WO2005047513A2 - Der glycin decarboxylase komplex als herbizides target - Google Patents

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WO2005047513A2
WO2005047513A2 PCT/EP2004/052816 EP2004052816W WO2005047513A2 WO 2005047513 A2 WO2005047513 A2 WO 2005047513A2 EP 2004052816 W EP2004052816 W EP 2004052816W WO 2005047513 A2 WO2005047513 A2 WO 2005047513A2
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nucleic acid
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gdc
subunit
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Thomas Ehrhardt
Andreas Reindl
Annette Freund
Ralf-Michael Schmidt
Uwe Sonnewald
Marc Stitt Nigel
Wolfgang Lein
Frederik BÖRNKE
Kirsten Deist
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes

Definitions

  • the glycine decarboxylase complex as a herbicidal target
  • the present invention relates to the use of the glycine decarboxylase complex, which causes growth retardations and chlorotic leaves as a target for herbicides when not present.
  • new nucleic acid sequences comprising SEQ ID NO: 1 and functional equivalents of SEQ ID NO: 1 are provided.
  • the present invention relates to the use of the glycine decarboxylase complex and its functional equivalents in a method for identifying compounds having a herbicidal or growth-regulating action, and to the use of these compounds identified via the method as herbicides or growth regulators.
  • the object of the present invention is therefore to identify new targets that are essential for the growth of plants or their Inhibition for the plant lead to reduced growth, and to provide methods which are suitable for identifying compounds with herbicidal and / or growth-regulating activity.
  • the object was achieved by using the glycine decarboxylase complex in a method for identifying herbicides.
  • affinity tag denotes a peptide or polypeptide whose coding nucleic acid sequence can be fused with the nucleic acid sequence according to the invention directly or by means of a linker using common cloning techniques.
  • the affinity tag is used for the isolation, enrichment and / or targeted purification of the recombinant target protein by means of affinity chromatography
  • the above-mentioned linker can advantageously contain a protease interface (e.g. for thrombin or factor Xa), as a result of which the affinity tag can be cleaved from the target protein if necessary.
  • affinity tags are the "His tag” e.g. by Quiagen, Hilden, "Strep-Tag", the “yc-Tag” (Invitrogen, Carlsberg), the chitin-binding domain and an intein from New England Biolabs, the maltose-binding protein (pMal) from New England Biolabs and the so-called Novagen CBD Tag.
  • the affinity tag can be attached to the 5 'or 3' end of the coding nucleic acid sequence with the sequence coding for the target protein.
  • Activity The term “activity” describes the ability of an enzyme to convert a substrate into a product. The activity can be determined in a so-called activity test via the increase in the product, the decrease in the substrate (or starting material) or the decrease in a specific cofactor or via a combination of at least two of the above-mentioned parameters depending on a defined period of time.
  • Activity of the glycine decarboxylase complex here means the ability of an enzyme to convert glycine to carbon dioxide, ammonium, water and a methylene group transferred to tetrahydrofolate with reduction of NAD + to NADH + H + .
  • the reaction can be measured, for example, on the isolated glycine decarboxylase complex in the presence of NAD + , glycine and tetrahydrofolate by photometric detection of the NADH formation at 340 nm.
  • activity of subunit P of the glycine decarboxylase complex here denotes the ability of an enzyme to react with glycine with elimination of carbon dioxide and water and thereby bind an aminomethyl group.
  • Activity of subunit L of the glycine decarboxylase complex here denotes the ability of an enzyme to oxidize a dihydroliponic prosthetic group of the H subunit of the glycine decarboxylase complex by converting NAD + to NADH and H + to lipoic acid.
  • Activity of subunit T of the glycine decarboxylase complex refers here to the ability of an enzyme to react with the aminomethyl group of the lipoic acid adduct of subunit H of the glycine decarboxylase complex and thereby transfer a methylene group to tetrahydofolate while splitting off an ammonium ion and to transfer a dihydroliponic acid prosthetic group to the the H subunit of the glycine decarboxylase complex.
  • activity of subunit H of the glycine decarboxylase complex here denotes the ability of an enzyme to covalently bind an aminomethyl group to a lipoic acid prosthetic group and to pass this on to subunit T of the glycine decarboxylase complex.
  • An expression cassette contains a nucleic acid sequence according to the invention functionally linked with at least one genetic control element, such as a promoter, and advantageously with a further control element, such as a terminator.
  • the expression cassette can be, for example, a genomic or a complementary DNA sequence or an RNA sequence and semisynthetic or fully synthetic analogues thereof. These sequences can be in linear or circular form, extra-chromosomal or integrated into the genome.
  • the corresponding nucleic acid sequences can be produced synthetically or obtained naturally or a mixture of synthetic and natural DNA components contain, and consist of different heterologous gene segments of different organisms.
  • Artificial nucleic acid sequences are also suitable here, as long as they enable expression of a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention with the activity of the glycine decarboxylase complex in a cell or an organism.
  • synthetic nucleotide sequences can be generated which have been optimized with regard to the codon usage of the organisms to be transformed.
  • nucleotide sequences mentioned above can be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleotide building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • various DNA fragments can be manipulated so that a nucleotide sequence with the correct reading direction and correct reading frame is obtained.
  • the nucleic acid fragments are connected to one another using general cloning techniques, as described, for example, in T.
  • a functional or operative linkage means the sequential arrangement of regulatory sequences or genetic control elements in such a way that each of the regulatory sequences or each of the genetic control elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
  • “Functional equivalents” here describe nucleic acid sequences which, under standard conditions, contain a nucleic acid sequence (here SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9) or parts of one
  • Nucleic acid sequence hybridize and are capable of causing the expression of at least one polypeptide with the activity of a subunit P, H, L or T of the glycine decarboxylase complex in a cell or an organism.
  • oligonucleotides For hybridization, it is advantageous to use short oligonucleotides with a length of about 10-50 bp, preferably 15-40 bp, for example of the conserved or other areas, which can be determined by comparison with other related genes in a manner known to the person skilled in the art.
  • longer fragments of the nucleic acids according to the invention with a length of 100-500 bp or the complete sequences for the hybridization can also be used.
  • the length of the fragment or the complete sequence or depending on the type of nucleic acid, i.e. DNA or RNA used for hybridization vary these standard conditions. For example, the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 65 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA: RNA hybrids the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 30 ° C.
  • These specified temperatures for the hybridization are, for example, calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of approx. 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant textbooks on genetics, such as, for example, Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, and can be made according to formulas known to the person skilled in the art, for example, depending on the length of the nucleic acids , the type of hybrid or the G + C content. The person skilled in the art can obtain further information on hybridization from the following textbooks: Ausubel et al.
  • nucleic acid sequences which are homologous or identical up to a defined percentage with a certain nucleic acid sequence (“original nucleic acid sequence) and have the same activity of the original nucleic acid sequences, furthermore in particular also natural or artificial mutations of these nucleic acid sequences.
  • the present invention also encompasses, for example, nucleotide sequences which are obtained by modification of the nucleic acid sequences mentioned above.
  • modifications can be exemplified by techniques familiar to the person skilled in the art, such as “site directed mutagenesis”, “error prone PCR”, “DNA shuffling” (Nature 370, 1994, pp. 389-391) or “staggered extension process” (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261).
  • the aim of such a modification can e.g. the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of DNA to shorten the sequence, the exchange of nucleotides for codon optimization or the addition of further sequences. Proteins that are encoded via modified nucleic acid sequences must still have the desired functions despite a different nucleic acid sequence.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. nucleic acid sequences obtained by chemical synthesis and adapted to codon use or the amino acid sequences derived therefrom.
  • Gene control sequence describes sequences which have an influence on the transcription and, if appropriate, translation of the nucleic acids according to the invention in prokaryotic or eukaryotic organisms. Examples of this are promoters, terminators or so-called “enhancer” sequences. In addition to these control sequences or instead of these sequences, the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified such that the natural
  • control sequence is selected depending on the host organism or starting organism. Genetic control sequences also include the 5 'untranslated region, introns or the non-coding 3' region of genes. Control sequences are also to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome. Genetic control sequences also include further promoters, promoter elements or minimal promoters, and sequences which influence the chromatin structure (for example matrix attachment regions (MAR's)) and which can modify the expression-controlling properties. Genetic control sequences can, for example, also result in tissue-specific expression depending on certain stress factors.
  • MAR's matrix attachment regions
  • Corresponding elements are, for example, water stress, abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131 -17135), cold and dry stress (Plant Cell 1994, (6): 251-264) and heat stress (Molecular & General Genetics, 1989, 217 (2-3): 246-53).
  • “Homology” between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is defined by the identity of the nucleic acid sequence / polypeptide sequence over the respective total length of the sequence, which can be determined by comparison using the GAP alignment (according to Needleman and Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48; 443-453 ) setting the following parameters for nucleic acids
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • Natural genetic environment means the natural chromosomal locus in the organism of origin.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the environment flanks the nucleic acid sequence at least on the 5 'or 3' side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 100 bp, particularly preferably at least 500 bp, very particularly preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • Plants in the sense of the invention are plant cells, tissues, organs or whole plants such as seeds, bulbs, flowers, pollen, fruits, seedlings, roots, leaves, stems or other parts of plants. Plants are also understood to mean propagation material such as seeds, fruits, seedlings, cuttings, tubers, cuts or rhizomes.
  • Response time means the time it takes for a test to determine the enzymatic activity to obtain significant information about an enzymatic activity and depends both on the specific activity of the protein used in the test and on the method used and the Sensitivity of the devices used. The determination of the reaction times is known to the person skilled in the art. In methods based on photometric methods for identifying compounds with a herbicidal action, the reaction times are, for example, generally between> 0 to 120 minutes.
  • Recombinant DNA describes a combination of DNA sequences that can be produced by recombinant DNA technology.
  • Recombinant DNA technology generally known techniques for fusing DNA sequences (e.g. described in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
  • Replication origins ensure the multiplication of the expression cassettes or vectors according to the invention in microorganisms and yeasts, e.g. the pBR322 ori or the P15A ori in E. coli (Sambrook et al .: "Molecular Cloning. A Laboratory
  • Reporter genes code for easily quantifiable proteins. These genes can be used to evaluate the transformation efficiency or the expression site or time via growth, fluorescence, chemo, bioluminescence or resistance assay or via photometric measurement (intrinsic color) or enzyme activity. Reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44) such as "green fluorescence protein” (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996) are very particularly preferred ; 389 (1): 44-47; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al.,
  • GFP green fluorescence protein
  • Selection markers confer resistance to antibiotics or other toxic compounds: Examples include the neomycin phosphotransferase gene, which is resistant to the aminoglycoside antibiotics neomycin (G 418), kanamycin, paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), the sul gene coding for a mutated dihydropteroate synthase (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15 (1): 127-136), the hygromycin B phosphotransferase gene (Gen Bank Accession NO: K 01193) and the shble resistance gene, which is resistant to bleomycin antibiotics such as. Zeocin gives. Further examples of selection marker genes are genes which are resistant to 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO
  • phosphinotricin etc. those which confer anti-metabolite resistance, for example the dhfr gene (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994) 142-149). Also suitable are genes such as trpB or hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sei U S A. 85 (1988) 8047-8051).
  • Mannose-phosphate isomerase WO 94/20627
  • ODC ornithine decarboxylase
  • the deaminase are also suitable from Aspergillus terreus (Tamura K et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
  • Transformation describes a process for introducing heterologous DNA into a pro- or eukaryotic cell. With a transformed cell is not just the product described the transformation process itself, but also all transgenic descendants of the transgenic organism produced by the transformation
  • Target / Target Protein a polypeptide encodes the nucleic acid sequence according to the invention, which can be an enzyme in the classical sense or e.g. a structural protein, a protein relevant for development processes, regulatory proteins such as transcription factors, kinases, phosphatases, receptors, subunits of channels, transport proteins, regulatory subunits which give an enzyme complex substrate or activity regulation. What all targets or sites of action have in common is that their functional presence is essential for survival or normal development and growth.
  • Transgene Relating to a nucleic acid sequence, an expression cassette or a vector containing a nucleic acid sequence according to the invention or an organism transformed with the above-mentioned nucleic acid sequence,
  • the expression transgenic describes all such constructions produced by genetic engineering methods in which either the nucleic acid sequence of the target protein or a genetic control sequence functionally linked to the nucleic acid sequence of the target protein or a combination of the abovementioned possibilities are not in their natural genetic environment or were modified by genetic engineering methods.
  • the modification can be achieved here, for example, by mutating one or more nucleotide residues of the corresponding nucleic acid sequence.
  • SEQ ID NO: 1 partial nucleic acid sequence of the P subunit of the Gycin decarboxylase complex from Nicotiana tabacuum
  • SEQ ID NO: 2 partial amino acid sequence of the P subunit of the Gycin decarboxylase complex from Nicotiana tabacuum
  • SEQ ID NO: 3 nucleic acid sequence of the P subunit of the Gycin decarboxylase complex from Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of the P subunit of the Gycin decarboxylase complex from Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID NO: 5 nucleic acid sequence of the L subunit of the Gycin decarboxylase complex from Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID NO: 7 nucleic acid sequence of the T subunit of the Gycin decarboxylase complex from Arabidopsis thaliana
  • SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of the T subunit of the Gycin decarboxylase complex from Arabidopsis thaliana ID NO: 9 nucleic acid sequence of the H subunit of the Gycin decarboxylase complex from Arabidopsis thaliana S
  • the degradation of glycine in the mitochondria plays a special role in plants.
  • the oxygenase side reaction of ribulose bisphosphate decarboxylase (RUBISCO) leads to the formation of 2-phoshoglycolate during photosynthesis, which must be metabolized in the photorespiratory pathway under ATP consumption in order to prevent photoinhibition.
  • the glycine formed in the peroxisomes during photorespiration is converted by the glycine decarboxylase complex.
  • the glycine decarboxylase complex is composed of four enzyme subunits, subunit P, subunit H, subunit L, and subunit T proteins.
  • the P subunit activates the glycine in the initial step by binding to a pyridoxal phosphate and decarboxylates it with C0 2 elimination.
  • the remaining aminomethyl group is transferred to the dihydrolipoic acid group of the H subunit.
  • a Ci unit is transferred to the tetrahydrofolate group of the T subunit.
  • the reduced dihydroliponic acid group thus restored is reoxidized using the L subunit with NAD reduction.
  • the Ci unit is eventually transferred from the serine hydroxymethyl transferase to glycine, thereby forming serine.
  • subunit P of the glycine decarboxylase complex was investigated by means of antisense inhibition of subunit P in potatoes. These plants had an approximately 50% reduced activity of the glycine decarboxylase complex as well as an increased glycine concentration, but a pronounced effect on the vitality of the plants could not be determined (Heineke et al 2001, Planta 212, p.880ff., Winzer et al. 2001, Annais of Applied Biology 138, pp. 9ff.). Furthermore, barley mutants with approximately 50% lower H-protein and GDC activity show neither visible growth problems nor increased glycine concentrations.
  • the toxin victorin from the fungus Cochliobolus victoriae has been described as an inhibitor of GDC activity.
  • bleaching of the leaf tissue can be observed at the infection site.
  • the H protein of the Gylcin decarboxylase complex was identified as the binding site of this approx. 900 Dalton natural product.
  • Victorin leads to the inhibition of GDC activity in vitro (Navarre and Wolpert 1995, The Plant Cell 7, p.463ff).
  • the present invention relates to the use of the glycine decarboxylase complex in a method for identifying herbicides, which consists of the subunits P, L (EC 1.8.1.4), T (EC 2.1.2.10) and H, or the subunit P, L , H or T, preferably the use of the glycine decarboxylase complex or the use of the subunit P.
  • the use of the glycine decarboxylase complex is particularly preferred, which is characterized in that a) the subunit P of the glycine decarboxylase complex is encoded by a nucleic acid sequence which: i) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or in SEQ ID NO: 3; or ii) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 on the basis of the degenerated genetic code; or iii) derives a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3, which has an identity with the SEQ ID NO: 3 of at least 59%; includes; and or
  • the subunit L of the glycine decarboxylase complex is encoded by a nucleic acid sequence which: i) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5; or ii) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or iii) derives a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, which has an identity with SEQ ID NO: 5 of at least 69%; includes; and or
  • the subunit T of the glycine decarboxylase complex is encoded by a nucleic acid sequence which: i) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7; or ii) a nucleic acid sequence which, owing to the degenerate genetic code, is converted back from the sequence shown in SEQ ID NO: 8 derived amino acid sequence can be derived; or iii) derives a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7, which has an identity with the SEQ ID NO: 7 of at least 68%; includes; and or
  • the subunit H of the glycine decarboxylase complex is encoded by a nucleic acid sequence which: i) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 9; or ii) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or iii) derives a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9, which has an identity with the SEQ ID NO: 9 of at least 64%; includes.
  • the functional equivalents according to a) iii), b) iii), c) iii) and d) iii) are characterized by the same functionality, i.e. they have the activity of subunit P of the glycine decarboxylase complex (a) iii)) or the activity of subunit L of the glycine decarboxylase complex (b) iii)) or the activity of subunit T of the glycine decarboxylase complex (c) iii) ) or the activity of subunit P of the glycine decarboxylase complex (d) iii)).
  • a subunit P of the glycine decarboxylase according to (a) iii) or of a subunit L of the glycine decarboxylase complex according to (b) iii)) or of a subunit T of the glycine decarboxylase complex according to (c) iii) ) prefers.
  • the use of a subunit P of the glycine decarboxylase complex according to (d) iii)) is particularly preferred.
  • nucleic acid sequences or “comprising” based on nucleic acid sequences means that the nucleic acid sequence according to the invention can contain additional nucleic acid sequences at the 3 'and / or at the 5' end, the length of the additional Nucleic acid sequences 500 bp at the 5 'and 500 bp 3' end of the nucleic acid sequences according to the invention, preferably not exceeding 250 bp at the 5 'and 250 bp at the 3' end, particularly preferably 100 bp at the 5 'and 100 bp at the 3' end.
  • Functional equivalents of SEQ ID NO: 3 according to a) iii) according to the invention preferably have a homology with SEQ ID No: 3 of at least 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% or 66% at least 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72% or 73% preferably at least 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% or 80% preferably at least 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92% or 93% particularly preferably at least 94%, 95%, 96%, 97% , 98% or 99%.
  • Tritordeum (Gen Bank Acc. No. AF024589), Avena sativa (Gen Bank Acc. No.
  • Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. BT000446), Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY091186),
  • Flaveria anomala Gen Bank Acc. No. Z99762
  • Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z36879)
  • Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z54239)
  • Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z25857), Flaveria trinervia (Gen Bank Acc. No. Z99767),
  • Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AY346327)
  • Functional equivalents of SEQ ID NO: 5 according to b) iii) according to the invention have a homology with SEQ ID No: 5 of at least 69%, preferably at least, 70%, 71%, 72% or 73%, preferably at least 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% or 80% preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92% or 93%, particularly preferably at least 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • Suitable functional equivalents according to b) iii) are also the plant nucleic acid sequences coding for the subunit L of the glycine decarboxylase complex
  • Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. X62995) and Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. X63464)
  • Functional equivalents of SEQ ID NO: 7 according to c) iii) according to the invention have a homology with SEQ ID No: 7 of at least 68% or 69%, preferably at least 70%, 71%, 72% or 73%, preferably at least 74%, 75 %, 76%, 77%, 78%, 79% or 80% preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90% , 91%, 92% or 93% particularly preferably at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • Suitable functional equivalents according to c) iii) are also the plant nucleic acid sequences coding for the subunit T of the glycine decarboxylase complex
  • Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK059270),
  • Flaveria anomala Gene Bank Acc.No. Z71184
  • Flaveria pringlei (Gen Bank Acc.No. Z25858) All of the above sequences are also the subject of the present invention.
  • Functional equivalents of SEQ ID NO: 9 according to d) iii) according to the invention have a homology with SEQ ID No: 9 of at least 64%, 65% or 66%, preferably at least 67%, 68%, 69%, 70%, 71% , 72% or 73% preferably at least 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% or 80% preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92% or 93%, particularly preferably at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • Suitable functional equivalents according to d) iii) are also the plant nucleic acid sequences coding for the subunit H of the glycine decarboxylase complex
  • Oryza sativa indica cultivar-group (Gen Bank Acc. No. AF022731),
  • Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK058606),
  • Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK062851),
  • Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK071621),
  • Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK104840), Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AF385740),
  • Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY089054), Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY097349),
  • Triticum aestivum (Gen Bank Acc. No. AY123417)
  • Flaveria anomala (Gen Bank Acc. No. Z37524),
  • Flaveria anomala (Gen Bank Acc. No. Z99530),
  • Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z25855), Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z25856),
  • Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z37522), Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No.
  • Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z99764)
  • Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z99765), Flaveria trinervia (Gen Bank Acc. No. Z37523),
  • Flaveria trinervia Gen Bank Acc. No. Z48797
  • Mesembryanthemum crystallinum Gene Bank Acc. No. U79768
  • Pisum sativum Gene Bank Acc. No. J05164
  • Pisum sativum Gene Bank Acc. No. X6472
  • Pisum sativum Gene Bank Acc. No. X53656
  • subunit P of the glycine decarboxylase complex is particularly preferably encoded by a nucleic acid sequence according to a) i), ii) and iii).
  • nucleic acid sequences mentioned above preferably come from a plant.
  • plant nucleic acid sequences coding for a polypeptide with the activity of subunit P of the glycine decarboxylase complex are contained in this context:
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • nucleic acid sequences coding for a polypeptide with the activity of subunit P of the glycine decarboxylase complex containing means nucleic acid sequences which contain a nucleic acid sequence according to a), b) or c) and which are on 3 'and / or on 5 'End may contain additional nucleic acid sequences, the length of the additional
  • Nucleic acid sequences 3500 bp at the 5 'and 500 bp 3' end of the invention Nucleic acid sequences, preferably not exceeding 3100 bp at the 5 'and 250 bp at the 3' end, particularly preferably 2900 bp at the 5 'and 100 bp at the 3' end.
  • nucleic acid sequences also represent suitable functional equivalents according to a) iii).
  • polypeptides encoded by the aforementioned nucleic acid sequences are also claimed.
  • the functional equivalents according to c) are characterized by the same functionality, i.e. they have the enzymatic, preferably biological activity of a glyoxysomal GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC,.
  • SEQ ID NO: 1 The functional equivalents of SEQ ID NO: 1 according to the invention have an identity with SEQ ID No: 1 of at least 89%, preferably at least 90%, 91%, 92%, 93%, preferably at least 94%, 95%, 96%, particularly preferably at least 97%, 98%, 99%.
  • nucleic acid sequence (s) according to the invention stands for a nucleic acid sequence / nucleic acid sequences coding for one or more subunits of the glycine decarboxylase complex or for
  • Nucleic acid sequences coding for the entire glycine decarboxylase complex preferably for a nucleic acid sequence / nucleic acid sequences coding for one or more subunits of the glycine decarboxylase complex or for nucleic acid sequences coding for the total glycine decarboxylase complex, wherein
  • the subunit P of the glycine decarboxylase complex is encoded by a nucleic acid sequence which: i) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or in SEQ ID NO: 3; or ii) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 on the basis of the degenerated genetic code; or iii) a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID N0: 3, which has an identity with the SEQ ID NO: 3 of at least 59%, can be derived; includes; and or
  • the subunit L of the glycine decarboxylase complex is encoded by a nucleic acid sequence which: i) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 5; or ii) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or iii) derives a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 which has an identity with SEQ ID NO: 5 of at least 69%; includes; and or
  • the subunit T of the glycine decarboxylase complex is encoded by a nucleic acid sequence which: i) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 7; or ii) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 based on the degenerate genetic code by back-translation; or iii) derives a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7, which has an identity with the SEQ ID NO: 7 of at least 68%; includes; and or
  • the subunit H of the glycine decarboxylase complex is encoded by a nucleic acid sequence which: i) a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID N0: 9; or ii) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or iii) a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9, which has an identity with SEQ ID NO: 9 of at least 64%, can be derived '; includes.
  • the subunit P of the glycine decarboxylase complex is preferably by
  • nucleic acid sequence containing a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • GDC The glycine decarboxylase complex encoded by the nucleic acid sequences according to the invention is referred to below as "GDC” for the sake of simplicity.
  • the subunits P, L, T or H encoded by a nucleic acid sequence according to the invention are referred to below as P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC.
  • the gene products of the nucleic acids according to the invention represent new targets for herbicides which make it possible to provide new herbicides for controlling unwanted plants. Furthermore, the gene products of the nucleic acids according to the invention represent new targets for growth regulators which make it possible to provide new growth regulators for regulating the growth of plants. Use as a target for herbicides is preferred. In the broadest sense, undesirable plants are understood to mean all plants that grow up in places where they are undesirable, for example:
  • SEQ ID NO: 1 or parts of the above-mentioned nucleic acid sequence can be used for the production of hybridization probes.
  • the manufacture of these probes and the conduct of the experiments are known. This can be done, for example, by the targeted production of radioactive or non-radioactive probes by means of PCR and the use of appropriately labeled oligonucleotides with subsequent hybridization experiments.
  • the technologies required for this are described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • the corresponding probes can also be modified using standard technologies (Lit. SDM or random mutagenesis) so that they can be used for other purposes, e.g. as a probe that hybridizes specifically to mRNA and the corresponding coding sequences for the purpose of analyzing the corresponding sequences in other organisms.
  • the above-mentioned probes can be used for the detection and isolation of functional equivalents of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 from other plant species as well as that of SEQ ID NO: 1 belonging full length sequence from Nicotiana tabacuum can be used due to sequence identities.
  • part or all of the sequence of the corresponding SEQ ID NO: 1 is used as a probe for screening in a genomic or cDNA bank of the corresponding plant species or in a computer search used for sequences of functional equivalents in electronic databases.
  • Preferred plant species are the undesired plants already mentioned at the beginning.
  • the invention furthermore relates to expression cassettes containing
  • nucleic acid sequence containing i. a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; or ii. a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or iii. a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 with an identity of at least 89% to SEQ ID NO: 1;
  • GDC for the expression of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC for use in in vitro test systems.
  • GDC for the expression of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC
  • GDC or P-GDC very particularly preferably P-GDC for use in in vitro test systems.
  • an expression cassette according to the invention comprises a promoter at the 5 'end of the coding sequence and a transcription termination signal at the 3' end and, if appropriate, further genetic control sequences which are functionally linked to the nucleic acid sequence according to the invention in between.
  • the expression cassettes according to the invention are also to be understood as analogs which can come about, for example, from a combination of the individual nucleic acid sequences on a polynucleotide (multiple constructs), on several polynucleotides in a cell (co-transformation) or through sequential transformation.
  • Expression cassettes are, for example, promoters such as cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, ⁇ PR - Or in the ⁇ -PL promoter, for the expression of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC, in gram-negative bacterial strains can be used.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, Ipp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, ⁇ PR - Or in the ⁇ -PL promoter, for the expression of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC, in gram-negative bacterial strains can be used.
  • Further advantageous genetic control sequences are, for example, in the amy and SP02 promoters, which can be used for the expression of P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC in gram-positive bacterial strains , as well as in the yeast or fungal promoters AUG1, GPD-1, PX6, TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PH05, AOX1, GAL10 / CYC1, CYC1, OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa or NMT or combinations of the promoters mentioned above (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11 (7): 629-40; Romanos et al.
  • Suitable genetic control sequences for expression in insect cells are the polyhedrin promoter and the p10 promoter (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio / Techn. 6, 47-55).
  • Advantageous genetic control sequences for expressing the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferred P-GDC in cell culture are in addition to polyadenylation sequences such as e.g. from Simian Virus 40 eukaryotic promoters of viral origin such as e.g. Promoters of Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus or Simian Virus 40.
  • Plant promoters CaMV / 35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940) or contained in the ubiquitin or phaseolin promoter, preferably a plant promoter or a promoter derived from a plant virus is preferably used. Promoters are particularly preferred viral
  • constitutive promoters are, for example, the promoter of nopaline synthase from Agrobacterium, the TR double promoter, the OCS (octopine synthase) promoter from Agrobacterium, the ubiquitin promoter (Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29: 637-649) , the promoters of the vacuolar ATPase subunits or the promoter of a proline-rich protein from wheat (WO 91/13991).
  • the expression cassettes can also contain a chemically inducible promoter as a genetic control sequence, by means of which the expression of the exogenous gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • a chemically inducible promoter such as the PRP1 promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), a salicylic acid-inducible (WO 95/19443), a benzenesulfonamide-inducible (EP-A -0388186), one that can be induced by tetracycline (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397404), one that can be induced by abscisic acid (EP-A 335528) or one that can be induced by ethanol or cyclohexanone (WO 93 / 21334) Promoters can also be used.
  • promoters which express tissue or organ-specific expression e.g. mediate in anthers, ovaries, flowers and flower organs, leaves, guard cells, trichomes, stems, lead tissues, roots and seeds.
  • tissue or organ-specific expression e.g. mediate in anthers, ovaries, flowers and flower organs, leaves, guard cells, trichomes, stems, lead tissues, roots and seeds.
  • those promoters which ensure leaf-specific expression are also suitable.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potato WO 97/05900
  • the SSU promoter small subunit
  • the Rubisco ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase
  • ST-LSI promoter from potato
  • Seed-specific promoters are, for example, the promoter of phaseoline (US 5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1 (9): 839-53), of 2S albumin gene (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262 : 12196-12201), leguminum (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989; 215 (2): 326-331), USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991, 225 (3): 459-67) of the Nap gene (Stalberg K, et al., L.
  • phaseoline US 5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989; 1 (9): 839-53
  • 2S albumin gene Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262 : 12196-12201
  • leguminum Shir
  • sucrose binding protein WO 00/26388
  • LeB4 promoter Bact al.
  • promoters suitable as genetic control sequences are, for example, specific promoters for tubers, storage roots or roots, such as, for example, the patatin promoter class I (B33), the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato, the promoter of the starch synthase (GBSS1) or the sporamine promoter, fruit-specific promoters, such as the fruit-specific promoter from tomato (EP-A 409625), fruit-ripening-specific promoters, such as the fruit-ripening-specific promoter from tomato (WO 94/21794), flower-specific promoters such as the phytoene synthase promoter (WO 92 / 16635) or the promoter of the P-rr gene (WO 98/22593) or specific plastid or
  • specific promoters for tubers, storage roots or roots such as, for example, the patatin promoter class I (B33), the promoter of the cathepsin D inhibitor from potato, the promoter of the starch synthase (GB
  • Chromoplast promoters such as the RNA polymerase promoter (WO 97/06250) or the promoter of the phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase from Glycine max (see also Genbank Accession No. U87999) or another node-specific promoter as in EP-A 249676 can advantageously be used become.
  • Additional functional elements b) include, by way of example, but not by way of limitation, reporter genes, origins of replication, selection markers and so-called affinity tags, fused with GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably to understand P-GDC directly or by means of a linker optionally containing a protease interface.
  • Suitable additional functional elements are sequences which ensure targeting in the apoplasts, in plastids, the vacuole, the mitochondrium, the peroxisome, the endoplasmic reticulum (ER) or, due to the lack of corresponding operative sequences, a retention in the compartment of formation, the cytosol (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
  • Vectors according to the invention also contain at least one copy of the nucleic acid sequences according to the invention and / or the expression cassettes according to the invention.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally. Chromosomal replication is preferred.
  • the nucleic acid construct according to the invention can also advantageously be introduced into the organisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the nucleic acid construct as a vector or the nucleic acid sequences used.
  • the expression cassette according to the invention and vectors derived therefrom can be used to transform bacteria, cyanobacteria (for example the genus Synechocystes, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema and Nostoc), proteobacteria such as Magnetococcus sp.
  • cyanobacteria for example the genus Synechocystes, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema and Nostoc
  • proteobacteria such as Magnetococcus sp.
  • MC1 yeast, filamentous fungi and algae and eukaryotic, non-human cells (eg insect cells) with the aim of recombinant production GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, entirely P-GDC can be used with particular preference, the production of a suitable expression cassette depending on the organism in which the gene is to be expressed.
  • nucleic acid sequence containing i. a nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; or ii. a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or iii. a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 with an identity of at least 89% to SEQ ID NO: 1;
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or ii) a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 with an identity of at least 89% to SEQ ID NO: 1;
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention can also be introduced into an organism alone.
  • nucleic acid sequences in addition to the nucleic acid sequences, further genes are to be introduced into the organism, they can all be introduced into the organism together in a single vector or each individual gene can be introduced into the organism, the different vectors being able to be introduced simultaneously or successively.
  • nucleic acid (s) according to the invention, the expression cassette or the vector can be introduced into the corresponding organisms (transformation) by all methods known to the person skilled in the art.
  • Suitable methods are the biolistic method or by protoplast transformation (see, for example, Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge), electroporation, the incubation of dry embryos in DNA containing solution, microinjection and gene transfer mediated by Agrobacterium.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and
  • the transformation by means of agrobacteria and the vectors to be used for the transformation are known to the person skilled in the art and are described in detail in the literature (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711.
  • the intermediate vectors can be homologous due to sequences Sequences in the T-DNA are integrated by homologous recombination into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria, which also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA.
  • Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobacterium tumefaciens (conjugation) by helper plasmids.
  • Binary vectors can replicate in both E.
  • coli and Agrobacteria contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are from the right and left T-DNA border region They can be transformed directly into the agrobacteria (; Holsters et al. Mol. Ge n. Genet. 163 (1978), 181-187), EP A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al. EMBO J. 4 (1985) 277-287).
  • Agrobacteria transformed with a vector according to the invention can also be used in a known manner to transform plants such as test plants such as Arabidopsis or crop plants such as cereals, maize, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, Potato, tobacco, tomato, carrot, bell pepper, rapeseed, tapioca, cassava, arrowroot, tagetes, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • test plants such as Arabidopsis or crop plants
  • crop plants such as cereals, maize, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, Potato, tobacco, tomato, carrot, bell pepper, rapeseed, tapioca,
  • the genetically modified plant cells can be regenerated using all methods known to the person skilled in the art. Appropriate methods can be found in the above-mentioned writings by S.D. Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer can be found.
  • the transgenic organisms produced by transformation with one of the above-described embodiments of an expression cassette containing a nucleic acid sequence according to the invention or a vector containing the abovementioned expression cassette, and the recombinant GDC, P-GDC, L-GDC, T obtained from the transgenic organism by expression -GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC are the subject of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of transgenic organisms containing an expression cassette according to the invention, for example for the provision of recombinant protein and / or the use of these organisms in in vivo test systems.
  • preferred organisms for recombinant expression are also eukaryotic cell lines.
  • mosses are Physcomitrella patens or other mosses described in Kryptogamen, Vol. 2, Moose, Farne, 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515).
  • bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes or Cyanobacteria for example of the genus Synechocystes, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema and Nostoc, particularly preferably Synechocystis or Anabena, are preferred.
  • yeasts are Candida, Saccharomyces, Schizosaccheromyces, Hansenula or Pichia.
  • Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995).
  • Preferred plants are selected in particular from monocotyledonous crop plants, such as, for example, cereals such as wheat, barley, millet, rye, triticale, maize, rice or oats, and sugar cane.
  • the transgenic plants according to the invention are selected in particular from dicotyledonous crop plants, such as, for example, Brassicacae such as rapeseed, cress, Arabidopsis, cabbages or canola; Leguminosae such as soy, alfalfa, pea, bean family or peanut Solanaceae such as potato, tobacco, tomato, eggplant or paprika; Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula; Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini, or flax, cotton, hemp, flax, red pepper, carrot, carrot, sugar beet or various tree, nut and wine species.
  • transgenic animals such as C. elegans are also suitable as host organisms.
  • vectors for use in yeast are pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), PJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES derivatives, pGAPZ derivatives, pPICZ derivatives and the vectors of the "Pichia Expression Kit” (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors for use in filamentous fungi are described in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., Eds., P. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • insect cell expression vectors can also be used advantageously, e.g. for expression in Sf9, Sf21 or Hi5 cells, which are infected via recombinant baculoviruses.
  • These are e.g. the vectors of the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the baculovirus expression systems "MaxBac2.0 Kit” and "Insect Select System” from Invitrogen, Calsbald or "BacPAK Baculovirus Expression System” from CLONTECH, Palo Alto, CA.
  • Insect cells are particularly suitable for overexpressing eukaryotic proteins because they carry out post-translational modifications of the proteins that are not possible in bacteria and yeasts.
  • the handling of insect cells in cell culture and their infection for the expression of proteins are known to the person skilled in the art and can be carried out in analogy to known methods (Luckow and Summers, Bio / Tech. 6, 1988, pp.47-55; Glover and Hames (eds) in DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205-244).
  • plant cells or algal cells can advantageously be used for gene expression.
  • plant expression vectors can be found in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 or in Bevan, MW (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be expressed in mammalian cells.
  • Examples of corresponding expression vectors are pCDM8 and pMT2PC mentioned in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 or Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • Promoters to be used are preferably of viral origin, e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or simian virus 40.
  • prokaryotic and eukaryotic expression systems are mentioned in chapters 16 and 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Further advantageous vectors are described in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000).
  • transgenic organisms which contain plant nucleic acid sequences coding for a polypeptide with the activity of the subunit P of the glycine decarboxylase complex:
  • nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
  • nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation;
  • transgenic organisms which contain GDC or at least one nucleic acid sequence coding for P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably P-GDC, are summarized under the term “transgenic organism according to the invention” .
  • the present invention furthermore relates to the use of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC in a method for identifying test compounds with herbicidal Effect.
  • the method according to the invention for identifying compounds having a herbicidal action preferably comprises the following steps:
  • test compound binds to the glycine decarboxylase complex or to a subunit of the glycine decarboxylase complex from i); or
  • test compound Detection of whether the test compound reduces or blocks the activity of the glycine decarboxylase complex or that of a subunit of the glycine decarboxylase complex from i); or
  • test compound reduces or blocks the transcription, translation or expression of the glycine decarboxylase complex that of a subunit of the glycine decarboxylase complex from i).
  • the term “reduced” means a reduction in the activity compared to the activity of the glycine decarboxylase complex not incubated with a test compound or a subunit of the glycine decarboxylase complex of at least 10%, advantageously at least 20%, preferably at least 50%, particularly preferably by at least 70%, and most preferably to mean at least 80%, 90% or 95%, the term “blocks" the total, i.e. 100% blocking of activity, the percentage reductions mentioned above for an inhibitor of less than 10 "4 M, Favor less than 10 -5 M, preferably less AISI 0 _6 M and most preferably less than 10 -7 M.
  • GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC are used.
  • the detection according to step (ii) of the above method can be carried out using techniques which show the interaction between protein and ligand.
  • Either the test compound or the enzyme may contain a detectable label, e.g. a fluorescent, radioisotope, chemiluminescent or enzymatic label.
  • a detectable label e.g. a fluorescent, radioisotope, chemiluminescent or enzymatic label.
  • enzymatic labels are horseradish peroxidase, alkaline phosphatase or luciferase.
  • the subsequent detection depends on the marking and is known to the person skilled in the art.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the fluorescence polarization uses the property of a resting fluorophore excited with polarized light to also emit polarized light again. However, if the fluorophore can rotate during the excited state, the polarization of the emitted fluorescent light is more or less lost. Under otherwise identical conditions (e.g. temperature, viscosity, Solvent) the rotation is a function of the molecular size, with which one can make a statement about the size of the residue bound to the fluorophore via the measurement signal (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300).
  • a method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of a test compound marked by a fluorescent molecule to the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably the GDC or P-GDC.
  • the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1.
  • Fluorescence resonance energy transfer is based on the radiation-free energy transfer between two spatially adjacent fluorescence molecules under suitable conditions. A prerequisite is the overlap of the emission spectrum of the donor molecule with the excitation spectrum of the acceptor molecule.
  • fluorescent labeling GDC, P-GDC, L- GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC and the bonded tet compound can be measured using FRET (Cytometry 34, 1998, pp. 159-179) the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described in 1.
  • a particularly suitable embodiment of the FRET technology is the "Homogeneous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), as sold by Packard BioScience.
  • GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC are then immobilized, preferably the GDC or P-GDC, on a suitable carrier and incubated with the test compound.
  • the molecules of the test compound additionally bound to the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably the GDC or P-GDC can be detected by means of the above-mentioned methodology and thus detected select the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably test compounds bound to the GDC or P-GDC. 5.
  • the measurement of surface plasmon resonance is based on the change in the refractive index on a surface when a test compound binds to a protein immobilized on said surface.
  • this method can in principle be applied to any protein (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 ( 1993) 186-187).
  • the measurement can be carried out, for example, with the aid of the automated analyzers based on surface plasmon resonance sold by Biacore (Freiburg) in a throughput of currently up to 384 samples per day.
  • a method according to the invention can be set up directly for measuring the binding of a test compound to the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably to the GDC or P-GDC.
  • the method according to the invention can also be designed in the form of the "displacement assay" described under 1.
  • the compounds identified via the above-mentioned methods 1 to 5 can be suitable as inhibitors. All of the substances identified by the abovementioned methods can then be checked for their herbicidal action in another embodiment of the method according to the invention.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention which is based on steps i) and ii), consists in selecting a test compound which has the enzymatic activity of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC reduced or blocked, the activity of the GDC, P-GDC, L- incubated with the test compound GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC with the activity of a GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC not incubated with a test compound, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC is compared.
  • a preferred embodiment of the method based on steps i) and ii) is that
  • GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC is expressed in a transgenic organism according to the invention or an organism which is naturally GDC, P-GDC , L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, most preferably P-GDC, is cultivated;
  • the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC preferably the GDC or P-GDC from step i) in cell disruption of the transgenic or non-transgenic organism, in a partially purified form or in a form purified to homogeneity is contacted with a test compound;
  • a compound is selected which reduces or blocks the activity of the P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably the GDC or P-GDC.
  • step iii. to determine the activity of the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC incubated with the test compound preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC with the activity of a GDC not incubated with a test compound
  • P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC.
  • the solution containing GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC can consist of the lysate of the original organism.
  • the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC-containing solution can consist of the lysate of the transgenic organism transformed with an expression cassette according to the invention
  • the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC can be partially or completely purified using conventional methods.
  • the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC required for in vitro methods preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC can thus either by heterologous expression from a transgenic organism according to the invention or be isolated from an organism containing GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, for example from a plant.
  • the glycine decarboxylase complex can be isolated from preparations of plant mitochondria or mitochondrial matrix extracts e.g. from Ebsenblättem (Sarojini and Oliver 1983, Plant Physiology 72, pp. 194ff.) or from spinach leaves (Douce et al. 1977, Plant Physiology 60, pp. 625ff.).
  • the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC is then incubated with a test compound.
  • the enzymatic activity of the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC with the enzymatic activity incubated with the test compound is not included a test compound incubated GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC.
  • GDC GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC
  • a significant decrease in activity is observed in comparison to the activity of the non-inhibited polypeptide according to the invention , wherein a decrease of at least 10%, advantageously at least 20%, preferably at least 30%, particularly preferably by at least 50% up to a 100% reduction (blocking) is achieved.
  • the activity of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC can be determined, for example, using an activity test in which the increase in the product, the removal of the substrate (or starting material) or the name or surname of the cofactor or via a combination of at least two of the above parameters can be determined as a function of a defined period of time.
  • the amounts of substrate to be used for the activity test can be between 0.5-100 mM and amounts of cofactor between 0.1-5 mM based on 1-100 ⁇ g / ml enzyme.
  • Suitable substrates for determining the activity of the GDC are, for example, glycine, examples of suitable cofactors NAD + , tetrahydrofolate, pyridoxal phosphate, FAD.
  • the activity of the subunit P-GDC can be determined independently of the other subunits of the GDC, L-GDC, H-GDC and T-GDC. This also applies to the L-GDC subunit.
  • An inhibitor which only inhibits the P or L-GDC can be identified, for example, by firstly determining the activity of the GDC in the presence of a test compound. If an inhibitor is successfully selected, the activity of the P-GDC (or L-GDC) can then be checked in the presence of the selected inhibitor.
  • Suitable substrates for the P-GDC are, for example, glycine, CO 2 or lipoic acid, an example of a suitable cofactor is pyridoxal phosphate
  • suitable substrates for the L-GDC are e.g. NAD +, dihydrolipoic acid, H-protein-2-dihydrolipoic acid, as a cofactor FAD.
  • the activity of the subunit H-GDC can be determined in conjunction with the activity of the subunit L-GDC.
  • H-GDC examples include lipoic acid.
  • the activity of the P-GDC, L-GDC and H-GDC can be determined together in one assay.
  • the activity of the subunit T-GDC can be determined in the overall GDC reaction together with the activity of the subunits P-GDC, L-GDC and H-GDC.
  • the identification of an inhibitor which only inhibits the T-GDC can be done, for example, by firstly determining the activity of the GDC in the presence of a test compound and secondly the activity of the P-GDC, L-GDC and H-GDC in Presence of the same test compound is determined.
  • derivatives of the abovementioned compounds which contain a detectable label such as e.g. a fluorescent, radioisotope or chemiluminescent label.
  • the determination of the activity of GDC in step iii) of the above-mentioned method can be carried out photometrically via the reduction of NAD + to NADH in the presence of glycine and tetrahydrofolate, e.g. according to Bourguignon et al (Biochemical Journal (1988) 255, p. 169ff.).
  • This assay can be performed in microtiter plates and is suitable for high throughput screening.
  • the conversion of glycine can be monitored photometrically using the coupled reduction of 2,6-dichlorophenol-indophenol.
  • a suitable method is here, for example, in Moore et al. (1980, FEBS Letters 115, pp.54ff.).
  • the joint activity of the H and L proteins of the GDC can also be photometric, as in Neuburger et al. described (1991, Biochemical Journal 278, p. 765ff.) by coupling to the reduction of 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid).
  • the activity of the P protein can be determined according to Higara and Kiguchi (Journal of Biological Chemistry 1980, 255, pp. 11664-11670).
  • L-protein activity can be detected photometrically in the presence of NAD + and free lipoic acid (as described e.g. in Moran et al., Plant Physiology 2002, 128, pp. 300-313)
  • a preferred embodiment of the method according to the invention which is based on steps i) and iii), consists of the following steps:
  • test compounds that cause a reduced growth or limited survivability of the non-transgenic organism compared to the growth of the transgenic organism.
  • Inhibitors with herbicidal activity at least 10%, preferably 20%, preferably 30%, particularly preferably 40% and very particularly preferably 50%.
  • transgenic organism means the above-mentioned transgenic organisms according to the invention.
  • a transgenic organism in which GDC or P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably P-GDC, is overexpressed, which is suitable for the above-mentioned method, can alternatively be produced in that the Overexpression of GDC or P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably P-GDC, is accomplished by manipulating the promoter sequences naturally present in the organism. Such methods are known to the person skilled in the art.
  • the transgenic organism is preferably a plant, algae, a cyanobacterium e.g. the genus Synechocystes or a proteobacterium such as Magnetococcus sp. MC1, preferably plants that can be transformed using common techniques, such as Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Nicotiana Tabacum, cyanobacteria that can be easily transformed, such as Synechocystis, in which the sequence coding for a polypeptide according to the invention was incorporated via transformation.
  • These transgenic organisms therefore have an increased tolerance to compounds which inhibit the polypeptide according to the invention.
  • “Knock-out” mutants can also be used here, in which the analog gene (s) naturally present in this organism for GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P- GDC, very particularly preferably P-GDC has been specifically switched off.
  • the above-mentioned embodiment of the method according to the invention can also be used to identify substances with a growth regulatory effect.
  • a plant is used as a transgenic organism.
  • the process for identifying substances with a growth regulatory effect thus comprises the following steps:
  • iii Determining the growth or survivability of the transgenic and non-transgenic plants after application of the test substance; and iv. Selection of test substances that cause an altered growth of the non-transgenic plant compared to the growth of the transgenic plant.
  • test compounds are selected that contain a modified one
  • Modified growth is to be understood as an inhibition of the vegetative growth of the plants, which can manifest itself in particular in a reduction in the growth in length.
  • the treated plants accordingly have a compact stature; a darker leaf coloration can also be observed.
  • the transgenic plant in which GDC or P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably P-GDC, is overexpressed can alternatively be produced by overexpressing the P-GDC, L -GDC, T-GDC or H-GDC, preferably P-GDC is accomplished by manipulating the promoter sequences naturally present in the plant. Such methods are known to the person skilled in the art.
  • test compounds can also be used in one method according to the invention. If the target is influenced by a group of test compounds, then it is either possible to directly isolate the individual test compounds or to divide the group of test compounds into different subgroups, for example if it consists of a large number of different components, so the number to reduce the various test compounds in the method according to the invention.
  • the method according to the invention is then repeated with the individual test compound or the corresponding subgroup of test compounds.
  • the steps described above can be repeated several times, preferably until the subgroup identified according to the method according to the invention only comprises a small number of test compounds or only one test compound.
  • method according to the invention preferably stands for the methods described above for the identification of inhibitors with herbicidal activity.
  • All of the compounds identified by the method according to the invention can then be checked for their herbicidal or growth-regulating action in vivo.
  • One way of testing the compounds for herbicidal activity is to use the Lemna minor duckweed in microtiter plates. Changes in chlorophyll content and photosynthesis performance can be measured as parameters. It is also possible to apply the compound directly to undesired plants, the herbicidal action e.g. about limited growth can be determined.
  • the method according to the invention can also advantageously be carried out in high-throughput methods, so-called HTS, which enables parallel testing of a large number of different connections.
  • the carrier used can be solid or liquid, is preferably solid, particularly preferably a microtiter plate.
  • the above-mentioned carriers are also the subject of the present invention. According to the most widespread technology, 96-well, 384-well and 1536-well microtiter plates are used, which can usually contain volumes of 200 ⁇ l. In addition to the microtiter plates, how many other components of a HTS system match the corresponding microtiter plates Instruments, materials, automatic pipetting devices, robots, automated plate readers and plate washers are commercially available.
  • the invention further relates to compounds with herbicidal activity identified by the processes according to the invention.
  • These compounds are referred to below as "selected compounds". They have a molecular weight of less than 1000 g / mol, advantageously less than 500 g / mol, preferably less than 400 g / mol, particularly preferably less than 300 g / mol.
  • Compounds with herbicidal activity have a Ki value of less than 1 mM, preferably less than 1 ⁇ M, particularly preferably less than 0.1 ⁇ M, very particularly preferably less than 0.01 ⁇ M.
  • the invention further relates to compounds with growth regulator-safe activity identified by the methods according to the invention. These compounds are also called “selected compounds” in the following. However, the term “selected compounds” preferably stands for compounds with herbicidal activity.
  • Agriculturally useful salts include, in particular, the salts of those cations or the acid addition salts of those acids whose cations or anions do not adversely affect the herbicidal activity of the herbicidally active compounds identified by the process of the invention.
  • the selected compounds if they contain asymmetrically substituted carbon atoms, either as racemates, mixtures of enantiomers, pure enantiomers or, if they have chiral substituents, also as Mixtures of diastereomers are present.
  • the selected compounds can be chemically synthesized or microbiologically produced substances and e.g. in cell extracts of e.g. Plants, animals or microorganisms occur.
  • the reaction mixture can be a cell-free extract or can comprise a cell or cell culture. Suitable methods are known to the person skilled in the art and are e.g. generally described in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), e.g. Chapter 17.
  • the selected compounds can also come from extensive substance libraries.
  • test compounds can be expression libraries such as cDNA expression libraries, peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic substances, hormones, PNAs or the like (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs , Cell. 79 (1994), 193-198 and references cited therein).
  • the selected compounds can be used to control undesirable plant growth and / or as growth regulators.
  • Herbicidal compositions containing the selected compounds control plant growth very well on non-cultivated areas. In crops such as wheat, rice, maize, soybeans and cotton, they act against weeds and grass weeds without significantly damaging the crop plants. This effect occurs especially at low application rates.
  • the selected compounds can be used to control the harmful plants already mentioned above.
  • selected compounds or herbicidal compositions containing them can advantageously also be used in a further number of crop plants for eliminating unwanted plants.
  • crops can be considered:
  • the selected compounds can also be used in crops which are tolerant to the action of herbicides by breeding, including genetic engineering methods. The preparation of these cultures is described below.
  • the invention further relates to a process for the preparation of the herbicidal or growth-regulating composition already mentioned above, characterized in that selected compounds are formulated with suitable auxiliaries to give crop protection agents.
  • the selected compounds can e.g. be formulated in the form of directly sprayable aqueous solutions, powders, suspensions, also high-proof aqueous, oily or other suspensions or suspoemulsions or dispersions, emulsifiable concentrates, emulsions, oil dispersions, pastes, dusts, sprinkling agents or granules and by spraying, atomizing, dusting, Scattering or pouring can be applied.
  • the application forms depend on the intended use and the nature of the selected compounds and should in any case ensure the finest possible distribution of the selected compounds.
  • the herbicidal composition contains a herbicidally effective amount of at least one selected compound and auxiliaries customary for the formulation of herbicidal compositions.
  • emulsions, pastes or aqueous or oil-containing formulations and dispersible concentrates the selected compounds can be dissolved or dispersed in an oil or solvent, it being possible to add further formulation auxiliaries for homogenization.
  • liquid or solid concentrates which are suitable for dilution with water can also be prepared from selected compound, optionally solvents or oil and optionally further auxiliaries.
  • EC, EW emulsifiable concentrates
  • SC suspensions
  • SL soluble concentrates
  • DC dispersible concentrates
  • corresponding powders or granules or tablets can also be provided with a solid coating ("coating") which prevents abrasion or premature release of the active ingredient.
  • auxiliary means the following classes of compounds: anti-foaming agents, thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants, emulsifiers, bactericides and / or thixotrophic agents.
  • anti-foaming agents thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants, emulsifiers, bactericides and / or thixotrophic agents.
  • SLs, EWs and ECs can be produced by simply mixing the corresponding ingredients, powder by mixing or grinding in special mill types (e.g. hammer mills).
  • DC, SCs and SEs are usually produced by wet milling, it being possible to produce an SE from a SC by adding an organic phase which may contain further auxiliaries or selected compounds.
  • the manufacture is known.
  • Powders, materials for broadcasting and dusts can advantageously be prepared by mixing or grinding the active substances together with a solid carrier.
  • Granules for example coated granules, impregnated granules and homogeneous granules, can be prepared by binding the selected compounds to solid carriers. Further details of the production are known to the person skilled in the art, and e.g.
  • inert liquid and / or solid carriers suitable for the formulations according to the invention are known to the person skilled in the art, e.g. liquid additives such as mineral oil fractions from medium to high boiling point, such as kerosene or diesel oil, also coal tar oils and oils of vegetable or animal origin, aliphatic, cyclic and aromatic hydrocarbons; e.g.
  • paraffin such as methanol, ethanol, propanol, butanol, cyclohexanol, ketones such as cyclohexanone or strongly polar solvents, for example amines such as N-methylpyrrolidone or water.
  • Solid carriers are, for example, mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate , Urea and vegetable products such as flour, tree bark, wood and nutshell flour, cellulose powder or other solid carriers.
  • mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate , Urea and vegetable products such as flour, tree bark, wood and nutshell flour
  • a large number of surface-active substances (surfactants) suitable for the formulations according to the invention are known to those skilled in the art, for example Alkali, alkaline earth, ammonium salts of aromatic sulfonic acids, e.g. Lignin, phenol, naphthalene and dibutylnaphthalenesulfonic acid, as well as of fatty acids, alkyl and alkylarylsulfonates, alkyl, lauryl ether and fatty alcohol sulfates, as well as salts of sulfated hexa-, hepta- and octadecanols as well as of fatty alcohol glycol ethers, condensation products of sulfonated naphthalene and its derivatives Formaldehyde, condensation products of naphthalene or
  • aromatic sulfonic acids e.g. Lignin, phenol, naphthalene and dibutylnaphthalenesulfonic
  • the herbicidal compositions or the selected compounds can be applied pre- or post-emergence. If the selected compounds are less compatible with certain crop plants, application techniques can be used in which the selected compounds are sprayed with the help of sprayers so that the leaves of the sensitive crop plants are not hit as far as possible, while the selected compounds get onto the leaves of unwanted plants growing underneath or the uncovered ground area (post-directed, lay-by).
  • the application rates of selected compounds are 0.001 to 3.0, preferably 0.01 to 1.0 kg / ha, depending on the control target, season, target plants and growth stage.
  • the provision of the herbicidal target further enables a method for identifying a glycine decarboxylase complex or a subunit of the glycine decarboxylase complex which is not or only to a limited extent by a herbicide which acts as the site of action of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC, for example the herbicidal selected compounds is inhibited.
  • GDC variant which is characterized by a Nucleic acid sequence is encoded
  • i) encodes a polypeptide with the activity of GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC, which was determined by the method mentioned above
  • Herbicidal substances which inhibit GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC, are not inhibited; and
  • nucleic acid sequence SEQ ID NO: 3 which has an identity with SEQ ID NO: 3 of at least 59%; includes; and or
  • iii) comprises a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, which has an identity with SEQ ID NO: 5 of at least 69%; and or
  • nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7 which has an identity with SEQ ID NO: 7 of at least 68%
  • SEQ ID NO: 9 a functional equivalent of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9 of at least 64%.
  • Functional equivalents of SEQ ID NO: 3 according to ii) have a homology with SEQ ID No: 3 of at least 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% or 66%, preferably at least 67% , 68%, 69%, 70%, 71%, 72% or 73% preferably at least 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% or 80% preferably at least 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92% or 93% particularly preferably at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • Functional equivalents of SEQ ID NO: 5 according to iii) have a homology with SEQ ID No: 5 of at least 69%, preferably at least, 70%, 71%, 72% or 73%, preferably at least 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% or 80% preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92 % or 93% particularly preferably at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • Functional equivalents of SEQ ID NO: 7 according to iv) have a homology with SEQ ID No: 7 of at least 68% or 69%, preferably at least 70%, 71%, 72% or 73%, preferably at least 74%, 75%, 76 %, 77%, 78%, 79% or 80% preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91% , 92% or 93% particularly preferably at least 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • Functional equivalents of SEQ ID NO: 9 according to v) have a homology with SEQ ID No: 9 of at least 64%, 65% or 66%, preferably at least 67%,
  • nucleic acid sequences preferably originate from one
  • the above-mentioned method for generating nucleic acid sequences coding for GDC variants of nucleic acid sequences comprises the following steps: a) expression of the proteins encoded by the above-mentioned nucleic acids in a heterologous system or in a cell-free system;
  • sequences selected according to the method described above are advantageously introduced into an organism.
  • Another object of the invention is therefore an organism produced by this method. The is preferred
  • Organism a plant, particularly preferably one of the crop plants defined above.
  • Modified proteins and / or nucleic acids which can impart resistance to the selected compounds in plants can also be produced from the above-mentioned nucleic acid sequences by means of the so-called "site directed mutagenesis".
  • This mutagenesis can, for example, improve the stability and / or activity of the target protein or the properties such as binding and action of the above-mentioned inhibitors according to the invention can be specifically improved or changed.
  • Zhu et al. (Nature Biotech., Vol. 18, May 2000: 555-558) describes a "site directed mutagenesis" method in plants which can be used advantageously.
  • EP-A-0 909 821 describes a method for changing proteins using the microorganism E. coli XL-1 Red. During replication, this microorganism creates mutations in the introduced nucleic acids and thus leads to a change in the genetic information. By isolating the modified nucleic acids or the modified proteins and testing for resistance, it is easy to identify advantageous nucleic acids and the proteins encoded by them. These can then express resistance there after introduction into plants and thus lead to resistance to the herbicides.
  • mutagenesis and selection are, for example, methods such as the in vivo mutagenesis of seeds or pollen and selection of resistant alleles in the presence of the inhibitors according to the invention, followed by genetic and molecular identification of the modified, resistant allele. Furthermore, mutagenesis and selection of resistances in cell culture by multiplying the culture in the presence of successively increasing concentrations of the inhibitors according to the invention. The increase in the spontaneous mutation rate can be exploited by chemical / physical mutagenic treatment. As described above, microorganisms which have an endogenous or recombinant activity of the nucleic acids used in the method according to the invention can also be used have encoded proteins and which are sensitive to the inhibitors identified according to the invention isolate modified genes. The cultivation of the microorganisms on media with an increasing concentration of inhibitors according to the invention allows the selection and evolution of resistant variants of the targets according to the invention. The frequency of the mutations can in turn be increased by mutagenic treatments.
  • Another object of the invention is therefore a method for producing nucleic acid sequences which code for gene products which have a changed biological activity, the biological activity being changed in contrast to the fact that there is increased activity.
  • Increased activity is to be understood as an activity which is at least 10%, preferably at least 30%, particularly preferably at least 50%, very particularly preferably at least 100% higher than that of the starting organism or of the starting gene product.
  • the biological activity may have been changed so that the substances and / or agents according to the invention no longer or no longer bind correctly to the nucleic acid sequences and / or the gene products encoded by them.
  • no longer or no longer correctly means that the substances have at least 30%, preferably at least 50%, particularly preferably at least 70%, very particularly preferably at least 80% or not at all of the modified nucleic acids and / or bind gene products in comparison to the starting gene product or the starting nucleic acids.
  • Yet another aspect of the invention therefore relates to a transgenic plant which has been transformed with a nucleic acid sequence which codes for a gene product which has an altered biological activity or with a nucleic acid sequence which codes for a GDC variant.
  • Methods for transformation are known to the person skilled in the art and are exemplified above.
  • Genetically modified transgenic plants which are resistant to the substances and / or agents containing these substances found by the method according to the invention can also be produced by transformation followed by overexpression of a nucleic acid sequence according to the invention.
  • a further subject of the invention is therefore a method for producing transgenic plants which are resistant to substances which have been found by a method according to the invention, characterized in that nucleic acids coding for a GDC, P-GDC, L-GDC, T- GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, most preferably P-GDC are overexpressed.
  • nucleic acids coding for a GDC, P-GDC, L-GDC, T- GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, most preferably P-GDC are overexpressed.
  • transgenic plants are produced using one of the above-described embodiments of the expression cassette according to the invention using common transformation methods also described above.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically expressed GDC variant can be determined, for example, in vitro by proliferation or by a germination test.
  • a change in the type and level of expression of the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC gene and its effect on the resistance to inhibitors the GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC or H-GDC, preferably GDC or P-GDC, very particularly preferably P-GDC can be tested on test plants in greenhouse experiments.
  • Example 1 Generation of a cDNA library in the plant transformation vector
  • a cDNA library (hereinafter referred to as "binary cDNA bank") in a vector which can be used directly for the transformation of plants, mRNA was isolated from various plant tissues and analyzed using the TimeSaver cDNA synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) rewritten into double-stranded cDNA.
  • the cDNA first strand synthesis was carried out with T ⁇ 2- ⁇ oligonucleotides according to the manufacturer's instructions. After size fractionation and ligation of EcoRI-Notl adapters according to the manufacturer's instructions and filling in the overhangs with Pfu DNA polymerase (Stratagene), the cDNA population was normalized. For this purpose, the method according to Kohci et al, 1995, Plant Journal 8, 771-776 was followed, the cDNA being amplified by PCR with the oligonucleotide N1 under the conditions listed in Table 1.
  • the PCR product obtained was bound to the column matrix of the PCR purification kit (Qiagen, Hilden) and eluted with 300 mM NaP buffer, pH 7.0, 0.5 mM EDTA, 0.04% SDS.
  • the DNA was denatured in a boiling water bath for 5 minutes and then renatured at 60 ° C. for 24 hours. 50 ⁇ l of the DNA was placed on a
  • the plant transformation vector for recording the cDNA population prepared as described above was produced by restriction enzyme digestion of the vector pUC18 with Sbfl and BamHI, purification of the vector fragment followed by filling in the overhangs with Pfu DNA polymerase and religation with T4 DNA ligase (Stratagene).
  • the construct thus produced is referred to below as pUC18Sbfl-.
  • the vector pBinAR was first cleaved with Notl, religated after filling in the ends, cleaved with Sbfl, religated after filling in the ends and then cleaved with EcoRI and HindIII.
  • the resulting fragment was ligated into a derivative of the binary plant transformation vector pPZP (Hajdukiewicz.P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25: 989-994), which enables a transformation of plants by means of Agrobacterium and a kanamycin resistance mediated in transgenic plants, ligated.
  • the construct generated here is referred to below as pSun12 / 35S.
  • pUC18Sbfl- was used as a template for a polymerase chain reaction (PCR) with the oligonucleotides V1 and V2 (see Table 2) and Pfu DNA polymerase.
  • the resulting fragment was ligated into the Smal digested pSun12 / 35S to generate pSunblues2.
  • pSunblues2 was ligated to the normalized and also NotL-cleaved cDNA population.
  • E.coli Xl-1blue (Stratagene)
  • the binary cDNA library contains cDNAs in "sense” and in "antisense” orientation under the control of the cauliflower mosaic virus 35s promoter, which are accordingly according to the
  • Transformation in tobacco plants can lead to "cosuppressions” and "antisene” effects.
  • Leaf disks of sterile plants were incubated in a petri dish with the agrobacterial dilution for 5-10 minutes. This was followed by a 2-day incubation in the dark at 25 ° C. on Murashige-Skoog medium (Physiol. Plant. 15 (1962), 473) with 2% sucrose (2MS medium) with 0.8% Bacto agar.
  • the cultivation was continued after 2 days with 16 hours of light / 8 hours of darkness and on a weekly basis on MS medium with 500 mg / l claforan (cefotaxime sodium), 50 mg / l kanamycin, 1 mg / l benzylaminopurine (BAP), 0.2 mg / l Naphtylacetic acid and 1, 6g / l glucose continued.
  • MS medium 500 mg / l claforan (cefotaxime sodium), 50 mg / l kanamycin, 1 mg / l benzylaminopurine (BAP), 0.2 mg / l Naphtylacetic acid and 1, 6g / l glucose continued.
  • Growing sprouts were transferred to MS medium with 2% sucrose, 250 mg / l Claforan and 0.8% Bacto agar. Regenerated sprouts were obtained on 2MS medium with kanamycin and claforan. In this way, transgenic plants of the line E_0000010590 were generated.
  • transgenic plants of the E_0000010590 line had similar phenotypes. These plants lag behind comparative plants in growth and have pronounced sheet chlorosis.
  • the integration of the cDNA of the clones into the genome of the transgenic lines was verified by PCR with the oligonucleotides G1 and G2 (see Table 1, Example 1) and genomic DNA of the corresponding transgenic lines.
  • TAKARA Taq-DNA polymerase according to the manufacturer's instructions (MoBiTec, Göttingen) was preferably used.
  • the cDNA clone of the binary cDNA bank used for the transformation served as a positive control as a template for a PCR reaction.
  • the insert of the clone Nt002002044_S2 was thus detected in the transgenic plants with the above-mentioned phenotypes.
  • the ctNA of Nt002002044_S2 (SEQ ID NO: 1) has a length of 558 bp and contains an open reading frame of 414 bp, which for a polypeptide of 138 amino acids (SEQ ID NO: 2) with significant identities to the subunit P of the plant Coded glycine decarboxylase complex.
  • the highest identity (88.2%) was between SEQ ID NO: 1 and the nucleic acid sequence from Solanum tuberosum (Gen Bank Acc. No .: Z99770) coding for subunit P of the vegetable glycine decarboxylase complex.
  • SEQ ID NO: 1 thus codes for the C-terminal part of a P protein.
  • the enzyme activity of the glycine decarboxylase complex can be measured from preparations of plant mitochondria or mitochondrial matrix extracts, for example from ebony leaves (Sarojini and Oliver 1983, Plant Physiology 72, p. 194ff.) Or from spinach leaves (Douce et al. 1977, Plant Physiology 60, pp. 625ff.) Can be isolated.
  • Example 5 in vitro test systems
  • the GDC activity can be determined photometrically (see, for example, Bourguignon et al 1988, Biochemical Journal 255, p. 169ff.).
  • the NADH formed during the reaction is monitored photometrically at 340 nm.
  • This assay can be performed in microtiter plates and is suitable for high throughput screening.
  • a system of detection of the joint activity of the P, L and H subunit of the GDC complex can be carried out by tracking the conversion of glycine photometrically using the coupled reduction of 2,6-dichlorophenol-indophenol, e.g. according to Moore et al. (1980, FEBS Letters 115, p.54fl).
  • the activity of the P protein can be determined according to Higara and Kiguchi (Journal of Biological Chemistry 1980, 255, pp. 11664-11670).
  • Higara and Kiguchi Journal of Biological Chemistry 1980, 255, pp. 11664-11670.
  • pyridoxyl phosphate and DTT 1- [ 14 C] glycine is decarboxylated and the resulting 14 C0 2 is detected radiometrically.
  • L-protein activity can be detected in the presence of NAD + and free lipoic acid with photometric monitoring of NADH formation at 340 nm (as described, for example, in Moran et al., Plant Physiology 2002, 128, pp. 300-313)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes, welcher bei Nichtanwesenheit Wachstumsretardierungen sowie chlorotische Blätter bedingt als Target für Herbizide. In diesem Rahmen werden neue Nukleinsäuresequenzen umfassend die SEQ ID NO:1 sowie funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:1 bereitgestellt. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes sowie dessen funktioneller Äquivalente in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung sowie die Verwendung dieser über das Verfahren identifizierten Verbindungen als Herbizide oder Wachstumsregulatoren. .

Description

Der Glycin Decarboxylase Komplex als herbizides Target
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes, welcher bei Nichtanwesenheit Wachstumsretardierungen sowie chlorotische Blätter bedingt als Target für Herbizide. In diesem Rahmen werden neue Nukleinsäuresequenzen umfassend die SEQ ID NO:1 sowie funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:1 bereitgestellt. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes sowie dessen funktioneller Äquivalente in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung sowie die Verwendung dieser über das Verfahren identifizierten Verbindungen als Herbizide oder Wachstumsregulatoren.
Das grundlegende Prinzip, Herbizide über Inhibierung eines definierten Targets zu identifizieren ist bekannt (z.Bsp. US 5,187,071, WO 98/33925, WO 00/77185). Generell besteht ein großer Bedarf, Enzyme zu detektieren, welche neue Targets für Herbizide darstellen könnten. Gründe hierfür sind auftretende Resistenzproblematiken von an bereits bekannten Targets wirkenden herbiziden Wirkstoffen und das ständige Bemühen neue herbizide Wirkstoffe zu identifizieren, die sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Verträglichkeit und/oder geringe Aufwandmengen auszeichnen.
Die Detektion von neuen Targets ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbunden, da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines Stoffwechselweges ist, häufig das Wachstum der Pflanze nicht weiter beeinflusst. Dies kann daran liegen, dass die Pfanze auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Existenz nicht bekannt ist, oder dass das inhibierte Enzym nicht limitierend für den Stoffwechselweg ist. Ferner zeichnen sich pflanzliche Genome durch eine große funktionelle Redundanz aus. Im Genom von Arabidopsis thaliana liegen funktional äquivalente Enzyme im Vergleich zu Insekten oder Säugern häufiger in Genfamilien vor (Nature, 2000, 408(6814):796-815). Diese Annahme wird experimentell bestätigt durch die Tatsache, dass grosse Gen-Knock-out-Programme durch T-DNA- oderTransposoninsertion in Arabidopsis bisher weniger ausgeprägte Phänotypen lieferten als erwartet (Curr. Op. Plant Biol. 4, 2001, pp.111-117).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, neue Targets zu identifizieren, die für das Wachstum von Pflanzen essentiell sind bzw. deren Inhibierung für die Pflanze zu einem verminderten Wachstum führen, sowie Verfahren bereitzustellen, welche zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider und/oder wachstumsregulatorischer Wirkung geeignet sind.
Die Aufgabe wurde gelöst durch die Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden.
An dieser Stelle werden nun weitere der in der Beschreibung verwendeten Begriffe definiert.
"Affinitäts-Tag": Bezeichnet ein Peptid oder Polypeptid, dessen kodierende Nukleinsäuresequenz mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz direkt oder mittels eines Linkers über gängige Klonierungstechniken fusioniert werden kann. Das Affinitäts-Tag dient zur Isolierung, Anreicherung und/oder gezielten Aufreinigung des rekombinanten Zielproteins mittels Affinitäts-Chromatographie aus
Gesamtzellextrakten. Der oben erwähnte Linker kann vorteilhaft eine Protease- Schnittstelle (z.B. für Thrombin oder Faktor Xa) enthalten, wodurch das Affinitäts-Tag bei Bedarf vom Zielprotein abgespalten werden kann. Beispiele für gängige Affinitäts- Tags sind das "His-Tag" z.B. von Quiagen, Hilden, "Strep-Tag", das " yc-Tag" (Invitrogen, Carlsberg), das aus einer Chitin bindenden Domäne und einem Intein bestehende Tag von New England Biolabs, das Maltose-bindende Protein (pMal) von New England Biolabs und das sogenannte CBD-Tag von Novagen. Der Affinitäts-Tag kann dabei am 5'- oder 3'-Ende der kodierenden Nukleinsäuresequenz mit der für das Zielprotein kodierenden Sequenz angebracht sein.
"Aktivität ": Der Begriff "Aktivität" beschreibt die Fähigkeit eines Enzyms, ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln. Die Aktivität kann in einem sogenannten Aktivitätstest über die Zunahme des Produktes, die Abnahme des Substrates (oder Eduktes) oder die Abnahme eines spezifischen Cofaktors oder über eine Kombination aus mindestens zwei der vorstehend genannten Parameter in Abhängigkeit einer definierten Zeitspanne bestimmt werden.
"Aktivität des Glycin Decarboxylase Komplexes " bezeichnet hier die Fähigkeit eines Enzyms, Umwandlung von Glycin in Kohlendioxid, Ammonium, Wasser und eine auf Tetrahydrofolat übertragene Methylengruppe unter Reduktion von NAD+ zu NADH + H+. Die Reaktion kann beispielsweise am isolierten Glycin Decarboxylase Komplex in Anwesenheit von NAD+, Glycin und Tetrahydrofolat durch photometrische Detektion der NADH-Bildung bei 340nm gemessen werden.
"Aktivität der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes " bezeichnet hier die Fähigkeit eines Enzyms mit Glycin unter Abspaltung von Kohlendioxyd und Wasser zu reagieren und dabei eine Aminomethylgruppe zu binden.
"Aktivität der Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes" bezeichnet hier die Fähigkeit eines Enzyms, eine Dihydroliponsäure prosthetische Gruppe der H- Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes unter Umsetzung von NAD+ zu NADH und H+ zur Liponsäure zu oxidieren.
"Aktivität der Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes" bezeichnet hier die Fähigkeit eines Enzyms mit der Aminomethylgruppe des Liponsäure-Addukts der Untereinheit H des Glycin Decarboxylase Komplexes zur reagieren und dabei unter Abspaltung eines Ammoniumions eine Methylengruppe auf Tetrahydofolat zu übertragen und eine Dihydroliponsäure prosthetische Gruppe am der H-Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes zu hinterlassen.
"Aktivität der Untereinheit H des Glycin Decarboxylase Komplexes" bezeichnet hier die Fähigkeit eines Enzyms eine Aminomethylgruppe kovalent an eine Liponsäure prosthetische Gruppe zu binden und diese an die Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes weiterzureichen.
"Expressionskassette": Eine Expressionskassette enthält eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz funktioneil verknüpft mit mindestens einem genetischen Kontrollelement, wie einem Promotor, sowie vorteilhaft mit einem weiteren Kontrollelement, wie einem Terminator. Die Nukleinsäuresequenz der
Expressionskasette kann beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon sein. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form, extra- chromosomal oder integriert in das Genom vorliegen. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Auch artifizielle Nukleinsäuresequenzen sind hierbei geeignet, solange sie die Expression eines durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuesequenz kodierten Polypeptides mit der Aktivität des Glycin Decarboxylase Komplexes in einer Zelle oder einem Organismus ermöglichen. Beispielsweise können synthetische Nukleotid- Sequenzen erzeugt werden, die bezüglich der Kodon-Nutzung des von den zu transformierenden Organismen optimiert wurden.
Alle vorstehend erwähnten Nukleotid-Sequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragment-Kondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleotidbausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise in bekannter Weise nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander erfolgt über allgemeine Klonierungstechniken wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind.
"Funktionelle Verknüpfung": Unter einer funktionellen oder operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung regulativer Sequenzen bzw. genetischer Kontrollelemente derart, daß jede der regulativen Sequenzen bzw. jedes der genetischer Kontrollelemente ihre Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
"Funktionelle Äquivalente" beschreiben hier Nukleinsäuresequenzen, die unter Standardbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz (hier SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:9) oder Teilen einer
Nukleinsäuresequenz (hier SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:9) hybridisieren und befähigt sind, die Expression mindestens eines Polypeptides mit der Aktivität einer Untereinheit P, H, L oder T des Glycin Decarboxylase Komplexes in einer Zelle oder einem Organismus zu bewirken.
Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 10-50 bp, vorzugsweise 15-40 bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-500 bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure/Oligonukleotid, der Länge des Fragmentes oder der vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart, d.h. DNA oder RNA, für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardhybridisierungsbbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man weiterhin auch
Nukleinsäuresequenzen die mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz („ursprüngliche Nukleinsäuresequenz) bis zu einem definierten Prozentsatz homolog bzw. identisch sind und die gleiche Aktivität der ursprünglichen Nukleinsäuresequenzen aufweisen, ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen dieser Nukleinsäuresequenzen.
Es werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen erhält. Beispielhaft können solche Modifikationen durch dem Fachmann geläufige Techniken, wie "Site Directed Mutagenesis", "Error Prone PCR", "DNA-shuffling" (Nature 370, 1994, pp.389-391) oder "Staggered Extension Process" (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp.258-261) erzeugt werden. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung von DNA zur Verkürzung der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon-Optimierung oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifizierte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, müssen trotz abweichender Nukleinsäuresequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen.
Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch adaptierte Nukleinsäuresequenzen bzw. die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
"Genetische Kontrollsequenz" beschreibt Sequenzen, die einen Einfluss auf die Transkription und gegebenenfalls Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in prokaryotischen odereukaryontischen Organismen haben. Beispiele hierfür sind Promotoren, Terminatoren oder sogenannte "enhancer" Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so modifiziert worden sein, dass die natürliche
Regulation ausgeschaltet und die Expression des Zielgens modifiziert, also erhöht oder erniedrigt wurde. Die Auswahl der Kontrollsequenz erfolgt abhängig vom Wirtsorganismus oder Ausgangsorganismus. Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, sowie die Chromatinstruktur beeinflussende Sequenzen (z.B. Matrix attachment regions (MAR's)) die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991 ; 266(26): 17131 -17135), Kälte- und Trockenstress (Plant Cell 1994, (6): 251-264) und Hitzestress (Molecular & General Genetics, 1989, 217(2-3): 246-53) beschrieben.
"Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des GAP-Alignments (nach Needleman and Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48; 443-453) unter Einstellung folgender Parameter für Nukleinsäuren
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10.OOOAverage Mismatch: 0.000 berechnet wird.
Anstelle des Begriff "homolog" oder "Homologie" wird im Folgenden auch gleichbedeutend der Begriff Identität verwendet.
"Mutationen" von Nuklein- oder Aminosäuresequenzen umfassen Substitutionen (=Ersetzungen), Additionen (Hinzufügung), Deletionen (Löschung), Inversion (Veränderungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann, wobei jedoch insgesamt die funktionellen Eigenschaften des Zielproteins im wesentlichen beibehalten werden.
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an 5'- oder 3'- Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 100 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am meisten bevorzugt mindestens 5000 bp.
"Pflanzen" im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke zu verstehen.
"Reaktionszeit" bezeichnet die Zeit, die man für die Durchführung eines Testes zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität bis zum Erhalt einer signifikanten Aussage über eine enzymatische Aktivität benötigt und hängt sowohl von der spezifischen Aktivität des im Test eingesetzten Proteins als auch von der verwendeten Methode und der Empfindlichkeit der verwendeten Geräte ab. Dem Fachmann ist die Ermittlung der Reaktionszeiten bekannt. Bei auf photometrischen Methoden basierenden Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung liegen die Reaktionszeiten beispielsweise im allgemeinen zwischen > 0 bis 120 Minuten.
"Rekombinante DNA" beschreibt eine Kombination von DNA-Sequenzen herstellbar durch rekombinante DNA-Technologie.
"Rekombinate DNA-Technologie": allgemein bekannte Techniken zur Fusionierung von DNA-Sequenzen (z.B. beschrieben in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
"Replikationsursprünge" gewährleisten die Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in Mikroorganismen und Hefen z.B. der pBR322 ori oder der P15A ori in E. coli (Sambrook et al.: "Molecular Cloning. A Laboratory
Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und der ARS1 ori in Hefe (Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068).
"Reportergene" kodieren für leicht quantifizierbare Proteine. Über Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung (Eigenfarbe) oder Enzymaktivität kann mittels dieser Gene eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder - Zeitpunktes vorgenommen werden. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter- Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1 ):44-47; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al.,
Biotech niques.23(5):912-8, 1997), die Chloramphenicolacetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sei 1996, 116:59-72; Scikantha, J Bact 1996, 178:121 ; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414), sowie Luziferasegene, im allgemeinen die ß-Galactosidase oder die ß-Glucu-ronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das Ura3-Gen.
"Selektionsmarker" verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika, oder andere toxische Verbindungen: Beispielhaft zu nennen seien hier das Neomycin-Phosphotransferase- Gen, das eine Resistenz gegen die Aminoglycosid-Antibiotika Neomycin (G 418), Kanamycin, Paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731 -2737), das sul Gen kodierend für eine mutierte Dihydropteroat Synthase (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15(1):127-136), das Hygromycin B Phosphotransferase-Gen (Gen Bank Accession NO: K 01193) und das shble Resistenzgen, das eine Resistenz gegen die Bleomycin Antibiotika wie zB. Zeocin verleiht. Weitere Beispiele für Selektionsmarker- Gene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO
98/45456) oder Phosphinotricin etc. verleihen oder solche, die eineAntimetaboliten- Resistenz verleihen, zum Beispiel das dhfr-Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994) 142-149). Geeignet sind ferner Gene wie trpB oder hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sei U S A. 85 (1988) 8047-8051). Geeignet ist auch das Gen der Mannose-Phosphat Isomerase (WO 94/20627), das ODC (Ornithin-Decar- boxylase) Gen (McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus (Tamura K etal., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
"Transformation" beschreibt einen Prozess zur Einführung heterologer DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt das Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus
"Target/Target Protein": ein Polypeptid codiert über die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, welches ein Enzym im klassischen Sinne sein kann oder z.B. ein Strukturprotein, ein für Entwicklungsprozesse relevantes Protein, Regulationsproteine wie Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Phosphatasen, Rezeptoren, Untereinheiten von Kanälen, Transportproteine, regulatorische Untereinheiten die einem Enzymkomplex eine Substrat- oder Aktivitätsregulation verleihen. Allen Targets oder Wirkorten gemein ist dabei, dass deren funktionale Anwesenheit essentiell für das Überleben oder die normale Entwicklung und das Wachstum sind.
"Transgen": Bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette oder einen Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus transformiert mit der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenz,
Expressionskassette oder Vektor beschreibt der Ausdruck transgen alle solche durch gentechnische Methoden hergestellten Konstruktionen, in denen sich entweder die Nukleinsäuresequenz des Zielproteins oder eine mit der Nukleinsäuresequenz des Zielproteins funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination der vorstehend genannten Möglichkeiten sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden. Die Modifikation kann hier beispielsweise über Mutation eines oder mehrerer Nukleotidreste der entsprechenden Nukleinsäuresequenz erreicht werden.
In der vorliegenden Anmeldung wird auf die folgende Sequenzen Bezug genommen:
SEQ ID NO:1 partielle Nukleinsäuresequenz der P-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Nicotiana tabacuum SEQ ID NO:2 partielle Aminosäuresequenz der P-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Nicotiana tabacuum
SEQ ID NO:3 Nukleinsäuresequenz der P-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Arabidopsis thaliana SEQ ID NO:4 Aminosäuresequenz der P-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Arabidopsis thaliana SEQ ID NO:5 Nukleinsäuresequenz der L-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Arabidopsis thaliana SEQ ID NO:6 Aminosäuresequenz der L-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Arabidopsis thaliana SEQ ID NO:7 Nukleinsäuresequenz derT-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Arabidopsis thaliana SEQ ID NO:8 Aminosäuresequenz derT-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Arabidopsis thaliana SEQ ID NO:9 Nukleinsäuresequenz der H-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Arabidopsis thaliana SEQ ID NO:10 Aminosäuresequenz der H-Untereinheit des Gycin Decarboxylase Komplexes aus Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO:11 - SEQ ID NO:15: Primer
In Pflanzen kommt dem Abbau von Glycin in den Mitochondrien eine besondere Rolle zu. Die Oxygenase Nebenreaktion der Ribulosebisphosphat Decarboxylase (RUBISCO) führt während der Photosynthese zur Bildung von 2-Phoshoglycolat, das im Photorespirationsweg unter ATP Verbrauch metabolisiert werden muss, um die Photoinhibition zu verhindern. Das im Verlauf der Photorespiration in den Peroxisomen gebildete Glycin wird vom Glycin Decarboxylase Komplex umgesetzt. Der Glycin Decarboxylase Komplex setzt sich aus vier Enzymuntereinheiten, der Untereinheit P, der Untereinheit H, der Untereinheit L, und der Untereinheit T-Proteinen zusammen. Die P-Untereinheit aktiviert im Eingangsschritt das Glycin durch Bindung an ein Pyridoxalphosphat und decarboxylert es unter C02-Abspaltung. Die verbleibende Aminomethylgruppe wird auf die Dihydroliponsäure-Gruppe der H- Untereinheit übertragen. Unter NH +-Abspaltung wird eine C-i-Einheit auf die Tetrahydrofolat-Gruppe der T- Untereinheit übertragen. Die so wiederhergestelle, reduzierte Dihydroliponsäure- Gruppe wird mit Hilfe der L- Untereinheit unter NAD-Reduktion reoxidiert. Die Ci- Einheit wird schließlich von der Serin-Hydroxymethyltransferase auf Glycin übertragen, wodurch Serin gebildet wird.
Die Bedeutung der Photorespiration für normales pflanzliches Wachstum wurde anhand von Arabidopsis thaliana Mutanten nachgewiesen (Somerville und Ogren 1982, Biochemical Journal 202, S. 373ff.), die keine messbare Aktivität des Glycin Decarboxylase Komplexes in Mitochondrien enthielten. Da diese Mutanten jedoch genetisch nicht charakterisiert wurden, ist nicht klar, ob dieser Effekt auf die Inaktivierung des Glycin Decarboxylase Komplexes zurückzuführen ist. Diese
Mutanten sind nur unter hohen Cθ2-Konzentrationen überlebensfähig. Unter diesen Bedingungen ist die Oxygenase Reaktion der RUBISCO stark zurückgedrängt, so dass keine Photorespiration benötigt wird.
Die spezielle Bedeutung der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes wurde mittels Antisense-Inhibierung der Untereinheit P in Kartoffel untersucht. Diese Pflanzen wiesen eine um ca. 50% reduzierte Aktivität des Glycin Decarboxylase Komplexes sowie eine erhöhte Glycin Konzentrationen auf, ein ausgeprägter Effekt auf die Vitalität der Pflanzen konnte jedoch nicht festgestellt werden (Heineke et al 2001 , Planta 212, S.880ff., Winzer et al. 2001 , Annais of Applied Biology 138, S. 9ff.). Desweiteren zeigen Gerste Mutanten mit ca. 50% geringerer H-Protein- und GDC Aktivität weder sichtbare Wachstumsprobleme noch erhöhte Glycin Konzentrationen auf.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass Pflanzen, in denen gezielt die Expression der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes verringert wurde, Phänotypen aufwiesen, die mit durch Herbizdidapplikation erzeugten Phänotypen vegleichbar sind. Beobachtet wurden drastische Wachstumsretardierungen und Schädigungen wie Chlorosen und Nekrosen.
Als Inhibitor der GDC Aktivität wurde das Toxin Victorin aus dem Pilz Cochliobolus victoriae beschrieben. Bei der Infektion durch den Pilz kann an der Infektionsstelle eine Ausbleichung des Blattgewebes beobachtet werden. Als Bindestelle dieses ca. 900 Dalton grossen Naturstoffs wurde das H-Protein des Gylcin Decarboxylase Komplexes identifiziert. Victorin führt in vitro zur Hemmung der GDC Aktivität (Navarre und Wolpert 1995, The Plant Cell 7, S.463ff).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden, welcher aus den Untereinheiten P, L (E.C. 1.8.1.4), T (E.C. 2.1.2.10) und H besteht, oder der Untereinheit P, L, H oder T, vorzugsweise die Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes oder die Verwendung der Untereinheit P.
Hierbei ist die Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes besonders bevorzugt, der dadurch gekennzeichnet ist, dass a) die Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 oder in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 oder in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:3, das eine Identität mit der SEQ ID NO:3 von mindestens 59% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
b) die Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:6 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:5, das eine Identität mit der SEQ ID NO:5 von mindestens 69% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
c) die Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:7 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:7, das eine Identität mit der SEQ ID NO:7 von mindestens 68% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
d) die Untereinheit H des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:9 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:10 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:9, das eine Identität mit der SEQ ID NO:9 von mindestens 64% aufweist, ableiten lässt; umfasst.
wobei sich die funktioneilen Äquivalente nach a) iii), b) iii), c) iii) und d) iii) sich durch eine gleiche Funktionalität auszeichnen, d.h. sie haben die Aktivität der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes (a) iii)) bzw. die Aktivität der Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes (b) iii)) bzw. die Aktivität der Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes (c) iii)) bzw. die Aktivität der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes (d) iii)).
Des weiteren ist die Verwendung einer Untereinheit P des Glycin Decarboxylase gemäß (a) iii) bzw. die einer Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes gemäß (b) iii)) bzw. die einer Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes gemäß (c) iii)) bevorzugt. Die Verwendung einer Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes gemäß (d) iii)) ist hierbei besonders bevorzugt.
Der Begriff "umfassend" oder "umfassen" bezogen auf Nukleinsäuresequenzen meint, daß die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz am 3' und/oder am 5' Ende zusätzliche Nukleinsäuresequenzen enthalten kann, wobei die Länge der zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen 500 bp am 5' und 500 bp 3' Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise 250 bp am 5' und 250 bp am 3' Ende nicht überschreitet, besonders bevorzugt 100 bp am 5' und 100 bp am 3' Ende.
Erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:3 gemäß a) iii) weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:3 von mindestens 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65% oder 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.
Beispiele für geeignete funktionelle Äquivalente gemäß a iii) sind auch die pflanzlichen
Nukleinsäuresequenzen codierend für die Untereinheit P des Glycin Decarboxylase
Komplexes aus
Tritordeum (Gen Bank Acc. No. AF024589), Avena sativa (Gen Bank Acc. No.
U11693),
Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY128922 ),
Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. BT000446), Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY091186),
Flaveria anomala (Gen Bank Acc. No. Z99762 ),
Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z36879 ),
Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z54239 ),
Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z25857 ), Flaveria trinervia (Gen Bank Acc. No. Z99767 ),
Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. X59773 ),
Solanum tuberosum (Gen Bank Acc. No. Z99770 ) und
Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AY346327 )
Alle vorstehend genannten Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden
Erfindung.
Erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:5 gemäß b) iii) weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:5 von mindestens 69% vorzugsweise mindestens, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.
Beispiele für geeignete funktionelle Äquivalente gemäß b) iii) sind auch die pflanzlichen Nukleinsäuresequenzen codierend für die Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes aus
Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AF228640), Bruguiera gymnorrhiza (Gen Bank Acc. No. AB060811 ),
Solanum tuberosum (Gen Bank Acc. No. AF295339),
Lycopersicon esculentum (Gen Bank Acc. No. AF542182),
Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. X62995) und Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. X63464)
Alle vorstehend genannten Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:7 gemäß c) iii) weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:7 von mindestens 68% oder 69% vorzugsweise mindestens 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.
Beispiele für geeignete funktionelle Äquivalente gemäß c) iii) sind auch die pflanzlichen Nukleinsäuresequenzen codierend für die Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes aus
Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. Z25861),
Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK059270),
Flaveria anomala (Gen Bank Acc. No. Z71184) oder
Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z25858) Alle vorstehend genannten Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand dervoriiegenden Erfindung.
Erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:9 gemäß d) iii) weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:9 von mindestens 64%, 65% oder 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.
Beispiele für geeignete funktionelle Äquivalente gemäß d) iii) sind auch die pflanzlichen Nukleinsäuresequenzen codierend für die Untereinheit H des Glycin Decarboxylase Komplexes aus
Oryza sativa (indica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AF022731),
Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK058606),
Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK062851),
Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK071621),
Oryza sativa (japonica cultivar-group) (Gen Bank Acc. No. AK104840), Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AF385740),
Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY050446),
Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY078028),
Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY086345),
Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY089054), Arabidopsis thaliana (Gen Bank Acc. No. AY097349),
Triticum aestivum (Gen Bank Acc. No. AY123417),
Flaveria anomala (Gen Bank Acc. No. Z37524),
Flaveria anomala (Gen Bank Acc. No. Z99530),
Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z25855), Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z25856),
Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z37522), Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No.
Z99763),
Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z99764),
Flaveria pringlei (Gen Bank Acc. No. Z99765), Flaveria trinervia (Gen Bank Acc. No. Z37523),
Flaveria trinervia (Gen Bank Acc. No. Z48797), Mesembryanthemum crystallinum (Gen Bank Acc. No. U79768), Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. J05164), Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. X64726), Pisum sativum (Gen Bank Acc. No. X53656) und
Populus tremuloides (Gen Bank Acc. No. AY369261).
Alle vorstehend genannten Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand dervoriiegenden Erfindung.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß a) i), ii) und iii) kodiert wird.
Sämtliche oben genannten Nukleinsäuresequenzen stammen vorzugsweise aus einer Pflanze.
Des weiteren werden in diesem Rahmen pflanzliche Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der Aktivität der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes enthaltend:
a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder
b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 89% zu der SEQ ID NO:1.
Mit dem vorstehend genannten Begriff " Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der Aktivität der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes enthaltend" sind Nukleinsäuresequenzen gemeint, welche eine Nukleinsäuresequenz gemäß a), b) oder c) enthalten und welche am 3' und/oder am 5' Ende zusätzliche Nukleinsäuresequenzen enthalten können, wobei die Länge der zusätzlichen
Nukleinsäu-resequenzen 3500 bp am 5' und 500 bp 3' Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-sequenzen, vorzugsweise 3100 bp am 5' und 250 bp am 3' Ende, besonders bevorzugt 2900 bp am 5' und 100 bp am 3' Ende nicht überschreiten.
Diese Nukleinsäuesequenzen stellen ebenfalls geeignete funktionelle Äquivalente gemäß a) iii) dar.
Ebenfalls beansprucht werden die durch die vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen kodierten Polypeptide. Die funktioneilen Äquivalente nach c) zeichnen sich durch eine gleiche Funktionalität aus, d.h. sie haben die enzymatische, vorzugsweise biologische Aktivität einer glyoxysomalen GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, .
Die erfindungsgemäßen funktioneilen Äquivalente der SEQ ID NO:1 weisen eine Identität mit der SEQ ID No:1 von mindestens 89% vorzugsweise mindestens 90%, 91 %, 92%, 93% bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96% besonders bevorzugt mindestens 97%, 98%, 99% auf.
Der im folgenden verwendete Begriff "erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz(en)" steht für eine Nukleinsäuresequenz/ Nukleinsäuresequenzen kodierend für eine oder mehrere Untereinheiten des Glycin Decarboxylase Komplexes oder für
Nukleinsäuresequenzen codierend für den gesamtent Glycin Decarboxylase Komplex, vorzugsweise für eine Nukleinsäuresequenz/ Nukleinsäuresequenzen kodierend für eine oder mehrere Untereinheiten des Glycin Decarboxylase Komplexes oder für Nukleinsäuresequenzen codierend für den gesamtent Glycin Decarboxylase Komplex, worin
a) die Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 oder in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 oder in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID N0:3, das eine Identität mit der SEQ ID NO:3 von mindestens 59% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
b) die Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:6 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:5, das eine Identität mit der SEQ ID NO:5 von mindestens 69% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
c) die Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:7 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:7, das eine Identität mit der SEQ ID NO:7 von mindestens 68% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
d) die Untereinheit H des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID N0:9 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:10 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:9, das eine Identität mit der SEQ ID NO:9 von mindestens 64% aufweist, ableiten ' lässt; umfasst.
Die Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes, wwird vorzugsweise durch
i) eine Nukleinsäuresequenz enthaltend eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder
ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder
iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:3, das eine Identität mit der SEQ ID NO:3 von mindestens 59% aufweist, ableiten lässt; umfasst.
Der durch erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen kodierte Glycin Decarboxylase Komplexes wird im folgenden der Einfachheit halber als "GDC" bzeichnet. Die durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen kodierten Untereinheiten P, L, T oder H werden im folgenden als P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC bezeichnet.
Die Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen neue Targets für Herbizide dar, welche die Bereitstellung neuer Herbizide zur Bekämpfung unerwünschter Pflanzen ermöglichen. Des weiteren stellen die Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen neue Targets für Wachstumsregulatoren dar, welche die Bereitstellung neuer Wachstumsregulatoren zur Regulation des Wachstums von Pflanzen ermöglichen. Hierbei ist die Verwendung als Target für Herbizide bevorzugt. Unter unerwünschten Pflanzen sind im weitesten Sinne alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind, zum Beispiel:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca,
Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.
Die SEQ ID NO:1 oder Teile der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenz kann für die Herstellung von Hybridisierungssonden verwendet werden. Die Herstellung dieser Sonden sowie die Durchführung der Experimente ist bekannt. Sie kann zum Beispiel über die gezielte Herstellung radioaktiver oder nicht radioaktiver Sonden mittels PCR und der Verwendung von entsprechend markierten Oligonukleotiden mit anschließenden Hybridisierungsexperimenten erfolgen. Die hierfür erforderlichen Technologien sind beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) aufgeführt. Die entsprechenden Sonden können weiterhin mittels Standardtechnologien (Lit. SDM bzw. random Mutagenesis) so modifiziert werden, dass sie für weitere Zwecke eingesetzt werden können, z.B. als Sonde, die spezifisch zu mRNA sowie den entsprechenden codierenden Sequenzen hybridisiert zwecks Analyse der entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen.
Die oben genannten Sonden können für die Detektion und Isolation von funktionellen Äquivalenten der SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:9 aus anderen Pflanzenspezies sowie der zur SEQ ID NO: 1 gehörigen Vollängensequenz aus Nicotiana tabacuum aufgrund von Sequenzidentitäten verwendet werden. Hierbei wird z.B. ein Teil oder die gesamte Sequenz der entsprechenden SEQ ID NO:1 als Sonde zum Screening in einer genomischen oder cDNA Bank der entsprechenden Pflanzenspezies oder in einer Computer-Recherche nach Sequenzen funktioneller Äquivalente in elektronischen Datenbanken verwendet.
Bevorzugte Pflanzenspezies sind hierbei die bereits eingangs erwähnten unerwünschten Pflanzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Expressionskassetten enthaltend
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer Nukleinsäuresequenz enthaltend i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder iii. ein funktionelles Äquivalente der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 89% zu der SEQ ID NO:1 ;
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b);
sowie die Verwendung von Expressionskassetten enthaltend
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz;
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b);
zur Expression von GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC zur Verwendung in in vitro Testsystemen. Beide Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Expressionskasetten werden im folgenden als erfindungsgemäße Expressionskassette bezeichnet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette am 5'-Ende der kodierenden Sequenz einen Promotor und am 3'- Ende Transkriptions-Terminations-Signal und gegebenenfalls weitere genetische Kontrollsequenzen, welche mit der dazwischenliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz funktioneil verknüpft sind.
Unter den erfindungsgemäßen Expressionskassetten sind auch Analoga zu verstehen, die zum Beispiel durch eine Kombination der einzelnen Nukleinsäuresequenzen auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte), auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Kotransformation) oder durch sequenzielle Transformation zustande kommen können.
Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen nach Punkt a) für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder für Vektoren enthaltend erfindungsgemäße
Expressionskasetten sind beispielsweise Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, Ipp-, lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor, die zur Expression von GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P- GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC, in gram-negativen Bakterienstämmen verwendet werden können.
Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den Promotoren amy und SP02, die zur Expression des/der, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC in gram-positiven Bakterienstämmen verwendet werden können, sowie in den Hefe- oder Pilzpromotoren AUG1 , GPD-1 , PX6, TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PH05, AOX1, GAL10/CYC1 , CYC1, OliC, ADH, TDH, Kex2, MFa oder NMT oder Kombinationen der vorstehend genannten Promotoren enthalten (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11 (7):629-40; Romanos et al. Yeast 1992 Jun;8(6):423-88; Benito et al. Eur. J. Plant Pathol. 104, 207-220 (1998); Cregg et al. Biotechnology (N Y) 1993 Aug; 11 (8):905-10; Luo X. , Gene 1995 Sep 22; 163(1 ): 127- 31 ; Nacken et al., Gene 1996 Oct 10;175(1-2): 253-60; Turgeon et al., Mol Cell Biol 1987Sep;7(9):3297-305) oder den Transkriptionsterminatoren NMT, Gcy1, TrpC, AOX1 , nos, PGK oder CYC1 (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15; 11 (7):629-40; Brunelli et al. Yeast 1993 Dec9(12): 1309-18; Frisch et al., Plant Mol. Biol. 27 (2), 405-409 (1995); Scoreret al., Biotechnology (N.Y.) 12 (2), 181-184 (1994), Genbank acc. numberZ46232; Zhao et al. Genbank acc number : AF049064; Punt et al., (1987) Gene 56 (1), 117-124), die zur Expression des/der, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H- GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC in Hefestämmen verwendet werden können.
Als zur Expression in Insektenzellen geeignete genetische Kontrollsequenzen sind exemplarisch der Polyhedrin-Promotor sowie der p10-Promotor (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio/Techn. 6, 47-55) zu nennen.
Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression der GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC in Zellkultur sind sind neben Polyadenylierungssequenzen wie z.B. aus Simian Virus 40 eukaryontische Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40.
Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression des/der, P-GDC, L- GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC in Pflanzen sind in den
Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1 , B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940) oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten, vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt sind Promotoren viralen
Ursprungs wie der Promotor des 35S-Transkriptes des Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294; Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812). Weitere bevorzugte konstitutive Promotoren sind zum Beispiel der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR-Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubiquitin Promotor (Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29:637-649), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991).
Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor als genetische Kontrollsequenz enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRP1 Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361- 366), ein durch Salicylsäure induzierbarer (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer (EP-A-0388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können ebenfalls verwendet werden.
Geeignet sind ferner Promotoren die eine gewebe- oder organspezifische Expression z.B. in Antheren, Ovarien, Blüten und Blütenorganen, Blättern, Schließzellen, Trichomen, Stengel, Leitgeweben, Wurzeln und Samen vermitteln. Ebenfalls geeignet sind hier neben den oben genannten konstitutiven Promotoren, insbesondere solche Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1 ,5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 245). Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989;1 (9):839-53), des 2S Albumingens (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262:12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989;215(2):326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991 , 225(3) :459-67) des Nap Gens (Stalberg K, et al., L. Planta 1996, 199:515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al., Mol Gen Genet 1991 , 225: 121-128; Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090).
Weitere als genetische Kontrollsequenzen geeignete Promotoren sind beispielsweise spezifische Promotoren für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593) oder spezifische Piastiden- oder
Chromoplasten-Promotoren, wie beispielsweise der RNA-Polymerase Promotor (WO 97/06250) oder auch der Promotor der PhosphoribosylpyrophosphatAmidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nr U87999) oder ein anderer Nodien-spezifischer Promotor wie in EP-A 249676 können vorteilhaft verwendet werden. Unter zusätzlichen Funktionselementen b) sind beispielhaft aber nicht einschränkend Reportergene, Replikationsursprünge, Selektionsmarker und sogenannte Affinitäts- Tags, fusioniert mit GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC direkt oder mittels eines Linkers optional enthaltend eine Protease-Schnittstelle zu verstehen. Weitere geeignete zusätzliche Funktionselemente sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das Peroxisom, das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423).
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthalten.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
In einerweiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual." 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette sowie davon abgeleitete Vektoren können zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien (z.B. der Gattung Synechocystes, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema und Nostoc), Proteobakterium wie etwa Magnetococcus sp. MC1 , Hefen, filamentösen Pilzen und Algen und eukaryontisehen, nicht humanen Zellen (z.B. Insektenzellen) mit dem Ziel der rekombinanten Herstellung GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC eingesetzt werden, wobei sich die Herstellung einer geeigneten Expressionskassette nach dem Organismus, in welchen das Gen exprimiert werden soll, richtet.
Vektoren enthaltend eine Expressionskassette, welche
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer Nukleinsäuresequenz enthaltend i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder iii. ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 89% zu der SEQ ID NO:1 ;
b) zusätzliche Funktionselemente; oder
c) eine Kombination aus a) und b); enthält;
oder Vektoren enthaltend
i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder
ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder ii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 89% zur SEQ ID NO:1;
sind Gegenstand dervoriiegenden Erfindung.
In einerweiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Hierbei kann das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n), der Expressionskassette oder des Vektors in die entsprechenden Organismen (Transformation) prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1 , (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Bei der Transformation von filamentösen Pilzen bieten sich zum einen die Herstellung von Protoplasten und Transformation mit Hilfe von PEG (Wiebe et al. (1997) Mycol. Res. 101 (7): 971-877; Proctoret al. (1997) Microbiol. 143, 2538-2591), zum anderen die Transformation unter zur Hilfe nähme von Agrobacterium tumefaciens (de Groot et al. (1998) Nat. Biotech. 16, 839-842) an.
Für dikotyle Pflanzen können die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zurtransienten oder stabilen Transformation genutzt werden. Geeignete Methoden sind das biolistische Verfahrens oder durch Protoplastentransformation (vergl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (HJ. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim- New York-Basel-Cambridge), die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and
Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.BioI. 42 (1991) 205-225) beschrieben.
Die Transformation mittels Agrobakterien sowie die für die Transformation zu verwendenden Vektoren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (; Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187) , EP A 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4: 1 -46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287).
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobacterium basierender Vektoren wurde beschrieben ( Chan et al, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al, Plant J. 6 (1994) 271 -282; Deng et al; Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11 ,(1992) 76-80; May et al; Biotechnology 13 (1995) 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sei. 153 (1992) 550-555; Ritchie et al; Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al; Biotechnology 11 (1992), 667-674; Ritala et al, Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spencer et al, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631 ) die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen ; die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z.B. WO 95/06128; EP 0513849 A1 ; EP 0465875 A1 ; EP 0292435 A1 ; Fromm et al, Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al, Biotechnology 11(1993) 194-200; Moroc et al, Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben z.B. für Gerste ( Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al, s.o.; Weizen ( Nehra et al, Plant J. 5(1994) 285-297).
Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Die durch Transformation mit einer der oben beschriebenen Ausführungsformen einer Expressionskassette, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einem Vektor, enthaltend die vorstehend genannte Expressionskassette, hergestellten transgenen Organismen sowie die mittels Expression aus dem transgenen Organismus erhältliche rekombinante GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ebenfalls Gegenstand dervoriiegenden Erfindung ist die Verwendung von transgenen Organismen enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionskassette z.B. für die Bereitstellung rekombinanten Proteins und/oder die Verwendung dieser Organismen in in vivo Testsystemen. Bevorzugte Organismen für die rekombinante Expression sind sind neben Bakterien, Hefen, Moose, Algen, Pilze auch eukaryontische Zellinien.
Bevorzugte Moose sind Physcomitrella patens oder weitere in Kryptogamen, Bd.2, Moose, Farne, 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515), beschriebene Moose.
Innerhalb der Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystes, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema und Nostoc, besonders bevorzugt Synechocystis oder Anabena bevorzugt.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Schizosaccheromyces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1 ,2 (1995) beschriebene Pilze.
Bevorzugte Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola; Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika; Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula; Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini, oder Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe oder verschiedene Baum-, Nuss- und Weinspecies.
Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet wie beispielsweise C. elegans.
Bevorzugt ist auch die Verwendung von Expressionsystemen und Vektoren, die öffentlich zugänglich oder kommerziell erhältich sind. Zur Verwendung in E. coli Bakterien sind die typischen vorteilhaften, kommerziell erhältlichen Fusions- und Expressionsvektoren pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A, die pTrc-Vektoren (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) der "pKK233-2" von CLONTECH, Palo Alto, CA und die "pET"-, und die "pBAD'-Vektor-Serien von Stratagene, La Jolla zu nennen.
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), PJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES-Derivate, pGAPZ- Derivate, pPICZ-Derivate sowie die Vektoren des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf9, Sf21 oder Hi5 Zellen, welche über rekombinante Baculoviren infiziert werden. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31- 39). Weiterhin genannt seien die Baculovirus Expressionssysteme "MaxBac2.0 Kit" und "Insect Select System" von Invitrogen, Calsbald oder "BacPAK Baculovirus Expressionssystem" von CLONTECH, Palo Alto, CA. Insektenzellen eignen sich in besonderer Weise zur Überexpression eukaryontischer Proteine, da sie posttranslationale Modifikationen der Proteine durchführen, die in Bakterien und Hefen nicht möglich sind. Die Handhabung von Insektenzellen in Zellkultur sowie ihre Infektion zur Expression von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und können in Analogie zu bekannten Methoden erfolgen (Luckow und Summers, Bio/Tech. 6, 1988, pp.47-55; Glover and Hames (eds) in DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205-244).
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich wie obenstehend erwähnt in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol.20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Die transgenen Organismen, welche pflanzliche Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der Aktivität der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes enthaltend:
i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder
ii. eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
iii. funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 89% zu der SEQ ID NO:1 ;
beinhalten, werden im Rahmen dervoriiegenden Erfindung beansprucht.
Sämtliche, oben beschriebenen Ausführungsformen der transgenen Organismen, welche GDC oder eine mindestens eine Nukleinsäuresequenz codierend für P-GDC, L- GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt P-GDC enthalten, werden unter dem Begriff "erfindungsgemäßer transgener Organismus" zusammengefasst. Ein weiterer Gegenstand der voriiegenden Erfindung ist die Verwendung von GDC, P- GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC in einem Verfahren zur Identifizierung von Testverbindungen mit herbizider Wirkung.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung die folgenden Schritte:
i. Inkontaktbringen des Glycin Decarboxylase Komplexes oder einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung derTestverbindung(en) an den Glycin Decarboxylase Komplex erlauben; und
ii. Nachweis, ob die Testverbindung an den Glycin Decarboxylase Komplex oder an eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes aus i) bindet; oder
iii. Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität des Glycin Decarboxylase Komplexes oder die einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes aus i) reduziert oder blockiert; oder
iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression des Glycin Decarboxylase Komplexes die einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes aus i) reduziert oder blockiert.
Unter dem Begriff "reduziert" ist eine Verringerung der Aktivität im Vergleich zur Aktivität des nicht mit einer Testverbindung inkubierten Glycin Decarboxylase Komplexes bzw. einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes von mindestens 10 %, vorteilhaft mindestens 20 %, bevorzugt mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 % und ganz besonders bevorzugt um mindestens 80 %, 90% oder 95% zu verstehen, unter demBegriff "blockiert" die gänzliche, das heißt 100 %ige Blockierung der Aktivität, wobei die vorstehend genannten prozentualen Verringerungen bei einer Inhibitor von weniger alsl 0"4M, bevorzug weniger als 10-5M, besonders bevorzugt weniger alsl 0_6M und ganz besonders bevorzugt von weniger als 10-7M. Im vorstehend genanten Verfahren werden vorzugsweise GDC, P-GDC, L-GDC, T- GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC verwendet.
Der Nachweis gemäß Schritt (ii) des oben stehenden Verfahrens kann anhand von Techniken, welche die Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand aufzeigen, erfolgen. Hierbei kann entweder die Testverbindung oder das Enzym eine detektierbare Markierung enthalten, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope, chemilumineszierende oder enzymatische Markierung. Beispiele für enzymatische Markierungen sind Meerrettich Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Luziferase. Die anschließende Detektion richtet sich nach der Markierung und ist dem Fachmann bekannt.
Hierbei sind insbesondere fünf bevorzugte Ausführungsformen zu nennen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch für Hochdurchsatzmethoden (High Troughput Screening, HTS) geeignet sind:
1. Über Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994) 11753-11575) läßt sich die durchschnittliche Diffusionsrate eines Fluoreszenzmoleküls in Abhängigkeit zur Masse in einem kleinen Probenvolumen bestimmen. Durch Messen der Massenänderung bzw. der daraus resultierenden veränderten Diffunsionsrate einer Testverbindung beim Binden an die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt die GDC oder P-GDC läßt sich FCS zur Bestimmung von Protein-Ligand- Wechselwirkungen einsetzten. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren so konzipiert sein, dass eine durch ein Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch weitere Testverbindungen verdrängt wird ("Verdrängungsassay").
2. Die Fluoreszenzpolarisation nutzt die Eigenschaft eines mit polarisiertem Licht angeregten ruhenden Fluorophors ebenfalls wieder polarisiertes Licht zu emittieren. Kann der Fluorophor allerdings während des angeregten Zustande rotieren, so geht die Polarisation des emittierten Fluoreszenzlichts mehr oder weniger verloren. Bei sonst gleichen Bedingungen (z.B. Temperatur, Viskosität, Lösungsmittel) ist die Rotation eine Funktion der Molekülgröße, womit man über das Messsignal eine Aussage über die Größe des am Fluorophor gebundenen Rests treffen kann (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300). Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung an die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt die GDC oder P-GDC aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein.
3. Fluoreszenz-Resonanz Energie Tranfer" (FRET) basiert auf der strahlungslosen Energieübertragung zwischen zwei räumlich benachbarten Fluoreszenzmolekülen unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung ist die Überlappung des Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des Akzeptormoleküls. Durch Fluoreszenzmarkierung GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC und den auf Bindung Tetsverbindung kann mittels FRET die Bindung gemessen werden (Cytometry 34, 1998, pp. 159-179). Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein. Eine besonders geeignete Ausführungsform der FRET Technologie ist die "Homogenous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), wie sie von Packard BioScience vertrieben wird.
4. Surface Enhanced-Laser Desorption/Ionisation (SELDI) in Kombination mit einem "Time of Flight" Massenspektrometer (MALDI-TOF) ermöglicht die schnelle Analyse von Molekülen auf einem Träger und kann zur Analyse von Protein-Ligand Wechselwirkungen verwendet werden (Worral et al., (1998) Anal. Biochem. 70:750-756). In einer bevorzugten Ausführungsform immobilisiert man nun die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt die GDC oder P- GDC auf einem geeigneten Träger und inkubiert diesen mit der Testverbindung. Nach einem oder mehreren geeigneten Waschschritten kann man die an die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt die GDC oder P-GDC zusätzlich gebundenen Moleküle der Testverbindung mittels der oben erwähnten Methodik detektieren und somit an die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H- GDC, bevorzugt an die GDC oder P-GDC gebundene Testverbindungen selektieren. 5. Die Messung von Oberflächen Plasmonenresonanz basiert auf der Änderung des Brechnungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer Testverbindung an ein auf besagter Oberfläche immobilisierten Protein. Da die Änderung des Brechungsindex für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, kann diese Methode prinzipiell auf jedes Protein angewendet werden (Lindberg etal. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). Die Messung kann beipielsweise mit Hilfe der von Biacore (Freiburg) vertriebenen auf Oberflächen-Plasmonenresonanz basierenden Analyseautomaten in einem Durchsatz von derzeit bis zu 384 Proben pro Tag durchgeführt werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer Testverbindung an die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt an die GDC oder P-GDC aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays" konzipiert sein.
Die über die oben genannten Verfahren 1 bis 5 identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein. Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Substanzen können anschließend in einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ihre herbizide Wirkung überprüft werden.
Auch besteht die Möglichkeit, über Aufklärung der dreidimensionalen Struktur GDC, P- GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC mittels Röntgenstrukturanalyse weitere potentielle herbizide Wirkstoffe mittels "Molecular Modelling" zu detektieren. Die Herstellung von für die Röntgenstrukturanalyse benötigten Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen dieser Messungen, die Detektion einer Bindungstelle im Protein sowie die Vorhersage möglicher Inhibitorstrukturen sind dem Fachmann bekannt. Über "Molecular Modelling" ist prinzipiell auch eine Optimierung der über die oben genannten Verfahren identifizierten Verbindungen möglich.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und ii) basiert, besteht darin, daß eine Testverbindung selektiert wird, welche die enzymatische Aktivität von GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten GDC, P-GDC, L- GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P- GDC mit der Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten GDC, P-GDC, L- GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P- GDC verglichen wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform des auf den Schritten i) und ii) basierenden Verfahrens besteht darin, dass
i. GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC in einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC enthält, kultiviert wird;
ii. die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt die GDC oder P-GDC aus Schritt i) im Zellaufschluss des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und
iii. eine Verbindung selektiert wird, welche die Aktivität des/der, P-GDC, L-GDC, T- GDC oder H-GDC, bevorzugt der GDC oder P-GDC reduziert oder blockiert.
Hierbei kann im Schritt iii. zur Ermittlung der Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC mit der Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC verglichen werden.
Die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC enthaltende Lösung kann aus dem Lysat des ursprünglichen Organismus bestehen. Alternativ kann die GDC, P-GDC, L-GDC, T- GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC enthaltende Lösung kann aus dem Lysat des transgenen, mit einer erfindungsgemäßen Expressionskasette transformierten Organismus bestehen. Falls erforderlich kann die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC partiell oder vollständig über gängige Methoden aufgereinigt werden. Eine allgemeine Übersicht über gängige Techniken zur Reinigung von Proteinen sind beispielsweise in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0- 87969-309-6 beschrieben. Bei rekombinanter Darstellung kann eine Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Proteins über nach dem Fachmann bekannten Affinitätschromoatographie erfolgen.
Die für in vitro Verfahren benötigte GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC kann somit entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus oder aus einem Organismus, der GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H- GDC enthält, isoliert werden, zum Beispiel aus einer Pflanze. So kann beispielsweise der Glycin Decarboxylase Komplexes aus Präparationen pflanzlicher Mitochondrien oder mitochondrialer Matrix-Extrakte isoliert werden z.B. aus Ebsenblättem (Sarojini und Oliver 1983, Plant Physiology 72, S. 194ff.) oder aus Spinatblättern (Douce et al. 1977, Plant Physiology 60, S. 625ff.).
Zur Identifizierung von herbiziden Verbindungen wird nun die GDC, P-GDC, L-GDC, T- GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC mit einer Testverbindung inkubiert. Nach einer Reaktionszeit wird die enzymatische Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H- GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC mit der enzymatischen Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC ermittelt. Bei Inhibition der GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC beobachtet man eine signifikante Abnahme der Aktivität im Vergleich zur Aktivität des nicht inhibierten erfindungsgemäßen Polypeptides, wobei eine Abnahme von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% bis hin zu einer 100% Reduktion (Blockierung) erzielt wird. Bevorzugt , mindestens 50% Hemmung bei Konzentrationen der Testverbindung von 10-4 M, bevorzugt bei 10-5 M, besonders bevorzugt von 10-6 M bezogen auf Enzymkonzentration im mikromolaren Bereich. Die Bestimmung der Aktivität von GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC kann beispielsweise über einen Aktivitätstest erfolgen, in welchem die Zunahme des Produktes, die Abnahme des Substrates (oder Eduktes) bzw. die Ab-oder Zuname des Cofaktors oder über eine Kombination aus mindestens zwei der vorstehend genannten Parameter in Abhängigkeit einer definierten Zeitspanne bestimmt werden.
Die für den Aktivitätstest einzusetzenden Mengen an Substrat können zwischen 0.5- 100 mM und Mengen an Cofaktor zwischen 0.1-5 mM bezogen auf 1 -100 μg/ml Enzym liegen.
Beispiele für geeignete Substrate für die Bestimmung der Aktivität der GDC sind z.B. Glycin, Beispiele für geeignete Cofaktoren NAD+, Tetrahydrofolat, Pyridoxalphosphat, FAD.
Die Aktivität der Untereinheit P-GDC kann unabhängig von den weiteren Untereinheiten der GDC, L-GDC, H-GDC und T-GDC bestimmt werden. Dies gilt auch für die Untereinheit L-GDC.
Die Identifizierung eines Inhibitors, welcher nur die P oder L-GDC hemmt, kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass zum einen die Aktivität der GDC in Anwesenheit einer Testverbindung bestimmt wird. Bei erfolgreicher Selektion eines Inhibitors kann die Aktivität der P-GDC (bzw. L-GDC) in Gegenwart des selektierten Inhibitors im Anschluss überprüft werden.
Beispiele für geeignete Substrate für die P-GDC sind z.B. Glycin, C02 oder Liponsäure, ein Beispiel für einen geeigneten Cofaktor ist Pyridoxalphosphat
Beispiele für geeignete Substrate für die L-GDC sind z.B. NAD+, Dihydroliponsäure, H- Protein-2-Dihydroliponsäure, als Cofaktor FAD.
Die Aktivität der Untereinheit H-GDC kann in Kopplung mit der Aktivität der Untereinheit L-GDC bestimmt werden.
Beispiele für geeignete Cofaktoren der H-GDC sind z.B. Liponsäure . Des weiteren kann die Bestimmung der Aktivität der P-GDC, L-GDC und H-GDC gemeinsam in einem Assay erfolgen.
Die Aktivität der Untereinheit T-GDC kann in der GDC Gesamtreaktion gemeinsam mit der Aktivität der Untereinheiten P-GDC, L-GDC und H-GDC bestimmt werden. Die Identifizierung eines Inhibitors, welcher nur die T-GDC hemmt wird, kann beispielsweise dadurch erfolgend, dass zum einen die Aktivität der GDC in Anwesenheit einer Testverbindung bestimmt wird und zum anderen die Aktivität der P- GDC, L-GDC und H-GDC in Gegenwart der gleichen Testverbindung bestimmt wird. Wenn der Vergleich der Aktivität der GDC in Anwesenheit der Testverbindung mit der Aktivität der P-GDC, L-GDC und H-GDC in Gegenwart der gleichen Testverbindung zeigt, dass die Aktivität der P-GDC, L-GDC und H-GDC nicht beeinflusst wird, jedoch die Aktivität der GDC, handelt es sich bei der Testverbindung um einen Inhibitor der T- GDC.
Beispiele für geeignete Substrate und Cofaktoren sind oben erwähnt.
Gegebenenfalls können auch Derivate der vorstehend genannten Verbindungen verwendet werden, die eine detektierbare Markierung enthalten, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope oder chemilumineszierende Markierung.
So kann die Bestimmung der Aktivität von GDC in Schritt iii) des oben genannten Verfahrens photometrisch über die Reduktion von NAD+ zu NADH in Anwesenheit von Glycin und Tetrahydrofolat photometrisch erfolgen wie z.B. nach Bourguignon et al (Biochemical Journal (1988) 255, S. 169ff.). Dieser Assay kann in Mikrotiterplatten durchgeführt werden und ist für das Hochdurchsatzscreening geeignet.
Es ist weiterhin möglich, die Aktivität durch Kopplung der über GDC katalysierten Reaktion Reaktion mit einem Farbreagenz zu bestimmen, wie z.B. 2,6-Dichlorphenol- Indophenol oder 5,5'-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure).
So kann für die Bestimmung der gemeinsamen Aktivität von P-GDC, L-GDC und H- GDC der Umsatz von Glycin photometrisch anhand der gekoppelten Reduktion von 2,6-Dichlorphenol-lndophenol verfolgt werden. Ein geeignetes Verfahren ist hier z.B. in Moore et al. (1980, FEBS Letters 115, S.54ff.) beschrieben. Die gemeinsame Aktivität des H- und L-Proteins des GDC kann ebenfalls photometrisch, wie bei Neuburger etal. beschrieben (1991, Biochemical Journal 278, S. 765ff.) durch Kopplung an die Reduktion von 5,5'-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) bestimmt werden. Die Bestimmung der Aktivität des P-Proteins kann nach Higara und Kiguchi durchgeführt werden (Journal of Biological Chemistry 1980, 255, S. 11664-11670).
L-Proteinaktivität lässt sich in Anwesenheit von NAD+ und freier Liponsäure photometrische nachweisen (wie z.B. in Moran et al., Plant Physiology 2002, 128, S. 300-313 beschrieben)
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und iii) basiert, besteht aus den folgenden Schritten:
i. Herstellung eines transgenen Organismus enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kodierend für P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt P-GDC, in welchem P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H- GDC, bevorzugt P-GDC, überexprimiert wird
ii. Aufbringen einer Testverbindung auf den transgenen Organismus nach i) und auf einen nicht-transgenen Organismus des gleichen Genotyps;
iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der Aufbringung der Testverbindung; und
iv. Selektion von Testverbindungen, die ein vermindertes Wachstum oder eingeschränkte Überlebensfähigkeit des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organismus bewirken.
Hierbei beträgt der Wachstumsunterschied der in Schritt iv) zur Selektion eines
Inhibitors mit herbizider Wirkung mindestens 10%, vorzugsweise 20%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 40% und ganz besonders bevorzugt 50%.
Unter dem Begriff des transgenen Organismus sind die oben genannten erfindungsgemäßen transgenen Organismen zu verstehen. Ein transgener Organismus, in welchem GDC oder P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H- GDC, bevorzugt P-GDC, überexprimiert wird, der für das oben genannte Verfahren geeignet ist, kann auch alternativ dadurch hergestellt werden, dass die Überexpression von GDC oder P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt P-GDC durch Manipulation der im Organismus natürlich vorhandenen Promotorsequenzen bewerkstelligt wird. Derartige Methoden sind dem Fachmann bekannt.
Der transgene Organismus ist hierbei vorzugsweise eine Pflanze, Alge, ein Cyanobakterium z.B. der Gattung Synechocystes oder ein Proteobakterium wie etwa Magnetococcus sp. MC1 , bevorzugt Pflanzen, die sich mittels gängiger Techniken transformieren lassen, wie Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Nicotiana Tabacum, Cyanobakterien die sich leicht transformieren lassen, wie z.B. Synechocystis, in welchen die für ein erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Sequenz über Transformation inkorporiert wurde. Diese transgenen Organismen weisen daher eine erhöhte Toleranz gegen Verbindungen auf, welche das erfindungsgemäße Polypeptid inhibieren. Hierbei können auch "knock-out"-Mutanten verwendet werden, bei denen das in diesem Organismus natürlich vorhandene analoge Gen(e) für GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC gezielt ausgeschaltet worden ist.
Die vorstehend genannte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedoch auch zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer Wirkung verwendet werden. Hierbei wird als transgener Organismus eine Pflanze eingesetzt. Das Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer Wirkung umfasst somit die folgenden Schritte:
i. Herstellung einer transgenen Pflanze enthaltend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt P-GDC, in welcher P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt P-GDC, überexprimiert wird
ii. Aufbringen einer Testsubstanz auf die transgene Pflanze nach i) und auf eine nicht-transgene Pflanze der gleichen Sorte;
iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit dertransgenen und der nicht transgenen Pflanze nach dem Aufbringen der Testsubstanz; und iv. Selektion von Testsubstanzen, die ein verändertes Wachstum der nicht- transgenen Pflanze bewirken verglichen mit dem Wachstum der transgenen Pflanze.
Hierbei werden in Schritt iv) Testverbindungen selektiert, die ein verändertes
Wachstum des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organmismus bewirken. Unter verändertem Wachstum ist hierbei eine Hemmung des vegetativen Wachstums der Pflanzen zu verstehen, was sich insbesondere in einer Reduzierung des Längenwachstums äußeren kann. Die behandelten Pflanzen weisen demgemäß einen gedrungenen Wuchs auf; außerdem ist eine dunklere Blattfärbung zu beobachten. Weiterhin ist unter verändertem Wachstum auch eine zeitliche Veränderung des Reifeverlaufs, eine Heummung oder Vermehrungen seitlicher Verzweigungen der Pflanzen, eine Verkürzung bzw. Verlängerung der Entwicklungsstadien, eine Erhöhung der Standfestigkeit, das Wachstum größerer Mengen an Knospen, Blüten, Blättern, Früchten, Samenkörnern, Wurzeln und Knollen, eine Erhöhung des Zuckergehaltes in Pflanzen wie Zuckerrüben, Zuckerrohr sowie Zitrusfrüchten, des Proteingehaltes in Pflanzen wie Getreide oder Soja oder eine Stimulierung des Latexfluß an Gummibäumen zu verstehen. Die Detektion dieses veränderten Wachstums ist dem Fachmann bekannt.
Auch hier kann alternativ die transgene Pflanze, in welcher GDC oder P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt P-GDC, überexprimiert wird, alternativ dadurch hergestellt werden, dass die Überexpression der P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt P-GDC durch Manipulation der in der Pflanze natürlich vorhandenen Promotorsequenzen bewerkstelligt wird. Derartige Methoden sind dem Fachmann bekannt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch mehrere Testverbindungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Wenn durch eine Gruppe von Testverbindungen eine Beeinflussung des Targets erfolgt, dann ist es entweder möglich, die einzelnen Testverbindungen direkt zu isolieren oder die Gruppe von Testverbindungen in verschiedene Untergruppen zu teilen, z.B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Testverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren wiederholt man dann mit der einzelnen Testverbindung oder der entsprechenden Untergruppe von Testverbindungen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Untergruppe nur noch eine geringe Anzahl von Testverbindungen oder nur noch eine Testverbindung umfaßt.
Alle oben beschriebenen Verfahren für die Identifizierung von Inhibitoren mit herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung werden im folgenden als "erfindungsgemäßes Verfahren" bezeichnet. Hierbei steht der "erfindungsgemäßes Verfahren" vorzugsweise für die oben beschriebenen Verfahren für die Identifizierung von Inhibitoren mit herbizider Wirkung.
Sämtliche, über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen können anschließend auf ihre herbizide oder wachstumsregulatorische Wirkung in vivo überprüft werden. Eine Möglichkeit zur Prüfung der Verbindungen auf herbizide Wirkung ist die Verwendung der Wasserlinse Lemna minor in Mikrotiterplatten. Als Parameter können Veränderungen des Chlorophyllgehalts und die Photosyntheseleistung gemessen werden. Es ist auch möglich, die Verbindung auf unerwünschte Pflanzen direkt zu applizieren, wobei die herbizide Wirkung z.B. über eingeschränktes Wachstum festgestellt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch vorteilhaft in Hochdurchsatzverfahren, sog. HTS durchgeführt werden, welches das parallele Testen einer Vielzahl verschiedener Verbindungen ermöglicht.
Im HTS bietet sich für die praktische Durchführung die Verwendung von Trägern an, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, einen oder mehrere die erfingungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthaltenden Vektoren, einen oder mehrere transgene Organismen, welche mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten oder eines oder mehrere (Poly)peptide codiert über die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten. Der verwendete Träger kann fest oder flüssig sein, ist bevorzugt fest, besonders bevorzugt eine Mikrotiterplatte. Die vorstehend genannten Träger sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Gemäß der am weit verbreitesten Technik werden 96-well, 384-well und 1536 well Mikrotiterplatten verwendet, die in der Regel Volumina von 200μl umfassen können. Neben den Mikrotiterplatten sind die weiteren Bestandteile eines HTS-Systems passend zu den entsprechenden Mikrotiterplatten wie viele Instrumente, Materialien, automatische Pipettiervorichtungen, Robotoren, automatisierte Plattenleser sowie Plattenwascher kommerziell erhältlich.
Neben den auf Mikrotiterplatten basierenden HTS-Verfahren können auch sogenannte "free format assays" oder Testsysteme, die zwischen den Proben keine physischen Barrieren aufweisen, verwendet werden wie z.B. in Jayaickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 19 (1994) 161418; Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libaries, First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995); Salmon et al., Molecular Diversity 2 (1996), 5763 und US 5,976,813.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen mit herbizider Wirkung identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren. Diese Verbindungen werden im folgenden "selektierte Verbindungen" genannt. Sie weisen ein Molekulargewicht von kleiner als 1000 g/mol, vorteilhaft kleiner 500 g/mol, bevorzugt kleiner 400 g/mol, besonders bevorzugt kleiner 300 g/mol. Verbindungen mit herbizider Wirkung weisen einem Ki-Wert kleiner 1 mM, bevorzugt kleiner 1 μM, besonders bevorzugt kleiner 0,1 μM ganz besonders bevorzugt kleiner 0,01 μM aufweisen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen mit wachstumsregulatorsicher Wirkung identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren. Auch diese Verbindungen werden im folgenden "selektierte Verbindungen" genannt. Der Begriff "selektierte Verbindungen" steht jedoch vorzugsweise für Verbindungen mit herbizider Wirkung.
Die selektierte Verbindungen können natürlich auch in Form ihrer landwirtschaft brauchbaren Salze vorliegen. Unter landwirtschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen Kationen oder die Säureadditionssalze derjenigen Säuren in Betracht, deren Kationen beziehungsweise Anionen die herbizide Wirkung der über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen mit herbizider Wirkung nicht negativ beeinträchtigen.
Ferner können die selektierten Verbindungen sofern sie asymmetrisch substituierte - Kohlenstoffatome enthalten, entweder als Racemate, Enantiomerengemische, reine Enantiomere oder, sofern sie chirale Substituenten aufweisen, auch als Diastereomerengemische vorliegen.
Die selektierten Verbindungen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z.B. in Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17. Die selektierte Verbindungen können auch aus umfangreichen Substanzbibliotheken stammen.
Mögliche Testverbindungen können Expressionsbibliotheken wie z.B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches sein (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen).
Die selektierte Verbindungen können zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs und/oder als Wachstumsregulatoren verwendet werden. Herbizide Zusammensetzungen, welche die selektierten Verbindungen enthalten, bekämpfen Pflanzenwuchs auf Nichtkulturflächen sehr gut. In Kulturen wie Weizen, Reis, Mais, Soja und Baumwolle wirken sie gegen Unkräuter und Schadgräser, ohne die Kulturpflanzen nennenswert zu schädigen. Dieser Effekt tritt vor allem bei niedrigen Aufwandmengen auf. Die selektierten Verbindungen können zur Bekämpfung der oben bereits erwähnten Schadpflanzen verwendet werden.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können selektierten Verbindungen bzw. diese enthaltende herbizide Zusammensetzungen vorteilhaft noch in einer weiteren Zahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung unerwünschter Pflanzen eingesetzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgäre, Humulus lupuius, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec, Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec, Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec, Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgäre), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.
Darüber hinaus können die selektierten Verbindungen auch in Kulturen, die durch Züchtung einschließlich gentechnischer Methoden gegen die Wirkung von Herbiziden tolerant sind, verwandt werden. Die Herstellung dieser Kulturen wird weiter unten beschrieben.
Weiter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der oben bereits erwähnten herbiziden oderwachstumsregulatorischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man selektierten Verbindungen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln formuliert.
Die selektierten Verbindungen können z.B. in Form von direkt versprühbaren wässrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, emulgierbaren Konzentraten, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten formuliert werden und durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken und der Natur der selektierten Verbindungen und sollte in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der selektierten Verbindungen gewährleisten. Die herbiziden Zusammensetzung enthalten eine herbizid wirksame Menge mindestens einer selektierten Verbindung und für die Formulierung von herbiziden Zusammensetzungen übliche Hilfsstoffe.
Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wässrigen oder ölhaltigen Formulierungen sowie dispergierbaren Konzentraten (DC) können die selektierten Verbindungen in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst oder dispergiert werden, wobei weitere Formulierungshilfsstoffe zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus selektierter Verbindung, gegebenenfalls Lösungsmitteln oder Öl sowie optional weiteren Hilfsmitteln bestehende flüssige oder feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind. Hier zu nennen sind emulgierbare Konzentrate (EC, EW), Suspensionen (SC), lösliche Konzentrate (SL), dispergierbaren Konzentrate (DC), Pasten, Pastillen netzbaren Pulvern oder Granulaten, wobei die festen Formulierungen entweder in Wasser löslich (soluble) oder dispergierbar (wettable) sein können. Desweiteren können entsprechende Pulver bzw. Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den Abrieb oder eine vorzeitige Wirkstofffreisetzung verhinderenden Überzug ("coating") versehen werden.
Prinzipiell sind unter dem Begriff "Hilfsmittel" folgende Verbindungsklassen zu verstehen: Antischäumungsmittel, Verdicker, Netzmittel, Haftmittel, Dispergiermittel, Emulgiermittel, Bakterizide und/oder thixotrophe Agentien. Die Bedeutung der oben genannten Mittel ist dem Fachmann bekannt.
SLs, EWs und ECs können durch einfaches Mischen der entsprechenden Inhaltsstoffe hergestellt werden, Pulver über Mischen oder Vermählen in speziellen Mühlentypen (z.Bsp. Hammermühlen). DC, SCs und SEs werden üblicherweise über Naßvermahlung ("wet milling") hergestellt, wobei ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organischen Phase, die weitere Hilfsmittel oder selektierte Verbindungen enthalten kann, hergestellt werden kann. Die Herstellung ist bekannt. Pulver-, Streu- und Stäubemittel können vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermählen der wirksamen Substanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden. Granulate, z.B. Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der selektierten Verbindungen an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Weitere Details der Herstellung sind dem Fachmann bekannt, und z.Bsp. in folgenden Schriften aufgeführt: US 3,060,084, EP-A 707445 (für flüssige Konzentrate), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 und ff. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701 , US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961 , Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 und Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Federal Republic of Germany), 2001. Inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.Bsp. flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe; z.B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z.B. Amine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser.
Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nußschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe.
Oberflächenaktive Stoffe (Tenside) geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.Bsp. Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z.B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der
Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglykolether.Alkylarylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalkoholethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Laurylalkoholpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfitablaugen oder Methylcellulose.
Die Applikation der herbiziden Zusammensetzungen bzw. der selektierten Verbindungen kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind die selektierten Verbindungen für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Ausbringungstechniken angewandt werden, bei welchen die selektierten Verbindungen mit Hilfe der Spritzgeräte so gespritzt werden, daß die Blätter der empfindlichen Kulturpflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die selektierten Verbindungen auf die Blätter darunter wachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen (post-directed, lay-by).
Die Aufwandmengen an selektierten Verbindungen betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0.001 bis 3.0, vorzugsweise 0.01 bis 1.0 kg/ha.
Die Bereitstellung des herbiziden Targets ermöglicht weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung einer Glycin Decarboxylase Komplexes oder einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Kompleses , welche nicht oder nur eingeschränkt durch ein Herbizid, welches als Wirkort die GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC hat, z.B. die herbizid wirkenden selektierten Verbindungen, gehemmt wird. Im folgenden wird ein sich derart von der GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC unterscheidendes Protein als GDC -Variante bezeichnet, welches durch eine Nukleinsäuresequenz codiert wird, welche
i) für ein Polypeptid mit der Aktivität von GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H- GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC kodiert, welche durch nach den oben genannten Verfahren ermittelte Substanzen mit herbizider Wirkung, welche GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC inhibieren, nicht inhibiert wird; und
ii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:3, das eine Identität mit der SEQ ID NO:3 von mindestens 59% aufweist; umfasst; und/oder
iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:5, das eine Identität mit der SEQ ID NO:5 von mindestens 69% aufweist, umfasst; und/oder
iv) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:7, das eine Identität mit der SEQ ID NO:7 von mindestens 68% aufweist, umfasst; und/oder v) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:9, das eine Identität mit der SEQ ID NO:9 von mindestens 64% aufweist, umfasst.
Funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:3 gemäß ii) weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:3 von mindestens 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65% oder 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.
Funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:5 gemäß iii) weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:5 von mindestens 69% vorzugsweise mindestens, 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.
Funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:7 gemäß iv) weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:7 von mindestens 68% oder 69% vorzugsweise mindestens 70%, 71 %, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.
Funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO:9 gemäß v) weisen eine Homologie mit der SEQ ID No:9 von mindestens 64%, 65% oder 66% vorzugsweise mindestens 67%,
68%, 69%, 70%, 71%, 72% oder 73% vorzugsweise mindestens 74%, 75%, 76%,
77%, 78%, 79% oder 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,
87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93% besonders bevorzugt mindestens
94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.
Sämtliche oben genannten Nukleinsäuresequenzen stammen vorzugsweise aus einer
Pflanze.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das oben genannte Verfahren zur Er- zeugung von Nukleinsäuresequenzen codierend für GDC-Varianten von Nukleinsäuresequenzen umfassen aus folgenden Schritten: a) Expression der von den oben genannten Nukleinsäuren kodierten Proteine in einem heterologen System oder in einem zellfreien System;
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure;
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid;
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen;
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides;
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.
Die nach dem oben beschriebenen Verfahren nach ausgewählten Sequenzen werden vorteilhaft in einen Organismus eingebracht. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsge- genstand ein nach diesem Verfahren hergestellter Organismus. Bevorzugt ist der
Organismus eine Pflanze, besonders bevorzugt eine der oben definierten Kulturpflanzen.
Anschließend erfolgt die Regeneration ganzer Pflanzen und Überprüfung der Resis- tenz gegenüber der selektierten Verbindung in intakten Pflanzen.
Veränderte Proteine und/oder Nukleinsäuren, die in Pflanzen Resistenz gegen die selektierten Verbindungen vermitteln können, können aus den oben genannten Nukleinsäuresequenzen auch über die sogenannte "site directed mutagenesis" hergestellt werden, durch diese Mutagenese kann beispielsweise die Stabilität und/oder Aktivität des Target Proteins oder die Eigenschaften wie Bindung und Wirkung der oben genannten erfindungsgemäßen Inhibitoren sehr gezielt verbessern bzw. verändert werden. Beispielsweise wurde von Zhu et al. (Nature Biotech., Vol. 18, May 2000: 555 - 558) eine "site directed mutagenesis"-Methode in Pflanzen beschrieben, die vorteilhaft verwendet werden kann.
Weiterhin können Veränderungen über die von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21 , No. 3, 1993: 777- 78) beschriebenen PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese erzielt werden oder durch die von Rellos et al. (Protein Expr. Purif., 5, 1994 : 270-277) weiter verbessert Methode.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung dieser veränderten Proteine und/oder von Nukleinsäuren ist eine von Stemmer et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 91 , 1994: 10747-10751 ) beschriebene "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution oder die von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) beschriebene Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode.
Ein weiterer Weg zur Mutagenese von Proteinen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (Vol. 57, 1996: 375-385) beschrieben. In EP-A-0 909 821 wird eine Methode zur Veränderung von Proteinen unter Verwendung des Mikroorganismus E. coli XL-1 Red beschrieben. Dieser Mikroorganismus erzeugt bei der Replikation Mutan- tionen in den eingeführten Nukleinsäuren und führt so zu einer Veränderung der genetischen Information. Über Isolierung der veränderten Nukleinsäuren bzw. der veränderten Proteine und Testung auf Resistenz lassen sich leicht vorteilhafte Nukleinsäuren und die durch sie kodierten Proteine identifizieren. Diese können dann nach Einbringen in Pflanzen dort die Resistenz ausprägen und so zur Resistenz gegen die Herbizide führen.
Weitere Methoden der Mutagenese und Selektion sind beispielsweise Methoden wie die in vivo Mutagenese von Samen oder Pollen und Selektion resistenter Allele in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Inhibitoren, gefolgt von genetischer und moleku- larer Identifizierung des veränderten, resistenten Allels. Weiterhin die Mutagenese und Selektion von Resistenzen in der Zellkultur durch Vermehrung der Kultur in Anwesenheit von sukzessiv steigenden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Dabei kann die Erhöhung der spontanten Mutationsrate durch chemische/physikalische mutagene Behandlung ausgenutzt werden. Wie vorgehend be- schrieben lassen sich auch mit Mikroorgansimen, die eine endogene oder rekombinante Aktivität der durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codierten Proteine haben, und die gegenüber den erfindungsgemäß identifizierten Inhibitoren sensitiv sind, veränderte Gene isolieren. Die Anzucht der Mikroorganismen auf Medien mit steigenden Konzentration von erfindungsgemäßen Inhibitoren erlaubt die Selektion und Evolution von resistenten Varianten der erfindungsgemäßen Targets. Die Frequenz der Mutationen kann wiederum durch mutagene Behandlungen erhöht werden.
Daneben stehen Verfahren zur gezielten Veränderungen von Nukleinsäuren zur Verfügung (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 96, 8768 - 8773 und Beethem et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol 96, 8774 - 8778). Diese Methoden ermöglichen es, in den Proteinen solche Aminosäuren, die für die Bindung von Inhibitoren von Bedeutung sind, durch funktionell analoge Aminosäuren zu ersetzen, die jedoch die Bindung des Inhibitors verhindern.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist deshalb ein Verfahren zur Erstellung von Nukleinsäuresequenzen, welche für Genprodukte kodieren, die eine veränderte biologische Aktivität aufweisen, wobei die biologische Aktivität dahingegen verändert wurde, daß eine erhöhte Aktivität vorliegt. Unter erhöhter Aktivität ist eine gegenüber dem Ausgangsorganismus bzw. gegenüber dem Ausgangsgenprodukt um mindestens 10% , bevorzugt um mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 100% höhere Aktivität zu verstehen. Weiterhin kann die biologische Aktivität dahingegen verändert worden sein, daß die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel nicht mehr oder nicht mehr richtig an die Nukleinsäuresequenzen und/oder die durch sie kodierten Genprodukte binden. Unter nicht mehr oder nicht mehr richtig ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, daß die Substanzen um mindestens 30%, bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 80% oder gar nicht mehr an die veränderten Nukleinsäuren und/oder Genprodukte im Vergleich zum Ausgangsgenprodukt oder den Ausgangsnukleinsäuren binden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine transgene Pflanze, welche mit einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Genprodukt kodiert, das eine veränderte biologische Aktivität aufweist, oder mit einer Nukleinsäuresequenz codierend für eine GDC-Variante transformiert wurde. Verfahren zur Transformation sind dem Fachmann bekannt und beispielhaft weiter oben ausgeführt. Genetisch veränderten transgene Pflanzen, die gegen die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen und/oder Mittel enthaltend diese Substanzen resistent sind, können auch durch Transformation gefolgt von Überexpression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz erzeugt werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden wurden, resistent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen Nukleinsäuren codierend für eine GDC, P-GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDCüberexprimiert werden. Ein ähnliches Verfahren wird beispielhaft in Lermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75 - 83 beschrieben.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung resistenter Pflanzen ermöglichen die Entwicklung neuer Herbizide, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung aufweisen (sog. Totaiherbizide), in Kombination mit der Entwicklung von gegenüber dem Totalherbizid resistenten Nutzpflanzen. Gegenüber Totalherbiziden resistente Nutzpflanzen sind bereits verschiedentlich beschrieben worden. Dabei können mehrere Prinzipien zur Erzielung einer Resistenz unterschieden werden:
a) Resistenzerzeugung in einer Pflanze über Mutationsverfahren oder gentechnische Verfahren, indem das als Zielort für das Herbizid dienende Protein deutlich überproduziert wird und indem auf Grund des großen Überschusses des als Zielort für das Herbizid dienende Protein, die von diesem Protein in der Zelle ausgeübte Funktion auch nach Applikation des Herbizides beibehalten wird.
b) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß eine modifizierte Version des als Zielort des Herbizid fungierenden Proteins eingeführt wird und daß das neu eingeführte modifizierte Protein vom Herbizid nicht in seiner Funktion beeinträchtigt wird.
c) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß ein neues Protein/ eine neue RNA eingeführt wird welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die für die herbizide Wirkung der niedermolekularen Substanz verantwortliche chemische Struktur des Proteins oder der Nukleinsäure wie der RNA oder der DNA so verändert wird, daß durch die veränderte Struktur keine herbizide Wirkung mehr entfaltet werden kann, daß heißt die Interaktion des Herbizids mit dem Zielort nicht mehr erfolgen kann.
d) das die Funktion des Targets durch ein neues in die Pflanze eingebrachtes Gen ersetzt wird, und so ein sogenannter "alternativer Pathway" geschaffen wird.
e) Das die Funktion des Targets durch ein anderes in der Pflanze vorhandenes Gen bzw. dessen Genprodukt übernommen wird.
Dem Fachmann sind alternative Verfahren zur Identifizierung von den homologen Nukleinsäuren beispielsweise in anderen Pflanzen mit ähnlichen Sequenzen wie beispielsweise unter Verwendung von Transposons, bekannt. Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch die Verwendung von alternativen Insertionsmutagenesever- fahren zur Insertion von fremder Nukleinsäuren in die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:3 in von diesen Sequenzen aufgrund des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen und/oder deren Derivate in anderen Pflanzen.
Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt mit einer der oben beschrieben Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Expressionskassette nach ebenfalls oben beschriebenen gängigen Transformationsmethoden.
Die Wirksamkeit der Expression dertransgen exprimierten GDC -Variante kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden.
Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des GDC, P-GDC, L-GDC, T- GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber Hemmstoffen der GDC, P- GDC, L-GDC, T-GDC oder H-GDC, bevorzugt GDC oder P-GDC, ganz besonders bevorzugt P-GDC an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefaßt werden sollten.
Beispiel 1 : Erzeugung einer cDNA-Bibliothek im Pflanzentransformationsvektor Zur Erzeugung einer cDNA-Bibliothek (im folgenden "binäre cDNA-Bank" genannt) in einem Vektor, der direkt für die Transformation von Pflanzen verwendet werden kann, wurde mRNA aus verschiedenen Pflanzengeweben isoliert und mit dem TimeSaver cDNA Synthese Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) in doppelsträngige cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit Tι2-ιβ Oligonucleotiden nach Herstellerangaben durchgeführt. Nach Größenfraktionierung und Ligation von EcoRI- Notl-Adaptern nach Herstellerangaben und Auffüllen der Überhänge mit Pfu DNA Polymerase (Stratagene) wurde die cDNA-Population normalisiert. Hierzu wurde die Methode nach Kohci et al, 1995, Plant Journal 8, 771 -776 vorgegangen, wobei die cDNA durch PCR mit dem Oligonukleotid N1 unter den in Tabelle 1 aufgeführten Bedingungen amplifiziert wurde.
Tabelle 1
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Das erhaltene PCR-Produkt wurde an die Säulenmatrix des PCR-Purification Kits (Qiagen, Hilden) gebunden und mit 300 mM NaP-Puffer, pH 7.0, 0.5 mM EDTA, 0.04% SDS eluiert. Die DNA wurde 5 Minuten im kochenden Wasserbad denaturiert und anschließend 24 Stunden bei 60°C renaturiert. 50μl der DNA wurden auf eine
Hydroxylapathitsäule aufgetragen und diese 3 Mal mit 1 ml 10 mM NaP-Puffer, pH 6.8 gewaschen. Die gebundene Einzelstrang-DNA wurde mit 130 mM NaP-Puffer, pH 6.8 eluiert, mit Ethanol gefällt und in 40μl Wasser gelöst. Hiervon wurden 20μl für eine weitere PCR-Amplifikation wie oben beschrieben verwendet. Nach einer weiteren Anreicherung von ssDNA wurde eine dritte PCR-Amplifikation wie oben beschrieben durchgeführt. Die Herstellung des Pflanzentransformationsvektors zur Aufnahme der wie oben beschrieben hergestellten cDNA-Population erfolgte über Restriktionsenzym-Verdau des Vektor pUC18 mit Sbfl und BamHI, Reinigung des Vektorfragment gefolgt von Auffüllen der Überhänge mit Pfu DNA Polymerase und Religation mit T4 DNA Ligase (Stratagene). Das so hergestellte Konstrukt wird im folgenden als pUC18Sbfl- bezeichnet.
Der Vektor pBinAR wurde zunächst mit Notl gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert, mit Sbfl gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert und im Anschluß mit EcoRI und Hindlll gespalten. Das resultierende Fragment wurde in ein Derivat des binären Pflanzentransformationsvektors pPZP (Hajdukiewicz.P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25:989-994) ligiert, der eine Transformation von Pflanzen mittels Agrobakterium ermöglich und eine Kanamycinresistenz in transgenen Pflanzen vermittelt, ligiert. Das hierbei erzeugte Konstrukt wird im folgenden als pSun12/35S bezeichnet.
pUC18Sbfl- wurde als Template für eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) mit den Oligonucleotiden V1 und V2 (siehe Tabelle 2) und Pfu DNA Polymerase eingesetzt. Das resultierende Fragment wurde in den mit Smal gespalten pSun12/35S ligiert, wodurch pSunblues2 erzeugt wurde. Nach Spaltung mit Notl, Dephosphorylierung mit Shrimp Alkalischer Phosphatase (Röche Diagnostics, Mannheim) und Aufreinigung des Vektorfragmentes wurde pSunblues2 mit der normalisierten und ebenfalls mit Notl gespaltenen cDNA Population ligiert. Nach Transformation in E.coli Xl-1blue (Stratagene) wurden die so erzeugte Klone in Mikrotiterplatten abgelegt. Die binäre cDNA-Bank enthält cDNAs in "Sense"- und in "Antisense"-Orientierung unter Kontrolle des Blumenkohlmosaikvirus 35s Promotors, die dementsprechend nach der
Transformation in Tabakpflanzen zu "Cosuppressions"- und "Antisene"-Effekten führen können.
Tabelle 2: Verwendete Oligonukleotide
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Beipiel 2: Transformation und Analyse von Tabakpflanzen
Ausgewählte Klone der binären cDNA-Bank wurden in Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 transformiert (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13(1984), 4777- 4788) und unter Streptomycin/Spectinomycin-Selektion inkubiert. Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN mit dem binären Klon Nt002002044_S2 wurde eine in YEB-Medium auf OD600 = 0.8-1.6 verdünnte Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie benutzt.
Blattscheiben steriler Pflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit der Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 2-tägige Inkubation in Dunkelheit bei 25oC auf Murashige-Skoog Medium (Physiol. Plant. 15(1962), 473) mit 2% Saccharose (2MS-Medium) mit 0,8 % Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50mg/l Kanamycin, 1mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2mg/l Naphtylessigsäure und 1 ,6g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprossen wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Regenerierte Sprossen wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten. Auf diese Weise wurden transgene Pflanzen der Linie E_0000010590 erzeugt.
Nach Transfer der Sprosse in Erde wurden die Pflanzen für 2-20 Wochen im Gewächshaus auf die Ausprägung von Phänotypen beobachtet. Dabei stellte sich heraus, dass transgene Pflanzen der Linie E_0000010590 ähnliche Phänotypen aufwiesen. Diese Pflanzen bleiben im Wachstum hinter Vergleichspflanzen zurück und weisen ausgeprägte flächige Blattchlorosen auf. Die Integration der cDNA der Klone in das Genom der transgenen Linien wurde über PCR mit den Oligonukleotiden G1 und G2 (s. Tab. 1 , Beispiel 1 ) und genomischer DNA der entsprechenden transgenen Linien nachgewiesen. Hierzu wurde vorzugsweise TAKARA Taq-DNA Polymerase nach Herstellerangaben (MoBiTec, Göttingen) eingestzt. Als Positivkontrolle diente der jeweils zur Transformation verwendete cDNA- Klon der binären cDNA-Bank als Template für eine PCR-Reaktion. PCR Produkte identischer Größe oder ggf. gleicher Spaltungsmuster, die nach Spaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, dienten als Nachweis der Integration der entsprechenden cDNA. Das Insert des Klones Nt002002044_S2 wurde auf diese Weise in den transgenen Pflanzen mit den oben genannten Phänotypen nachgewiesen.
Beispiel 3 Sequenzanalyse des Klone
Das cDNA-lnsert des Klons Nt002002044_S2, dessen Transformation in
Tabakpflanzen zu den oben genannten Phänotypen führte wurde sequenziert.
Die cDNA von Nt002002044_S2 (SEQ ID NO:1) weist eine Länge von 558 bp auf, und enthält ein offenes Leseraster von 414 bp, welches für ein Polypeptid von 138 Aminosäuren (SEQ ID NO:2) mit signifikanten Identitäten zur Untereinheit P des pflanzlichen Glycin Decarboxylase Komplexes codiert.
Die höchste Identität (88,2%) bestand zwischen der SEQ ID NO:1 und der für die Untereinheit P des pflanzlichen Glycin Decarboxylase Komplexes kodierenden Nukleinsäuresequenz aus Solanum tuberosum (Gen Bank Acc. No.: Z99770).
Die SEQ ID NO:1 codiert somit für den C-terminalen Teil eines P-Proteins.
Beispiel 4: Bereitstellung des Glycin Decarboxylase-Komplexes
Die Enzymaktivität des Glycin Decarboxylase-Komplexes kann aus Präparationen pflanzlicher Mitochondrien oder mitochondrialer Matrix-Extrakte gemessen werden, die z.B. aus Ebsenblättern (Sarojini und Oliver 1983, Plant Physiology 72, S. 194ff.) oder aus Spinatblättern (Douce et al. 1977, Plant Physiology 60, S. 625ff.) isoliert werden können. Beispiel 5: in vitro Testsysteme
Die GDC-Aktivität kann photometrisch bestimmt werden (siehe z.B. Bourguignon et al 1988, Biochemical Journal 255, S. 169ff.). Hierfür wird der Glycin Decarboxylase Komplex in Kalium phosphat Puffer (pH 7,4) mit NAD+ (2,5mM), Glycin (30mM), Pyridoxalphosphat (20μM), MgCI2 (0,2mM), EGTA (0,2mM) und Tetrahydrofolat (200μM) versetzt. Das bei der Reaktion entstehende NADH wird bei 340nm photometrisch verfolgt.
Dieser Assay kann in Mikrotiterplatten durchgeführt werden und ist für das Hochdurchsatzscreening geeignet.
Ein Nachweissystem der gemeinsamen Aktivität der P-, L- und H-Untereinheit des GDC-Komplexes kann dadurch erfolgen, dass der Umsatz von Glycin photometrisch anhand der gekoppelten Reduktion von 2,6-Dichlorphenol-lndophenol verfolgt wird wie z.B. nach Moore et al. (1980, FEBS Letters 115, S.54fl).
Für die Bestimmung der gemeinsamen Aktivität von H- und L-Proteins des GDC wird wird deren Reaktion in umgekehrter Richtung vorfolgt indem das L-Protein unter einem Uberschuss an NADH die am H-Protein gebundene Liponsäure reduziert. Die gebildete Dihydroliponsäure wird durch einen Uberschuss an 5,5'-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) reoxidiert wobei 2-Nitro-5-Thiobenzoesäure gebildet wird, deren Absorption photometrisch ei 412 nm verfolgt werden kann, (wie z.B. Neuburger et al. 1991 , Biochemical Journal 278, S. 765ff. beschrieben)
Die Bestimmung der Aktivität des P-Proteins kann nach Higara und Kiguchi durchgeführt werden (Journal of Biological Chemistry 1980, 255, S. 11664-11670). Hierbei wird in Anwesenheit von Pyridoxylphosphat und DTT 1-[14C]Glycin decarboxyliert wird und das entstehende 14C02 radiometrisch nachgewiesen.
L-Proteinaktivität lässt sich in Anwesenheit von NAD+ und freier Liponsäure unter photometrischer Verfolgung der NADH Bildung bei 340nm nachweisen (wie z.B. in Moran et al., Plant Physiology 2002, 128, S. 300-313 beschrieben)

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung des Glycin Decarboxylase Komplexes oder einer Untereinheit des Gyicin Decarboxylase Komplexes in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass a) die Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 oder in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 oder in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:3, das eine Identität mit der SEQ ID NO:3 von mindestens 59% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder b) die Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:6 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:5, das eine Identität mit der SEQ ID NO:5 von mindestens 69% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder c) die Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:7 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:7, das eine Identität mit der SEQ ID NO:7 von mindestens 68% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder d) die Untereinheit H des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:9 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:10 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:9, das eine Identität mit der SEQ ID NO:9 von mindestens 64% aufweist, ableiten lässt; umfasst.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Untereinheit P gemäß Anspruch 2 a) verwendet wird.
4. Pflanzliche Nukleinsäuresequenzen kodierend für ein Polypeptid mit der Aktivität der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes enthaltend eine Nukleinsäuresequenz umfassend: a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID N0:1 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder c) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 mit einer Identität von mindestens 89% zu der SEQ ID NO:1.
5. Polypeptid mit der Aktivität der Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes kodiert von einem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4.
6. Expressionskassette umfassend a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 4; oder b) zusätzliche Funktionselemente; oder c) eine Kombination aus a) und b).
7. Vektor umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 6.
8. Transgener Organismus umfassend mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydrogenase gemäß Anspruch 4, eine Expressionskassette gemäß Anspruch 6 oder einen Vektor gemäß Anspruch 7 ausgewählt aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen oder pflanzlichen Zellen.
9. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung umfassend die folgenden Schritte: i. Inkontaktbringen des Glycin Decarboxylase Komplexes oder einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbindung(en) an den Glycin Decarboxylase Komplex erlauben; und ii. Nachweis, ob die Testverbindung an den Glycin Decarboxylase Komplex oder an eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes aus i) bindet; oder iii. Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität des Glycin Decarboxylase Komplexes oder die einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes aus i) reduziert oder blockiert; oder iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression des Glycin Decarboxylase Komplexes die einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes aus i) reduziert oder blockiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass a) die Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 oder in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 oder in SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:3, das eine Identität mit der SEQ ID NO:3 von mindestens 59% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder b) die Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID N0:5 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:6 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:5, das eine Identität mit der SEQ ID NO:5 von mindestens 69% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
c) die Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:7 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:7, das eine Identität mit der SEQ ID NO:7 von mindestens 68% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
d) die Untereinheit H des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:9 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:10 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:9, das eine Identität mit der SEQ ID NO:9 von mindestens 64% aufweist, ableiten lässt; umfasst.
11. Verfahren nach Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet, dass in dem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden die Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes gemäß Anspruch 9 a) verwendet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Testverbindung selektiert wird, welche die Aktivität des Glycin Decarboxylase Komplexes oder die einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten des Glycin Decarboxylase Komplexes oder die der Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes mit der Aktivität des nicht mit einer Testverbindung inkubierten Glycin Decarboxylase Komplexes oder der nicht mit einer Testverbindung inkubierten Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes verglichen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 9, 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass i. der Glycin Decarboxylase Komplexes oder eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes entweder in einem transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß den Glycin Decarboxylase Komplex oder eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes enthält, kultiviert wird; ii. der Glycin Decarboxylase Komplexes oder eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes aus Schritt i) im Zellaufschluss des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und iii. eine Testverbindung selektiert wird, welche die enzymatische Aktivität des des Glycin Decarboxylase Komplexes oder die einer Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes aus Schritt ii) reduziert oder blockiert.
14. Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11 dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte umfasst: i. Herstellung eines transgenen Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz codierend für eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes, in welchem mindestens eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes überexprimiert wird; ii. Aufbringen einer Testsubstanz auf den transgenen Organismus nach i) und auf einen nicht-transgenen Organismus des gleichen Genotyps; und iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der Aufbringung der Testsubstanz; und iv. Selektion von Testsubstanzen, die ein vermindertes Wachstum oder eine eingeschränkte Überlebensfähigkeit des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organismus.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es in einem pflanzlichen Organismus, einem Cyanobakterium oder einem Proteobakterium durchgeführt wird.
16. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Schritte umfasst: i. Herstellung einer transgenen Pflanze enthaltend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für mindestens eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes, in welcher mindestens eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes überexprimiert wird; ii. Aufbringen einer Testsubstanz auf die transgene Pflanze nach i) und auf eine nicht-transgene Pflanze der gleichen Sorte; iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht transgenen Pflanze nach dem Aufbringen der Testsubstanz; und iv. Selektion von Testsubstanzen, die ein verändertes Wachstum der nicht- transgenen Pflanze bewirken verglichen mit dem Wachstum der transgenen Pflanze.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High-Throughput-Screening durchgeführt wird.
18. Träger, der eines oder mehrere der Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 4, oder eine oder mehrere Expressionskassetten nach Anspruch 6, einen oder mehrere Vektoren nach Anspruch 7, einen oder mehrere Organismen nach Anspruch 8 oder eines oder mehrere (Poly)peptide nach Anspruch 5 aufweist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High-Throughput-Screening durchgeführt wird unter Verwendung eines Trägers gemäß Anspruch 18.
20. Verbindungen mit herbizider Wirkung identifiziert über eines der Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, 17 und 19.
21. Verbindungen mit wachstumsregulatorischer Wirkung identifiziert über das Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 19.
22. Verfahren zur Herstellung einer agrochemischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man a) eine Verbindung mit herbizider Wirkung über eines der Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 15, 17 und 19 oder eine Verbindung mit wachstumsregulatorischer Wirkung nach Anspruch 16, 17 oder 19 identifiziert; und b) diese Verbindung zusammen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln mit herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung formuliert.
23. Verfahren zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs und/oder zur Regulation des Wachstums von Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Verbindung gemäß Anspruch 20 oder 21 oder eine agrochemische Zusammensetzung enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 20 oder 21 auf Pflanzen, deren Lebensraum und/oder auf Samen einwirken läßt.
24. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 20 oder 21 oder einer agrochemische Zusammensetzung enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 20 oder 21 in einem Verfahren nach Anspruch 22.
25. Verfahren zur Erzeugung von Nukleinsäuresequenzen, welche für den Glycin Decarboxylase Komplexes oder eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase kodieren, die durch Substanzen nach Anspruch 20 nicht inhibiert werden, wobei die Nukleinsäuresequenz ii) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit der SEQ ID NO:3 von mindestens 59% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder iii) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit der SEQ ID NO:5 von mindestens 69% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder iv) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit der SEQ ID NO:7 von mindestens 68% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder v) eine Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit der SEQ ID NO:9 von mindestens 64% aufweist, ableiten lässt; umfasst;; dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Prozessschritte umfaßt: a) Expression des von der Nukleinsäuresequenz gemäß i) kodierten Proteins in einem heterologen System oder in einem zellfreien System; b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure; c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid; . . . d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen; e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbi- zides; und f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Anspruch 25 f) ausgewählten Sequenzen in einen Organismus eingebracht werden.
27. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen nach Anspruch 20 resistent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen mindestens eine Nukleinsäuresequenz, welche für eine Untereinheit des Glycin Decarboxylase Komplexes oder den Glycin Decarboxylase Komplex codiert, überexprimiert wird, wobei a) die Untereinheit P des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:1 oder in SEQ ID NO:3 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:3, das eine Identität mit der SEQ ID NO:3 von mindestens 59% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder b) die Untereinheit L des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:5 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:6 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:5, das eine Identität mit der SEQ ID NO:5 von mindestens 69% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
c) die Untereinheit T des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:7 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:8 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:7, das eine Identität mit der SEQ ID NO:7 von mindestens 68% aufweist, ableiten lässt; umfasst; und/oder
d) die Untereinheit H des Glycin Decarboxylase Komplexes durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO:9 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO:10 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten lässt; oder iii) ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:9, das eine Identität mit der SEQ ID NO:9 von mindestens 64% aufweist, ableiten lässt; umfasst. umfasst, überexprimiert wird.
28. Transgene Pflanze hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 28.
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