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Die
vorliegende Erfindung betrifft Polynukleotidphosphorylase (PNPase),
deren Abwesenheit zu reduziertem Wachstum sowie chlorotischen Blättern führt, als
Ziel für
Herbizide. Zu diesem Zweck werden Nukleinsäuresequenzen, umfassend die
SEQ. ID No. 1, sowie funktionelle Äquivalente der SEQ. ID No.
1 bereitgestellt. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung
von Polynukleotidphosphorylase in einem Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen mit herbizid- oder wachstumsregulierender Aktivität sowie
die Verwendung der mit diesem Verfahren identifizierten Verbindungen
als Herbizide oder Wachstumsregulatoren.
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Das
grundlegende Prinzip der Identifizierung von Herbiziden über die
Hemmung eines definierten Ziels ist bekannt (zum Beispiel
US 5,187,071 , WO 98/33925,
WO 00/77185). Allgemein besteht ein großer Bedarf, Enzyme nachzuweisen,
die neue Ziele für
Herbizide darstellen könnten.
Gründe
hierfür
sind Resistenzprobleme, die bei auf bekannte Ziele wirkenden herbiziden
Wirkstoffen auftreten, sowie das ständige Bemühen, neue herbizide Wirkstoffe
zu identifizieren, die sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische
und toxikologische Verträglichkeit
und/oder geringe Aufwandmengen auszeichnen.
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Der
Nachweis neuer Ziele ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbunden,
da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines Stoffwechselwegs
ist, häufig
das Wachstum der Pflanze nicht weiter beeinflußt. Dies kann daran liegen,
daß die
Pflanze auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Existenz nicht
bekannt ist, oder daß das
gehemmte Enzym für
den Stoffwechselweg nicht limitierend ist. Weiterhin teilen Pflanzengenome
einen hohen Grad an funktioneller Redundanz. Im Genom von Arabidopsis
Thaliana finden sich häufiger
funktionell äquivalente
Enzyme in Genfamilien als bei Insekten oder Säugern (Nature, 2000, 408(6814):796-815).
Diese Hypothese wird experimentell durch die Tatsache bestätigt, daß umfassende Gen-knock-out-Programme durch T-DNA-
oder Transposoninsertion in Arabidopsis bislang weniger ausgeprägte Phänotypen
lieferten als erwartet (Curr. Op. Plant Biol. 4, 2001, S.111-117).
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Identifizierung
neuer Ziele, die für
das Wachstum von Pflanzen essentiell sind bzw. deren Hemmung zu
reduziertem Pflanzenwachstum führt,
sowie in der Bereitstellung von Verfahren, die sich zur Identifizierung
von Verbindungen mit herbizider und/oder wachstumsregulatorischer
Wirkung eignen.
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Diese
Aufgabe wurde gelöst
durch die Verwendung nukleär
codierter Polynukleotidphosphorylase in einem Verfahren zur Identifizierung
von Herbiziden.
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An
dieser Stelle werden nun weitere in der Beschreibung verwendete
Begriffe definiert.
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„Affinitäts-Tag": damit wird ein
Peptid oder Polypeptid bezeichnet, dessen codierende Nukleinsäuresequenz
mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
entweder direkt oder mittels eines Linkers unter Verwendung gängiger Klonierungstechniken
fusioniert werden kann. Das Affinitäts-Tag dient dabei zur Isolierung, Anreicherung
und/oder selektiven Aufreinigung des rekombinanten Zielproteins
mittels Affinitätschromatografie
aus Gesamtzellextrakten. Der oben erwähnte Linker kann dabei vorteilhafterweise
eine Proteasespaltstelle (zum Beispiel für Thrombin oder Faktor Xa)
enthalten, wodurch sich das Affinitäts-Tag bei Bedarf vom Zielprotein
abspalten läßt. Beispiele
für gängige Affinitäts-Tags
sind das „His-Tag", beispielsweise
von der Firma Qiagen, Hilden, „Strep-Tag", das „Myc-Tag" (Invitrogen, Carlsberg),
das aus einer chitinbindenden Domäne und einem Intein bestehende
Tag von der Firma New England Biolabs, das Maltose-Bindungsprotein
(pMal) von New England Biolabs, das pCal-System mit einem Calmodulin-bindenden
Peptid-Tag von der Firma Stratagene, und das sogenannte CBD-Tag
von der Firma Novagen. Dabei kann das Affinitäts-Tag am 5'- oder am 3'-Ende der codierenden Nukleinsäuresequenz
mit der für
das Zielprotein codierenden Sequenz angebracht sein.
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„Aktivität nukleär codierter
Polynukleotidphosphorylase (PNPase)": der Begriff Aktivität beschreibt
die Fähigkeit
eines Enzyms, ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln. Die enzymatische
Aktivität
läßt sich
dabei in einem sogenannten Aktivitätstest über die Zunahme des Produkts,
die Abnahme des Substrats (oder Ausgangsmaterials) oder die Abnahme
eines spezifischen Cofaktors oder über eine Kombination aus mindestens zwei
der vorstehend genannten Parameter in Abhängigkeit eines definierten
Zeitraums bestimmen.
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„Aktivität nukleär codierter
Polynukleotidphosphorylase" beschreibt
hier die Fähigkeit
eines Enzyms, a) die reversible Polymerisierung von Dinukleotiden
zu Polyribonukleotiden und anorganischem Phosphat oder b) die reversible
Verlängerung
eines Primer-Oligonukleotids
mit Dinukleotiden unter Bildung von anorganischem Phosphat zu katalysieren.
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„Antisense": der Begriff „Antisense", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf eine Desoxyribonukleotidsequenz, deren Abfolge
von Desoxyribonukleotidresten in bezug auf die Abfolge von Desoxyribonukleotidresten
in einem Sense-Strang eines DNA-Duplexes
in umgekehrter 5'-
nach 3'-Orientierung
vorliegt. Ein „Sense-Strang" eines DNA-Duplexes
bezieht sich dabei auf einen Strang in einem DNA-Duplex, der von
einer Zelle in ihrem natürlichen
Zustand in eine „Sense-mRNA" transkribiert wird.
Somit handelt es sich bei einer „Antisense"-Sequenz um eine Sequenz mit der gleichen
Sequenz wie der nichtcodierende Strang in einem DNA-Duplex. Der
Begriff „Antisense-RNA" bezieht sich auf
ein RNA-Transkript, das zu einem primären Zieltranskript oder einer
Ziel-mRNA vollständig
oder teilweise komplementär
ist und das die Expression eines Zielgens durch Störung der
Prozessierung, des Transports und/oder der Translation seines primären Transkripts oder
seiner mRNA stört.
Dabei kann die Komplementarität
einer Antisense-RNA mit einem beliebigen Teil des spezifischen Gentranskripts,
beispielsweise an der 5'-nichtcodierenden
Sequenz, 3'-nichtcodierenden
Sequenz, den Introns oder der codierenden Sequenz, vorhanden sein.
Darüber
hinaus kann Antisense-RNA, wie sie hier verwendet wird, Bereiche
von Ribozymsequenzen enthalten, die die Wirksamkeit der Antisense-RNA bei
der Blockierung der Genexpression erhöht.
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„Expression": der Begriff, wie
er hier verwendet wird, ist so zu verstehen, daß er Transkription, reverse Transkription
und Translation mit umfaßt.
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"Expressionskassette": eine Expressionskassette
enthält
eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz,
die mit wenigstens einem genetischen Kontrollelement, wie z.B. einem
Promotor und vorteilhafterweise einem weiteren Kontrollelement,
wie z.B. einem Terminator, operativ verknüpft ist. Bei der Nukleinsäuresequenz
der Expressionskassette kann es sich beispielsweise um eine genomische
oder komplementäre DNA-Sequenz oder eine
RNA-Sequenz sowie deren halbsynthetische oder vollsynthestische
Analoge handeln. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form,
extrachromosomal oder in das Genom integriert existieren. Die betreffenden
Nukleinsäuresequenzen
lassen sich synthetisieren oder auf natürliche Weise gewinnen oder
können
ein Gemisch aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten
oder auch aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener
Organismen bestehen.
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Künstliche
Nukleinsäuresequenzen
sind in diesem Zusammenhang ebenso geeignet, solange sie die Expression
eines durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
codierten Polypeptids mit der enzymatischen Aktivität einer
nukleär
codierten Polynukleotidphosphorylase, vorzugsweise mit der biologischen
Aktivität
einer nukleär
codierten Polynukleotidphosphorylase, in einer Zelle oder einem
Organismus ermöglichen. Beispielsweise
können
synthetische Nukleinsäuresequenzen
erzeugt werden, die bezüglich
der Codon-Nutzung der zu transformierenden Organismen optimiert
wurden.
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Alle
oben erwähnten
Nukleinsäuresequenzen
können
in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen,
wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender,
komplementärer
Nukleotidbausteine der Doppelhelix erzeugt werden. Die chemische
Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise in bekannter Weise
nach dem Phosphoamiditverfahren (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press
New York, S. 896-897) erfolgen. Bei der Herstellung einer Expressionskassette
können verschiedene
DNA-Fragmente so manipuliert werden, daß eine Nukleinsäuresequenz
mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhal ten wird.
Die Nukleinsäurefragmente
werden miteinander über
allgemeine Clonierungstechniken, wie sie beispielsweise bei T. Maniatis,
E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), bei
T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene
Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)
und bei Ausubel, F.M. et al., "Current
Protocols in Molecular Biology",
Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1994) beschrieben
sind.
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„Gen": der Begriff bezieht
sich auf eine diskrete Nukleinsäuresequenz,
die für
ein diskretes Zellprodukt verantwortlich ist. Dabei bezieht sich
der Begriff „Gen", wie er hier verwendet
wird, nicht nur auf die ein spezifisches Protein codierende Nukleinsäuresequenz,
sondern auch auf alle benachbarten 5'- und 3'-nichtcodierenden Nukleotidsequenzen,
die an der Regulation der Expression des von dem interessierenden
Gen codierten Proteins beteiligt sind. Zu diesen nichtcodierenden
Sequenzen gehören
Terminatorsequenzen, Promotorsequenzen, stromaufwärts liegende
Aktivatorsequenzen, regulatorische proteinbindende Sequenzen und
dergleichen.
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„Inhibitor": eine chemische
Substanz, die die enzymatische Aktivität eines Proteins, wie z.B.
eines Biosyntheseenzyms, eines Rezeptors, eines Signalweiterleitungsproteins,
eines Strukturgenprodukts oder eines Transportproteins, inaktiviert.
Der Begriff „Herbizid" (oder „Herbizidverbindung") wird hier zur Definition
eines an eine Pflanze in einem beliebigen Entwicklungsstadium applizierten
Inhibitors verwendet, womit das Herbizid das Wachstum der Pflanze
hemmt oder diese abtötet.
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„Operative
Verknüpfung" oder „funktionelle
Verknüpfung": unter einer operativen
oder funktionellen Verknüpfung
versteht man die sequentielle Anordnung regulatorischer Sequenzen
oder genetischer Kontrollelemente derart, daß jede der regulatorischen
Sequenzen oder jedes der genetischen Kontrollelemente ihre bzw.
seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
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„Funktionelle Äquivalente" beschreiben in diesem
Zusammenhang Nukleinsäuresequenzen,
die unter Standardbedingungen mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
oder Teilen der oben erwähnten
Nukleinsäuresequenzen
hybridisieren und in der Lage sind, die Expression eines Polypeptids
mit der Aktivität
einer Polynukleotidphosphorylase in einer Zelle oder einem Organismus
herbeizu- führen.
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Zur
Durchführung
der Hybridisierung werden vorteilhafterweise kurze Oligonukleotide
mit einer Länge von
ungefähr
10-50 Bp, vorzugsweise 15-40 Bp, beispielsweise aus den konservierten
oder sonstigen Bereichen, die über
Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter
Weise ermittelt werden können,
verwendet. Es können
aber auch längere
Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit
einer Länge
von 100-500 Bp oder die vollständigen
Sequenzen für
die Hybridisie rung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure/dem
verwendeten Oligonukleotid, der Länge des Fragments oder der
vollständigen
Sequenz bzw. je nach dem, welche Nukleinsäureart, d.h. DNA oder RNA,
für die
Hybridisierung verwendet wird, variieren diese Standardbedingungen.
So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride
ungefähr
10°C niedriger
als die von DNA:RNA-Hybriden
gleicher Länge.
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Unter
Standardhybridisierungsbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen
42 und 58°C
in einer wäßrigen Pufferlösung mit
einer Konzentration zwischen 0,1 und 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM
Natriumcitrat, pH 7.2) oder zusätzlich
in Gegenwart von 50% Formamid, wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50%
Formamid, zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen
für DNA:DNA-Hybride
bei 0,1 × SSC
und Temperaturen zwischen ungefähr
20°C und
65°C, vorzugsweise
zwischen ungefähr
30°C und
45°C. Bei
DNA:RNA-Hybriden
liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhafterweise bei 0,1 × SSC und
Temperaturen zwischen ungefähr
30°C und
65°C, vorzugsweise
zwischen ungefähr
45°C und
55°C. Bei
diesen angegebenen Hybridisierungstemperaturen handelt es sich um Schmelztemperaturwerte,
die für
eine Nukleinsäure
mit einer Länge
von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit
von Formamid beispielhaft berechnet wurden. Die experimentellen
Bedingungen für
die DNA-Hybridisierung
sind in einschlägigen
Lehrbüchern
der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989 beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten
Formeln beispielsweise abhängig
von der Länge
von Nukleinsäuren,
der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen
zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen:
Ausubel et al. (Hrsg.), 1985, "Current
Protocols in Molecular Biology",
John Wiley & Sons,
New York; Hames und Higgins (Hrsg.), 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical
Approach", IRL Press
at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.), 1991, Essential
Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University
Press, Oxford.
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Ein
funktionelles Äquivalent
der SEQ ID No. 1 läßt sich
weiterhin auch über
den Grad der Homologie bzw. Identität mit der SEQ ID No. 1 definieren
und kann weiterhin auch natürliche
oder künstliche
Mutationen der oben erwähnten
Nukleinsäuresequenzen,
die für
ein Polypeptid mit der Aktivität
einer nukleär
codierten Polynukleotidphosphorylase codieren, umfassen.
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Von
der vorliegenden Erfindung sind ebenso beispielsweise diejenigen
Nukleinsäuresequenzen
umfaßt,
die durch Modifikation der SEQ ID No. 1 erhalten werden.
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Solche
Modifikationen lassen sich beispielsweise mit dem Fachmann geläufigen Techniken,
wie z.B. „Site
Directed Mutagenesis" (stellengerichtete
Mutagenese), „Error
Pro ne PCR" (zu Fehlern
neigende PCR), „DNA-shuffling" (Umordnung von DNA)
(Nature 370, 1994, S.389-391) oder „Staggered Extension Process" (stufenweiser Verlängerungsprozeß) (Nature
Biotechnol. 16, 1998, S.258-261) erzeugen. Ziel einer solchen Modifikation
kann beispielsweise die Insertion weiterer Schnittstellen für Restriktionsenzyme,
die Entfernung von DNA zur Verkürzung
der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon-Optimierung
oder das Hinzufügen
weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifizierte Nukleinsäuresequenzen
codiert werden, müssen
trotz abweichender Nukleinsäuresequenz
noch die gewünschte
Funktion besitzen.
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Der
Begriff „funktionelle Äquivalente" kann sich auch auf
die von der betreffenden Nukleinsäuresequenz codierte Aminosäuresequenz
beziehen. In diesem Fall beschreibt der Begriff „funktionelles Äquivalent" ein Protein, dessen
Aminosäuresequenz
eine definierte Prozentualidentität oder Homologie mit der SEQ
ID No. 2 aufweist.
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Funktionelle Äquivalente
umfassen somit auch natürlich
vorkommende Varianten der hier beschriebenen Sequenzen sowie künstliche,
beispielsweise durch chemische Synthese erhaltene, an den Codon-Gebrauch
angepaßte
Nukleinsäuresequenzen
und ebenso die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
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„Genetische
Kontrollsequenz" beschreibt
Sequenzen, die einen Einfluß auf
die Transkription und gegebenenfalls die Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in
prokariontischen oder eukariontischen Organismen haben. Beispiele
hierfür
sind Promotoren, Terminatoren oder sogenannte „Enhancer"-Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen
oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen
vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls
genetisch so modifiziert worden sein, daß die natürliche Regulation ausgeschaltet
und die Expression des Zielgens modifiziert, also erhöht oder
erniedrigt wurde. Die Wahl der Kontrollsequenz hängt dabei vom Wirtsorganismus
oder Ausgangsorganismus ab. Genetische Kontrollsequenzen umfassen
ferner auch den 5'-nichttranslatierten
Bereich, Introns oder den nichtcodierenden 3'-Bereich von Genen. Als Kontrollsequenzen
sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination
bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen
oder die Entfernung aus dem Genom gestatten. Genetische Kontrollsequenzen
umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren
sowie die Chromatinstruktur beeinflussende Sequenzen (z.B. MARs
(Matrix Attachment Regions)), die die expressionssteuernden Eigenschaften
modifizieren können.
So kann durch genetische Kontrollsequenzen beispielsweise die gewebespezifische
Expression zusätzlich
abhängig
von bestimmten Streßfaktoren
erfolgen. Derartige Elemente sind zum Beispiel für Wasserstreß, Abscisinsäure (Lam
E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135), Streß aufgrund
hoher und niedriger Temperaturen (Plant Cell 1994, (6): 251-264)
und Hitzestreß (Molecular & General Genetics, 1989,
217(2-3): 246-53) beschrieben.
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„Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen
oder Polypeptidsequenzen ist über
die Identität der
Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die
jeweils gesamte Sequenzlänge
definiert, die durch eine vergleichende Gegenüberstellung mit Hilfe des Programmalgorithmus
BESTFIT nach Needleman und Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48; 443-453)
unter Einstellung der folgenden Parameter für Polypeptide:
Gap Weight:
8
Length Weight: 2
und der folgenden Parameter für Nukleinsäuren:
Gap
Weight: 50
Length Weight: 3
berechnet wird.
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Nachfolgend
wird der Begriff Identität
auch synonym mit dem Begriff „Homologie" verwendet.
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„Mutationen" von Nuklein- oder
Aminosäuresequenzen
umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversionen oder
Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch
die entsprechende Aminosäuresequenz
des Zielproteins mittels Substitution, Insertion oder Deletion einer
oder mehrerer Aminosäuren
verändern
kann, wobei jedoch insgesamt die funktionellen Eigenschaften der
Zielproteine im wesentlichen beibehalten werden.
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„Natürliche genetische
Umgebung" bedeutet
den natürlichen
chromosomalen Locus im Ursprungsorganismus. Im Fall einer genomischen
Bibliothek ist die natürliche
genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz
vorzugsweise zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert
die Nukleinsäuresequenz
wenigstens auf der 5'-
oder 3'-Seite und
weist eine Sequenzlänge
von wenigstens 50 Bp, vorzugsweise wenigstens 100 Bp, besonders
bevorzugt wenigstens 500 Bp, ganz besonders bevorzugt wenigstens
1000Bp und am meisten bevorzugt wenigstens 5000 Bp auf.
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„Pflanzen" sind im Sinne der
Erfindung Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganze Pflanzen,
wie etwa Samen, Knollen, Blüten,
Pollen, Früchte,
Sämlinge,
Wurzeln, Blätter,
Stengel oder sonstige Pflanzenteile. Zudem versteht man unter dem
Begriff Pflanzen Vermehrungsmaterial, wie etwa Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge,
Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke.
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„Promotor": der Begriff bezieht
sich auf die 5'-flankierende,
nichtcodierende Sequenz, die zu einer codierenden Sequenz benachbart
und an der Initiation der Transkription der codierenden Sequenz
beteiligt ist.
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„Rekombinante
DNA" beschreibt
eine Kombination von DNA-Sequenzen, die sich über rekombinante DNA-Technologie
erzeugen lassen.
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„Rekombinante
DNA-Technologie":
allgemein bekannte Techniken zur Fusion von DNA-Sequenzen (zum Beispiel
beschrieben bei Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold
Spring Harbor Laboratory Press).
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„Replikationsursprünge" gewährleisten
die Vervielfachung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder
Vektoren in Mikroorganismen und Hefen, beispielsweise pBR322 ori
oder P15A ori in E. coli (Sambrook et al.: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2. Aufl. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) sowie ARS1
ori in Hefe (Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068).
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„Reportergene" codieren für leicht
quantifizierbare Proteine. Über
einen Wachstums-Fluoreszenz-, Chemolumineszenz-,
Biolumineszenz- oder Resistenztest oder über eine photometrische Messung
(Eigenfarbe) oder Enzymaktivität
läßt sich
mittels dieser Gene die Transformationseffizienz oder der Expressionsort oder
-zeitpunkt beurteilen. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporterproteine
(Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44),
wie z.B. das "green
fluorescent protein" (grün fluoreszierendes
Protein, GFP) (Gerdes HH und Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1):44-47; Chui WL et al.,
Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5):912-8,
1997), die Chloramphenikol-Acetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin,
Plant Sci 1996, 116:59-72; Scikantha, J Bact 1996, 178:121; Millar
et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414), sowie Luziferasegene,
im allgemeinen β-Galactosidase
oder β-Glucuronidase (Jefferson
et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das Ura3-Gen.
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„Selektionsmarker" verleihen eine Resistenz
gegen Antibiotika oder andere toxische Verbindungen: beispielhaft
zu nennen seien hier das Gen für
Neomyzin-Phosphotransferase,
das eine Resistenz gegen das Aminoglycosid Antibiotikum Neomycin
(G 418) verleiht, Kanamycin, Paromycin (Deshayes A et al., EMBO
J. 4 (1985) 2731-2737), das Sul-Gen, das für eine mutierte Dihydropteroat-Synthase
codiert (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15(1):127-136),
das Gen für
Hygromycin-B-Phosphotransferase
(Gen Bank Accession NO: K 01193) und das shble-Resistenzgen; das
eine Resistenz gegen Bleomycinantibiotika, wie z.B. Zeocin, verleiht.
Weitere Beispiele für
Selektionsmarkergene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose-6-phosphate
(WO 98/45456) oder Phosphinothricin und dergleichen verleihen, oder
solche, die eine Resistenz gegen Antimetabolite verleihen, zum Beispiel
das dhfr-Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994) 142-149).
Beispiele für
andere, ebenfalls geeignete Gene sind trpB oder hisD (Hartman SC
und Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci USA. 85 (1988) 8047-8051). Ein
weiteres geeignetes Gen ist das Gen für Mannosephosphat-Isomerase
(WO 94/20627), das ODC (Ornithindecar boxylase)-gen (McConlogue,
1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring
Harbor Laboratory, Hrsg.) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus
(Tamura K et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
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„Transformation" beschreibt einen
Prozeß zur
Einführung
heterologer DNA in eine pro- oder
eukaryontische Zelle. Dabei wird mit dem Begriff transformierte
Zelle nicht nur das Produkt des Transformationsprozesses per se
beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die
Transformation erzeugten transgenen Organismus.
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„Ziel/Zielprotein": ein über die
erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
(dieser Begriff ist weiter unten definiert) codiertes Polypeptid,
bei dem es sich um ein Enzym im klassischen Sinne oder beispielsweise
um ein Strukturprotein, ein für
Entwicklungsprozesse relevantes Protein, ein Regulationsprotein,
wie z.B. Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Phosphatasen, Rezeptoren,
Untereinheiten von Kanälen,
Transportproteine, regulatorische Untereinheiten, die einem Enzymkomplex
eine Substrat- oder Aktivitätsregulation
verleihen, handeln kann. Allen Zielen oder Wirkorten ist dabei gemein,
daß ihre
funktionelle Anwesenheit essentiell für das Überleben oder eine normale
Entwicklung bzw. ein normales Wachstum ist.
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„Transgen": bezogen auf eine
Nukleinsäuresequenz,
eine Expressionskassette oder einen Vektor, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz,
oder einen mit der oben genannten Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette
oder dem oben genannten Vektor transformierten Organismus beschreibt
der Begriff transgen alle diejenigen Konstrukte, die mit gentechnischen
Verfahren erzeugt wurden und in denen sich entweder die Nukleinsäuresequenz
des Zielproteins oder eine mit der Nukleinsäuresequenz des Zielproteins funktionell
verknüpfte
genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination der vorstehend
genannten Möglichkeiten
sich nicht in ihrer natürlichen
genetischen Umgebung befindet oder durch rekombinante Verfahren
modifiziert wurde. Dabei läßt sich
die Modifikation beispielsweise über
eine Mutation eines oder mehrerer Nukleotidreste der betreffenden
Nukleinsäuresequenz
erreichen.
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„Vektor", wie hier verwendet,
bezieht sich auf ein selbstreplizierendes DNA- oder RNA-Molekül, das einen
Nukleinsäureabschnitt
zwischen Zellen transferiert.
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Als
Messenger-RNA vor nahezu 40 Jahren entdeckt wurde, war ihre kennzeichnende
Eigenschaft ihre Instabilität.
Die mRNA repräsentiert
zu jedem Zeitpunkt eine wesentliche Fraktion der von RNA-Polymerase hergestellten
Transkripte, wird jedoch rasch abgebaut. Die Instabilität der mRNA
stellte sich als ein wichtiger Parameter heraus, der die Niveaus
der Genexpression bestimmt und schnell Antworten auf Regulationssignale
gestattet. Die Instabilität
führte
auch unmittelbar zu der Frage, wie mRNA enzymatisch abgebaut wird,
um die Nukleotideinheiten als NTPs wiederzuverwenden. Es wurden
innerhalb weniger Jahre nach der Entdeckung der mRNA wenigstens
drei Enzym aktivitäten
aus Escherichia coli identifiziert: Polynukleotidphosphorylase,
Poly(A)-Polymerase
I und RNase II, wobei seitdem viele andere Aktivitäten gefunden
wurden.
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Von
den über
20 in E. coli identifizierten RNasen scheinen lediglich sechs am
mRNA-Abbau beteiligt zu
sein: Bei drei der RNasen des mRNA-Abbaus handelt es sich um stellenspezifische
Endoribonukleasen und bei dreien um 3'-5'-Exoribonukleasen.
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Eine
Hauptexonuklease des mRNA-Abbaus ist Polynukleotidphosphorylase,
eine phosphorylytisches Enzym, das anorganisches Phosphat zur Abtrennung
von Nukleotiden von 3'-RNA-Enden
verwendet, wobei Nukleosid-5'-Diphosphate
erhalten werden. Bei einer Inaktivierung von entweder RNase II oder
PNPase bleiben die E. coli-Stämme lebensfähig, doch
ist die Inaktivierung beider Enzyme lethal. RNase-R-Mutanten sind ebenso
mit PNPase-Mutanten lethal.
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Das
Nichtüberleben
von Stämmen
ohne PNPase und RNase R deutete darauf hin, daß diese beiden Enzyme an einer
bzw. einigen wichtigen Zellfunktion bzw. Zellfunktionen beteiligt
sind und daß ihre
Aktivität teilweise
redundant sein könnte
(Cheng et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, S. 14077-14080). Bei einer
ihrer Aktivitäten
handelt es sich um den Abbau von mRNA-Fragmenten (Donovan und Kushner,
1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, S. 120-124). Biochemische Analysen
ließen
darauf schließen,
daß PNPase
die Hauptaktivität
bei der Auslösung
des Abbaus von RNA-Molekülen
nach endonukleolytischer Spaltung und Polyadenylierung darstellt
(Hayes et al., Trends Biochem. Sci., 24, 199-202). Der Abbau von
RNA-Molekülen
wird durch die Polyadenylierung verstärkt, indem sie mit einem Abbau-Tag
versehen werden, wobei die Polyadenylierung ein allgemeines Merkmal
von Bakterien und Pflanzenorganellen ist (Carpousis et al., Trends
Genet., 15, 24-28).
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Bei
Polynukleotidphosphorylase (PNPase, Polyribonukleotid-Nukleotidyltransferase,
EC 2.7.7.8) handelt es sich um ein multifunktionelles Protein mit
der oben erwähnten
prozessiven 3'-5'-Exoribonuklease,
ihrer reversiblen Aktivität
der Synthese von RNA unter Verwendung eines beliebigen Nukleosiddiphosphats,
ferner einem Pi (anorganisches Phosphat)-Austausch
und einer Autoregulationsaktivität.
Die Wechselwirkung zwischen der Polynukleotidphosphorylase und dem
mRNA-Ziel ist für
ihre Aktivitäten
entscheidend. Die PNPase besitzt eine hohe Affinität für mRNA,
ssRNA und für
ssDNA (ssRNA/DNA, Einzelstrang-RNA/DNA), wohingegen sie eine geringere
Affinität
für dsDNA,
Doppelstrang-DNA aufweist (Bermudez-Cruz et al., 2002, Biochimie 84(4),
S. 321-328).
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Darüber hinaus
ist die PNPase an der Qualitätskontrolle
der tRNA-Synthese beteiligt. Eine defekte tRNA-Vorstufe wird zunächst einer
Polyadenylierung durch Poly(A)-Polymerase
unterzogen und dann von PNPase abgebaut (Li et al., 2002, EMBO J.
21, S. 1132-1138).
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Es
besteht eine hohe Ähnlichkeit
der molekularen Mechanismen der RNA-Polyadenylierung und des RNA-Abbaus
in Bakterien und in Chloroplasten (Yehudai-Resheff et al., 2001, Mol. & Cell. Biol. 21(16),
S. 5408-5416). Die PNPase in Chloroplasten ist am RNA-Abbau beteiligt.
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Diese
Ergebnisse werden von Baginsky und Gruissem, 2002, Nucleic Acids
Research 30(20), S. 4527-4533 unterstützt, die zeigen konnten, daß die relativen
Halbwertszeiten für
Photosyntheseproteine codierende mRNAs in Chloroplasten dunkel angepaßter Pflanzen
verkürzt
sind. Die Polyadenylierungsaktivität der Polynukleotidphosphorylase
(PNPase) stieg in der aus Plastiden isolierten Proteinfraktion in
dunkel angepaßten
Pflanzen synchron stark an.
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Ferner
ist ein Modell offenbart, bei dem PNPase und RNase R einen bislang
unbekannten Qualitätskontrollprozeß vermitteln,
mit dem in der Regel defekte rRNAs unmittelbar nach ihrer Erzeugung
entfernt werden. Bei Abwesenheit dieser Enzyme reichern sich rRNA-Fragmente
an, was zur Störung
der ribosomen Reifung und letztendlich zum Zelltod führt (Cheng
und Deutscher, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100(11), S. 6388-6393).
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Wie
bei vielen anderen Bakteriengenen wird die Expression der Polynukleotidphosphorylase-Synthese
auf der postranskriptionalen Ebene in einem RNase III-abhängigen Mechanismus
autokontrolliert. Dabei spaltet RNase III eine lange „Stem-loop"-Struktur in der
pnp-Leitsequenz, die die pnp-mRNA-Instabilität auslöst, was zu einer Abnahme der
Synthese von Polynukleotidphosphorylase führt. Durch die Spaltung mit
RNase III wird der obere Teil der Stem-loop-Struktur abgetrennt,
wodurch ein Duplex mit einer kurzen 3'-Verlängerung entsteht (Jarrige et
al., 2001, EMBO J. 20(23), S. 6845-6855).
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Da
Pflanzen auf einen effizienten Nukleotidmetabolismus angewiesen
sind, kann man annehmen, daß Enzyme,
die an der Nukleotidbiosynthese teilnehmen, ein geeignetes Zielprotein
für Herbizide
darstellen. So wurden bereits Wirkstoffe beschrieben, die die de-Novo-Purinbiosynthese
in Pflanzen hemmen. Beispielhaft sei die natürlich vorkommende Substanz
Hydanthocidin genannt, die nach der Phosphorylierung in Pflanzen die
Adenylosuccinat-Synthetase (ASS) hemmt (Siehl et al., Plant Physiol.
110(1996), 753-758).
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Die
Eignung eines Enzyms als Ziel für
Herbizide läßt sich über die
Verminderung der Enzymaktivität, beispielsweise
mittels Antisense-Technologie in transgenen Pflanzen, bestätigen. Falls
die Einführung
einer Antisense-DNA für
ein bestimmtes Gen in eine Pflanze zu reduziertem Wachstum führt, so
läßt dies
darauf schließen,
daß das
Enzym, dessen Aktivität
verringert ist, eine geeignete Angriffstelle für Herbizidwirkstoffe darstellt.
So führt
beispielsweise die Antisense-Hemmung von Acetolactat-Synthese (ALS) in
transgenen Kartoffelpflanzen ebenso wie die Behandlung von Kontrollpflanzen
mit ALS hemmenden Herbiziden zu vergleichbaren Phänotypen
(Höfgen
et al., Plant Physiology 107(1995), 469-477).
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Überraschenderweise
wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß Pflanzen,
bei denen die Aktivität
von Polynukleotidphosphorylase PNPase erniedrigt war, reduziertes
Wachstum, Wachstumsretardierung und/oder Fitneßverlust zeigen. Transgene
Tabakpflanzen, die ein PNPase-Antisense-Gen sowie eine teilweise
erniedrigte PNPase-Aktivität
enthalten, zeigen die gleichen oben erwähnten Symptome eines reduzierten
Wachstums, einer Wachstumsretardierung und/oder eines Fitneßverlusts.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids,
das die Aktivität
von nukleär
codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist, in einem Verfahren
zur Identifizierung von Herbiziden, vorzugsweise eines Polypeptids,
das die Aktivität
von nukleär
codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist, bei dem es sich um
- a) die Polynukleotidphosphorylase handelt,
die von einer Nukleinsäuresequenz
codiert wird, welche:
i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID
No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz,
oder
ii) eine Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in
SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
iii) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ
ID No. 1 von wenigstens 50% aufweist; oder
iv) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, die eine Identität
von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 2 aufweist, umfaßt; oder
- b) die Polynukleotidphosphorylase handelt, die von einer Nukleinsäuresequenz
codiert wird, welche:
i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID
No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz,
oder
ii) eine Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in
SEQ ID No. 4 gezeigten Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
iii) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ
ID No. 3 von wenigstens 50% aufweist; oder
iv) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, die eine Identität
von wenigstens 50% mit der SEQ ID No.4 aufweist, umfaßt;
oder
- c) die Polynukleotidphosphorylase-Protease handelt, die von
einer Nukleinsäuresequenz
codiert wird, welche:
i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID
No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz,
oder
ii) eine Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in
SEQ ID No. 6 gezeigten Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
iii) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ
ID No. 5 von wenigstens 50% aufweist; oder
iv) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, die eine Identität
von wenigstens 50% mit der SEQ ID No.6 aufweist, umfaßt;
oder
- d) die Polynukleotidphosphorylase handelt, die von einer Nukleinsäuresequenz
codiert wird, welche:
i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID
No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz,
oder
ii) eine Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in
SEQ ID No. 8 gezeigten Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
iii) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ
ID No. 7 von wenigstens 50% aufweist; oder
iv) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, die eine Identität
von wenigstens 50% mit der SEQ ID No.8 aufweist,
umfaßt.
-
Der
Begriff „umfassend" in Verbindung mit
einer Nukleinsäuresequenz
bedeutet, daß die
Nukleinsäuresequenz
von zusätzlichen
Nukleinsäuresequenzen
flankiert sein kann, die am 5'-Ende
und am 3'-Ende bzw. am
5'-Ende oder am
3'-Ende am Ende
eine Sequenzlänge
von wenigstens 1000 Bp, vorzugsweise wenigstens 500 Bp, stärker bevorzugt
wenigstens 250 Bp und am meisten bevorzugt wenigstens 100 Bp, aufweisen.
-
Das
erfindungsgemäße funktionelle Äquivalent
der SEQ ID No. 1 , wie in a) iii) beschrieben, das für ein Polypeptid
codiert, welches die Aktivität
von nukleär
codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist, und eine Identität von wenigstens
50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%,
63%, 64% oder 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,
71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt
von 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%,
am meisten bevorzugt von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%
oder 99%, mit der SEQ ID NO. 1 aufweist.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in a) iv. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 1 werden von
einer Aminosäuresequenz
codiert, die die Aktivität
einer nukleärcodierten
Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%,
51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%,
64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81
%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt
von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ
ID NO. 2 aufweist.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in b) iii. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 3, das
für ein
Polypeptid codiert, welches die Aktivität einer nukleärcodierten
Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%,
51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%,
64% or 65% oder vorzugs weise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81
%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt
von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ
ID NO. 3 aufweist.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in b) iv. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 3 werden von
einer Aminosäuresequenz
codiert, die die Aktivität
einer nukleärcodierten
Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%,
51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%,
64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%,
73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81%,
82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt
von 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ
ID NO. 4 aufweist.
-
Ein
Beispiel für
ein funktionelles Äquivalent
der SEQ ID NO. 3 ist die Nukleinsäuresequenz aus Spinacia oleracea
(Gene Bank Acc. No U52048). Diese Sequenz ist hiermit durch Bezugnahme
aufgenommen.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in c) iii. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 5, das
für ein
Polypeptid codiert, welches die Aktivität einer nukleärcodierten
Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität- von 50%,
51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%,
64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81
%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt
von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ
ID NO. 5 aufweist.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in c) iv. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 5 werden von
einer Aminosäuresequenz
codiert, die die Aktivität
einer nukleärcodierten
Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%,
51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%,
64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81
%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt
von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ
ID NO. 6 aufweist.
-
Ein
Beispiel für
ein funktionelles Äquivalent
der SEQ ID NO. 5 ist die Nukleinsäuresequenz aus Pisum sativum
PN (Gene Bank Acc. No AF010578). Diese Sequenz ist hiermit durch
Bezugnahme aufgenommen.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in d) iii. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 7, das
für ein
Polypeptid codiert, welches die Aktivität einer nukleärcodierten
Poly nukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%,
51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%,
64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81
%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt
von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ
ID NO. 7 aufweist.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in d) iv. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 7 werden von
einer Aminosäuresequenz
codiert, die die Aktivität
einer nukleärcodierten
Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%,
51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%,
64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81
%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt
von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ
ID NO. 8 aufweist.
-
Ein
Beispiel für
ein funktionelles Äquivalent
der SEQ ID NO. 5 ist die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis
thaliana (Gene Bank Acc. No AF450480). Diese Sequenz ist hiermit
durch Bezugnahme aufgenommen.
-
Weiterhin
werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung pflanzliche Nukleinsäuresequenzen
beansprucht,
- I) codierend für eine Polynukleotidphosphorylase,
umfassend:
a) eine Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine
Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in
SEQ ID No. 2 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
c) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die mit der SEQ
ID No. 1 eine Identität
von wenigstens 69%, vorzugsweise 69,495%, aufweist, oder
d)
ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, die wenigstens eine Identität von 65%, vorzugsweise 65,079%,
mit der SEQ ID NO. 2 aufweist;
- II) codierend für
eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend:
a) eine Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID No. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine
Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in
SEQ ID No. 4 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
c) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die mit der SEQ
ID No. 3 eine Identität
von wenigstens 73%, vorzugsweise 73,151%, aufweist, oder
d)
ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, die wenigstens eine Identität von 71 %, vorzugsweise 71,429%,
mit der SEQ ID NO. 4 aufweist;
- III) codierend für
eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend:
a) eine Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID No. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder
b) eine
Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in
SEQ ID No. 6 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
c) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID No. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die mit der SEQ
ID No. 5 eine Identität
von wenigstens 73%, vorzugsweise 73,973%, aufweist, oder
d)
ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, die wenigstens eine Identität von 72%, vorzugsweise 72,8%,
mit der SEQ ID NO. 6 aufweist;
-
Das
funktionelle Äquivalent
der in I c) angegebenen SEQ ID No. 1 weist wenigstens eine Identität von 69%,
70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, bevorzugt wenigstens 75%, 76%, 77%, 78%,
79%, 80%, 81 %, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%,
86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93%, besonders bevorzugt
wenigstens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit SEQ ID No. 1 auf.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in I) d) angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID No. 1 sind
von einer Aminosäuresequenz
codiert, die die Aktivität
einer nukleär
codierten Polynukleotidphosphorylase und wenigstens eine Identität von 65%,
66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, bevorzugt
wenigstens 78%, 79%, 80%, 81 %, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens
84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, besonders bevorzugt
wenigstens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, mit der SEQ ID No. 2 aufweist.
-
Das
funktionelle Äquivalent
der in II c) angegebenen SEQ ID No. 3 weist wenigstens eine Identität von 73%,
74%, bevorzugt wenigstens 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%
oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91 %, 92% oder 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%, 95%,
96%, 97%, 98% oder 99%, mit SEQ ID No. 3 auf.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in II) d) angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID No. 3 sind
von einer Aminosäuresequenz
codiert, die die Aktivität
einer nukleär
codierten Polynukleotidphosphorylase und wenigstens eine Identität von 71
%, bevorzugt wenigstens 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,
80%, 81 %, 82%, 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%,
88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99%, mit der SEQ ID No. 4 aufweist.
-
Das
funktionelle Äquivalent
der in III c) angegebenen SEQ ID No. 5 weist wenigstens eine Identität von 72%,
73%, 74%, bevorzugt wenigstens 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81
%, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91 %, 92% oder 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%,
95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit SEQ ID No. 6 auf.
-
Die
funktionellen Äquivalente
der in I) d) angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID No. 5 sind
von einer Aminosäuresequenz
codiert, die die Aktivität
einer nukleär
codierten Polynukleotidphosphorylase und wenigstens eine Identität von 72%,
73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, bevorzugt wenigstens 79%, 80%, 81
%, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99%, mit der SEQ ID No. 6 aufweist.
-
Ebenso
werden die von den oben erwähnten
Nukleinsäuresequenzen
gemäß I c)-d),
II c)-d) und III c)-d) codierten Polypeptide beansprucht. Die funktionellen Äquivalente,
wie in c) und d) beschrieben, zeichnen sich durch die gleiche Funktionalität aus, d.h.
sie weisen die Aktivität
einer Polynukleotidphosphorylase auf.
-
Die
Nukleinsäuresequenzen
I c)-d), II c)-d) und III c)-d) werden im folgenden als NPNP-Sequenzen bezeichnet.
-
Der
im folgenden verwendete Begriff "erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen" bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen,
die für
ein Polypeptid codieren, welches die Aktivität von nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase
in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden aufweist,
vorzugsweise eines Polypeptids, das die Aktivität von nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase
aufweist, bei der es sich um
- a) die von einer
Nukleinsäuresequenz
codierte Polynukleotidphosphorylase, die:
i) eine Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder
ii) eine
Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degenerie des genetischen Codes von der in SEQ
ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
iii) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit SEQ
ID NO. 1 von wenigstens 50% aufweist; oder
iv) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, welche eine Identität von wenigstens 50% mit der
SEQ ID NO. 2 aufweist, umfaßt,
oder
- b) die von einer Nukleinsäuresequenz
codierte Polynukleotidphosphorylase, die:
i) eine Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder
ii) eine
Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degenerie des genetischen Codes von der in SEQ
ID NO. 4 dargestellten Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
iii) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit SEQ
ID NO. 3 von wenigstens 50% aufweist; oder
iv) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, welche eine Identität von wenigstens 50% mit der
SEQ ID NO. 4 aufweist, umfaßt,
oder
- c) die von einer Nukleinsäuresequenz
codierte Polynukleotidphosphorylase-Protease, die:
i) eine Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder
ii) eine
Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degenerie des genetischen Codes von der in SEQ
ID NO. 6 dargestellten Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
iii) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit SEQ
ID NO. 5 von wenigstens 50% aufweist; oder
iv) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, welche eine Identität von wenigstens 50% mit der
SEQ ID NO. 6 aufweist, umfaßt,
oder
- d) die von einer Nukleinsäuresequenz
codierte Polynukleotidphosphorylase, die:
i) eine Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID NO. 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder
ii) eine
Nukleinsäuresequenz,
die aufgrund der Degenerie des genetischen Codes von der in SEQ
ID NO. 8 dargestellten Aminosäuresequenz
durch Rückübersetzung
abgeleitet werden kann, oder
iii) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit SEQ
ID NO. 7 von wenigstens 50% aufweist; oder
iv) ein funktionelles Äquivalent
der in SEQ ID NO. 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz
codiert wird, welche eine Identität von wenigstens 50% mit der
SEQ ID NO. 8 aufweist, umfaßt,
handelt.
-
Ein
Polypeptid, das die Aktivität
von nukleär
codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist und von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
codiert ist, wird im folgenden einfach als "PNP" bezeichnet.
-
Reduzierte
Mengen an Polynukleotidphosphorylase PNPase verursachen Wachstumsretardierung
sowie nekrotische und chlorotische Blätter in Pflanzen.
-
Die
Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen
neue Ziele für
Herbizide dar, wodurch die Bereitstellung neuer Herbizide zur Bekämpfung unerwünschter
Pflanzen ermöglicht
wird. Zudem stellen die Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren neue
Ziele für
Wachstumsregulatoren dar, durch die Bereitstellung neuer Wachstumsregulatoren
zur Regulation des Wachstums vom Pflanzen ermöglicht wird.
-
Unter
unerwünschten
Pflanzen sind im weitesten Sinne alle Pflanzen zu verstehen, die
an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind, beispielsweise:
dikotyle
Unkräuter
der Gattungen: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria,
Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca,
Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium,
Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica,
Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium,
Ranunculus, Taraxacum.
-
Monokotyle
Unkräuter
der Gattungen: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum,
Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus,
Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristylis, Sagittaria,
Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium,
Agrostis, Alopecurus, Apera.
-
SEQ
ID NO. 1, 3, 5 oder 7 läßt sich
ganz oder teilweise zur Herstellung von Hybridisierungssonden verwenden.
Die Herstellung dieser Sonden sowie die experimentelle Durchführung sind
bekannt. Letztere kann beispielsweise über die gezielte Herstellung
radioaktiver oder nichtradioaktiver Sonden mittels PCR und die Verwendung
entsprechend markierter Oligonukleotide mit anschließenden Hybridisierungsexperimenten erfolgen.
Die für
diesen Zweck benötigten
Technologien sind beispielsweise bei T. Maniatis, E.F. Fritsch und
J. Sambrook, "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ausführlich beschrieben.
Die betreffenden Sonden können
weiterhin mittels Standardtechnologien (Lit. SDM bzw. Zufallsmutagenese)
so modifiziert werden, daß sie
für weitere
Zwecke einsetzbar sind, beispielsweise als Sonde, die spezifisch
mit mRNA und den entsprechenden codierenden Sequenzen hybridisiert,
um die entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen zu analysieren.
-
Die
oben erwähnten
Sonden lassen sich zum Nachweis und zur Isolierung funktioneller Äquivalente der
SEQ ID NO. 2, 4, 6 oder 8 aus anderen Pflanzenspezies auf der Grundlage
von Sequenzidentitäten
verwenden. Hierbei wird die Sequenz der betreffenden SEQ ID NO.
2 ganz oder teilweise als Sonde zum Screening einer genomischen
oder cDNA-Bibliothek der betreffenden Pflanzenspezies oder in einer
Computer-Recherche nach Sequenzen funktioneller Äquivalente in elektronischen
Datenbanken verwendet.
-
Bevorzugte
Pflanzenspezies sind dabei die unerwünschten Pflanzen, die bereits
eingangs erwähnt wurden.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin Expressionskassetten, umfassend
- a) genetische Kontrollsequenzen in operativer
Verknüpfung
mit einer NPNP-Sequenz;
oder
- b) zusätzliche
Funktionselemente, oder
- c) eine Kombination aus a) und b);
sowie die Verwendung
von Expressionskassetten, umfassend - a) genetische
Kontrollsequenzen in operativer Verknüpfung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz,
- b) zusätzliche
Funktionselemente, oder
- c) eine Kombination aus a) und b);
zur Expression
einer PNPase, die sich in in-vitro-Testsystemen verwenden läßt. Beide
Ausführungsformen
der oben beschriebenen Expressionskassetten werden im folgenden
als erfindungsgemäße Expressionskassetten
bezeichnet.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
eine erfindungsgemäße Expressionskassette
am 5'-Ende der codierenden
Sequenz einen Promotor sowie am 3'-Ende ein Transkriptionsterminationssignal
und gegebenenfalls weitere genetische Kontrollsequenzen, welche
mit der dazwischenliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
operativ verknüpft
sind.
-
Unter
den erfindungsgemäßen Expressionskassetten
sind auch Analoge zu verstehen, die beispielsweise durch eine Kombination
der einzelnen Nukleinsäuresequenzen
auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte), auf mehreren Polynukleotiden
in einer Zelle (Kotransformation) oder durch sequenzielle Transformation
zustande kommen können.
-
Vorteilhafte
genetische Kontrollsequenzen unter Punkt a) für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten
oder für
erfindungsgemäße Expressionskassetten
umfassende Vektoren sind beispielsweise Promotoren, wie z.B. der
cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-,
trc-, ara-, SP6-, λ-PR-
oder der λ-PL-Promotor,
wobei sich die Promotoren jeweils zur Expression einer Polynukleotidphosphorylase
in Gramnegativen Bakterienstämmen
verwenden lassen.
-
Weitere
vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen liegen beispielsweise
in den Promotoren amy und SPO2, die sich jeweils zur Expression
von Polynukleotid-phosphorylase in Gram-positiven Bakterienstämmen verwenden
lassen, sowie in den Hefe- bzw. Pilzpromotoren AUG1, GPD-1, PX6,
TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PHO5, AOX1, GAL10/CYC1, CYC1, OliC, ADH,
TDH, Kex2, MFA oder NMT oder Kombinationen der oben genannten Promotoren
(Degryse et al., Yeast, 15. Juni 1995; 11(7):629-40; Romanos et
al. Yeast, Juni 1992;8(6):423-88; Benito et al. Eur. J. Plant Pathol.
104, 207-220 (1998);
Cregg et al. Biotechnology (N Y), August 1993;11(8):905-10; Luo
X., Gene, 22. Sept. 1995;163(1):127-31: Nacken et al., Gene, 10.
Okt. 1996;175(1-2): 253-60; Turgeon et al., Mol Cell Biol, Sept.
1987;7(9):3297-305) oder den Transkriptions-terminatoren NMT, Gcy1,
TrpC, AOX1, nos, PGK oder CYC1 (Degryse et al., Yeast, 15. Juni
1995; 11(7):629-40; Brunelli et al. Yeast, Dez. 1993 9(12): 1309-18;
Frisch et al., Plant Mol. Biol. 27(2), 405-409 (1995); Scorer et al.,
Biotechnology (N.Y. 12 (2), 181-184
(1994), Genbank acc. number Z46232; Zhao et al. Genbank acc number
AF049064; Punt et al., (1987) Gene 56 (1), 117-124) vor, wobei diese
Sequenzen sich jeweils zur Expression von Polynukleotidphosphorylase
in Hefestämmen
verwenden lassen.
-
Für die Expression
in Insektenzellen geeignete genetische Kontrollsequenzen sind beispielsweise
der Polyhedrin-Promotor sowie der p10-Promotor (Luckow, V.A. und
Summers, M.D. (1988) Bio/Techn. 6, 47-55).
-
Vorteilhafte
genetische Kontrollsequenzen zur Expression von PNP in Zellkultur
sind neben Polyadenylierungssequenzes, wie beispielsweise aus Affenvirus
40, eukaryontische Promotoren viralen Ursprungs, wie z.B. Promotoren
des Polyomavirus, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Affenvirus
40.
-
Weitere
vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression nukleär codierter
PNPase in Pflanzen liegen in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck
et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol.
22 (1993)], SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940)
oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor, wobei vorzugsweise insbesondere
ein Pflanzenpromotor oder ein aus einem Pflanzenvirus stammender
Promotor verwendet wird. Besonders bevorzugt sind Promotoren viralen
Ursprungs, wie etwa der Promotor des 35S-Transkripts des Blumenkohlmosaikvirus
(Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294; Odell et al., Nature 313
(1985), 810-812). Weitere bevorzugte konstitutive Promotoren sind beispielsweise
der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobakterium, der TR Doppelpromotor,
der OCS (Octopin-Synthase)-Promotor aus Agrobakterium, der Ubiquitin-Promotor,
(Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29:637-649), die Promotoren
der vakuolären
ATPase-Untereinheiten
oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991).
-
Die
Expressionskassetten können
auch einen chemisch induzierbaren Promotor als genetische Kontrollsequenz
enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze
zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren,
wie etwa beispielsweise der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol.
Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor
(WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor
(EP-A-0388186), ein durch Tetracyclin induzierbarer Promotor (Gatz
et al., (1992) Plant J. 2, 397404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer
Promotor (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon
induzierbarer Promotor (WO 93/21334), können ebenso verwendet werden.
-
Geeignet
sind weiterhin solche Promotoren, die eine gewebe- oder organspezifische
Expression, beispielsweise in Antheren, Ovarien, Blüten und
Blütenorganen,
Blättern,
Schließzellen,
Trichomen, Stengel, Leitgeweben, Wurzeln und Samen, vermitteln.
Ebenso geeignet sind neben den oben genannten konstitutiven Promotoren
insbesondere solche Promotoren, die eine blattspezifische Expression
gewährleisten.
Zu nennen sind hier der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel
(WO 97/05900), der SSU (small subunit)-Promotor der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase)
oder der ST-LSI-Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J.
8 (1989), 2445-245).
Bevorzugt sind weiterhin Promotoren, die eine Expression in Samen und
pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind
zum Beispiel der Phaseolin-Promotor (
US
5,504,200 , Bustos MM et al., Plant Cell. 1989;1(9):839-53),
the Promotor des 2S-Albumin-Gens (Joseffson LG et al., J Biol Chem
1987, 262:12196-12201),
der Legumin-Promotor (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989;215(2):326-331),
der Promotor des USP (unknown seed protein) (Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics
1991, 225(3):459-67), der Promotor des Napin-Gens (Stalberg K, et
al., L. Planta 1996, 199:515-519), der Promotor des Saccharosebindungsproteins
(WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al., Mol Gen Genet
1991, 225: 121-128;
Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090).
-
Weitere
als genetische Kontrollsequenzen geeignete Promotoren sind beispielsweise
spezifische Promotoren für
Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin-Promotor
Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin-D-Inhibitors aus Kar toffel,
der Promotor der Stärke-Synthase
(GBSS1) oder der Sporamin-Promotor, fruchtspezifische Promotoren,
wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A
409625), fruchtreifungsspezifische Promotoren, wie beispielsweise
der fruchtreifungsspezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794),
blütenspezifische
Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Synthase-Promotor (WO
92/16635) oder der Promotor des P-rr-Gens (WO 98/22593), oder spezifische
Plastiden- oder Chromoplasten-Promotoren, wie beispielsweise der
RNA-Polymerase-Promotor (WO 97/06250), oder auch der Promotor der
Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase
aus Glycin max (siehe auch Genbank Accession Nr. U87999), oder ein
anderer Nodien-spezifischer Promotor, wie in der EP-A 249676 beschrieben.
-
Unter
zusätzlichen
Funktionselementen b) sind beispielhaft, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Reportergene,
Replikationsursprünge,
Selektionsmarker und sogenannte Affinitäts-Tags, fusioniert mit Polynukleotidphosphorylase,
direkt oder mittels eines Linkers, der optional eine Protease-Schnittstelle
umfaßt,
zu verstehen. Weitere geeignete zusätzliche Funktionselemente sind
Sequenzen, die sicherstellen, daß das Produkt in die Apoplasten,
in Plastiden, in die Vacuole, in das Mitochondrium, in das Peroxisom,
in das endoplasmatische Reticulum (ER) geleitet wird oder aufgrund
des Fehlens derartiger operativer Sequenzen im Kompartiment verbleibt,
in dem es entstand, nämlich
dem Cytosol, (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423).
-
Ebenso
sind im Sinne der Erfindung Vektoren, die wenigstens eine Kopie
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassetten
umfassen.
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Außer Plasmiden
sind unter Vektoren auch alle anderen, dem Fachmann geläufigen Vektoren,
wie etwa beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus,
Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide
oder lineare oder zirkuläre
DNA, zu verstehen. Dabei können
diese Vektoren autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal
repliziert werden; bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Vektors läßt sich
das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt
auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen
einführen
und über
heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus
integrieren. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid
oder lediglich aus dem Nukleinsäurekonstrukt
als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
-
Weitere
prokaryontische oder eukaryontische Expressionssysteme sind in Kapitel
16 und 17 bei Sambrook et al., "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual." 2.
Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, genannt. Weitere vorteilhafte
Vektoren sind bei Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000)
beschrieben.
-
Die
erfindungsgemäße Expressionskassette
sowie davon abgeleitete Vektoren lassen sich zur Transformation
von Bakterien, Cyanobakterien (z.B. der Gattung Synechocystis, Anabaena,
Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema und Nostoc), Proteobakterien,
wie etwa Magnetococcus sp. MC1, Hefen, filamentösen Pilzen sowie Algen und
eukaryontischen nichtmenschlichen Zellen (z.B. Insektenzellen) mit
dem Ziel der rekombinanten Herstellung von PNP, einsetzen, wobei
die Erzeugung einer geeigneten Expressionskassette von dem Organismus,
in dem das Gen exprimiert werden soll, abhängt.
-
Eine
NPNP-Sequenz umfassende Vektoren bilden einen Teil des Gegenstands
der vorliegenden Erfindung.
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In
einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
auch alleine in einen Organismus eingeführt werden.
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Sollen
neben den Nukleinsäuresequenzen
weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle
zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen jeweils
in einem Vektor in den Organismus eingeführt werden, wobei die unterschiedlichen
Vektoren gleichzeitig oder nacheinander eingeführt werden können.
-
Dabei
kann das Einführen
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n),
der Expressionskassette oder des Vektors in die betreffenden Organismen
(Transformation) prinzipiell nach allen dem Fachmann geläufigen Verfahren
erfolgen.
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Im
Falle von Mikroorganismen kann der Fachmann geeignete Verfahren
den Lehrbüchern
von Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular
cloning: A laboratory manual",
Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) "Current protocols
in molecular biology",
John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Bnd. 1,
(1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994)
Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder
Guthrie et al. "Guide
to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, 1994, Academic
Press, entnehmen. Bei der Transformation filamentöser Pilze bieten
sich zum einen die Erzeugung von Protoplasten und Transformation
mit Hilfe von PEG (Wiebe et al. (1997) Mycol. Res. 101 (7): 971-877;
Proctor et al. (1997) Microbiol. 143, 2538-2591) und zum anderen
die Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens (de Groot
et al. (1998) Nat. Biotech. 16, 839-842) als Verfahren an.
-
Im
Falle von dikotylen Pflanzen lassen sich die beschriebenen Verfahren
zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben
oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation
nutzen. Geeignete Verfahren sind dabei das biolistische Verfahren
oder die Transformation von Protoplasten (vgl. z.B. Willmitzer,
L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive
Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, Hrsg.), Bd.
2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basle-Cambridge), Elektroporation,
die Inkubation trockener Embryos in DNA-haltiger Lösung, Mikroinjektion
sowie der durch Agrobakterium verbreitete Gentransfer. Die oben
erwähnten
Verfahren sind beispielsweise bei B. Jenes et al., Techniques for
Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization,
herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 und bei Potrykus,
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben.
-
Die
Transformation mittels Agrobakterien sowie die zur Transformation
zu verwendenden Vektoren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur
ausführlich
beschrieben (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711. Die
intermediären
Vektoren lassen sich aufgrund von Sequenzen, die zu Sequenzen in
der T-DNA homolog sind, mittels homologer Rekombination in das Ti-
oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integrieren. Dieses Plasmid enthält zusätzlich den
für den
Transfer der T-DNA benötigten
vir-Bereich. Intermediäre Vektoren
sind nicht in der Lage, in Agrobakterien zu replizieren. Mittels
eines Helferplasmids läßt sich
der intermediäre
Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen (Konjugation). Binäre Vektoren
können
sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten
ein Selektionsmarkergen sowie einen Linker oder Polylinker, die
vom rechten und linken T-DNA-Grenzbereich eingerahmt werden. Sie
lassen sich direkt in die Agrobakterien transformieren (Holsters
et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187), EP A 0 120 516; Hoekema,
in: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V.,
Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant.
Sci., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287).
-
Auch
die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Vektoren auf Agrobakterium-Basis wurde beschrieben
(Chan et al., Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al., Plant
J. 6 (1994) 271-282; Deng et al. Science in China 33 (1990), 28-34;
Wilmink et al., Plant Cell Reports 11,(1992) 76-80; May et al. Biotechnology 13
(1995) 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992)
550-555; Ritchie et al. Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative
Systeme zur Transformation monokotyler Pflanzen sind die Transformation
mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol.
104 (1994), 37-48; Vasil et al. Biotechnology 11 (1992), 667-674;
Ritala et al., Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spencer et al.,
Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), die Protoplastentransformation,
die Elektroporation partiell permeabilisierter Zellen sowie die Einführung von
DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais
ist in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z.B. WO 95/06128;
EP 0513849 A1 ;
EP 0465875 A1 ;
EP 0292435 A1 ;
Fromm et al., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al.,
Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11(1993)
194-200; Moroc et al., Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).
-
Auch
die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits
beschrieben, beispielsweise für
Gerste (Wan und Lemaux, see above; Ritala et al., siehe oben (Nehra
et al., Plant J. 5(1994) 285-297).
-
Mit
einem erfindungsgemäßen Vektor
transformierte Agrobacterien können
ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, wie
etwa Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide,
Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Kanola,
Sonnenblume, Flax, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Pfefferschote,
Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den
verschiedenen Baum-, Nuß-
und Weinspezies verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder
Blattstücke
in einer Agrobakterienlösung
gebadet und anschließend
in geeigneten Medien kultiviert werden.
-
Die
genetisch veränderten
Planzenzellen lassen sich über
alle dem Fachmann geläufigen
Verfahren regenerieren. Derartige Verfahren können den oben erwähnten Veröffentlichungen
von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen
werden.
-
Die
durch die Transformation mit einer der oben beschriebenen Ausführungsformen
einer Expressionskassette, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz,
oder einem Vektor, umfassend die oben erwähnte Expressionskassette, erzeugten
transgenen Organismen sowie die mittels Expression aus dem transgenen
Organismus erhältliche
rekombinante PNP bilden einen Teil des Gegenstands der vorliegenden
Erfindung. Die Verwendung transgener Organismen, umfassend eine
erfindungsgemäße Expressionskassette,
beispielsweise zur Bereitstellung von rekombinantem Protein, und/oder
die Verwendung dieser Organismen in in-vivo-Testsystemen bilden
ebenfalls einen Teil des Gegenstands der vorliegenden Erfindung.
-
Bevorzugte
Organismen für
die rekombinante Expression sind nicht nur Bakterien, Hefen, Mose,
Algen und Pilze, sondern auch eukaryontische Zellinien.
-
Bevorzugte
Mose sind Physcomitrella patens oder weitere in Kryptogamen [Cryptogamia],
Bd. 2, Moose, Farne [Mosses, Ferns], 1991, Springer Verlag (ISBN
3540536515) beschriebene Mose.
-
Innerhalb
der Bakterien sind beispielsweise Bakterien der Gattung Escherichia,
Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien, beispielsweise
der Gattung Synechocystis, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria,
Plectonema und Nostoc, besonders bevorzugt Synechocystis oder Anabaena,
bevorzugt.
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Bevorzugte
Hefen sind Candida, Saccharomyces, Schizosaccheromyces, Hansenula
oder Pichia.
-
Bevorzugte
Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium,
Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian
Chem Engr. Section B. Bd. 37, Nr. 1,2 (1995) beschriebene Pilze.
-
Bevorzugte
Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen,
wie beispielsweise Getreidearten wie Weizen, Gerste, Sorghum oder
Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie Zuckerrohr.
Weiterhin sind die erfindungsgemäßen transgenen
Pflanzen insbesondere ausgewählt
unter dikotylen Kulturpflanzen, wie beispielsweise Brassicaceae
wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Kanola; Leguminosae
wie Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuß, Solanaceae
wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Pfefferschote; Asteraceae
wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula; Cucurbitaceae wie
Melone, Kürbis
oder Zucchini, oder Lein, Baumwolle, Hanf, Flax, roter Pfeffer,
Möhre,
Zuckerrübe, oder
verschiedene Baum-, Nuß-
und Weinspezies.
-
Prinzipiell
sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet, wie beispielsweise
C. elegans.
-
Ebenso
bevorzugt ist die Verwendung von Expressionssystemen und Vektoren,
die öffentlich
zugänglich
oder kommerziell erhältlich
sind.
-
Zur
Verwendung in E. coli-Bakterien sind die typischen vorteilhaften,
kommerziell erhältlichen
Fusions- und Expressionsvektoren pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith,
D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England
Biolabs, Beverly, MA) bzw. pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die
Glutathione-S-Transferase (GST), Maltosebindungsprotein bzw. Protein
A enthalten, die pTrc-Vektoren (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315), "pKK233-2" der Firma CLONTECH,
Palo Alto, CA sowie die Vektorserien "pET" und "pBAD" der Firma Stratagene,
La Jolla und die Vektorserie TOPO-TA der Firma Invitrogen zu nennen.
-
Weitere
vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSec1 (Baldari,
et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz,
(1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123)
sowie pYES-Derivate, pGAPZ- Derivate, pPICZ-Derivate sowie Vektoren
des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation,
San Diego, CA). Vektoren zur Verwendung in filamentösen Pilzen
sind beschrieben bei: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems
and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular
Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge
University Press: Cambridge.
-
Alternativ
können
auch vorteilhafterweise Insektenzellenexpressionsvektoren verwendet
werden, beispielsweise für
die Expression in Sf9-, Sf21- oder Hi5-Zellen, die jeweils über rekombinante
Baculoviren infiziert werden. Beispiele hierfür sind die Vektoren der pAc-Serie
(Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL-Serie
(Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39). Weiter genannt
seien die Baculovirus-Expressionssysteme "MaxBac 2.0 Kit" und "Insect Select System" der Firma Invitrogen, Carlsbad, USA, oder "BacPAK Baculovirus
Expression System" der
Firma CLONTECH, Palo Alto, CA, USA. Insektenzellen eignen sich in
besonderer Weise zur Überexpression
eukaryontischer Proteine, da sie posttranslational Modifikationen
der Proteine durchführen,
die in Bakterien und Hefen nicht möglich sind. Die Handhabung
von Insektenzellen in Zellkultur sowie ihre Infektion zur Expression
von Proteinen sind dem Fachmann geläufig und können in Analogie zu bekannten
Verfahren erfolgen (Luckow und Summers, Bio/Tech. 6, 1988, S. 47-55;
Glover und Hames (Hrsg.) in DNA Cloning 2, A practical Approach,
Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995,
205-244).
-
Des
weiteren können
zur Expression von Genen vorteilhafterweise Pflanzenzellen oder
Algenzellen eingesetzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren
finden sich, wie oben erwähnt,
bei Becker, D., et al. (1992) "New
plant binary vectors with selectable markers located proximal to
the left border",
Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder bei Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium
vectors for plant transformation",
Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
-
Zudem
lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
in Säugerzellen
exprimieren. Beispiele für
geeignete Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC, die in Seed,
B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195
Erwähnung
finden. Vorzugsweise zu verwendende Promotoren sind dabei viralen
Ursprungs, wie beispielsweise Promotoren des Polyomavirus, Adenovirus
2, Cytomegalovirus oder Affenvirus 40. Weitere prokaryontische und
eukaryontische Expressionssysteme sind in Kapitel 16 und 17 in Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1989, genannt. Weitere vorteilhafte Vektoren sind bei
Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
-
Die
transgenen Organismen, die eine NPNP-Sequenz umfassen, werden im
Rahmen der vorliegenden Erfindung beansprucht.
-
Sämtliche
oben beschriebene Ausführungsformen
der transgenen Organismen, die wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
umfassen, fallen unter den Begriff "erfindungsgemäßer transgener Organismus".
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von PNP
in einem Verfahren zur Identifizierung von Testverbindungen mit
herbizider Wirkung.
-
Bevorzugt
umfaßt
das erfindungsgemäße Verfahren
zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung die
folgenden Schritte:
- i. in Kontakt bringen von
PNP mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen,
die die Bindung der Testverbindung(en) an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
oder an PNP gestatten, und
- ii. Nachweisen, ob die Testverbindung an die PNP aus i) bindet,
oder
- iii. Nachweisen, ob die Testverbindung die enzymatische oder
biologische Aktivität
von PNP aus i) reduziert oder blockiert, oder
- iv. Nachweisen, ob die Testverbindung die Transkription, Translation
oder Expression von PNP aus i) reduziert oder blockiert.
-
Der
Nachweis gemäß Schritt
(ii) des obigen Verfahrens läßt sich
unter Verwendung von Techniken, mit denen die Wechselwirkung zwischen
dem Polypeptid und Liganden identifiziert werden kann, durchführen. Dabei
kann entweder die Testverbindung oder das Enzym eine nachweisbare
Markierung enthalten, wie beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung,
ein Radioisotop, eine Chemilumineszenzmarkierung oder eine Enzymmakierung.
Beispiele für
Enzymmarkierungen sind Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase
oder Luziferase. Der anschließende
Nachweis hängt
von der Markierung ab und ist dem Fachmann bekannt.
-
In
diesem Zusammenhang sind insbesondere fünf bevorzugte Ausführungsformen
zu nennen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung auch
für Verfahren
mit hohem Durchsatz (high-throughput methods, HTS) geeignet sind:
- 1. Die mittlere Diffusionsgeschwindigkeit eines
Fluoreszenzmoleküls
in Abhängigkeit
von der Masse läßt sich
in einem kleinen Probenvolumen über
Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie
(FCS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 11753-11575) bestimmen. FCS läßt sich
zur Bestimmung von Protein/Ligand-Wechselwirkungen einsetzen, indem die
Massenänderung
bzw. die daraus resultierende veränderte Diffusionsgeschwindigkeit
einer Testverbindung, wenn diese an PNP bindet, gemessen wird. Ein
erfindungsgemäßes Verfahren
kann direkt zur Messung der Bindung einer mit einem Fluoreszenzmolekül markierten
Testverbindung aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren
so konzipiert sein, daß eine mit
einem Fluoreszenzmolekül
markierte chemische Referenzverbindung durch weitere Testverbindungen verdrängt wird
("Verdrängungs-Assay").
- 2. Bei der Fluoreszenzpolarisation wird die Eigenschaft eines
mit polarisiertem Licht angeregten ruhenden Fluorophors, ebenfalls
wieder polarisiertes Licht zu emitieren, ausgenutzt. Läßt man allerdings
den Fluorophor im angeregten Zustand rotieren, so geht die Polarisation
des emitierten Fluoreszenzlichts mehr oder weniger verloren. Bei
sonst gleichen Bedingungen (z.B. Temperatur, Viskosität, Lösungsmittel)
ist die Rotation eine Funktion der Molekülgröße, womit man über das
abgelesene Signal Erkenntnisse über
die Größe des am
Fluorophor gebundenen Rests gewinnen kann (Methods in Enzymology
246 (1995), S. 283-300). Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur
Messung der Bindung einer mit einem Fluoreszenzmolekül markierten
Testverbindung an die PNP aufgebaut werden. Alternativ kann das
erfindungsgemäße Verfahren
auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungs-Assays" erfolgen.
- 3. Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) basiert auf der
strahlungslosen Energieübertragung
zwischen zwei räumlich
benachbarten Fluoreszenzmolekülen
unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung dabei ist die Überlappung
des Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des
Akzeptormoleküls.
Die Fluoreszenzmarkierung der PNP sowie Bindung der Testverbindung,
die Bindung läßt sich
mittels FRET messen (Cytometry 34, 1998, S. 159-179). Alternativ
kann das erfindungsgemäße Verfahren
auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungs-Assays" erfolgen. Eine besonders geeignete
Ausführungsform
der FRET-Technologie ist HTRF ("Homogeneous
Time Resolved Fluorescence"),
wie sie von der Firma Packard BioScience erhältlich ist.
- 4. SELDI (Surface-enhanced laser desorption/ionization) in Kombination
mit MALDITOF (time-of-flight mass spectrometer) ermöglicht die
schnelle Analyse von Molekülen
auf einem Träger
und kann zur Analyse von Protein-Ligand-Wechselwirkungen verwendet werden (Worral
et al., (1998) Anal. Biochem. 70:750-756). In einer bevorzugten
Ausführungsform
wird PNP auf einem geeigneten Träger
immobilisiert und mit der Testverbindung inkubiert. Nach einem oder
mehreren geeigneten Waschschritten lassen sich die an PNP zusätzlich gebundenen
Moleküle
der Testverbindung mittels der oben erwähnten Methodik nachweisen und
somit an PNP gebundene Testverbindungen selektionieren.
- 5. Die Messung von Oberflächenplasmonresonanz
basiert auf der Änderung
des Brechungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer Testverbindung
an ein auf der Oberfläche
mobilisiertes Protein. Da die Änderung
des Brechungsinde xes für
eine definierte Änderung
der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide
identisch ist, läßt sich
dieses Verfahren im Prinzip auf jedes Protein ansetzen (Lindberg
et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993)
186-187). Die Messung kann beispielsweise mit dem von der Firma
Biacore (Freiburg) erhältlichen
auf Oberflächenplasmonresonanz
beruhenden Analyseautomaten mit einem Durchsatz von derzeit bis
zu 384 Proben pro Tag durchgeführt
werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren
kann direkt zur Messung der Bindung einer Testverbindung an PNP
aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren
auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungs-Assays" erfolgen.
-
Die über die
oben erwähnten
Verfahren 1 bis 5 identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet
sein. Sämtliche über die
oben erwähnten
Verfahren identifizierten Substanzen können anschließend in einer
weiteren Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
auf ihre herbizide Wirkung überprüft werden.
-
Weiterhin
besteht die Möglichkeit, über die
Aufklärung
der dreidimensionalen Struktur der PNP mittels Röntgenstrukturanalyse weitere
potentielle herbizide Wirkstoffe über "Molecular Modelling" nachzuweisen. Die Herstellung von für die Röntgenstrukturanalyse
benötigten
Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen
dieser Messungen, der Nachweis einer Bindungsstelle im Protein sowie
die Vorhersage potentieller Inhibitorstrukturen sind dem Fachmann
bekannt. Über "Molecular Modelling" ist prinzipiell
auch eine Optimierung der mit dem oben erwähnten Verfahren identifizierten
Verbindung möglich.
-
Eine
bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
die auf den Schritten i) und ii) beruht, besteht darin, daß eine Testverbindung
ausgewählt
wird, die die Aktivität
der PNP reduziert oder blockiert. Vorzugsweise wird hierbei die
Aktivität
der mit der Testverbindung inkubierten PNP mit der Aktivität einer nicht
mit einer Testverbindung inkubierten PNP verglichen.
-
Eine
stärker
bevorzugte Ausführungsform
des auf den Schritten i) und ii) beruhenden Verfahrens besteht darin,
daß man
- i. PNP in einem erfindungsgemäßen transgenen
Organismus exprimiert oder einen Organismus anzieht, der PNP natürlicherweise
enthält,
- ii. PNP aus Schritt i) entweder im Zellverdau des transgenen
oder nichttransgenen Organismus, in teilgereinigter oder in homogen
gereinigter Form mit einer Testverbindung in Kontakt bringt; und
- iii. eine Verbindung auswählt,
die die Aktivität
der nukleär
codierten PNPase reduziert oder blockiert. Vorzugsweise wird hierbei
die Aktivität
von mit der Testverbindung inkubierter PNP mit der Aktivität einer
nicht mit einer Testverbindung inkubierten PNP verglichen.
-
Die
PNP enthaltende Lösung
kann aus dem Lysat des ursprünglichen
Organismus oder des transgenen, mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette
transformierten Organismus bestehen. Falls notwendig kann die PNP
teilweise oder vollständig über gängige Verfahren
aufgereinigt werden. Eine allgemeine Übersicht über derzeitige Proteinreinigungstechniken
ist beispielsweise bei Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in
Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience
(1994); ISBN 0-87969-309-6, beschrieben. Bei einer rekombinanten
Präparation
kann die Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Proteins über eine
Affinitätschromatographie,
wie sie dem Fachmann bekannt ist, erfolgen.
-
Die
für in-vitro-Verfahren
benötigte
PNP läßt sich
somit entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen transgenen
Organismus oder aus einem PNP enthaltenden Organismus, beispielsweise
aus einer unerwünschten
Pflanze, isolieren, wobei unter dem Begriff "unerwünschte Pflanze" die eingangs erwähnten Spezies
zu verstehen sind.
-
Zur
Identifizierung herbizider Verbindungen wird nun die PNP mit einer
Testverbindung inkubiert. Nach einer Reaktionszeit wird die enzymatische
Aktivität
der mit der Testverbindung inkubierten PNP im Vergleich zu einer
nicht mit einer Testverbindung inkubierten PNP bestimmt. Bei einer
Hemmung der PNP wird eine signifikante Abnahme der Aktivität im Vergleich
zur Aktivität
des nicht gehemmten erfindungsgemäßen Polypeptids beobachtet,
was zu einer Abnahme von wenigstens 10%, vorteilhafterweise wenigstens
20%, vorzugsweise wenigstens 30%, besonders bevorzugt wenigstens
50%, bis zu einer 100%igen Reduktion (Blockierung) führt. Dabei
ist eine Hemmung von wenigstens 50% bei Konzentrationen der Testverbindung
von 10–4M,
vorzugsweise bei 10–5M, besonders bevorzugt
von 10–6M,
bezogen auf die Enzymkonzentration im mikromolaren Bereich bevorzugt.
-
Die
enzymatische Aktivität
von PNP läßt sich
beispielsweise mit einem Aktivitätstest,
bei dem die Zunahme des Produkts, die Abnahme des Substrats (oder
Ausgangsmaterials) oder die Abnahme bzw. Zunahme des Kofaktors bestimmt
werden, ober über
eine Kombination aus wenigstens zwei der oben genannten Parameter
als zeitlicher Verlauf über
einen definierten Zeitraum bestimmen.
-
Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
die auf den Schritten i) und iii) beruht, besteht aus den folgenden
Schritten:
- i. Erzeugen eines eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
umfassenden erfindungsgemäßen transgenen
Organismus, wobei PNP rekombinant exprimiert wird;
- ii. Applizieren einer Testverbindung an den transgenen Organismus
aus i) und an einen nichttransgenen Organismus der gleichen Spezies;
- iii. Bestimmen des Wachstums oder der Lebensfähigkeit
des transgenen und des nichttransgenen Organismus nach Applikation
der Testsubstanz und
- iv. Auswählen
von Testverbindungen, die zu einem reduzierten Wachstum oder einer
begrenzten Lebensfähigkeit
des nichtransgenen Organismus im Vergleich zum Wachstum des transgenen
Organismus führen.
-
Dabei
beträgt
der Wachstumsunterschied in Schritt iv) für die Auswahl eines Inhibitors
mit herbizider Wirkung wenigstens 10%, bevorzugt 20%, vorzugsweise
30%, besonders bevorzugt 40% und ganz besonders bevorzugt 50%.
-
Bei
dem transgenen Organismus handelt es sich in diesem Zusammenhang
vorzugsweise um eine Pflanze, eine Alge, ein Cyanobakterium, beispielsweise
der Gattung Synechocystis oder ein Proteobakterium wie beispielsweise
Magnetococcus sp. MC1, vorzugsweise Pflanzen, die mittels herkömmlicher
Techniken transformiert werden können,
wie etwa Arabidopsis thaliana Allium cepa, Ananas comosus, Arachis
hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima,
Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus
var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis,
Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus
sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis
sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria
vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium
herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum
vulgare, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris,
Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot
esculenta, Medicago sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N.rustica),
Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris,
Picea abies, Pinus spec., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica,
Pyrus communis, Ribes sylvestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum,
Secale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgare),
Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum
durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays, oder Cyanobakterien, die
sich leicht transformieren lassen, wie etwa Synechocystis, in die
jeweils die für
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
codierende Sequenz durch Transformation eingebracht wurde. Diese
transgenen Organismen weisen somit eine erhöhte Toleranz gegenüber Verbindungen
auf, die das erfindungsgemäße Polypeptid
hemmen. "Knock-out"-Mutanten, bei denen
das in diesem Organismus natürlich
vorhande ne analoge Gen für
Polynukleotid- phosphorylase gezielt ausgeschaltet wurde, können ebenso
verwendet werden.
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Die
oben genannte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
läßt sich
jedoch auch zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer
Wirkung verwenden. Dabei wird als transgener Organismus eine Pflanze
eingesetzt. Das Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit
wachstumsregulatorischer Wirkung umfaßt somit die folgenden Schritte:
- i. Erzeugen einer eine für PNP codierende erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
umfassenden transgenen Pflanze, wobei PNP rekombinant exprimiert
wird;
- ii. Applizieren einer Testsubstanz auf die transgene Pflanze
aus i) und auf eine nichttransgene Pflanze der gleichen Sorte,
- iii. Bestimmen des Wachstums oder der Lebensfähigkeit
der transgenen Pflanze sowie der nichttransgenen Pflanze nach Applikation
der Testverbindung und
- iv. Auswählen
von Testsubstanzen, die zu einem reduzierten Wachstum der nichttransgenen
Pflanze im Vergleich zum Wachstum der transgenen Pflanze führen.
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Hierbei
werden in Schritt iv) Testverbindungen ausgewählt, die zu einem veränderten
Wachstum des nichttransgenen Organismus im Vergleich zum Wachstum
des transgenen Organismus führen.
Unter verändertem
Wachstum ist dabei eine Hemmung des vegetativen Wachstums der Pflanzen
zu verstehen, was sich insbesondere in einer Reduzierung des Längenwachstums äußern kann.
Die behandelten Pflanzen weisen demgemäß einen gedrungenen Wuchs auf;
außerdem
ist eine dunklere Blattfärbung
zu beobachten. Darüber hinaus
ist unter verändertem
Wachstum auch eine zeitliche Veränderung
des Reifeverlaufs, die Hemmung oder Förderung seitlicher Verzweigungen
der Pflanzen, die Verkürzung
bzw. Verlängerung
der Entwicklungsstadien, eine erhöhte Standfestigkeit, das Wachstum
größerer Mengen
an Knospen, Blüten,
Blättern,
Früchten,
Samenkörnern,
Wurzeln und Knollen, ein erhöhter
Zuckergehalt in Pflanzen wie etwas Zuckerrüben, Zuckerrohr und Zitrusfrüchten, ein
erhöhter
Proteingehalt in Pflanzen wie etwa Getreide oder Soja oder eine
Stimulierung des Latexflusses in Gummibäumen zu verstehen. Der Nachweis
eines derartigen veränderten Wachstums
ist dem Fachmann geläufig.
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Ebenso
besteht beim erfindungsgemäßen Verfahren
die Möglichkeit,
mehrere Testverbindungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen.
Wenn durch eine Gruppe von Testverbindungen eine Beeinflussung des
Ziels erfolgt, ist es entweder möglich,
die einzelnen Testverbindungen direkt zu isolieren oder die Gruppe
von Testverbindungen in verschiedene Untergruppen zu teilen, beispielsweise
wenn sie aus einer Vielzahl unterschiedlicher Komponenten besteht,
um so die Zahl der unterschiedlichen Testverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren
zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren
wird dann mit der einzelnen Testverbindung oder der jeweiligen Untergruppe
von Testverbindungen wiederholt. Je nach der Komplexität der Probe
lassen sich die oben beschriebenen Schritte wiederholt durchführen, vorzugsweise
bis die im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierte
Untergruppe nur noch eine geringe Anzahl von Testverbindungen oder
tatsächlich
gerade nur eine Testverbindung umfaßt.
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Alle
oben beschriebenen Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
mit herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung werden im folgenden
als "erfindungsgemäße Verfahren" bezeichnet.
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Sämtliche über die
erfindungsgemäßen Verfahren
identifizierten Verbindungen lassen sich anschließend auf
ihre herbizide bzw. wachstumsregulatorische Wirkung in-vivo überprüfen. Eine
Möglichkeit
zur Prüfung
der Verbindungen auf herbizide Wirkung ist die Verwendung der Wasserrinsel
Lemna minor in Mikrotiterplatten. Als Parameter können dabei
Veränderungen
des Chlorophyllgehalts und die Geschwindigkeit der Photosynthese
gemessen werden. Es ist auch möglich,
die Verbindung direkt auf unerwünschte
Pflanzen zu applizieren, wobei die herbizide Wirkung beispielsweise über ein
eingeschränkes
Wachstum identifiziert werden kann.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
läßt sich
vorteilhafterweise auch in Verfahren mit hohem Durchsatz, sogenannten
HTS-Verfahren, durchführen,
wodurch das gleichzeitige Überprüfen einer
Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen ermöglicht wird.
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Bei
der praktischen Durchführung
eines HTS-Verfahrens bietet sich die Verwendung von Trägern an, die
eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, einen
oder mehrere die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
enthaltende Vektoren, einen oder mehrere transgene Organismen, die
wenigstens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
enthalten, oder eines oder mehrere (Poly)peptide, die über die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
codiert sind, enthalten.
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Träger, die
eine oder mehrere der NPNP-Sequenzen, einen oder mehrere der die
NPNP-Sequenzen umfassenden Vektoren, einen oder mehrere, wenigstens
eine NPNP-Sequenz enthaltende transgene Organismen oder ein oder
mehrere (Poly)peptide, die von den NPNP-Sequenzen codiert sind,
enthalten, sind Teil der folgenden Erfindung.
-
Der
verwendete Träger
kann in fester oder flüssiger
Form vorliegen, wobei es sich jedoch vorzugsweise um einen festen
Träger
und besonders bevorzugt um eine Mikrotiterplatte handelt. Die oben
genannten Träger
bilden ebenso einen Teil des Gegenstand der folgenden Erfindung.
Im Sinne der am weitesten verbreiteten Technik werden 96-Loch-,
384-Loch- und 1536-Loch-Mikrotiterplatten verwendet, die in der
Regel Volumen von jeweils 200 μl
umfassen können.
Neben den Mikrotiterplatten sind die weiteren Bestandteile eines HTS-Systems,
die zu den entsprechenden Mikrotiterplatten passen, wie beispielsweise
eine große
Anzahl an Instrumenten, Materialien, automatischen Pipertiervorrichtungen,
Robotern, automatischen Plattenablesegeräten und Plattenwaschgeräten, kommerziell
erhältlich.
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Neben
den auf Mikrotiterplatten beruhenden HTS-Systemen können auch
sogenannte "Tests
im freien Format" ("free-format assays") oder Testsysteme,
bei denen zwischen den Proben keine physischen Barrieren vorliegen,
verwendet werden, wie beispielsweise bei Jayaickreme et al., Proc.
Natl. Acad. Sci U.S.A. 19 (1994) 161418; Chelsky, "Strategies for Screening
Combinatorial Libraries",
First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening
in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995); Salmon et al., Molecular
Diversity 2 (1996), 5763 und
US
5,976,813 .
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Die
Erfindung betrifft weiterhin nach den erfindungsgemäßen Verfahren
identifizierte Verbindungen mit herbizider Wirkung. Diese Verbindungen
werden im folgenden als "ausgewählte Verbindungen" bezeichnet. Sie
weisen ein Molekulargewicht von weniger als 1000 g/mol, vorteilhafterweise
weniger als 500 g/mol, vorzugsweise weniger als 400 g/mol, besonders
bevorzugt weniger als 300 g/mol auf. Verbindungen mit herbizider
Wirkung weisen einen Ki-Wert von weniger als 1 mM, vorzugsweise
weniger als 1 μM,
besonders bevorzugt weniger als 0,1μM, ganz besonders bevorzugt
weniger als 0,01 μM,
auf.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin nach den erfindungsgemäßen Verfahren
identifizierte Verbindungen mit wachstumsregulatorischer Wirkung.
Auch diese Verbindungen werden im folgenden als "ausgewählte Verbindungen" bezeichnet.
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Die
ausgewählten
Verbindungen können
natürlich
auch in Form ihrer landschaftlich brauchbaren Salze vorliegen. Unter
landschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen
Kationen oder die Säureadditionssalze
derjenigen Säuren
in Betracht, deren Kationen bzw. Anionen die herbizide Wirkung der über die
erfindungsgemäße Verfahren
identifizierten Verbindungen herbizider Wirkung nicht negativ beeinflussen.
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Falls
die ausgewählten
Verbindungen asymmetrisch substituierte α-Kohlenstoffatome enthalten,
so können
sie weiterhin auch in Form von Racematen, Enantiomerengemi schen,
reinen Enantiomeren oder, sofern sie chirale Substituenten aufweisen,
auch in Form von Diastereomerengemischen vorliegen.
-
Bei
den ausgewählten
Verbindungen kann es sich um chemisch synthetisierte oder mikrobiell
produzierte Substanzen handeln, die beispielsweise in Zellextrakten
von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen angetroffen werden
können.
Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine
Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Verfahren sind dem Fachmann
bekannt und sind in allgemeiner Weise beispielsweise bei Alberts,
Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17,
beschrieben. Die ausgewählten
Verbindungen können
auch aus umfangreichen Stoffbibliotheken stammen.
-
Potentielle
Testverbindungen können
Expressionsbibliotheken, wie beispielsweise cDNA-Expressionsbibliotheken,
Peptide, Proteine, Nukleinsäuren,
Antikörper,
kleine organische Substanzen, Hormone, PNAs oder dergleichen sein
(Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995),
237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Literaturstellen).
-
Die
ausgewählten
Verbindungen lassen sich zur Bekämpfung
von unerwünschtem
Pflanzenwuchs und/oder als Wachstumsregulatoren verwenden. Dabei
bekämpfen
herbizide Zusammensetzungen, die die ausgewählten Verbindungen umfassen,
sehr gut den Pflanzenwuchs auf Nichtkulturflächen. Bei Kulturen, wie beispielsweise
Weizen, Reis, Mais, Soja und Baumwolle, wirken sie gegen Unkräuter und
Schadgräser,
ohne die Kulturpflanzen dabei nennenswert zu schädigen. Dieser Effekt wird insbesondere
bei niedrigen Aufwandmengen beobachtet. Die ausgewählten Verbindungen
lassen sich zur Bekämpfung
der oben bereits erwähnten Schadpflanzen
verwenden.
-
Je
nach dem verwendeten Applikationsverfahren lassen sich ausgewählte Verbindungen
bzw. diese umfassende herbizide Zusammensetzungen vorteilhafterweise
auch bei einer weiteren Anzahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung
unerwünschter
Pflanzen einsetzen. Dabei kommen beispielsweise folgende Kulturen in
Betracht:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus
officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec.
rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica,
Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctorius,
Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica
(Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon,
Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium
hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium),
Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgare, Humulus
lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum,
Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot esculenta, Medicago
sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea,
Oryza sativa, Pha seolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies,
Pinus spec., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus
communis, Ribes sylvestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum,
Secale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgare),
Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum
durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.
-
Darüber hinaus
können
die ausgewählten
Verbindungen auch bei Kulturen verwendet werden, die durch Züchtung,
einschließlich
rekombinanter Verfahren, gegenüber
der Wirkung von Herbiziden tolerant sind. Die Erzeugung solcher
Kulturen ist weiter unten beschrieben.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der oben
bereits erwähnten
herbiziden oder wachstumsregulatorischen Zusammensetzung, das die
Formulierung ausgewählter
Verbindungen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln
umfaßt.
-
Die
ausgewählten
Verbindungen können
beispielsweise in Form von direkt versprühbaren wäßrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen,
auch hochkonzentrierten wäßrigen, öligen oder
sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, emulgierbaren
Konzentraten, Emulsionen, Öldispersionen,
Pasten, Stäubemitteln,
Streumitteln und Granulaten formuliert und mittels Versprühen, Vernebeln,
Verstäuben,
Verstreuen oder Gießen
appliziert werden. Die Anwendungsformen richten sich dabei nach
dem Verwendungszweck sowie der Beschaffenheit der ausgewählten Verbindungen
und sollten in jedem Fall die feinstmögliche Verteilung der ausgewählten Verbindungen
gewährleisten.
Die herbiziden Zusammensetzungen umfassen eine herbizidwirksame
Menge wenigstens einer ausgewählten
Verbindung sowie für
die Formulierung herbizider Zusammensetzungen übliche Hilfsstoffe.
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Zur
Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wäßrigen bzw. ölhaltigen
Formulierungen sowie dispergierbaren Konzentraten (dispersible concentrates,
DC), können
die ausgewählten
Verbindungen in einem Öl oder
Lösungsmittel
gelöst
oder dispergiert werden, wobei weitere Formulierungshilfsstoffe
zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus ausgewählter Verbindung,
gegebenenfalls Lösungsmittel
oder Öl
sowie optional weiteren Hilfsmitteln bestehende flüssige oder
feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit
Wasser geeignet sind. Zu nennen sind hier: emulgierbare Konzentrate
(emulsifiable concentrates, EC, EW), Suspensionen (SC), lösliche Konzentrate
(SL), dispergierbare Konzentrate (DC), Pasten, Pastillen, benetzbare
Pulver oder Granulate, wobei die festen Formulierungen entweder
in Wasser löslich
oder dispergierbar (benetzbar) sein können. Darüber hinaus können geeignete
Pulver oder Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den
Abrieb oder eine vorzeitige Hilfsstofffreisetzung verhindernden Überzug versehen
werden.
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Prinzipiell
sind unter dem Begriff "Hilfsmittel" folgende Verbindungsklassen
zu verstehen: Antischäumungsmittel,
Verdicker, Netzmittel, Haftmittel, Dispergiermittel, Emulgiermittel,
Bakterizide und/oder thixotrophe Agentien. Die Bedeutung der oben
genannten Mittel ist dem Fachmann geläufig.
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SLs,
EWs und ECs lassen sich durch einfaches Mischen der betreffenden
Inhaltsstoffe herstellen; Pulver lassen sich durch Mischen oder
Vermahlen in speziellen Mühlentypen
(z.B. Hammermühlen)
herstellen. DCs, SCs und Ses werden üblicherweise über Naßvermahlung
("wet milling") hergestellt, wobei
ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organischen Phase, die weitere
Hilfsmittel oder ausgewählte
Verbindungen umfassen kann, hergestellt werden kann. Die Herstellung
ist bekannt. Pulver-, Streu- und Stäubemittel lassen sich vorteilhafterweise
durch Mischen oder gemeinsames Vermahlen der wirksamen Substanzen
mit einem festen Trägerstoff
herstellen. Granulate, beispielsweise Umhüllungs-, Imprägnierungs-
und Homogengranulate können
durch Bindung der ausgewählten
Verbindungen an feste Trägerstoffe
hergestellt werden. Weitere Einzelheiten hinsichtlich ihrer Herstellung
sind dem Fachmann geläufig
und beispielsweise in den folgenden Veröffentlichungen aufgeführt:
US 3,060,084 , EP-A 707445
(für flüssige Konzentrate),
Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering,
4. Dez. 1967, 147-48, Perry's
Chemical Engineer's
Handbook, 4. Aufl., McGraw-Hill, New York, 1963, S. 8-57 und ff.,
WO 91/13546,
US 4,172,714 ,
US 4,144,050 ,
US 3,920,442 ,
US 5,180,587 ,
US 5,232,701 ,
US 5,208,030 ,
GB 2,095,558 ,
US 3,299,566 , Klingman, Weed Control
as a Science, John Wiley und Sons, Inc., New York, 1961, Hance et
al., Weed Control Handbook, B. Aufl., Blackwell Scientific Publications,
Oxford, 1989 und Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology,
Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Bundesrepublik Deutschland), 2001.
-
Dem
Fachmann sind eine Vielzahl inerter flüssiger und/oder fester Trägerstoffe
geläufig,
die sich für die
erfindungsgemäßen Formulierungen
eignen, wie beispielsweise flüssige
Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen
von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie etwa Kerosin oder Dieselöl, weiterhin
Kohlenteeröle
sowie Öle pflanzlichen
oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische
Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Paraffin, Tetrahydronaphthalin,
alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren
Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol und
Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel,
beispielsweise Amine wie N-Methylpyrrolidon, oder Wasser.
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Feste
Trägerstoffe
sind beispielsweise Mineralerden, wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate,
Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Brolus, Löß, Ton,
Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid,
gemahlene Kunststoffe, Düngemittel
wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammonium-nitrat, Harnstoffe
so wie Produkte pflanzlichen Ursprungs, wie etwa Getreidemehl, Baumrinden-,
Holz- und Nußschalenmehl,
Zellulosepulver, oder andere feste Trägerstoffe.
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Dem
Fachmann sind eine Vielzahl oberflächenaktiver Stoffe (Tenside),
die sich für
die erfindungsgemäßen Formulierungen
eignen, geläufig,
wie beispielsweise Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalze aromatischer
Sulfonsäuren,
z.B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie
von Fettsäuren,
Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten,
sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanole sowie von
Fettalkoholglykolethern, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Napththalin
und seinen Derivaten mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte von
Naphthalin oder der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd,
Polyoxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl-
oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglycolether, Alkylaryl-
polyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalkohol-Ethylenoxid-Kondensate,
ethoxyliertes Rizinusöl,
Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Lauryl-
alkoholpolyglycoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfit-Ablaugen
oder Methylcellulose.
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Die
Applikation der herbiziden Zusammensetzungen bzw. der ausgewählten Verbindungen
kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind
die ausgewählten
Verbindungen für
gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Applikationstechniken
angewandt werden, bei denen die ausgewählten Verbindungen mit Hilfe
der Spritzgeräte
so gespritzt werden, daß die
Blätter
der empfindlichen Kulturpflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden,
während
die ausgewählten
Verbindungen auf die Blätter
darunterwachsender unerwünschter
Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen ("post-directed", "lay-by").
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Die
Aufwandmengen an ausgewählten
Verbindungen betragen je nach Bekämpfungszweck, Jahreszeit, Zielpflanzen
und Wachstumsstadium 0,001 bis 3,0, vorzugsweise 0,01 bis 1,0 kg/ha.
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Die
Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele in größerer Ausführlichkeit
veranschaulicht, wobei die Beispiele nicht als beschränkend aufgefaßt werden
sollten.
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Allgemeine
DNA-Manipulations- und Klonierungsverfahren
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Klonierungsverfahren,
wie beispielsweise Restriktionsschnitte, Agarosegelelektrophoresen,
Reinigung von DNA-Fragmenten, Übertragung
von Nukleinsäuren
auf Nitrocellulose- und Nylonmembranen, Verknüpfung von DNA-Fragmenten, Transformation
von Escherichia coli-Zellen, Bakterienanzucht sowie Sequenzanalysen
rekombinanter DNA, wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring
Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) and Ausubel, F.M. et
al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.
und Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
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Molekularbiologische
Standardverfahren für
Pflanzen sowie Pflanzentransformationsverfahren sind bei Schultz
et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers
(1998), Reither et al., Methods in Arabidopsis Research, World scientific
press (1992) und Arabidopsis: A Laboratory Manual (2001), ISBN 0-87969-573-0
beschrieben.
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Die
im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli DHS, XL-1 blue)
wurden von den Firmen Stratagene, BRL Gibco bzw. Invitrogen, Carlsberg,
CA, bezogen. Bei den zur Klonierung verwendeten Vektoren handelt
es sich um pUC 19 von Amersham Pharmacia (Freiburg) und den Vektor
pBinAR (Höfgen
und Willmitzer, Plant Science 66, 1990, 221-230).
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Beispiel 1:
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Erzeugung
einer cDNA-Bibliothek im Pflanzentransformationsvektor
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Zur
Erzeugung einer cDNA-Bibliothek (im folgenden "binäre
cDNA-Bibliothek" genannt)
in einem Vektor, der direkt zur Transformation von Pflanzen eingesetzt
werden kann, wurde mRNA aus verschiedenen Pflanzengeweben isoliert
und mit dem cDNA-Synthesekit
(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) in doppelsträngie cDNA
transkribiert. Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit T12-18-Oligonukleotiden
nach Herstellerangaben durchgeführt.
Nach Größenfraktionierung
und Ligation von EcoRI-NotI-Adaptern
nach Herstellerangaben sowie Auffüllen der Überhänge mit Pfu-DNA-Polymerase
(Stratagene) wurde die cDNA-Population normalisiert. Dabei wurde
nach dem Verfahren von Kohci et al, 1995, Plant Journal 8, 771-776
vorgegangen, wobei die cDNA mittels PCR mit dem Oligonukleotid N1
unter den in der Tabelle 1 aufgeführten Bedingungen amplifiziert
wurde.
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Das
erhaltene PCR-Produkt wurde an die Säulenmatrix des PCR-Reinigungskits
(Qiagen, Hilden) gebunden und mit 300 mM NaP Puffer, pH 7,0, 0,5
mM EDTA, 0,04% SDS eluiert. Die DNA wurde 5 Minuten im kochenden
Wasserbad denaturiert und anschließend 24 Stunden bei 60°C renaturiert.
50μl der
DNA wurden auf eine Hydroxylapatitsäule aufgetragen, wonach letztere
dreimal mit jeweils 1 ml 10 mM NaP-Puffer, pH 6,8 gewaschen wurde.
Die gebundene Einzelstrang-DNA wurde mit 130 mM NaP-Puffer, pH 6,8, eluiert,
mit Ethanol gefällt
und in 40 μl
Wasser gelöst.
Hiervon wurden 20 μl
für eine
weitere PCR-Amplification wie oben beschrieben verwendet. Nach einer
weiteren Anreicherung von ssDNA wurde eine dritte PCR-Amplifikation
wie oben beschrieben durchgeführt.
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Die
Erzeugung des Pflanzentransformationsvektors zur Aufnahme der wie
oben beschrieben erzeugten cDNA-Population erfolgte über Restriktionsenzymspaltung
des Vektors pUC18 mit SbfI und BamHI, Aufreinigung des Vektorfragments
mit anschließendem
Auffüllen
der Überhänge mit
Pfu-DNA-Polymerase und Religation mit T4-DNA-Ligase (Stratagene). Das entstandene
Konstrukt wird im folgenden als pUC18SbfI- bezeichnet.
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Der
Vektor pBinAR wurde zunächst
mit NotI gespalten, nach Auffüllen
der Enden religiert, mit SbfI gespalten, nach Auffüllen der
Enden religiert und im Anschluß daran
mit EcoRI und HindIII gespalten. Das erhaltene Fragment wurde in
ein Derivat des binären
Pflanzentransformationsvektors pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga,
P., (1994) Plant Mol Biol 25:989-994) ligiert, der eine Transformation
von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens sowie die Verwendung
der Kanamycinresistenz zum Nachweis von transgenen Pflanzen ermöglicht.
Das so erzeugte Konstrukt wird im folgenden als pSun12/35S bezeichnet.
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pUC18SbfI-
wurde als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit den
Oligonukleotiden V1 und V2 (siehe Tabelle 2) sowie Pfu-DNA-Polymerase
eingesetzt. Das erhaltene Fragment wurde in das mit SmaI geschnittene
pSun12/35S ligiert, wodurch pSunblues2 gebildet wurde. Nach der
Spaltung mit NotI, Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase
aus Shrimp (Roche Diagnostics, Mannheim) sowie Aufreinigung des
Vektorfragments wurde pSunblues2 mit der normalisierten und ebenfalls
mit NotI geschnittenen cDNA-Population ligiert. Nach der Transformation
in E. coli XI-1 blue (Stratagene) wurden die erhaltenen Klone in
Mikrotiterplatten abgelegt. Die binäre cDNA-Bibliothek enthält cDNAs
in "sense"- und in "antisense"-Orientierung unter
der Kontrolle des 35S-Promotors aus Blumenkohlmosaikvirus, und diese
cDNAs können dementsprechend
nach der Transformation in Tabakpflanzen zu "Kosuppressions"- und "Antisense"-effekten führen.
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Tabelle
2: verwendete Oligonukleotide
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Beispiel 2:
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Transformation und Analyse
von Tabakpflanzen
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Ausgewählte Klone
der binären
cDNA-Bibliothek wurden in Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260
und (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13(1984), 4777-4788) transformiert
und unter Streptomycin/Spectinomycin-Selektion inkubiert.
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Bei
dem für
die Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. Samsun
NN) mit dem binären
Klon Nt005010068r eingesetzten Material handelte es sich um ein Übernachtkultur
einer mit YEB-Medium auf OD600 = 0,8-1,6 verdünnten Kultur von positiv transformiertem
Agrobacterium tumefaciens. Blattscheiben steriler Pflanzen (jeweils
ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale 5-10 Minuten mit einer 1:50
verdünnten
Agrobakterienlösung
inkubiert. Danach folgte eine zweitägige Inkubation in Dunkelheit
bei 25°C
auf Murashige-Skoog-Medium (Physiol. Plant. 15(1962), 473), das
mit 2% Saccharose (2MS Medium) und 0,8% Bacto-Agar supplementiert
war. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/8
Stunden Dunkelheit weitergeführt
und im wöchentliche
Rhythmus auf mit 500mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50mg/l Kanamycin,
1mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2mg/l Naphthylessigsäure und
1,6g/l Glucose supplementiertem MS-Medium fortgesetzt. Regenerierte
Schößlinge wurden
auf ein mit Kanamycin and Claforan supplementiertes MS-Medium übertragen.
Auf diese Weise wurden transgene Pflanzen der Linie E 0000013430
erzeugt.
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Die
Integration der Klon-cDNA in das Genom der transgenen Linien wurde über PCR
mit den Oligonukleotiden G1 und G2 (siehe Tabelle 2) sowie aus den
betreffenden transgenischen Linien präparierter genomischer DNA nachgewiesen.
Hierzu wurde vorzugsweise TAKARA-Taq-DNA-Polymerase nach den Angaben des
Herstellers (MoBiTec, Göttingen)
eingesetzt. Als Positivkontrolle diente der zur Transformation verwendete cDNA-Klon
der binären
cDNA-Bibliothek als Matrize für
eine PCR- Reaktion.
PCR-Produkte identischer Größe oder
gegebenenfalls identischer Spaltungsmuster, die nach Spaltung mit
verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, dienten als Beweis
für die
Integration der entsprechenden cDNA des Klons Nt005010068r. Auf
diese Weise wurden die Insertionen der Klone in der jeweiligen transgenen
Pflanzenlinie E 0000013430 mit den unten aufgeführten Phänotypen nachgewiesen.
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Nach Überführung der
Schößlinge in
Erde wurden die Pflanzen 1-20 Wochen im Gewächshaus auf die Ausprägung von
Phänotypen
hin beobachtet. Dabei stellte sich heraus, daß transgene Pflanzen der Linie
E 0000013430 ähnliche
Phänotypen
aufwiesen. Die Pflanzen zeigten im Bezug auf Wildtyppflanzen starke
Chlorose und eine gleichzeitige drastische Wachstumsretardierung.
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Beispiel 3:
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Sequenzanalyse der Klone
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Die
cDNA-Insertion des Klons Nt005010068r, deren Transformation in Tabakpflanzen
zu den oben erwähnten
Phänotypen
führte,
wurde vollständig
sequenziert.
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Die
cDNA-Insertion des Klons Nt005010068r weist ein offenes Leseraster
von 453 nt (SEQ ID No. 1, Pos. 1-453) auf, das für 151 Aminosäuren codiert
(SEQ ID No. 2).
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Mit
Hilfe dieser Sequenzangaben wurden homologe Sequenzen aus Spinacea
oleracea, Pisum sativum und Arabidopsis thaliana mit einem hohen
Grad an Homologie (Tabelle 3) identifiziert. Dieser hohe Grad an
Homologie zeigt, daß die
codierten Proteine die gleiche Funktion erfüllen.
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Somit
wurde zum ersten mal und auf überraschende
Weise gezeigt, daß die
natürliche
Expression nukleär
codierte Polynukleotidphosphorylase codierender Gene für Pflanzen
essentiell ist und daß eine
reduzierte Expression zu Schäden
führen,
wie sie an Hand der in Beispiel 2 genannten Phänotypen aufgezeigt wurden. Dies
zeigt die Eignung nukleär
codierter Polynukleotidphosphorylase als Ziel für Herbizide.
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Beispiel 4:
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Expression in E.coli
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Um
die PNPase-Aktivität
des von der SEQ ID No. 7 codierten Enzyms zu demonstrieren und eine
PNPase-Aktivität
in für
Verfahren mit hohem Durchsatz (HTS) geeigneten Mengen zu erzeugen,
wurden Fragmente der PNPase-cDNA von SEQ ID No. 7 mittels PCR amplifiziert
und in die Expressionsvektoren subkloniert. Dabei wurden cDNA und
cDNA-Bibliotheken aus Arabidopsis thaliana als Matrizen für die PCR
verwendet, bei der Pfu und Pfu-ultra-Polymerase (Stratagene, Heidelberg)
zum Einsatz kamen.
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Hierzu
wurden die in Tabelle 4 aufgeführten
Oligonukleotide zur Amplifikation von cDNA-Fragmenten über die
Polymerasekettenreaktion verwendet. Die PCR wurde nach Standardbedingungen
(wie bei Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor
Laboratory Press beschrieben) in 33 Zyklen durchgeführt, wobei
die Annealing-Temperaturen zwischen 50 und 57°C lagen und die Polymerisationszeit
jeweils 60 Sekunden pro 1000Bp betrug.
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Die
produzierten Fragmente wurden in die Vektoren pMALc2x (New England
Biolabs) und pET15b (Novagen) kloniert und zur Bestätigung der
Sequenzidentität
sequenziert. Die Expressionplasmide wurden in die E. coli-Stämme JM109
bzw. BL-21(DE3) (Novagen) transformiert. Die transformierten Stämme wurden über Nacht
in LB-Medium mit 100 μg/ml
Ampicillin bei 37°C
kultiviert. Größer volumige
Tageskulturen wurden angeimpft und bis zu einer optischen Dichte
von 0,4–0,7
bei 600 nm kultiviert. Die Kulturen wurden dann mit 0,5 bis 2 mM
IPTG induziert und 2,5–5
hours kultiviert. Dabei wurde den Standardvorschriften (Invitrogen)
gefolgt.
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Zur
Erhöhung
des Expressionsniveaus ist die N-Terminalefusion mit einem Hexahistidin-Tag
(His-Tag) oder einem Maltosebindungsprotein (MBP) vorteilhaft. Mittels
des fusionierten His-Tags bzw. MBP-Tags ist eine Reinigung mit Ni-NTA
(Nitrilotriessigsäure),
wie bei His-Trap-Säulen
(Pharmacia, Uppsala, Schweden) oder Amylose-Matrices (New England
Biolabs), möglich.
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Beispiel 5:
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Expression in Hefe
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Die
für eine
PNPase gemäß SEQ ID
No. 1, 3, 5 oder 7 codierende cDNA wird in Vektoren wie pYES/NT,
der eine His-Tag-Expression in Hefen wie INVSc1 gestattet, kloniert.
Die Hefetransformation wird nach Standardvorschriften (Invitrogen)
oder nach Hinnen, Hicks und Fink, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 75,
1929-1933 durchgeführt.
Dabei wird eine über
Nacht bei 30°C
angewachsene Kultur mit 2% Galactose induziert und bei 30°C weiter
inkubiert. Das PNPase-Protein wird nach 2, 4, 8, 16 bzw. 24h Induktion
extrahiert. Die Polynukleotidphosphorylase wird mittels des fusionierten
His-Tag mit Ni-NTA-Matrices
wie His-Trap-Säulen
(Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgereinigt.
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Beispiel 6:
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In-vitro Aktivitätstest
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PNP
katalysiert die reversible Polymerisierung von Nukleotiddiphosphaten
zu Polyribonukleotiden und anorganischem Phosphat. Isolierte PNP-Aktivität wird mittels
freigesetztem Phosphat in einem kolorimetrischen Test gemessen.
Der HTS-Test beruht auf der Messung der Endpunktkonzentration von
freigesetztem Phosphat in der PNPase-Reaktion nach Ausbildung des Malachitgreen – Molybdophosphat-Komplexes
in saurer Lösung
(Lanzetta et al., 1979, Analytical Biochemistry 100, pp 95-97; Cogan
et al., 1999, Analytical Biochemistry 271, S. 29-35). Der Testansatz
enthält
1 bis 10 μg
gerei nigtes PNPase-Protein, 1 bis 5 μg Poly(C) (10mer) in 1 mM MgSO4, 100 mM NH4Cl,
10 mM KCl, 10 mM Mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,2 und 0,02
bis 0,05 mM UDP. Man startet die Reaktion durch Zugabe beider Lanzetta-Starter-Lösungen und
stimuliert mit 30 mM Spermin. Die Ausbildung des Molybdophosphat-Komplexes
ist wichtig, da freies Phosphat in Lösung die PNPase-Aktivität hemmen
kann (Brishammar und Juntti, 1974, Archives of Biochemistry and
Physics 164, S. 224-232 und Khan und Fraenkel-Conrat, 1985, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 1311-1315). Der Malachitgreen-Molybdophosphat-Komplex
wird mit dem BMG-Reader bei 640 nm analysiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
eines Tests wird über
die Rückwärtsreaktion
die 3'-5'-Exoribonukleaseaktivität gemessen,
wobei freie Nukleotiddiphosphate erzeugt werden. Diese Nukleotiddiphosphate
werden dann über
eine Reaktion, bei der Pyruvatkinase und Lactatdehydrogenase zum
Einsatz kommen, so daß die
Oxidation von NADH photometrisch verfolgt werden kann, gemessen.
Das Reaktionsvolumen von 200μl enthält 20 mM
Hepes, pH 7,9, 12 mM MgCl2 mM, 50 mM KCl,
0,1 mM EDTA, 1,5 mM DTT, 1 fmol polyadenylierte RNA (ca. 500 Basen)
und 15% Glycerin. Der Test wird bei 25°C über einen Zeitraum von bis
zu 120 Min. durchgeführt.
Die Freisetzung von ADP wird durch Zugabe von 1,5 U Pyruvatkinase
(426 U/mg Protein; Sigma) und 1,2 U Lactatdehydrogenase (500 U/mg
Protein; Sigma), 6 mM Phosphoenolpyruvat sowie 0,6 mM NADH verfolgt.
Die Oxidation von NADH wird photometrisch bei 340 nm bestimmt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
eines Tests wird 3H-markiertes UDP in einen
Einzelstrang-Poly-C-Primer eingebaut, wie bei Brishammar et al.
(Brishammar und Juntti, 1974, Archives of Biochemistry and Physics
164, S. 224-232) beschrieben. Dabei enthält das Reaktionsvolumen von
200 μl 5 μg Primer,
1 bis 5 μg PNPase,
0,5 μCi 3H-UDP,
0,02 mM UDP, 1 mM MgSO4, 100 mM NH4Cl, 10
mM KCl, 10 mM Mercaptoethanol in 50 mM Tris-HCl, pH 8,2. Der Einbau
wird mit einem Szintillationszähler
bestimmt.
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Die
Tests eignen sich für
das Screening mit hohem Durchsatz (HTS) in 96-Loch- und 384-Loch-Format. SEQUENCE
LISTING
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Polynukleotidphosphorylase (PNPase),
deren Abwesenheit zu reduziertem Wachstum sowie chlorotischen Blättern führt, als
Ziel für
Herbizide. Zu diesem Zweck werden Nukleinsäuresequenzen, umfassend die
SEQ. ID No. 1, sowie funktionelle Äquivalente der SEQ. ID No.
1 bereitgestellt. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung
von Polynukleotidphosphorylase in einem Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen mit herbizid- oder wachstumsregulierender Aktivität sowie
die Verwendung der mit diesem Verfahren identifizierten Verbindungen
als Herbizide oder Wachstumsregulatoren.