komponenten enthalten, was besondere Anforderungen an die Formulierung stellt.

Neue Herbizide sollten sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Unbedenklichkeit sowie geringe Aufwandmengen auszeichnen.

Das bisherige Vorgehen bei der Identifizierung und Entwicklung neuer Herbizide war durch die Applikation von potentiellen Wirk stoffen direkt auf geeignete Testpflanzen gekennzeichnet. Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, dass zum Testen relativ große Substanzmengen erforderlich sind. Dies ist im Zeitalter der kombinatorischen Chemie mit seiner in einer äußerst großen Viel falt, aber nur in geringen Mengen herstellbaren Substanzen selten gegeben. Dies stellt von daher eine wichtige Limitierung bei der Entwicklung neuer Herbizide dar. Zum anderen werden bei der direkten Applikation auf die zu testenden Pflanzen bereits im ersten Screeningschritt äußerst hohe Anforderungen an die Substanz gestellt, da nicht nur die Inhibierung oder sonstige Modulation der Aktivität eines zellulären Zieles (in der Regel ein Protein oder Enzym) erforderlich sind, sondern die Substanz dieses Ziel zunächst überhaupt erreichen muss, was bereits iii diesem ersten Schritt Anforderungen an die Testsubstanz in Bezug auf Aufnahme durch die Pflanze; Permeabilität durch die ver schiedenen Zellwände und Membranen, Persistenz zur Erreichung des gewünschten Effektes, und schließlich Inhibierung/ Veränderung der Aktivität des gewünschten Zielenzyms erfordert.

Es ist angesichts dieser Erfordernisse daher nicht überraschend, dass zum einen die Identifizierung neuer Wirkstoffe immer höhere Kosten verursacht, zum anderen immer weniger Wirkstoffe entdeckt werden.

Es war deshalb Aufgabe in der vorliegenden Erfindung, Targets für die Identifizierung neuer Herbizide, sowie neue Herbizide und deren Verwendung zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass man die Tanskription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genprodukt der durch eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Sequenz, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerier ten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten läßt,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Nukleinsäure sequenzen, die für Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 60% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen,

kodierten Aminosäuresequenz, beeinflußt und solche Substanzen auswählt, die die Transkription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genprodukt reduzieren oder blockieren.

Wobei im Sinne der Erfindung unter Transkription die RNA-Synthese mithilfe einer RNA-Polymerase in 5'→3'-Richtung anhand einer DNA-Matrize zu verstehen ist. Unter Translation ist die Bio synthese von Proteinen in vitro und in vivo zu verstehen. Expression bedeutet die Neusynthese in vitro und in vivo von durch die oben genannten Nukleinsäuren kodierten Proteine und umfaßt die Transkription. Die Translation und gegebenenfalls die postranslationale Modifizierungen des Proteins. Unter Aktivität des Genprodukts ist die biologische Aktivität bzw. Funktion des Proteins wie beispielsweise die enzymatische Aktivität, die Rezeptorbindungseigenschaft, die Eigenschaft Nukleinsäuren zu binden das heißt die regulative Eigenschaft oder die Transporter funktion des Proteins zu verstehen, wie sie im Organismus natür licherweise vorkommt. Unter Reduktion der Aktivität des Gen produkts ist eine Verringerung der biologischen Aktivität im Ver gleich zur natürlichen Aktivität des Genprodukts von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% und ganz besonders bevor zugt um mindestens 70% zu verstehen. Blockierung der Aktivität des Genprodukts bedeutet die gänzliche, das heißt 100%ige Blockierung der Aktivität oder die teilweise Blockierung der Aktivität, bevorzugt eine mindestens 80%ige, besonders bevorzugt mindestens 90%ige, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%ige Blockierung der biologischen Aktivität.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen oder vorteilhaft in einem High-Throughput- Screening durchgeführt werden und zur Identifizierung von Sub stanzen mit herbizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden. Im vorgenannten Verfahren können vorteilhaft auch Sub stanzen identifiziert werden, die mit den oben genannten Nuklein säuren bzw. mit deren Genprodukten interagieren, diese Substanzen sind potentielle Herbizide, die über die klassische chemische Synthese in ihrer Wirkung weiter verbessert werden können.

Nach dem Verfahren identifizierte bzw. ausgewählte Substanzen können vorteilhaft auf eine Pflanze verbracht werden, um die herbizide Aktivität der Substanzen zu testen. Es werden solche Substanzen auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens können die Substanzen auch neben dem vorgenannten in vivo-Test verfahren auch in einem in vitro Test gescreent werden. Ein der artiger in vitro Test mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. deren Genprodukten hat den Vorteil, dass die Substanzen rasch und einfach auf ihre biologische Wirkung hin gescreent werden können. Derartige Test eignen sich auch vorteilhaft für das sog. HTS.

Das Verfahren kann mit freien Nukleinsäure wie DNA oder RNA, freien Genprodukten oder vorteilhaft in einem Organismus durch geführt werden, wobei als Organismus Bakterien, Hefen, Pilze oder vorteilhaft Pflanzen verwendet werden. Als Organismen werden vor teilhaft der konditionale oder natürliche Mutanten der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 verwendet. Unter konditionalen Mutanten sind Mutanten zu verstehen, die erst nach Induktion eine Reduktion der Transkription, der Expression oder der Translation der vorher genannten Nukleinsäuren oder der durch sie kodierten Genprodukte aufweisen. Ein Beispiel derartiger konditionaler Mutanten sind Mutanten, in denen die Nukleinsäuren hinter einem temperatur sensitiven Promotor liegen, der bei höheren Temperaturen nicht funktionell ist, das heißt der die Transkription bei höheren Temperaturen beispielsweise oberhalb 37°C verhindert.

Ein weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten von Proteinen, die durch eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

kodiert werden indem folgende Verfahrensschritte durchlaufen werden

a) in Kontaktbringen von Zellen, die das Protein exprimieren, oder des Proteins mit einem Kandidatenstoff;
b) Testen der biologischen Aktivität des Protein;
c) Vergleichen der biologischen Aktivität des Proteins mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei eine Verringerung der biologischen Aktivität des Proteins anzeigt, daß der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.

In einer vorteilhaften Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens wird der/die unter Buchstabe f) identifizierte(n) Antagonist(en) auf eine Pflanze verbracht, um seine/ihre herbizide Aktivität zu testen und den/die Antagonist(en) aus gewählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen in vivo oder in vitro und/oder vorteilhaft gemeinsam oder besonders vorteilhaft in einem High-Throughput- Screening durchgeführt werden und zur Identifizierung von Sub stanzen mit herbizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten bzw. selektierten Nukleinsäuresequenzen sind für das Wachstum und die Entwicklung von höheren Pflanzen essentiell. Die Unter drückung der Transkription, der Expression und/oder Translation der mRNA und damit der Bildung der Genprodukte und/oder der Unterdrückung der von den kodierten Genprodukten ausgeübten Funktion bzw. biologischen Aktivität in intakten Pflanzen durch Substanzen vorteilhaft niedermolekulare Substanzen mit einem Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, einem Ki-Wert kleiner 1 mM und weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring oder proteinogenen Substanzen oder einer Antisense-RNA führt daher zu massiven Veränderungen des Wachstums und der Entwicklung der betroffenen Pflanzen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen sind deshalb in der Landwirtschaft als Herbizide geeignet.

Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 sind essentiell für die Organismen bevorzugt für die Pflanzen. Die Genprodukte der genannten Sequenzen sind den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 zu entnehmen. Die genomische DNA der Sequenzen wird jeweils in SEQ ID NO: 19 (genomische DNA von Linie P95), SEQ ID NO: 20 (genomische DNA von Linie P9), SEQ ID NO: 21 (genomische DNA von Linie P38), SEQ ID NO: 22 (genomische DNA von Linie P44), SEQ ID NO: 23 (genomische DNA von Linie P77) und SEQ ID NO: 24 (genomische DNA von Linie P102) wiedergegeben. SEQ ID NO: 1 (= Klon P95) codiert für ein Protein (PID: g2460037), das Ähn lichkeiten zu verschiedenen m6A-Methyltransferasen unter anderem aus Maus (NP 062695) und Mensch (AAB71850) aufweist. SEQ ID NO: 3 (= Klon P9) codiert für ein "DNA repair protein RAD54-like" Pro tein, das auf Chromosom 3 (EMBL/AP000419) von Arabidopsis liegt. Es hat Ähnlichkeiten im Blast-Vergleich zu einer Reihe von DNA bindenden Proteinen wie Helicasen, Transactivatoren etc. (Emery et al., Gene 104 (1), 103-106, 1991). Eine besonders hohe Ähn lichkeit liegt zu dem DNA-Repair-Protein RHP 54 aus Schizosaccha romyces pombe vor (Muris et al., J. Cell. Sci. 109 (Pt 1), 73-81, 1996; ) SEQ ID NO: 5 (= Klon P38) codiert für einen ORF auf Chro mosom 3 (EMBLNEW/ACO23912), der möglicherweise ein Thioredoxin ist. Im Blast-Vergleich zeigen sich Ähnlichkeiten zu Thioredoxinen verschiedener Herkunft (Fraser et al., Nature 390 (6660), 580-586, 1997; Reith et al., Plant Mol. Biol. Rep., 13, 333-335, 1995). Der Klon P44 (= SEQ ID NO: 7) kodiert für ein Protein des TAC Klons K15C23 (EMBLALERT/AB024024) ohne eindeutige Homologie in der Blast-Suche. Sequenzvergleiche auf Aminosäureebene zeigen schwache Homologien zu VAV2-Proteinen (kleines ras-ähnliches GTP- bindende Protein, Swissprot Q60992, Schuebel et al., Oncogene 13 (2), 363-371, 1996; Henske et al., Ann. Hum. Genet. 59 (Pt 1), 25-37, 1995). SEQ ID NO: 9 ( = Klon P77) codiert wahrscheinlich für eine Fructokinsase des BAC Klons F24B22 des Chromosoms 3 (EMBL/ATF24B22). Blast-Vergleiche bestätigen diese Homologie (swissprot P37829, Smith et al., Plant Physiol., 102 (3), 1043, 1993; Blatch et al., Gene, 95 (1), 17-23, 1990). Von SEQ ID NO: 11 wird ein Protein (Accession number BAB09578.1) codiert, das schwache Homologien zu verschiedenen Zinkfinger-Proteinen hat. Das durch SEQ ID NO: 13 codierte Protein (AB36712.1) hat Ähnlich keiten zu LYTB-Proteinen speziell zu LYTB SYNY3 aus Synechocystis (Q55643). Das Gen bzw. das durch das Gen codierte Protein liegt auf Chromosoms V (Accession number AB006706). Innerhalb der Se quenz von SEQ ID NO: 13 sind einige ESTs (gb:Z34640, Z30476, AA605545, Z34228, H76883, Z26425) bekannt. SEQ ID NO: 15 codiert für ein hypothetisches Protein (CAB81447,1), das die Crepropin- Familien-Signatur enthält und schwache Homologien zu myc-Protoon kogenen aufweist.

Das von SEQ ID NO: 17 (siehe auch ESTAV528166) codierte Protein (AAF23295), hat eine gewisse Homologie zu einem Leucin-reichen Protein aus dem Mensch (Acession number P42704, Wang et al., In vitro Cell Dev. Biol. Amin. 1994, 30A(2): 111-114).

Die Unterdrückung der Bildung der Genprodukte bzw. Unterdrückung der von den kodierten Genprodukten ausgeübten Funktion oder Aktivität in intakten Pflanzen durch eine niedermolekulare Substanz führt zur Unterdrückung des Wachstums und die Ent wicklung der Pflanze wird massiv verändert und unterdrückt. Weitere Klone, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze massiv verändern, sind die Klone P95 und P99a, auch sie sind zur Identifizierung von Herbiziden vorteilhaft geeignet. Der genomische Bereich, in dem die Insertion der T-DNA bei Klon P91 stattfand, liegt in einem Bereich, für den kein Open Reading Frame (= ORF) vorhergesagt werden konnte. Die Insertion der T-DNA erfolgte bei Klon P91 in Position 6632 des P1-Klons MUJ8 (AB028621) des Chromosoms III von Arabidopsis. Die Sequenz ist AB028621 zu entnehmen. Auch im Falle des Klons P99a erfolgte die Insertion des T-DNA (Position 96710 des BACs F10K1 [AC067971] des Chromosoms I von Arabidopsis) an einer Stelle im Genom, für die kein ORF vorhergesagt wurde. Dem Klon AC067971 kann die genomische Sequenz entnommen werden.

Dies vorgenannten Sequenzen oder funktionale Teile davon ermögli chen die Identifizierung von in der Landwirtschaft nutzbaren Her biziden beispielsweise über Verfahren, die folgende Schritte vor teilhaft enthalten:

a) Erzeugung von rekombinanten Organismen vorteihaft transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben wie Geweben von beispielsweise Blatt, Wurzel, Sproß oder Stamm, Pflanzensamen, Pflanzenkalli oder Pflanzenzellen, die die Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17, oder De rivate wie Teilen dieser Sequenz enthalten, die die biologi sche Aktivität dieser Sequenzen aufweisen, enthalten;
b) Zugabe von chemischen Verbindungen zu den unter a) genannten, rekombinanten Organismen und nicht rekombinanten Ausgangsor ganismen, die auf ihre Herbizidaktivität getestet werden sol len oder
c) Zugabe von chemischen Verbindungen zu den unter a) genannten, rekombinanten Organismen, die auf ihre Herbizidaktivität ge testet werden sollen; und
d) Bestimmung der biologischen Aktivität beispielsweise der en zymatischen Aktivität, des Wachstums oder der Vitalität der rekombinanten Organismen im Vergleich zu den nicht rekombi nanten Ausgangsorganismen nach Zugabe von chemischen Verbin dungen gemäß Punkt b) oder
e) Bestimmung der biologischen Aktivität beispielsweise der en zymatischen Aktivität, des Wachstums oder der Vitalität der rekombinanten Organismen nach Zugabe von chemischen Verbin dungen gemäß Punkt c) im Vergleich zu denselben nicht behan delten, rekombinanten Organismen;
f) Selektion der chemischen Verbindungen, die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der nicht rekombi nanten Organismen, der gemäß Punkt d) oder e) bestimmten che mischen Verbindungen, im Vergleich zu den rekombinanten Orga nismen reduzieren oder vollständig hemmen bzw. blockieren.

Unter chemischen Verbindungen, die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Organismen reduzieren, sind Ver bindungen zu verstehen, die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Organismen mindestens um 10%, vorteilhaft um mindestens 30%, bevorzugt um mindestens 50%, besonders be vorzugt um mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt um minde stens 90% hemmen.

Assaysysteme, die die Identifizierung von Substanzen, die die Bildung der Genprodukte und/oder die von den Genprodukten aus geübten Funktionen oder die Aktivität der Genprodukte in intakten Pflanzen, Pflanzenteilen, -geweben oder Pflanzenzellen unter drücken, sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft sei hier auf Testesysteme für die Inhibierung von Enzymassays wie der Fructo kinaseaktivität wie von Tangney et al. (J. Mol. Microbiol. Bio technol., 2 (1), 2000: 71-80), Martinez-Barajas et al. (Protein Expr. Purif., 1997, 11 (1), 41-46), Kanayama et al. (Plant Phy siol., 1997, 113 (4), 1379-1384) oder von Veiga-da-Cunha et al. (Protein Expr. Purif., 19 (1), 2000: 48-52) beschrieben, verwie sen. Diese Testsysteme können beispielsweise vorteilhaft für sog. Inhibierungsassays für beispielsweise den Klon P77 verwenden.

Weitere vorteilhafte Assaysysteme sind beispielsweise die Fluoreszenz Korrelationsspectroskopie (= FCS). Mit Hilfe der FCS (Brock et al., PNAS, 1999, 96, 10123-10128; Lamb et al., J. Phys. Org. Chem., 2000, 13654-658) ist es möglich die zeitliche Diffusion von Molekülen zu messen bzw. die Differenz der gebundenen gegenüber den freien Molekülen zu ermitteln. Hierzu werden die zu untersuchenden Moleküle fluoreszenzmarkiert und beispielsweise ein definiertes Volumen in Mikrotiterplatten gegeben. Die Fluktuation der Moleküle wird in den Proben dabei von der Braunschen Molekularbewegung getrieben. Durch einen in der Probe fokusierten Laser lassen sich die translateralen bzw. rotationale Diffusion und Konformationsänderungen der Moleküle verfolgen und über eine Korrelation analysieren. Durch Bindung an andere Substanzen ändert sich der Diffusionskoeffizient der Mole küle. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen lässt sich die Bindung der Moleküle über die Änderung des Diffusionskoeffizienten er mitteln bzw. quantifizieren. Mit dieser Methode kann in einem breiten Konzentrationsbereich vorteilhaft gemessen werden. Die Methode eignet sich vorteilhaft für die Messung von rekombinanten Proteinen, die vorteilhaft mit einem sog. His-Tag zur leichteren Aufreinigung über handelsübliche Chromatographie-Säulen (Porath et al., Nature 1975, 258, 598-599) versehen sind. Das so ge reinigte Protein wird schließlich mit einem Fluoreszenzmarker wie z. B. Carboxytetramethylrhodamin oder BODIPY® (z. B. BODIPY 576/589 Angiotensin II, NEN® Life Science Products, Boston, MA, USA) ver sehen. Die zu untersuchende Verbindung bzw. Substanz wird zu dem Protein anschließend in einem Überschuß zugegeben. Die Diffusion des so markierten Proteins wird schließlich mit einem FCS-System (z. B. ConfoCor2 mit LSM 510, Carl Zeiss Mikroskop, Jena, Deutsch land) ermittelt.

Eine weitere vorteilhafte Detektions-Methode für das erfindungs gemäße Verfahren ist die sog. "Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation"-Methode (= SELDI ProteinChip®). Diese Methode wurde von Hutchens und Yip (1980) erstmals beschrieben. Mit dieser Methode, die für die reproduzierbare, gleichzeitige Identifi zierung von Biomarkern oder Antigenen entwickelt wurden (Hutchens und Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom, 1993, 7, 576-580), kann die Ligand-Protein-Bindung über Massenspektrometrie analysiert werden. Dabei wird erfolgt die Detektion über normale TOF- Detektion (= time of flight). Auch bei dieser Methode können rekombinant exprimierte Protein wie oben beschrieben exprimiert und gereinigt werden. Zur Messung wird das Protein auf den SELDI ProteinChips® immobilisiert beispielsweise über die schon zur Reinigung verwendeten His-Tags oder über Ionen- oder hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Chip. Auf diesen so vorbereiteten Chip werden anschließend die Liganden mit beispielsweise einem Auto sampler gegeben. Nach einem oder mehreren Waschschritten mit Puffern verschiedener Ionenstärke werden die gebundenen Liganden mit dem LDI-Laser analysiert. Dabei wird die Bindungsstärke der Liganden nach jedem Waschschritt ermittelt.

Als weitere vorteilhafte Dektionsmethode sei die sog. Biacore- Methode genannt. Bei der der Refraktionsindes an der Oberfläche bei Bindung von Liganden and das an der Oberfläche gebundene Protein analysiert wird. Bei dieser Methode wird eine Kollektion von kleinen Liganden sequentiell in eine Meßzelle mit dem gebundenen Protein gegeben. Die Bindung an der Oberfläche wird über eine erhöhte sog. "Plasmon-Resonanz" ( = SPR) über die Auf zeichnung der Laserrefraktion von der Oberfläche ermittelt. Im allgemeinen ist die Refraktionsindexänderung, die für eine Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche, ermittelt wird für alle Proteine oder Polypeptide gleich, das heißt diese Methode kann vorteilhaft für die verschiedensten Proteine ver wendet werden. (Liedberg et al., Sens. Actuators, 1984, 4, 299-304). Wie oben beschrieben werden auch hier vorteilhaft rekombinant exprimierte Proteine verwendet, die an den Biacore Chip (Upsala, Schweden) beispielsweise über Histidin-Reste (z. B. His-Tag) gebunden werden. Der so hergestellte Chip wird wieder mit den Liganden in Verbindung gebracht z. B. mit einem Autosampler und die Bindung über ein von Biacore vertriebenes Detektionssystem mit Hilfe des SPR-Signals d. h. über die Änderung des Refraktionsindex gemessen.

Die erfindungsgemäßen Verfahren haben eine Reihe von Vorteilen wie beispielsweise:

- neue potentielle Angriffsorte für herbizide Wirkstoffe können identifiziert werden,
- Identifizierung von Herbiziden, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung haben,
- Substanzen, die mittels der kombinatorischen Chemie erzeugte wurden, und die sich durch eine hohe Vielfalt, aber geringe zur Verfügung stehende Mengen auszeichnen können effizient auf Inhibitoren der neu identifizierten Angriffsorte geprüft werden
- sie erlauben, landwirtschaftlichen Nutzpflanzen im Fall von z. B. sehr breite Wirksamkeit aufweisenden Herbiziden (Total herbiziden oder auch selektiven Herbiziden) Resistenz gegen über diesen zu vermitteln (siehe Beschreibung im folgenden).

Weiterhin können schon in einem sehr frühen Stadium Unter suchungen zu den Aufwandmengen der gefundenen Herbizide gemacht werden. Außerdem kann die hoher Spezifität und Effizienz gegen über Unkräutern leicht ermittel werden.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige ver tiefte Prüfungen durchzuführen.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identi fizierung von Inhibitoren pflanzlicher Proteine, die durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen codiert werden, mit potentiell herbizider Wirkung indem man die Genprodukte kloniert, in einer geeigneten Expressionskassette - beispielsweise in Insektenzellen - zur Überexpression bringt, die Zellen öffnet und den Zellextrakt direkt bzw. nach Anreicherung oder Isolierung des Proteins in einem Testsystem zur Messung der biologischen Aktivität in Gegenwart von nieder molekularen chemischen Verbindungen einsetzt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb Substanzen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanz ein Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteil haft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevor zugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, einem Ki-Wert kleiner 1 mM und weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring hat bzw. wobei es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz oder um eine Antisense-RNA handelt.

Die identifizierten Substanzen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z. B. in Zell extrakten von z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auf treten. Weiterhin können die genannten Stoffe zwar im Stand der Technik bekannt sein, aber bisher nicht bekannt sein als Herbi zid. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z. B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3^rd Edition (1994), z. B. Kapitel 17. Die genannten Stoffe können z. B. zu dem Reaktions gemisch oder dem Kulturmedium zugegeben werden oder den Zellen injiziert werden oder auf eine Pflanze gesprüht werden.

Wenn eine Probe, die ein nach der erfindungsgemäßen Methode aktive Substanz beinhaltet, identifiziert wurde, dann ist es entweder möglich, den Stoff direkt von der ursprünglichen Probe zu isolieren oder man kann die Probe in verschiedene Gruppen teilen, z. B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu reduzieren und dann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer solchen "Unterprobe" der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugs weise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Probe nur noch eine geringe Anzahl von Substanzen oder nur noch eine Substanz umfaßt. Vorzugsweise wird der gemäß der erfindungs gemäßen Methode identifizierte Stoff oder Derivate davon weiter formuliert, so, daß er für die Anwendung in der Pflanzenzüchtung oder Pflanzenzell- oder Gewebekultur geeignet ist.

Die Stoffe, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet und identifiziert wurden, können sein: Expressionsbibliotheken, z. B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nuklein säuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen). Diese Stoffe könne auch funktionelle Derivate oder Analogon der bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten oder Analogon sind dem Fachmann bekannt. Die genannten Derivate und Analogon können gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik getestet werden. Weiterhin kann computergestütztes Design oder Peptidomimetics zur Herstellung geeigneter Derivate und Analogon verwendet werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugs weise eine erfindungsgemäße Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wie in den oben genannten Ausführungsformen beschrieben.

Unter Derivate(n) (der Plural und der Singular seien für diese Anmeldung und deren Definitionen äquivalent) der in den erfin dungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sind beispiels weise funktionelle Homologe der von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 kodierten Proteine oder deren biologischer Aktivität, das heißt Proteine, die dieselben biologischen Reaktionen wie die von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 9 kodierten Proteine ausführen, zu verstehen. Diese Derivate bzw. Gene sind ebenfalls als herbizide Targets geeignet.

SEQ ID NO: 1 kodiert für ein Protein, das zu einer m6A-Methyl transferase Ähnlichkeiten aufweist, deren Proteinsequenz in SEQ ID NO: 2 wiedergegeben ist. SEQ ID NO: 3 kodiert für sog. "DNA repair protein RAD 54 like Protein", dessen Proteinsequenz SEQ ID NO: 4 zu entnehmen ist. SEQ ID NO: 5 kodiert für ein Thioredoxin kodieren, die Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt. SEQ ID NO: 7 kodiert für ein unbekanntes Protein, dessen Sequenz in SEQ ID NO: 2 wiedergegeben ist. SEQ ID NO: 9 kodiert für eine Fructokinase, deren Proteinsequenz SEQ ID NO: 10 zu entnehmen ist. SEQ ID NO: 11 codiert für ein Protein, das schwache Homolo gien zu verschiedenen Zinkfinger-Proteinen aufweist. Die Protein sequenz ist SEQ ID NO: 12 zu entnehmen. Von SEQ ID NO: 13 wird ein Protein codiert, das Ähnlichkeiten mit LYTB-Proteinen hat. SEQ ID NO: 14 gibt die Proteinsequenz wieder. Für ein Protein, mit der in SEQ ID NO: 16 gezeigten Sequenz, codiert die Sequenz SEQ ID NO: 15. Dieses durch SEQ ID NO: 15 codierte hypothetische Protein enthält eine sog. Crepropin-Familien-Signatur und hat schwache Homologien zu myc-Protoonkogenen. SEQ ID NO: 17 codiert für ein Protein, das eine gewisse Homologie zu einem Leucin-rei chen Protein aus Mensch hat. SEQ ID NO: 18 ist die Proteinsequenz zu entnehmen.

Die oben genannten Nukleinsäuresequenz(en) oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer Sequenzen wie z. B. ge nomische, cDNA oder sonstige Sequenzen, die als Herbizidtarget geeigenet sind, über Homologiescreening verwendet werden.

Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen eukaryontischen Organismen wie Pflanzen wie speziell Algen, Moosen, Dinoflagellaten oder Pilze isolieren.

Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 genannten Sequenzen beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, vorteilhaft mindestens 70% Homologie, bevorzugt mindestens 80% Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85% Homologie, ganz besonders bevorzugt 90% Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE bzw. BACK TRANSLATE (= Bestandteil des Programmpaketes UWGCG, Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Deverux et al., Nucleic. Acid Res., 12, 1984: 387-395) verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleitete Aminosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 zu entnehmen. Unter Homologie ist Identität zu verstehen, das heißt die Aminosäuresequenzen sind zu mindestens 60% identisch. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auf Nukleinsäureebene mindestens 55% Homolog, bevorzugt mindestens 65%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt mindesten 80%.

Weiterhin umfasst der Begriffe Derivate auch Teilbereiche der Sequenzen oder deren homologen Sequenzen von mindestens 50 Aminosäuren, vorteilhaft von mindestens 40 Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt von mindestens 20 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 10 Aminosäuren, die es ermöglichen, selektiv inter agierende Substanzen zu identifizieren. Entsprechende Verfahren sind z. B. wie oben beschrieben SELDI, FCS oder Biocore und sind dem Fachmann bekannt.

Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise Mikroorganismen wie Hefen, Pilzen, Ciliaten, Pflanzen wie Algen, Moosen oder sonstigen Pflanzen isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligo nukleotide beispielsweise der konservierten oder sonstigen Be reiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nuklein säuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligo nukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridi sierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein säure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Puffer lösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formanid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs bedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit ein er Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hartes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Uni versity Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Bio logy: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID No: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Ein zelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu ver stehen.

Außerdem sind unter Homologen der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 Derivate wie beispielsweise Varianten aus anderen Organismen bei spielsweise anderen Pflanzen zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktio nalität bzw. die biologische Aktivität der Variantenbeein trächtigt wird.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 und deren Derivate sind deshalb vorteilhaft dafür geeignet um weitere essentielle, neue Gene aus anderen Organismen bevorzugt Pflanzen zu isolieren.

Die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17, deren durch sie kodierte Genprodukte im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten werden, können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA- Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen Expression der heterologen Gene. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit be stimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Ein Beispiel für Corynebacterium glutamicum ist gegeben in: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Die Durchführung solcher Experimente sind mit Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.

Funktionell äquivalente Sequenzen, die für die im erfindungs gemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren kodieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenzen, welche trotz abweichen der Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, das heißt die biologische Aktivität der Proteine besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Codon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise die Bindung an einen Rezoptor oder die enzymatische Aktivität vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispiels weise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling kon struierter Proteine oder durch in vitro-Selektion ermittelt wer den. Mögliche Techniken zur in vitro-Evolution von DNA zur Ver änderung bzw. Verbesserung der DNA-Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P. A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733(1997) oder bei Moore, J. C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347(1997). Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computer auswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind vorteilhaft Aminosäure sequenzen zu verstehen, die eine in den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitu tion, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die biolo gische Aktivität des in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird. Unter nicht wesent lich reduziert sind alle Proteine zu verstehen, die noch min destens 10%, bevorzugt 20%, besonders bevorzugt 30% der bio logischen Aktivität des Ausgangsproteins aufweisen. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydro phobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Arginin reste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihen folge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.

Unter Derivaten sind auch funktionelle Äquivalente zu verstehen, die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der verwendeten Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 beinhalten, wel che weiterhin die gewünschte Funktion, das heißt deren biologi sche Aktivität nicht wesentlich reduziert ist, zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vor liegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der genannten Nukleotidsequenzen erhält. Ziel einer solchen Modi fikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.

Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt (= nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist (= Enzymaktivität stärker als die Aktivität des Ausgangsenzym, das heißt Aktivität ist höher als 100%, bevorzugt höher als 150%, besonders bevorzugt höher als 180%).

Die Nukleinsäuresequenz kann dabei vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt (= Expressionskassette oder Nukleinsäurefragment) geeignete codierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für ein Protein mit den oben beschriebenen Sequenzen kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion des Proteins und damit seiner biologischen Funktion verleihen. Diese Sequenzen können homologen oder hetero logen Ursprungs sein.

Daher ist ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ein Nuklein säurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist. Die vorhergenannten Begriffe die oben genannte Bedeutung haben.

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 genannten Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genex pression funktionell verknüpft wurden und welche die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regu latorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulations sequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das erfindungsgemäße Nuklein säurekonstrukt kann auch vorteilhaft nur aus der natürlichen gentechnologisch veränderten Regulationsregion am 5'- und/oder 3'-Ende bestehen. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher auf gebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulations signale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulations sequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nuklein säuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Ver stärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bei spielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform kann die Expression jedoch auch gezielt reduziert oder blockiert werden.

Als Promotoren in der Expressionskassette sind grundsätzlich alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organismen vorteilhaft in Pflanzen oder Pilzen steuern können. Vorzugsweise verwendet man insbesondere ein pflanzliche Promoto ren oder Promotoren, die aus einem Pflanzenvirus entstammen. Vor teilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteil hafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilz promotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression der Nukleinsäure sequenzen im erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt in den Organismen vorteilhaft in den Pflanzen zu einem bestimmten Zeit punkt gesteuert werden kann. Derartige vorteilhafte Pflanzen promotoren sind beispielsweise deer PRP1-Promotor [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366], ein durch Benzensulfonamid induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Salizylsäure- induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Abscisinsäure induzierbarer (EP 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclo hexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor. Weitere Pflanzen promotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stock haus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien- spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft ver wandt werden. Vorteilhaft sind insbesondere solche pflanzliche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen/- organen sicherstellen, in denen die Fettsäurebiosynthese bzw. dessen Vorstufen stattfindet wie beispielsweise im Endosperm oder im sich entwickelnden Embryo. Insbesondere zu nennen sind vorteilhafte Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten wie beispielsweise der USP-Promotor oder Derivate davon, der LEB4-Promotor, der Phaseolin-Promotor oder der Napin- Promotor. Der besonders vorteilhafte USP-Promotor oder dessen Derivate vermitteln in der Samenentwicklung eine sehr früh Gen expression (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67). Weitere vorteilhafte samenspezifische Promotoren, die für monokotyle und dikotyle Pflanzen verwendet werden können, sind die für Dikotyle geeignete Promotoren wie der Napingen- Promotor aus Raps (US 5,608,152), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Leguminosen B4-Promotor (LeB4, Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239) oder für Monokotyle geeignete Promotoren wie die Promotoren die Promotoren des lpt2- oder lpt1-Gens aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die Promotoren des Gersten Hordein-Gens, des Reis Glutelin-Gens, des Reis Oryzin-Gens, des Reis Prolamin-Gens, des Weizen Gliadin- Gens, des Weizen Glutelin-Gens, des Mais Zein-Gens, des Hafer Glutelin-Gens, des Sorghum Kasirin-Gens oder des Roggen Secalin- Gens, die in WO 99/16890 beschrieben werden.

Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen vorteilhaft die biologische Aktivität der durch die Nukleinsäure sequenzen kodierten Proteine natürlicherweise stattfindet. Ins besondere zu nennen sind Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor des Napin- Gens aus Raps (US 5,608,152), des USP-Promotor aus Vicia faba (USP = unbekanntes Samenprotein, Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), des Oleosin-Gens aus Arabidopsis (WO 98/45461), des Phaseolin-Promotors (US 5,504,200) oder der Promotor des Legumin B4-Gens (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9). Weiterhin sind zu nennen Promotoren, wie der des lpt2 oder lpt1-Gens aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), die in monokotylen Pflanzen samenspezifische Expression vermitteln.

In der Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäure konstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die im Verfahren verwendeten Nukleinsäure sequenzen liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um Biosynthesegene des Stoffwechsels wie der Fettsäure-, der Aminosäure- oder der Vitaminbiosynthese oder Regulationsgene um nur einige zu nennen.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungs gemäße Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie unten beschrieben, verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker ange setzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Poly linker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptions richtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteine kodiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche können vorteilhaft gegeneinander aus getauscht werden.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktions schnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, -primerrepair-, Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, -chewing-back- oder Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplemen täre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u. a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natür licherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Poly adenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des T1- Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder entsprechende funktionelle Äquivalente.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Nukleinsäure seguenz sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Rlonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäurese quenzen beinhalten alle Sequenzmerkmale, die notwendig sind, um eine für den Ort der biologischen Wirkung bzw. Aktivität korrekte Lokalisation zu erreichen. Daher sind keine weiteren Targeting sequenzen per se notwendig. Allerdings kann eine solche Lokali sation wünschenswert und vorteilhaft sein und daher künstlich verändert oder verstärkt werden, sodaß auch solche Fusions konstrukte eine bevorzugte vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sind.

Vorteilhaft sind dafür beispielsweise Sequenzen, die ein Targe ting in Plastiden gewährleisten. Unter bestimmten Umständen kann auch ein Targeting in andere Kompartimente (referiert: Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423) z. B. in in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER), Peroxisomen, Lipidkörper oder durch ein Fehlen entsprechen der operativer Sequenzen ein Verbleib im Kompartiment des Ent stehens, dem Zytosol, wünschenswert sein.

Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäure sequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenz assay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Bei spielhaft seien als Reportergene Antibiotika oder Herbizid resistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Bio lumineszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferase gen, das β-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglu cose-6-phosphat-Phosphatasegen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycin phosphotransferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identi fizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressions kassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Poly adenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteinen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung ver steht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation in Plastiden. Aber auch Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (= ER), im Zellkern, in Ölkörper chen oder anderen Kompartimenten sind bei Bedarf einsetzbar sowie Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor beispielsweise den 35S-Promotor, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Als ER-Retentionssi gnal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparagin säure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.

Die Expressionskassette wird zur Expression in einem prokaryon tischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafter weise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR-Serie wie z. B. pBR322, pUC-Serie wie pUC18 oder pUC19, M113mp-Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos, M. A. et al., [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] und von von den Hondel, C. A. M. J. J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi] sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte Hefepromo toren sind beispielsweise 2µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. and Will mitzer, L., 1988). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 be schrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.

Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fach mann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäure konstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.

Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit oder ohne einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.

Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der ver wendeten Nukleinsäuresequenzen und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts.

Beispielhaft kann das Nukleinsäurekonstrukt in den Tabak-Trans formationsvektor pBinAR eingebaut werden und unter der Kontrolle des 35S-Promotor oder des USP-Promotor stehen.

Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor) auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z. B. durch Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.

Weitere vorteilhafte Vektoren enthalten in Pflanzen oder Pflanzenkulturen nutzbare Resistenzen wie die Phosphinotricin- (= bar-Resistenz), die Methioninsulfoximin-, die Sulfonylharn stoff- (= ilv-Resistenz, ind S. cerevisiae ilv2), die Phenoxy phenoxyherbizid- (= ACCase-Resistenz), die Glyphosate- oder Clearfieldresistenz (AHAS-Resistenz) bzw. die Gene, die für diese Resistenzen codieren. Diese Resistenzen sind in ganzen Pflanzen zur Selektion von transgenen Pflanzen nutzbar. Nur Pflanzen, die über eine Transformation, diese Resistenzen erhalten haben, können in Gegenwart der selektierenden Substanz wachsen. In Zell kulturen auf Agarplatten können nach Transformation in planta - beispielsweise Infiltration der Samenvorläuferzellen - auch bei spielsweise Kanamycin oder Hygromycin als selektierendes Agenz verwendet werden. Darüberhinaus können vorteilhafe Vektoren Sequenzen für die Integration in das Genom der Organismen bevor zugt der Pflanzen enthalten. Beispiele für derartige Sequenzen sind die sog. T-DNA-Borders. Außerdem können vorteilhafte Vek toren noch Promotoren und Terminatoren, wie beispielsweise die oben beschriebenen, enthalten. Auch sogenannte PolyA-Sequenzen können im Vektor enthalten sein. Vorteilhafte Vektoren sind beispielsweise Fig. 1, 2 und 3 zu entnehmen. SEQ ID NO: 25 gibt die vorteilhafte Sequenz des Vektors pMTX 1a300 wieder. Dieser enthält eine Kanamycin-Resistenz (Nukleotid 4922-5713), eine Phosphinotricin-Resistenz (Nukleotid 6722-7288), das LacZalpha- Fragment (Nukleotid 7630-7864), einen Teil von pVS1sta (Nukleotid 945-1945), einen Teil von pBR322bom (Nukleotid 3948-4208), eine T-Horder-Sequenz (links, Nukleotid 6138-6163), eine T-Border- Sequenz (rechts, Nukleotid 7924-7949), ein PolyA-Teil (Nukleotid 7292-7503), den mas2'1'-Promotor (Nukleotid 6241-6718) und zwei Replikations-Origins pVS1rep (Nukleotid 6241-6718) sowie pBR322ori (Nukleotid 43-4628).

In Prokaryoten verwendete Expressionsvektoren nutzen häufig induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteinen bzw. Fusions oligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C- terminal oder anderen nutzbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen in der Regel dazu: i.) die Expressionsrate der RNA zu erhöhen ii.) die erzielbare Protein sytheserate zu erhöhen, iii.) die Löslichkeit des Proteins zu erhöhen, iv.) oder die Reinigung durch einen für die Affinitäts chromatographie nutzbare Bindesequenz zu vereinfachen. Häufig werden auch proteolytische Spaltstellen über Fusionsproteine eingeführt, was die Abspaltung eines Teils des Fusionsproteins auch der Reinigung ermöglicht. Solche Erkennungssequenzen für Proteasen erkennen sind z. B. Faktor Xa, Thrombin und Entero kinase.

Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX [Pharmacia Biotech Inc. Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A.

Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315] und pET Vektoren [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande].

Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYep- Sec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES-Derivate (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamen tösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressions vektoren genutzt werden z. B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies sind z. B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).

Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzen expressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren vi ralen Ursprungs wie z. B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteil hafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.

Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispiels weise in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.

Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Bio logy, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer vorteilhaft erfolgt der Gentransfer in der vorliegenden Erfindung mit bei spielsweise dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV 3101 pMP90. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, En gineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vor zugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobak terien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabak pflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blät ter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und an schließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transfor mation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispiels weise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Im folgenden ist eine vorteilhafte Ausführungsform wiedergegeben. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, wird die einzuführende Nukleinsäure bzw. DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien trans formiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig trans formierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzen zellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzel len ist intensiv untersucht und ausreichend in EPA-0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzen zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Anti biotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen ent halten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vergl. z. B. Will mitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi- Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel- Cambridge).

Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agro bacterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al. Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al. Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al. Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al. Plant Cell Reports 11, (1992) 76-80; May et al. Bio technology 13 (1995) 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992) 550-555; Ritchie et al. Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen An satzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al. Biotechnology 11 (1992), 667-674; Ritala et al. Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spencer et al. Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631) die Protoplastentransformation, die Elektro poration von partiell permeabilisierten Zellen; die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128; EP 0513849 A1; EP 0465875 A1; EP 0292435 A1; Fromm et al. Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al. Biotechnology 11(1993) 194-200; Moroc et al. Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).

Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al. s.o.; Weizen (Nehra et al. Plant J. 5 (1994) 285-297).

Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baum wolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeil wurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und an schließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.

Unter Pflanzen im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke zu verstehen.

Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäurenzu exprimieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Bei spielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calen dula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Sac charomyces, Cyanobakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Beispielsweise seien Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen syntheti sieren wie Soja, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume genannt. Prinzi piell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.

Bevorzugt sind transgene Pflanzen, die ein erfindungsgemäßes funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt oder einen erfindungsgemäßen funktionellen oder nicht funktionellen Vektor enthalten. Unter funktionell ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, daß die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder im Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor exprimiert werden und ein biologisch aktives Genprodukt hergestellt wird. Unter nicht funktionell ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, daß die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder im Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor nicht transcribiert, nicht exprimiert werden und/oder ein biologisch inaktives Genprodukt hergestellt wird. In diesem Sinne handelt es sich bei den so genannten Antisense-RNAs auch um nicht funktionelle Nukleinsäuren bzw. bei Insertion in das Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor um ein nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt oder nicht funktionellen Vektor. Sowohl das erfindungsgemäße Nukleinsäure konstrukt als auch der erfindungsgemäße Vektor kann zur Her stellung von transgenen Organismen bevorzugt Pflanzen vorteilhaft verwendet werden.

Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, daß die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nuklein säuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Tansgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Gleiches gilt für das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor.

Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Verwendbare Expressionsstämme z. B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch die Verwendung der unter den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargelegten Nukleotidsequenzen zur Erstellung von genetisch veränderten Pflanzen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie veränderte Proteine, der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 kodierten Proteine enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind dass sie eine sehr viele geringere Interaktion mit dem Herbizid aufweisen bzw. in ihrer Aktivität nicht durch das Herbizid gestört werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17, deren aufgrund des degenerierten genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen sowie deren Derivate wurden aus einer Populationen transgener Pflanzen identifiziert, die zum einen dadurch gekennzeichnet war, daß sie mittels des Agrobacterium transformiert worden sind und im Rahmen dieses Prozesses neue DNA im Chromosomen an zufälliger Stelle integriert worden war. Durch Rückkreuzungen wurden schließlich Pflanzen isoliert, die die identifizierten Nukleinsäuren auf beiden homologen Chromosomen enthalten. Darüberhinaus sind diese Pflanzen dadurch gekenn zeichnet, daß sie im Verlauf des Screenings als für lethale Mutationen segregierende Linien identifiziert worden sind. Diese Pflanzen weisen als Ergebnis der Integration der neuen DNA starke Behinderungen im Wachstum und oder Entwicklung auf. Es ist davon auszugehen, daß diese Wachstums- und Entwicklungsbehinderungen darauf zurückzuführen sind, daß die neu inserierte DNA in für Wachstum und Entwicklung wichtige Gene integriert hat, wodurch deren biologische Funktion eingeschränkt oder blockiert wird. Dieses bedeutet, daß diese Gene sowie deren aufgrund des degene rierten genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen sowie deren De rivate für Proteine kodieren, welche in analoger Weise wie für die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 beschrieben, geeignete Zielproteine für neu zu ent wickelnde Herbizide darstellen.

Zur Erzeugung derartiger veränderter Proteine werden in einer vorteilhaften Ausführungsform die genannten Nukleinsäuren über exprimiert und folgende Prozessschritte werden vorteilhaft durch laufen:

a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 oder von ei ner Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten ge 48602 00070 552 001000280000000200012000285914849100040 0002010107843 00004 48483netischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten läßt, oder von Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 60% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, kodierten Proteine in einem heterologen System beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Bakterium der Gattung Escherichia wie E. coli XL1-Red oder in einem Zellfreien system
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion des veränderten Proteins mit dem Herbizid,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides.

Vorteilhaft erfolgt die Überführung des so erhaltenen ver änderten Proteins bzw. der veränderten Nukleinsäure der unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 aufgeführten Sequenzen sowie der weiteren oben beschriebenen Sequenzen in einen Organismus vorteilhaft in eine Pflanze bevorzugt pflanzliche Zellen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung veränderter Genprodukte, die von den Nukleinsäure sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, 5EQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß es fol gende Prozessschritte umfaßt:

a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 kodierten Proteine in einem heterologen System oder in einem Zellfrei ensystem
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides,
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren nach ausgewählten Sequenzen werden vorteilhaft in einen Organismus eingebracht werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein nach diesem Verfahren hergestellter Organismus bevorzugt ist der Organismus eine Pflanze.

Anschließend erfolgt die Regeneration ganzer Pflanzen und Überprüfung der Resistenz gegenüber dem Herbizid in intakten Pflanzen.

Veränderte Proteine und/oder Nukleinsäuren, die in Pflanzen Resistenz gegen Herbizide vermitteln können, können aus den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 auch über die sogenannte "site directed mutagene sis" hergestellt werden, durch diese Mutagenese kann beispiels weise die Stabilität und/oder enzymatische Aktivität von Enzymen oder die Eigenschaften wie Bindung von niedermolekularen Verbin dungen mit kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz be sonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, von Proteinen oder Anti sense-RNA sehr gezielt verbessern bzw. verändert werden.

Beispielsweise wurde von Zhu et al. (Nature Biotech., Vol. 18, May 2000: 555-558) eine "site directed mutagenisis"-Methode in Pflanzen beschrieben, die vorteilhaft verwendet werden kann.

Weiterhin können Veränderungen über die von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-78) beschriebenen PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese erzielt werden oder durch die von Rellos et al. (Protein Expr. Purif., 5, 1994: 270-277) weiter verbessert Methode.

Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung dieser veränderten Proteie und/oder von Nukleinsäuren ist eine von Stemmer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschriebene "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution oder die von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) beschriebene Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode.

Ein weiterer Weg zur Mutagenese von Proteinen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (Vol. 57, 1996: 375-385) beschrieben. In EP-A-0 909 821 wird eine Methode zur Veränderung von Proteinen unter Verwendung des Mikroorganismus E. coli XL-1 Red beschrieben. Dieser Mikroorganismus erzeugt bei der Replikation Mutantionen in den eingeführten Nukleinsäuren und führt so zu einer Veränderung der genetischen Information. Über Isolierung der veränderten Nukleinsäuren bzw. der veränderten Proteine und Testung auf Resistenz lassen sich leicht vorteil hafte Nukleinsäuren und die durch sie kodierten Proteine identifizieren. Diese können dann nach Einbringen in Pflanzen dort die Resistenz ausprägen und so zur Resistenz gegen die Herbizide führen.

Weitere Methoden der Mutagenese und Selektion sind beispielsweie Methoden wie die in vivo Mutagenese von Samen oder Pollen und Se lektion resistenter Allele in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Inhibitoren, gefolgt von genetischer und molekularer Identifizie rung des veränderten, resistenten Allels. Weiterhin die Mutage nese und Selektion von Resistenzen in der Zellkultur durch Ver mehrung der Kultur in Anwesenheit von sukzessiv steigenden Kon zentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Dabei kann dieEr höhung der spontanten Mutationsrate durch chemische/physikalische mutagene Behandlung ausgenutzt werden. Wie vorgehend beschrieben lassen sich auch mit Mikroorgansimen, die eine endogene oder rekombinante Aktivität der durch die im erfindungsgemäßen Verfah ren verwendeten Nukleinsäuren codierten Proteine haben, und die gegenüber den erfindungsgemäß identifizierten Inhibitoren sensi tiv sind, veränderte Gene isolieren. Die Anzucht der Mikroorga nismen auf Medien mit steigenden Konzentration von erfindungsgemä ßen Inhibitoren erlaubt die Selektion und Evolution von resisten ten Varianten der erfindungsgemäßen Targets. Die Frequenz der Mutationen kann wiederum durch mutagenen Behandlungen erhöht wer den.

Daneben stehen Verfahren zur gezielten Veränderungen von Nuklein säuren zur Verfügung (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, 8768-8773 und Beethern et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 96, 8774-8778).

Diese Methoden ermöglichen es, in den Proteinen solche Ami nosäuren, die für die Bindung von Inhibitoren von Bedeutung sind, durch funktionell äquivalente Aminosäuren zu ersehen, die jedoch die Hindung des Inhibitors verhindern.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist deshalb ein Verfahren zur Erstellung von Nukleotidsequenzen welche für Genprodukte kodieren, die eine veränderte biologische Aktivität aufweisen, wobei die biologische Aktivität dahingegen verändert wurde, daß eine erhöhte Aktivität vorliegt. Unter erhöhter Aktivität ist eine gegenüber dem Ausgangsorganismus bzw. gegenüber dem Aus gangsgenprodukt um mindestens 10%, bevorzugt um mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50%, ganze besonders bevorzugt um mindestens 100% höhere Aktivität zu verstehen. Weiterhin kann die biologische Aktivität dahingegen verändert worden sein, daß die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel nicht mehr oder nicht mehr richtig an die Nukleinsäuresequenzen und/oder die durch sie kodierten Genprodukte binden. Unter nicht mehr oder nicht mehr richtig ist im Sinne der Erfindung zu ver stehen, daß die Substanzen um mindestens 30%, bevorzugt min destens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70%, ganz be sonders bevorzugt um mindestens 80% oder gar nicht mehr an die veränderten Nukleinsäuren und/oder Genprodukte im Vergleich zum Ausgangsgenprodukt oder den Ausgangsnukleinsäuren binden.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine nach dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren genetisch ver änderte transgene Pflanze.

Genetisch veränderten transgene Pflanzen, die gegen die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen und/oder Mittel enthaltend diese Substanzen resistent sind, können auch durch Überexpression der in den erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Nukleinsäuren SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 erzeugt werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Erzeugung trans gener Pflanzen, die gegen Substanzen, die nach einem erfindungs gemäßen Verfahren gefunden wurden, resistent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen Nukleinsäuren mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 überexprimiert werden. Ein ähnliches Verfahren wird beispielhaft in Lermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75- 83 beschrieben.

Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung resistenter Pflanzen ermöglichen die Entwicklung neuer Herbizide, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung aufweisen (sog. Totalherbizide), in Kombination mit der Ent wicklung von gegenüber dem Totalherbizid resistenten Nutz pflanzen. Gegenüber Totalherbiziden resistente Nutzpflanzen sind bereits verschiedentlich beschrieben worden. Dabei können mehrere Prinzipien zur Erzielung einer Resistenz unterschieden werden:

a) Resistenzerzeugung in einer Pflanze über Mutationsverfahren oder gentechnische Verfahren, indem das als Zielort für das Herbizid dienende Protein deutlich überproduziert wird und indem auf Grund des großen Überschusses des als Zielort für das Herbizid dienende Protein, die von diesem Protein in der Zelle ausgeübte Funktion auch nach Applikation des Herbizides beibehalten wird.
b) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß eine modifizierte Version des als Zielort des Herbizid fungierenden Proteins eingeführt wird und daß das neu eingeführte modifizierte Protein vom Herbizid nicht in seiner Funktion beeinträchtigt wird.
c) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß ein neues Protein/ eine neue RNA eingeführt wird welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die für die herbizide Wirkung der niedermolekularen Substanz verantwortliche chemische Struktur des Proteins oder der Nukleinsäure wie der RNA oder der DNA so verändert wird, daß durch die veränderte Struktur keine herbizide Wirkung mehr entfaltet werden kann, daß heißt die Interaktion des Herbizids mit dem Zielort nicht mehr erfolgen kann.
d) das die Funktion des Targets durch ein neues in die Pflanze eingebrachtes Gen ersetzt wird, und so ein sogenannter "al ternativer Pathway" geschaffen wird.
e) Das die Funktion des Targets durch ein anderes in der Pflanze vorhandenes Gen bzw. dessen Genprodukt übernommen wird.

Die vorliegende Erfindung umfaßt daher weiterhin die Verwendung von Pflanzen, die durch die T-DNA Insertion getroffene Gene mit den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 zur Entwicklung von neuen Herbiziden. Dem Fachmann sind alternative Verfahren zur Identifizierung von den homologen Nukleinsäuren beispiels weise in anderen Pflanzen mit ähnlichen Sequenzenwie beispiels weise unter Verwendung von Transposons, bekannt. Gegenstand die ser Erfindung ist daher auch die Verwendung von alternativen Insertionsmutageneseverfahren zur Insertion von fremder Nuklein säurein die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17, in von diesen Sequenzen aufgrund des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen und/oder deren Derivate in anderen Pflanzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb wie oben beschrieben Substanzen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanz ein Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, einem Ki-Wert kleiner 1 mM und weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring hat bzw. wobei es sich bei der Substanz um eine proteinogene Sub stanz oder um eine Antisense-RNA handelt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind Substanzen, die nach den erfindungsgemäßen oben beschriebenen Verfahren identifiziert wurden und wobei es sich bei den Substanzen um einen Antikörper gegen das durch die Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 kodierte Protein handelt.

Diese Substanzen zeichnen sich vorteilhaft durch ihre herbizide Wirkung, die mit den oben beschriebenen Verfahren identifizierbar sind.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind Mittel, enthaltend eine herbizid wirksame Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren oder eines Anta gonisten identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.

Eine weitere Ausführungsform sind Mittel, enthaltend eine das Wachstum regulierende Menge mindestens einer Substanz identi fiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren oder eines Anta gonisten identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.

Diese erfindungsgemäßen Substanzen oder Mittel mit ihrer her biziden Wirkung können als Defoliants, Desiccants, Kraut abtötungsmittel und insbesondere als Unkrautvernichtungsmittel verwendet werden. Unter Unkraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind. Ob die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Ver fahren gefundenen Substanzen bzw. Wirkstoffe als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt unter anderem von der ange wandten Menge, ihrer Selektivität und weiteren Faktoren ab. Die Substanzen können beispielsweise gegen folgende Unkräuter verwendet werden:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen:
Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen:
Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyl octenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.

In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen bzw. sie enthaltende Mittel vorteilhaft noch in einer weiteren Zahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung unerwünschter Pflanzen eingesetzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napo brassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgare, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Secale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgare), Theobroma cacao, Tri folium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen können vorteilhaft auch in Kulturen verwandt werden, die durch Züchtung einschließlich gentechnischer Methoden gegen die Wirkung von Herbiziden tolerant sind.

Die erfindungsgemäßen Substanzen bzw. die sie enthaltenden herbi ziden Mittel können beispielsweise in Form von direkt versprüh baren wässrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hoch prozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen oder Dispersionen, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die An wendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken; sie sollten in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe gewährleisten.

Als inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe kommen flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z. B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z. B. Amine wie N-Methyl pyrrolidon oder Wasser in Frage.

Weitere vorteilhafte Anwendungsformen der erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel sind Wäßrige Anwendungsformen wie Emulsionskonzentrate, Suspensionen, Pasten, netzbaren Pulvern oder wasserdispergierbaren Granulaten, die beispielsweise durch Zusatz von Wasser bereitet werden können. Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder Öldispersionen können die Substanzen und/oder Mittel die sog. Substrate als solche oder in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst, mittels Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel in Wasser homogenisiert werden. Es können aber auch aus wirksamer Substanz, Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel und eventuell Lösungsmittel oder Öl bestehende Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind.

Als oberflächenaktive Stoffe kommen die Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z. B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Lauryl ether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Poly oxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglykolether, Alkyl arylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalkoholethylen oxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkyl ether oder Polyoxypropylenalkylether, Laurylalkoholpolyglykol etheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfitablaugen oder Methyl cellulose in Betracht.

Pulver-, Streu- und Stäubemittel können als feste Trägerstoffe vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermahlen der wirk samen Substanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden.

Granulate, z. B. Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der Wirkstoffe an feste Trägerstoffe her gestellt werden. Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineral erden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunst stoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreide mehl, Baumrinden-, Holz- und Nußschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe.

Die Konzentrationen der erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel in den anwendungsfertigen Zubereitungen können in weiten Bereichen variiert werden. Die Formulierungen enthalten im all gemeinen 0,001 bis 98 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 95 Gew.-%, mindestens eines Wirkstoffs. Die Wirkstoffe werden dabei in einer Reinheit von 90% bis 100%, vorzugsweise 95% bis 100% (nach NMR- Spektrum) eingesetzt.

Die Applikation der herbiziden Mittel bzw. der Substanzen kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind die Wirk stoffe für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Ausbringungstechniken angewandt werden, bei welchen die herbi ziden Mittel oder Substanzen mit Hilfe der Spritzgeräte so ge spritzt werden, daß die Blätter der empfindlichen Kulturpflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die Wirkstoffe auf die Blätter darunter wachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen (post-directed, lay-by).

Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums und zur Erzielung synergistischer Effekte können die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel mit zahlreichen Vertretern anderer herbizider oder wachstumsregulierender Wirkstoffgruppen gemischt und gemein sam ausgebracht werden. Beispielsweise kommen als Mischungs partner 1,2,4-Thiadiazole, 1,3,4-Thiadiazole, Amide, Amino phosphorsäure und deren Derivate, Aminotriazole, Anilide, (Het)-Aryloxyalkansäure und deren Derivate, Benzoesäure und deren Derivate, Benzothiadiazinone, 2-Aroyl-1,3-cyclohexandione, Hetaryl-Aryl-Ketone, Benzylisoxazolidinone, Meta-CF3-phenyl derivate, Carbamate, Chinolinsäure und deren Derivate, Chlor acetanilide, Cyclohexan-1,3-dionderivate, Diazine, Dichlor propionsäure und deren Derivate, Dihydrobenzofurane, Dihydro furan-3-one, Dinitroaniline, Dinitrophenole, Diphenylether, Dipyridyle, Halogencarbonsäuren und deren Derivate, Harnstoffe, 3-Phenyluracile, Imidazole, Imidazolinone, N-Phenyl-3,4,5,6- tetrahydrophthalimide, Oxadiazole, Oxirane, Phenole, Aryloxy- oder Heteroaryloxyphenoxypropionsäureester, Phenylessigsäure und deren Derivate, Phenylpropionsäure und deren Derivate, Pyrazole, Phenylpyrazole, Pyridazine, Pyridincarbonsäure und deren Derivate, Pyrimidylether, Sulfonamide, Sulfonylharnstoffe, Triazine, Triazinone, Triazolinone, Triazolcarboxamide, Uracile in Betracht.

Außerdem kann es von Nutzen sein, die erfindungsgemäßen Sub stanzen und/oder Mittel allein oder in Kombination mit anderen Herbiziden auch noch mit weiteren Pflanzenschutzmitteln gemischt, gemeinsam auszubringen, beispielsweise mit Mitteln zur Bekämpfung von Schädlingen oder phytopathogenen Pilzen bzw. Bakterien. Von Interesse ist ferner die Mischbarkeit mit Mineralsalzlösungen, welche zur Behebung von Ernährungs- und Spurenelementmängeln eingesetzt werden. Es können auch nichtphytotoxische Öle und Ölkonzentrate zugesetzt werden.

Die Aufwandmengen an Wirkstoff (= Substanze und/oder Mittel) betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0.001 bis 3.0, vorzugsweise 0.01 bis 1.0 kg/ha aktive Substanz.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist die Verwendung einer Substanz identifiziert nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren oder Mittel enthaltend diese Substanzen als Herbizid oder zur Wachstumsregulierung von Pflanzen.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Kit, umfassend das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt, den erfindungsgemäßen Antikörper, das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül und/oder einen Antagonisten und/oder eine herbizide Substanz identifiziert gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren sowie die unten beschriebene Zusammensetzung.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist eine Zusammen setzung, enthaltend den erfindungsgemäßen Antikörper, das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäurekonstrukt und/oder einen erfindungsgemäßen Antagonisten und/oder eine erfindungsgemäße Substanz identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefaßt werden sollten.

Beispiele

a) Molekularbiologische Methoden
Molekularbiologische Methoden wie sie hier eingesetzt wurden entsprechen dem Stand der Technik und sind an verschiedenen Stellen, wie bspw. Sambrock et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Reiter et al., Methods in Arabidopsis Research, World Sientific Press (1992), Schultz et al., Plant Molecular Bio logy Manual, Kluwer Academic Publishers (1998) und Martinez- Zapater und Salinas, Methods in Molecular Biology, Vol. 82: Arabidogsis Protocols eds., Humana Press Inc., Totowa, NJ. Diese Referenzen beschreiben die gängigen Standardmethoden für die Produktion, Identifizierung und Klonierung von durch T-DNA-Insertionen hervorgerufenen Mutanten. Zusätzlich wurde für die Identifizierung von Insertionsstellen auf eine weitere gängige Methode, wie sie u. a. von Spertini et al., Biotechniques 27: 308-314 (1999) beschrieben wurde, zurück gegriffen. Die Sequenzierungen erfolgten durch die Firma AGOWA (Berlin).
b) Material
Die verwendeten Chemikalien wurden, wenn im Text nicht gesondert angegeben, in p.A.-Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deideshofen) bezogen. Lösungen wurden unter Verwendung von reinem pyrogenfreiem Wasser, im Text als 1110 bezeichnet, aus einer Ionenaustauschanlage der Firma (TKA, Niederelbert) hergestellt. Restriktionsnukleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits und Oligonukleotide wurden bezogen von den Firmen Amersham Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Dynal (Hamburg), Gibco-BRL (Gaithersburg, MD., USA), lnvitrogen (Groningen, Niederlande), MBI Fermentas (St. Leon Rot), New England Bio labs (Schwalbach, Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Qiagen (Hilden), Roche Diagnostics (Mannheim), Stratagene (Amsterdam, Niederlande), TTB-Molbiol (Berlin). Falls nicht anders beschrieben wurden die Produkte nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.
c) Herstellung und Identifizierung von Linien, die für lethale Mutationen segregieren
Wildtypische Arabidopsis-Pflanzen des Ökotyps C24 wurden mittels eines modifizierten "in planta"Transformations protokoll transformiert (Bechthold et al., 1992; Clough and Bent, 1998) und transgene F1 Pflanzen mittels Antibiotika- oder Herbizidresistenzen (eventuell einfügen Resistenzmaker u. a. Clearfleld) selektioniert. T2-Samen dieser Linien wurden auf Sterilmedium und auf Erde ausgelegt und nach 7 Tagen Wachstum unter Standardbedingungen auf das Vorkommen von absterbenden Keimlingen visuell hin untersucht. Insbesondere wurden Veränderungen der Pigmentierung his hin zu derem völligen Fehlen sowie morphologische Anomalien beobachtet. Es wurden nur solche Linien weiter untersucht, für die in einer Paralleluntersuchung eine Segregationsverhältnis von ca. 2 : 1-3 : 1, daher die zwei bis dreifache Menge resistenter Pflanzen gegenüber sensitiven Pflanzen bestimmt wurden. Dieses Verhältnis ist indikativ für einen einzelnen Integrationsort, der die Resistenz bewirkt.

Beispiel 1 Identifizierung und Analyse der Linie P9, die für eine lethale Mutation segregiert

Die Linie P9 (siehe SEQ ID NO: 3) wurde wie oben beschrieben als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identi fiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25% der Nachkommen den Albinophänotyp, 25% der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50% der Nachkommen Resistenz gegen über der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird er wartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge homozygot für die Mutation sind somit den recessivcn Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Die Kopplung wurde weiterhin in einer Cose gregationsanalyse überprüft. Dazu wurden von 34 wildtypischen, resistenten Pflanzen der Linie P9 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nachkommenschaft ge funden werden. Dieser Umstand läßt den Schluß zu, dass die Resi stenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusam men vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit) übereinstimmen. Daraufhin wurde die Linie molekularbiologisch un tersucht, um den T-DNA-Integrationsort genau zu bestimmen. Dazu wurde aus ca. 50 mg Gewebe dieser Pflanzen genomische DNA mittels Standardprodukten und Methoden (Säulen der Firma Qiagen, Hilden, Germany, oder Phytopure-Kit der Firma Amersham Pharmacia, Frei burg, Germany) isoliert und anhand gelelektrophoretischer Auf trennung auf Integrität und Menge hin untersucht. Die Amplifika tion der zu der T-DNA benachbarten genomischen Sequenzen erfolgte mittels eines modifizierten Adaptor-PCR-Protokolls (Spertini et al., 1999). Etwa 50 bis 100 ng der DNA wurden jeweils für eine kombinierte Restriktion und Adaptorligation mit den Restriktions enzymen, BglII, MunI, Spel, PspI406I/BspI991, AflII und dem aus den annealten Oligos 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCG GCCGGGCAGGT-3' und 5'NN_(2-4)ACCTGCCCAA-3' bestehenden Adaptor', wobei 5'NN_(2-4) den zum jeweiligen Enzym passenden Überhang re präsentieren, unterworfen. Ein µl dieser mit Adaptoren versehenen genomischen DNA wurde für eine Amplifikation der zu den T-DNAs flankierend liegenden Sequenzen unter Verwendung eines adaptor spezifischen (5'GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' und eines gen spezifischen Primers (LB1: 5'TGACGCCATTTCGCCTTTTCA-3' für die "Left border" und RB 1: 5'CAACTTAATCGCCTTGCAGCACA-3' für die "Right bordet') eingesetzt. Die PCR wurde unter Standard bedingungen für 7 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 72°C und für 32 bei einer Annealingtemperatur von 65°C in 25 µl Reaktionsvolumen durchgeführt, Das erhaltene Amplifikat wurde 1 : 50 in H₂O verdünnt und ein µl dieser Verdünnung für eine Zweite Amplifikationsrunde (5 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 67°C und 28 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 60°C an sonsten Standard-PCR-Bedingungen) eingesetzt. Hierzu werden "ein gerückte" daher auf dem PCR-Produkt weiter innenliegende Primer (5'-TATAGGGCTCGAGCGGC-3' für den Adaptor, LB2: 5'CAGAAATGGATAAA TAGCCTTGCTTCC-3' für die "Left border" und RH2: 5'AGCTGGCGTAA TAGCGAAGAG-3' für die "Right border") eingesetzt, wodurch die Spezifität und Selektivität der Amplifikation erhöht wird. Von dem in 50 µl Reaktionsvolumen erhaltenen Amplifikaten wurde ein Aliquot einer gelelektrophoretischen Analyse unterzogen. Für die Linie P9 wurde für, die Enzymkombination Pspl406I/BspII9I ein 1350 bp-großes Fragment für die linke T-DNABorder und ein 750 bp- großes Fragment für die rechte Border identifiziert. Die Produkte wurden mittels der Primer RBseq und Lbseq (5'-CAATACATTACACTAG CATCTG-3') sequenziert. Beide Produkte identifizierten den iden tischen Bereich im Genom von Arabidopsis. Die erfolgreiche Iden tifizierung wurde durch eine PCR-Reaktion mit einem für die abge leitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA-spezifi schen Primer, RBl verifiziert. Der Erhalt des PCR-Produkts der vorhergesagten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenzen (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Mol. Biol. 215: 403-410) demonstrierte die Insertion der linken Border in Position 53498 und der rechten Border in Posi tion 54283 des Klons MVII1 des Chromosoms 111 (EMBL|AP000419). In diesem Bereich ist ein ORF (MVI11.13) annotiert, der für ein "DNA Repair protein RAD-54-like"-Protein kodiert. Dieser durch die In sertion unterbrochene ORF zeigt eine hohe Homologie zu dem DNA Repair Protein RHP54 aus Hefe (Muris et al., J. Cell. Sei., 1996) sowie Ähnlichkeiten zu einer Reihe weiterer DNA-bindender Pro teine.

Beispiel 2 Identifizierung und Analyse der Linie P38, die für eine lethale Mutation

Die Linie P38 wurde wie oben beschrieben als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25% der Nachkommen den Albinophänotyp, 25% der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50% der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge den Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Mit der Cosegregationsanalyse soll die Kopplung weiterhin überprüft werden. Dazu wurden von 34 wild typischen, resistenten Pflanzen der Linie P38 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nach kommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand läßt den Schluß zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahr scheinlichkeit) übereinstimmen. Die molekularbiologische Analyse wurde wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die Linie P38 wurde für das Enzym MunI ein 350 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Das Produkt wurde mittels der Primer Lbseq sequenziert und zeigte die erwartet Identität zu einem Bereich des Arabidopsis-Genoms. Die erfolgreiche Identifizierung wurde durch eine PCR-Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierende Seguenz und einem für die T-DNA spezifischen Primer, LB1, verifiziert. Der Erhalt des PCR- Produkts der vorhergesagten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenz (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Mol. Biol. 215: 403-410) demonstrierte die Insertion der T-DNA in Position 42163 des BAC-Klons F3E22 des Chromosoms 111 (EMBLNEW|AC023912). Nach der Annotation dieses Bereichs ist die Integration in einen vorhergesagten ORF (F3E22.13), der signifikante Ähnlichkeit zu verschiedenen Thio redoxinen neigt, erfolgt. Daraufhin wurden Primer für das vorher gesagte 5'- und 3'Ende synthetisiert und für eine Standard-PCR mit cDNA von Arabidopsis eingesetzt. Die mRNA wurde mittels Oligo-dT Dynabeads von Dynal aus Keimlingen isoliert, die cDNA daraus unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kits der Firma Gibco-BRL und einem Oligo-dT-Primen hergestellt. Das erhaltene PCR-Produkt wurde in einen TA-Vektor (pCRScriptII, Invitrogen) ligiert und sequenziert. Die Sequenz zeigte vollständige Über einstimmung mit der vorhergesagten Sequenz und Genstruktur für diesen ORF. Demnach dokumentieren die Erfinder hiermit erstmals die experimentelle Bestätigung für die Existenz dieses ORFs in der vorhergesagten Struktur.

Beispiel 3 Identifizierung und Analyse der Linie P44 die für eine lethale Mutation segregiert

Die Linie P44 wurde wie oben beschrieben als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25% der Nachkommen den Albinophänotyp, 25% der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50% der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge den Phäno typ zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Die Kopplung wurde weiterhin in einer Cosegregationsanalyse überprüft. Dazu wurden von 34 wildtypischen, resistenten Pflanzen der Linie P44 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nachkommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand läßt den Schluß zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahrscheinlich keit) übereinstimmen. Die molekularbiologische Analyse wurde wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die Linie P44 wurde tur das Enzym MunI ein 350 bp-großes und für das Enzym BglII ein 500 bp-großes Fragment jeweils für die linke T-DNA-Borden identifiziert. Die Produkte wurden mittels des Primers Lbseq sequenziert und definierten die identische Position im Arabi dopsis-Genoms. Die erfolgreiche Identifizierung wurde durch eine PCR-Reaktion reit einem für die abgeleitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA-spezifischen Primen, LB1, ver ifiziert. Der Erhalt des PCR-Produkts der vorhergesagten Grölte spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identi fizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Seguenz (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Mol. Biol. 215: 403-410) demonstrierte die Insertion der T-DNA in Position 66762 des TAC-Klons K15C23 (EMBLALERT|AB024024). Nach der Annotation dieses Bereichs ist die Integration in einen vorher gesagten ORF (K15C23.10) erfolgt, dessen abgeleitete Amino säuresequenz keine signifikanten Homologien zeigt. Schwache Ilomologien findet man dagegen zu VAV2 Proteine aus Maus (Accession Q60992) und Mensch (Accession: P52735). Daraufhin wurden Primer für das vorhergesagte 5'- und 3'- Ende des ORFs synthetisiert und für eine Standard-PCR mit cDNA von Arabidopsis eingesetzt. Die cDNA wurde wie in Beispiel 3 beschrieben her gestellt. Die Sequenz zeigte vollständige Übereinstimmung mit der vorhergesagten Sequenz und Genstruktur für diesen ORF. Demnach dokumentieren die Erfinder hiermit erstmals die experimentelle Bestätigung für die Existenz dieses ORFs in der vorhergesagten Struktur.

Beispiel 4 Identifizierung und Analyse der Linie P77, die für eine lethale Mutation segregiert

Die Linie P77 wurde wie oben beschrieben als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25% der Nachkommen den Albinophänotyp, 25% der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50% der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge den Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Die Kopplung wurde weiterhin in einer Cosegregationsanalyse überprüft. Dazu wurden von 34 wild typischen, resistenten Pflanzen der Linie P77 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nach kommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand läßt den Schluß zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahr scheinlichkeit) übereinstimmen. Die molekularbiologische Analyse wurde wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die Linie P77 wurde für die Enzymkombination Psp14061/Bsp119I ein 650 bp- großes und für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Produkte wurden mittels des Primers Lbseq sequenziert. Die erfolgreiche Identifizierung wurde durch eine PCR-Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA- spezifischen Primer, LBI, verifiziert. Der Erhalt des PCR- Produkts der vorhergesagten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenz (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Mol. Biol. 215: 403 410) zeigte eine absolute Übereinstimmung der Sequenz mit einem Abschnitt auf dem Chromosom III von Arabidopsis und demonstrierte die Insertion der T-DNA in Position 13436 des BAC-Klons F24B22 (EMBLATF24B22) und unterbricht ein vorhergesagtes offenes Lesesraster (F24B22.50), welches für ein Protein mit hoher Ähnlichkeit zu verschiedenen Fructokinases bspw. aus Kartoffel (Solanum tuberosum, Accession: P37829) oder aus dem Bakterium Vibrio alginolyticus (Accession: P22824) kodiert. Daraufhin wurden Primer für das vorhergesagte 5'- und 3'- Ende des ORFs synthetisiert und für eine Standard-PCR mit cDNA von Arabidopsis eingesetzt. Die cDNA wurde wie in Bei spiel 3 beschrieben hergestellt. Die Sequenz zeigte vollständige Übereinstimmung mit der vorhergesagten Sequenz und Genstruktur für diesen ORF. Demnach dokumentieren die Erfinder hiermit erst mals die experimentelle Bestätigung für die Existenz dieses ORFs in der vorhergesagten Struktur.

Beispiel 5 Identifizierung und Analyse der Linien P95, P98, P99b, P102 und P103, die für eine lethale Mutation segregieren

Analog den vorgenannten Beispielen 1 bis 4 wurden die Klone P95, P98, P99b, P102 und P103 als Linien identifiziert, die für keim lingslethale Mutationen segregieren. Die molekularbiologischen Arbeiten bzw. Analysen wurden wie unter Beispiel 1 bis 4 be schrieben durchgeführt.

Bei der Linie P95 erfolgte die Insertion der T-DNA in Position 35442 des BACT5L19 (Accession number AL049481) des Chromosoms IV von Arabidopsis. Die Insertion der T-DNA erfolgte bei der Linie P98 in Position 54861 des P1-Klons MVA3 (Accession number: AB006706) des Chromosoms V. Die Insertion der T-DNA wurde bei der Linie P99b in Position 66042 des BACs F10M10 (AL035521) auf Chro mosom IV lokalisiert. Bei Klon P102 wurde die Insertion der T-DNA auf Chromosom IV im Bereich des Contigfragments 69 in Position 46342-46355 (AL 161573) lokalisiert. Die Linie P103 wies eine In sertion der T-DNA in Position 57314 des BACs F11F8 (AC016661) des Chromosoms I auf.

Beispiel 6 Identifizierung und Analyse der Linien P91 und P99a, die für eine lethale Mutation segregieren

Analog den vorgenannten Beispielen würden die Klone P91 und P99a als Linien identifiziert, die für keimlingslethale Mutationen se gregieren. Die molekularbiologischen Analysen wurden wie unter den Beispielen 1 bis 4 beschrieben, durchgeführt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man die Tanscription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genprodukt der durch eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Sequenz, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rück übersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dar gestellten Aminosäuresequenzen ableiten läßt,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Nuklein säuresequenzen, die für Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellten Aminosäu resequenzen codieren und mindestens 60% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen,

kodierten Aminosäuresequenz, beeinflußt und solche Substanzen auswählt, die die Tanscription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genprodukt reduzieren oder blockieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High-Throughput- Screening durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die ausgewählten Substanzen auf eine Pflanze ver bringt, um die herbizide Aktivität der Substanzen zu testen und die Substanzen auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, dass das Verfahren in einem Organismus durchgeführt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, dass als Organismus Bakterien, Hefen, Pilze oder Pflanzen verwendet werden.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, dass ein Organismus verwendet wird, der eine konditionale oder natürliche Mutante der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 ist.

7. Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die Substanz ein Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, einem Ki-Wert kleiner 1 mM und weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom enthaltenden Ring hat.

8. Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, wobei es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz oder um eine Antisense-RNA handelt.

9. Substanz nach Anspruch 8, wobei es sich um einen Antikörper gegen das durch die Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 kodierte Protein handelt.

10. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Sequenz, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degene rierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 darge stellten Aminosäuresequenzen ableiten läßt,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Nuklein säuresequenzen, die für Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellten Amino säuresequenzen codieren und mindestens 60% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen,

wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

11. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 10, wobei im Nuklein säurekonstrukt zusätzliche weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten sind.

12. Vektor enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 10 oder 11.

13. Organismus enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 10 oder 11 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 12.

14. Organismus nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, einen Mikroorganismus oder ein Tier handelt.

15. Transgene Pflanze enthaltend ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 10 oder 11 oder einen funktionellen oder nicht funktionellen Vektor gemäß Anspruch 12.

16. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 10 oder 11 oder eines Vektors gemäß Anspruche 12 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.

17. Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten von Proteinen, die durch eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Sequenz, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich auf grund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rück übersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dar gestellten Aminosäuresequenzen ableiten läßt,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 dargestellten Nuklein säuresequenzen, die für Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 oder SEQ ID NO: 18 dargestellten Amino säuresequenzen codieren und mindestens 60% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen,

kodiert werden indem folgende Verfahrensschritte durchlaufen werden

a) in Kontaktbringen von Zellen, die das Protein exprimieren, oder des Proteins mit einem Kandidatenstoff;
b) Testen der biologischen Aktivität des Protein;
c) Vergleichen der biologischen Aktivität des Proteins mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidaten stoffs, wobei eine Verringerung der biologischen Aktivi tät des Proteins anzeigt, daß der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man den nach Anspruch 17 Buchstabe f) identifizierten Antagonisten auf eine Pflanze verbringt, um seine herbizide Aktivität zu testen und die Antagonisten auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.

19. Verfahren zur Bekämpfung unerwünschten Pflanzenwuchses, dadurch gekennzeichnet, daß man eine herbizid wirksame Menge einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 auf Pflanzen oder deren Lebensraum oder auf Pflanzen und deren Lebensraum ein wirken läßt.

20. Verwendung einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 als Herbizid oder zur Wachstumsregulierung von Pflanzen.

21. Verfahren zur Erzeugung veränderter Genprodukte, die von den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Prozess schritte umfaßt:

a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 kodierten Proteine in einem heterologen System oder in einem Zell freiensystem
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides,
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Anspruch 21f) ausgewählten Sequenzen in einen Organismus eingebracht werden.

23. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Sub stanzen gefunden nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 resi stent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen Nukleinsäuren mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 oder SEQ ID NO: 17 über exprimiert werden.

24. Organismus hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 23.

25. Mittel, enthaltend eine herbizid wirksame Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.

26. Mittel, enthaltend eine das Wachstum regulierende Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18 und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.

27. Kit, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach den Anspruch 10 oder 11, den Antikörper gemäß Anspruch 9, das Antisense- Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 8 oder einen Antagonisten identifiziert gemäß Anspruch 17, die Zusammensetzung nach Anspruch 28.

28. Zusammensetzung, enthaltend den Antikörper gemäß Anspruch 9, das Antisense-Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 8 oder einen Antagonisten identifiziert gemäß Anspruch 17.