DE112005000590T5 - Polynukleotidphosphorylase (PNPase) als Ziel für Herbizide - Google Patents

Polynukleotidphosphorylase (PNPase) als Ziel für Herbizide Download PDF

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Abstract

Verwendung nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase (PNPase) in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polynukleotidphosphorylase (PNPase), deren Abwesenheit zu reduziertem Wachstum sowie chlorotischen Blättern führt, als Ziel für Herbizide. Zu diesem Zweck werden Nukleinsäuresequenzen, umfassend die SEQ. ID No. 1, sowie funktionelle Äquivalente der SEQ. ID No. 1 bereitgestellt. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polynukleotidphosphorylase in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizid- oder wachstumsregulierender Aktivität sowie die Verwendung der mit diesem Verfahren identifizierten Verbindungen als Herbizide oder Wachstumsregulatoren.
  • Das grundlegende Prinzip der Identifizierung von Herbiziden über die Hemmung eines definierten Ziels ist bekannt (zum Beispiel US 5,187,071 , WO 98/33925, WO 00/77185). Allgemein besteht ein großer Bedarf, Enzyme nachzuweisen, die neue Ziele für Herbizide darstellen könnten. Gründe hierfür sind Resistenzprobleme, die bei auf bekannte Ziele wirkenden herbiziden Wirkstoffen auftreten, sowie das ständige Bemühen, neue herbizide Wirkstoffe zu identifizieren, die sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Verträglichkeit und/oder geringe Aufwandmengen auszeichnen.
  • Der Nachweis neuer Ziele ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbunden, da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines Stoffwechselwegs ist, häufig das Wachstum der Pflanze nicht weiter beeinflußt. Dies kann daran liegen, daß die Pflanze auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Existenz nicht bekannt ist, oder daß das gehemmte Enzym für den Stoffwechselweg nicht limitierend ist. Weiterhin teilen Pflanzengenome einen hohen Grad an funktioneller Redundanz. Im Genom von Arabidopsis Thaliana finden sich häufiger funktionell äquivalente Enzyme in Genfamilien als bei Insekten oder Säugern (Nature, 2000, 408(6814):796-815). Diese Hypothese wird experimentell durch die Tatsache bestätigt, daß umfassende Gen-knock-out-Programme durch T-DNA- oder Transposoninsertion in Arabidopsis bislang weniger ausgeprägte Phänotypen lieferten als erwartet (Curr. Op. Plant Biol. 4, 2001, S.111-117).
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Identifizierung neuer Ziele, die für das Wachstum von Pflanzen essentiell sind bzw. deren Hemmung zu reduziertem Pflanzenwachstum führt, sowie in der Bereitstellung von Verfahren, die sich zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider und/oder wachstumsregulatorischer Wirkung eignen.
  • Diese Aufgabe wurde gelöst durch die Verwendung nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden.
  • An dieser Stelle werden nun weitere in der Beschreibung verwendete Begriffe definiert.
  • „Affinitäts-Tag": damit wird ein Peptid oder Polypeptid bezeichnet, dessen codierende Nukleinsäuresequenz mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz entweder direkt oder mittels eines Linkers unter Verwendung gängiger Klonierungstechniken fusioniert werden kann. Das Affinitäts-Tag dient dabei zur Isolierung, Anreicherung und/oder selektiven Aufreinigung des rekombinanten Zielproteins mittels Affinitätschromatografie aus Gesamtzellextrakten. Der oben erwähnte Linker kann dabei vorteilhafterweise eine Proteasespaltstelle (zum Beispiel für Thrombin oder Faktor Xa) enthalten, wodurch sich das Affinitäts-Tag bei Bedarf vom Zielprotein abspalten läßt. Beispiele für gängige Affinitäts-Tags sind das „His-Tag", beispielsweise von der Firma Qiagen, Hilden, „Strep-Tag", das „Myc-Tag" (Invitrogen, Carlsberg), das aus einer chitinbindenden Domäne und einem Intein bestehende Tag von der Firma New England Biolabs, das Maltose-Bindungsprotein (pMal) von New England Biolabs, das pCal-System mit einem Calmodulin-bindenden Peptid-Tag von der Firma Stratagene, und das sogenannte CBD-Tag von der Firma Novagen. Dabei kann das Affinitäts-Tag am 5'- oder am 3'-Ende der codierenden Nukleinsäuresequenz mit der für das Zielprotein codierenden Sequenz angebracht sein.
  • „Aktivität nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase (PNPase)": der Begriff Aktivität beschreibt die Fähigkeit eines Enzyms, ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln. Die enzymatische Aktivität läßt sich dabei in einem sogenannten Aktivitätstest über die Zunahme des Produkts, die Abnahme des Substrats (oder Ausgangsmaterials) oder die Abnahme eines spezifischen Cofaktors oder über eine Kombination aus mindestens zwei der vorstehend genannten Parameter in Abhängigkeit eines definierten Zeitraums bestimmen.
  • „Aktivität nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase" beschreibt hier die Fähigkeit eines Enzyms, a) die reversible Polymerisierung von Dinukleotiden zu Polyribonukleotiden und anorganischem Phosphat oder b) die reversible Verlängerung eines Primer-Oligonukleotids mit Dinukleotiden unter Bildung von anorganischem Phosphat zu katalysieren.
  • „Antisense": der Begriff „Antisense", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Desoxyribonukleotidsequenz, deren Abfolge von Desoxyribonukleotidresten in bezug auf die Abfolge von Desoxyribonukleotidresten in einem Sense-Strang eines DNA-Duplexes in umgekehrter 5'- nach 3'-Orientierung vorliegt. Ein „Sense-Strang" eines DNA-Duplexes bezieht sich dabei auf einen Strang in einem DNA-Duplex, der von einer Zelle in ihrem natürlichen Zustand in eine „Sense-mRNA" transkribiert wird. Somit handelt es sich bei einer „Antisense"-Sequenz um eine Sequenz mit der gleichen Sequenz wie der nichtcodierende Strang in einem DNA-Duplex. Der Begriff „Antisense-RNA" bezieht sich auf ein RNA-Transkript, das zu einem primären Zieltranskript oder einer Ziel-mRNA vollständig oder teilweise komplementär ist und das die Expression eines Zielgens durch Störung der Prozessierung, des Transports und/oder der Translation seines primären Transkripts oder seiner mRNA stört. Dabei kann die Komplementarität einer Antisense-RNA mit einem beliebigen Teil des spezifischen Gentranskripts, beispielsweise an der 5'-nichtcodierenden Sequenz, 3'-nichtcodierenden Sequenz, den Introns oder der codierenden Sequenz, vorhanden sein. Darüber hinaus kann Antisense-RNA, wie sie hier verwendet wird, Bereiche von Ribozymsequenzen enthalten, die die Wirksamkeit der Antisense-RNA bei der Blockierung der Genexpression erhöht.
  • „Expression": der Begriff, wie er hier verwendet wird, ist so zu verstehen, daß er Transkription, reverse Transkription und Translation mit umfaßt.
  • "Expressionskassette": eine Expressionskassette enthält eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, die mit wenigstens einem genetischen Kontrollelement, wie z.B. einem Promotor und vorteilhafterweise einem weiteren Kontrollelement, wie z.B. einem Terminator, operativ verknüpft ist. Bei der Nukleinsäuresequenz der Expressionskassette kann es sich beispielsweise um eine genomische oder komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie deren halbsynthetische oder vollsynthestische Analoge handeln. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form, extrachromosomal oder in das Genom integriert existieren. Die betreffenden Nukleinsäuresequenzen lassen sich synthetisieren oder auf natürliche Weise gewinnen oder können ein Gemisch aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten oder auch aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
  • Künstliche Nukleinsäuresequenzen sind in diesem Zusammenhang ebenso geeignet, solange sie die Expression eines durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz codierten Polypeptids mit der enzymatischen Aktivität einer nukleär codierten Polynukleotidphosphorylase, vorzugsweise mit der biologischen Aktivität einer nukleär codierten Polynukleotidphosphorylase, in einer Zelle oder einem Organismus ermöglichen. Beispielsweise können synthetische Nukleinsäuresequenzen erzeugt werden, die bezüglich der Codon-Nutzung der zu transformierenden Organismen optimiert wurden.
  • Alle oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen können in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleotidbausteine der Doppelhelix erzeugt werden. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise in bekannter Weise nach dem Phosphoamiditverfahren (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Bei der Herstellung einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, daß eine Nukleinsäuresequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhal ten wird. Die Nukleinsäurefragmente werden miteinander über allgemeine Clonierungstechniken, wie sie beispielsweise bei T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), bei T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und bei Ausubel, F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind.
  • „Gen": der Begriff bezieht sich auf eine diskrete Nukleinsäuresequenz, die für ein diskretes Zellprodukt verantwortlich ist. Dabei bezieht sich der Begriff „Gen", wie er hier verwendet wird, nicht nur auf die ein spezifisches Protein codierende Nukleinsäuresequenz, sondern auch auf alle benachbarten 5'- und 3'-nichtcodierenden Nukleotidsequenzen, die an der Regulation der Expression des von dem interessierenden Gen codierten Proteins beteiligt sind. Zu diesen nichtcodierenden Sequenzen gehören Terminatorsequenzen, Promotorsequenzen, stromaufwärts liegende Aktivatorsequenzen, regulatorische proteinbindende Sequenzen und dergleichen.
  • „Inhibitor": eine chemische Substanz, die die enzymatische Aktivität eines Proteins, wie z.B. eines Biosyntheseenzyms, eines Rezeptors, eines Signalweiterleitungsproteins, eines Strukturgenprodukts oder eines Transportproteins, inaktiviert. Der Begriff „Herbizid" (oder „Herbizidverbindung") wird hier zur Definition eines an eine Pflanze in einem beliebigen Entwicklungsstadium applizierten Inhibitors verwendet, womit das Herbizid das Wachstum der Pflanze hemmt oder diese abtötet.
  • „Operative Verknüpfung" oder „funktionelle Verknüpfung": unter einer operativen oder funktionellen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung regulatorischer Sequenzen oder genetischer Kontrollelemente derart, daß jede der regulatorischen Sequenzen oder jedes der genetischen Kontrollelemente ihre bzw. seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
  • „Funktionelle Äquivalente" beschreiben in diesem Zusammenhang Nukleinsäuresequenzen, die unter Standardbedingungen mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder Teilen der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und in der Lage sind, die Expression eines Polypeptids mit der Aktivität einer Polynukleotidphosphorylase in einer Zelle oder einem Organismus herbeizu- führen.
  • Zur Durchführung der Hybridisierung werden vorteilhafterweise kurze Oligonukleotide mit einer Länge von ungefähr 10-50 Bp, vorzugsweise 15-40 Bp, beispielsweise aus den konservierten oder sonstigen Bereichen, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-500 Bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisie rung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure/dem verwendeten Oligonukleotid, der Länge des Fragments oder der vollständigen Sequenz bzw. je nach dem, welche Nukleinsäureart, d.h. DNA oder RNA, für die Hybridisierung verwendet wird, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ungefähr 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
  • Unter Standardhybridisierungsbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7.2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid, wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid, zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen ungefähr 20°C und 65°C, vorzugsweise zwischen ungefähr 30°C und 45°C. Bei DNA:RNA-Hybriden liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhafterweise bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen ungefähr 30°C und 65°C, vorzugsweise zwischen ungefähr 45°C und 55°C. Bei diesen angegebenen Hybridisierungstemperaturen handelt es sich um Schmelztemperaturwerte, die für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid beispielhaft berechnet wurden. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge von Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (Hrsg.), 1985, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York; Hames und Higgins (Hrsg.), 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
  • Ein funktionelles Äquivalent der SEQ ID No. 1 läßt sich weiterhin auch über den Grad der Homologie bzw. Identität mit der SEQ ID No. 1 definieren und kann weiterhin auch natürliche oder künstliche Mutationen der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit der Aktivität einer nukleär codierten Polynukleotidphosphorylase codieren, umfassen.
  • Von der vorliegenden Erfindung sind ebenso beispielsweise diejenigen Nukleinsäuresequenzen umfaßt, die durch Modifikation der SEQ ID No. 1 erhalten werden.
  • Solche Modifikationen lassen sich beispielsweise mit dem Fachmann geläufigen Techniken, wie z.B. „Site Directed Mutagenesis" (stellengerichtete Mutagenese), „Error Pro ne PCR" (zu Fehlern neigende PCR), „DNA-shuffling" (Umordnung von DNA) (Nature 370, 1994, S.389-391) oder „Staggered Extension Process" (stufenweiser Verlängerungsprozeß) (Nature Biotechnol. 16, 1998, S.258-261) erzeugen. Ziel einer solchen Modifikation kann beispielsweise die Insertion weiterer Schnittstellen für Restriktionsenzyme, die Entfernung von DNA zur Verkürzung der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon-Optimierung oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifizierte Nukleinsäuresequenzen codiert werden, müssen trotz abweichender Nukleinsäuresequenz noch die gewünschte Funktion besitzen.
  • Der Begriff „funktionelle Äquivalente" kann sich auch auf die von der betreffenden Nukleinsäuresequenz codierte Aminosäuresequenz beziehen. In diesem Fall beschreibt der Begriff „funktionelles Äquivalent" ein Protein, dessen Aminosäuresequenz eine definierte Prozentualidentität oder Homologie mit der SEQ ID No. 2 aufweist.
  • Funktionelle Äquivalente umfassen somit auch natürlich vorkommende Varianten der hier beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, beispielsweise durch chemische Synthese erhaltene, an den Codon-Gebrauch angepaßte Nukleinsäuresequenzen und ebenso die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
  • „Genetische Kontrollsequenz" beschreibt Sequenzen, die einen Einfluß auf die Transkription und gegebenenfalls die Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in prokariontischen oder eukariontischen Organismen haben. Beispiele hierfür sind Promotoren, Terminatoren oder sogenannte „Enhancer"-Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so modifiziert worden sein, daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression des Zielgens modifiziert, also erhöht oder erniedrigt wurde. Die Wahl der Kontrollsequenz hängt dabei vom Wirtsorganismus oder Ausgangsorganismus ab. Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch den 5'-nichttranslatierten Bereich, Introns oder den nichtcodierenden 3'-Bereich von Genen. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom gestatten. Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren sowie die Chromatinstruktur beeinflussende Sequenzen (z.B. MARs (Matrix Attachment Regions)), die die expressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen beispielsweise die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Streßfaktoren erfolgen. Derartige Elemente sind zum Beispiel für Wasserstreß, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135), Streß aufgrund hoher und niedriger Temperaturen (Plant Cell 1994, (6): 251-264) und Hitzestreß (Molecular & General Genetics, 1989, 217(2-3): 246-53) beschrieben.
  • „Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen ist über die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, die durch eine vergleichende Gegenüberstellung mit Hilfe des Programmalgorithmus BESTFIT nach Needleman und Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48; 443-453) unter Einstellung der folgenden Parameter für Polypeptide:
    Gap Weight: 8
    Length Weight: 2
    und der folgenden Parameter für Nukleinsäuren:
    Gap Weight: 50
    Length Weight: 3
    berechnet wird.
  • Nachfolgend wird der Begriff Identität auch synonym mit dem Begriff „Homologie" verwendet.
  • „Mutationen" von Nuklein- oder Aminosäuresequenzen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversionen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann, wobei jedoch insgesamt die funktionellen Eigenschaften der Zielproteine im wesentlichen beibehalten werden.
  • „Natürliche genetische Umgebung" bedeutet den natürlichen chromosomalen Locus im Ursprungsorganismus. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz wenigstens auf der 5'- oder 3'-Seite und weist eine Sequenzlänge von wenigstens 50 Bp, vorzugsweise wenigstens 100 Bp, besonders bevorzugt wenigstens 500 Bp, ganz besonders bevorzugt wenigstens 1000Bp und am meisten bevorzugt wenigstens 5000 Bp auf.
  • „Pflanzen" sind im Sinne der Erfindung Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganze Pflanzen, wie etwa Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile. Zudem versteht man unter dem Begriff Pflanzen Vermehrungsmaterial, wie etwa Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke.
  • „Promotor": der Begriff bezieht sich auf die 5'-flankierende, nichtcodierende Sequenz, die zu einer codierenden Sequenz benachbart und an der Initiation der Transkription der codierenden Sequenz beteiligt ist.
  • „Rekombinante DNA" beschreibt eine Kombination von DNA-Sequenzen, die sich über rekombinante DNA-Technologie erzeugen lassen.
  • „Rekombinante DNA-Technologie": allgemein bekannte Techniken zur Fusion von DNA-Sequenzen (zum Beispiel beschrieben bei Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • „Replikationsursprünge" gewährleisten die Vervielfachung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in Mikroorganismen und Hefen, beispielsweise pBR322 ori oder P15A ori in E. coli (Sambrook et al.: "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) sowie ARS1 ori in Hefe (Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068).
  • „Reportergene" codieren für leicht quantifizierbare Proteine. Über einen Wachstums-Fluoreszenz-, Chemolumineszenz-, Biolumineszenz- oder Resistenztest oder über eine photometrische Messung (Eigenfarbe) oder Enzymaktivität läßt sich mittels dieser Gene die Transformationseffizienz oder der Expressionsort oder -zeitpunkt beurteilen. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporterproteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44), wie z.B. das "green fluorescent protein" (grün fluoreszierendes Protein, GFP) (Gerdes HH und Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1):44-47; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5):912-8, 1997), die Chloramphenikol-Acetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sci 1996, 116:59-72; Scikantha, J Bact 1996, 178:121; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414), sowie Luziferasegene, im allgemeinen β-Galactosidase oder β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das Ura3-Gen.
  • „Selektionsmarker" verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika oder andere toxische Verbindungen: beispielhaft zu nennen seien hier das Gen für Neomyzin-Phosphotransferase, das eine Resistenz gegen das Aminoglycosid Antibiotikum Neomycin (G 418) verleiht, Kanamycin, Paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), das Sul-Gen, das für eine mutierte Dihydropteroat-Synthase codiert (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15(1):127-136), das Gen für Hygromycin-B-Phosphotransferase (Gen Bank Accession NO: K 01193) und das shble-Resistenzgen; das eine Resistenz gegen Bleomycinantibiotika, wie z.B. Zeocin, verleiht. Weitere Beispiele für Selektionsmarkergene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) oder Phosphinothricin und dergleichen verleihen, oder solche, die eine Resistenz gegen Antimetabolite verleihen, zum Beispiel das dhfr-Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994) 142-149). Beispiele für andere, ebenfalls geeignete Gene sind trpB oder hisD (Hartman SC und Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci USA. 85 (1988) 8047-8051). Ein weiteres geeignetes Gen ist das Gen für Mannosephosphat-Isomerase (WO 94/20627), das ODC (Ornithindecar boxylase)-gen (McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus (Tamura K et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
  • „Transformation" beschreibt einen Prozeß zur Einführung heterologer DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Dabei wird mit dem Begriff transformierte Zelle nicht nur das Produkt des Transformationsprozesses per se beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die Transformation erzeugten transgenen Organismus.
  • „Ziel/Zielprotein": ein über die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz (dieser Begriff ist weiter unten definiert) codiertes Polypeptid, bei dem es sich um ein Enzym im klassischen Sinne oder beispielsweise um ein Strukturprotein, ein für Entwicklungsprozesse relevantes Protein, ein Regulationsprotein, wie z.B. Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Phosphatasen, Rezeptoren, Untereinheiten von Kanälen, Transportproteine, regulatorische Untereinheiten, die einem Enzymkomplex eine Substrat- oder Aktivitätsregulation verleihen, handeln kann. Allen Zielen oder Wirkorten ist dabei gemein, daß ihre funktionelle Anwesenheit essentiell für das Überleben oder eine normale Entwicklung bzw. ein normales Wachstum ist.
  • „Transgen": bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette oder einen Vektor, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder einen mit der oben genannten Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder dem oben genannten Vektor transformierten Organismus beschreibt der Begriff transgen alle diejenigen Konstrukte, die mit gentechnischen Verfahren erzeugt wurden und in denen sich entweder die Nukleinsäuresequenz des Zielproteins oder eine mit der Nukleinsäuresequenz des Zielproteins funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination der vorstehend genannten Möglichkeiten sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befindet oder durch rekombinante Verfahren modifiziert wurde. Dabei läßt sich die Modifikation beispielsweise über eine Mutation eines oder mehrerer Nukleotidreste der betreffenden Nukleinsäuresequenz erreichen.
  • „Vektor", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein selbstreplizierendes DNA- oder RNA-Molekül, das einen Nukleinsäureabschnitt zwischen Zellen transferiert.
  • Als Messenger-RNA vor nahezu 40 Jahren entdeckt wurde, war ihre kennzeichnende Eigenschaft ihre Instabilität. Die mRNA repräsentiert zu jedem Zeitpunkt eine wesentliche Fraktion der von RNA-Polymerase hergestellten Transkripte, wird jedoch rasch abgebaut. Die Instabilität der mRNA stellte sich als ein wichtiger Parameter heraus, der die Niveaus der Genexpression bestimmt und schnell Antworten auf Regulationssignale gestattet. Die Instabilität führte auch unmittelbar zu der Frage, wie mRNA enzymatisch abgebaut wird, um die Nukleotideinheiten als NTPs wiederzuverwenden. Es wurden innerhalb weniger Jahre nach der Entdeckung der mRNA wenigstens drei Enzym aktivitäten aus Escherichia coli identifiziert: Polynukleotidphosphorylase, Poly(A)-Polymerase I und RNase II, wobei seitdem viele andere Aktivitäten gefunden wurden.
  • Von den über 20 in E. coli identifizierten RNasen scheinen lediglich sechs am mRNA-Abbau beteiligt zu sein: Bei drei der RNasen des mRNA-Abbaus handelt es sich um stellenspezifische Endoribonukleasen und bei dreien um 3'-5'-Exoribonukleasen.
  • Eine Hauptexonuklease des mRNA-Abbaus ist Polynukleotidphosphorylase, eine phosphorylytisches Enzym, das anorganisches Phosphat zur Abtrennung von Nukleotiden von 3'-RNA-Enden verwendet, wobei Nukleosid-5'-Diphosphate erhalten werden. Bei einer Inaktivierung von entweder RNase II oder PNPase bleiben die E. coli-Stämme lebensfähig, doch ist die Inaktivierung beider Enzyme lethal. RNase-R-Mutanten sind ebenso mit PNPase-Mutanten lethal.
  • Das Nichtüberleben von Stämmen ohne PNPase und RNase R deutete darauf hin, daß diese beiden Enzyme an einer bzw. einigen wichtigen Zellfunktion bzw. Zellfunktionen beteiligt sind und daß ihre Aktivität teilweise redundant sein könnte (Cheng et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, S. 14077-14080). Bei einer ihrer Aktivitäten handelt es sich um den Abbau von mRNA-Fragmenten (Donovan und Kushner, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, S. 120-124). Biochemische Analysen ließen darauf schließen, daß PNPase die Hauptaktivität bei der Auslösung des Abbaus von RNA-Molekülen nach endonukleolytischer Spaltung und Polyadenylierung darstellt (Hayes et al., Trends Biochem. Sci., 24, 199-202). Der Abbau von RNA-Molekülen wird durch die Polyadenylierung verstärkt, indem sie mit einem Abbau-Tag versehen werden, wobei die Polyadenylierung ein allgemeines Merkmal von Bakterien und Pflanzenorganellen ist (Carpousis et al., Trends Genet., 15, 24-28).
  • Bei Polynukleotidphosphorylase (PNPase, Polyribonukleotid-Nukleotidyltransferase, EC 2.7.7.8) handelt es sich um ein multifunktionelles Protein mit der oben erwähnten prozessiven 3'-5'-Exoribonuklease, ihrer reversiblen Aktivität der Synthese von RNA unter Verwendung eines beliebigen Nukleosiddiphosphats, ferner einem Pi (anorganisches Phosphat)-Austausch und einer Autoregulationsaktivität. Die Wechselwirkung zwischen der Polynukleotidphosphorylase und dem mRNA-Ziel ist für ihre Aktivitäten entscheidend. Die PNPase besitzt eine hohe Affinität für mRNA, ssRNA und für ssDNA (ssRNA/DNA, Einzelstrang-RNA/DNA), wohingegen sie eine geringere Affinität für dsDNA, Doppelstrang-DNA aufweist (Bermudez-Cruz et al., 2002, Biochimie 84(4), S. 321-328).
  • Darüber hinaus ist die PNPase an der Qualitätskontrolle der tRNA-Synthese beteiligt. Eine defekte tRNA-Vorstufe wird zunächst einer Polyadenylierung durch Poly(A)-Polymerase unterzogen und dann von PNPase abgebaut (Li et al., 2002, EMBO J. 21, S. 1132-1138).
  • Es besteht eine hohe Ähnlichkeit der molekularen Mechanismen der RNA-Polyadenylierung und des RNA-Abbaus in Bakterien und in Chloroplasten (Yehudai-Resheff et al., 2001, Mol. & Cell. Biol. 21(16), S. 5408-5416). Die PNPase in Chloroplasten ist am RNA-Abbau beteiligt.
  • Diese Ergebnisse werden von Baginsky und Gruissem, 2002, Nucleic Acids Research 30(20), S. 4527-4533 unterstützt, die zeigen konnten, daß die relativen Halbwertszeiten für Photosyntheseproteine codierende mRNAs in Chloroplasten dunkel angepaßter Pflanzen verkürzt sind. Die Polyadenylierungsaktivität der Polynukleotidphosphorylase (PNPase) stieg in der aus Plastiden isolierten Proteinfraktion in dunkel angepaßten Pflanzen synchron stark an.
  • Ferner ist ein Modell offenbart, bei dem PNPase und RNase R einen bislang unbekannten Qualitätskontrollprozeß vermitteln, mit dem in der Regel defekte rRNAs unmittelbar nach ihrer Erzeugung entfernt werden. Bei Abwesenheit dieser Enzyme reichern sich rRNA-Fragmente an, was zur Störung der ribosomen Reifung und letztendlich zum Zelltod führt (Cheng und Deutscher, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100(11), S. 6388-6393).
  • Wie bei vielen anderen Bakteriengenen wird die Expression der Polynukleotidphosphorylase-Synthese auf der postranskriptionalen Ebene in einem RNase III-abhängigen Mechanismus autokontrolliert. Dabei spaltet RNase III eine lange „Stem-loop"-Struktur in der pnp-Leitsequenz, die die pnp-mRNA-Instabilität auslöst, was zu einer Abnahme der Synthese von Polynukleotidphosphorylase führt. Durch die Spaltung mit RNase III wird der obere Teil der Stem-loop-Struktur abgetrennt, wodurch ein Duplex mit einer kurzen 3'-Verlängerung entsteht (Jarrige et al., 2001, EMBO J. 20(23), S. 6845-6855).
  • Da Pflanzen auf einen effizienten Nukleotidmetabolismus angewiesen sind, kann man annehmen, daß Enzyme, die an der Nukleotidbiosynthese teilnehmen, ein geeignetes Zielprotein für Herbizide darstellen. So wurden bereits Wirkstoffe beschrieben, die die de-Novo-Purinbiosynthese in Pflanzen hemmen. Beispielhaft sei die natürlich vorkommende Substanz Hydanthocidin genannt, die nach der Phosphorylierung in Pflanzen die Adenylosuccinat-Synthetase (ASS) hemmt (Siehl et al., Plant Physiol. 110(1996), 753-758).
  • Die Eignung eines Enzyms als Ziel für Herbizide läßt sich über die Verminderung der Enzymaktivität, beispielsweise mittels Antisense-Technologie in transgenen Pflanzen, bestätigen. Falls die Einführung einer Antisense-DNA für ein bestimmtes Gen in eine Pflanze zu reduziertem Wachstum führt, so läßt dies darauf schließen, daß das Enzym, dessen Aktivität verringert ist, eine geeignete Angriffstelle für Herbizidwirkstoffe darstellt. So führt beispielsweise die Antisense-Hemmung von Acetolactat-Synthese (ALS) in transgenen Kartoffelpflanzen ebenso wie die Behandlung von Kontrollpflanzen mit ALS hemmenden Herbiziden zu vergleichbaren Phänotypen (Höfgen et al., Plant Physiology 107(1995), 469-477).
  • Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß Pflanzen, bei denen die Aktivität von Polynukleotidphosphorylase PNPase erniedrigt war, reduziertes Wachstum, Wachstumsretardierung und/oder Fitneßverlust zeigen. Transgene Tabakpflanzen, die ein PNPase-Antisense-Gen sowie eine teilweise erniedrigte PNPase-Aktivität enthalten, zeigen die gleichen oben erwähnten Symptome eines reduzierten Wachstums, einer Wachstumsretardierung und/oder eines Fitneßverlusts.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polypeptids, das die Aktivität von nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist, in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden, vorzugsweise eines Polypeptids, das die Aktivität von nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist, bei dem es sich um
    • a) die Polynukleotidphosphorylase handelt, die von einer Nukleinsäuresequenz codiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 1 von wenigstens 50% aufweist; oder iv) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 2 aufweist, umfaßt; oder
    • b) die Polynukleotidphosphorylase handelt, die von einer Nukleinsäuresequenz codiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 4 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 3 von wenigstens 50% aufweist; oder iv) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No.4 aufweist, umfaßt; oder
    • c) die Polynukleotidphosphorylase-Protease handelt, die von einer Nukleinsäuresequenz codiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 6 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 5 von wenigstens 50% aufweist; oder iv) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No.6 aufweist, umfaßt; oder
    • d) die Polynukleotidphosphorylase handelt, die von einer Nukleinsäuresequenz codiert wird, welche: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 8 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 7 von wenigstens 50% aufweist; oder iv) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No.8 aufweist, umfaßt.
  • Der Begriff „umfassend" in Verbindung mit einer Nukleinsäuresequenz bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz von zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen flankiert sein kann, die am 5'-Ende und am 3'-Ende bzw. am 5'-Ende oder am 3'-Ende am Ende eine Sequenzlänge von wenigstens 1000 Bp, vorzugsweise wenigstens 500 Bp, stärker bevorzugt wenigstens 250 Bp und am meisten bevorzugt wenigstens 100 Bp, aufweisen.
  • Das erfindungsgemäße funktionelle Äquivalent der SEQ ID No. 1 , wie in a) iii) beschrieben, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität von nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist, und eine Identität von wenigstens 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64% oder 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ ID NO. 1 aufweist.
  • Die funktionellen Äquivalente der in a) iv. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 1 werden von einer Aminosäuresequenz codiert, die die Aktivität einer nukleärcodierten Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ ID NO. 2 aufweist.
  • Die funktionellen Äquivalente der in b) iii. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 3, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität einer nukleärcodierten Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64% or 65% oder vorzugs weise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ ID NO. 3 aufweist.
  • Die funktionellen Äquivalente der in b) iv. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 3 werden von einer Aminosäuresequenz codiert, die die Aktivität einer nukleärcodierten Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt von 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ ID NO. 4 aufweist.
  • Ein Beispiel für ein funktionelles Äquivalent der SEQ ID NO. 3 ist die Nukleinsäuresequenz aus Spinacia oleracea (Gene Bank Acc. No U52048). Diese Sequenz ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Die funktionellen Äquivalente der in c) iii. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 5, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität einer nukleärcodierten Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität- von 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ ID NO. 5 aufweist.
  • Die funktionellen Äquivalente der in c) iv. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 5 werden von einer Aminosäuresequenz codiert, die die Aktivität einer nukleärcodierten Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ ID NO. 6 aufweist.
  • Ein Beispiel für ein funktionelles Äquivalent der SEQ ID NO. 5 ist die Nukleinsäuresequenz aus Pisum sativum PN (Gene Bank Acc. No AF010578). Diese Sequenz ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Die funktionellen Äquivalente der in d) iii. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 7, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aktivität einer nukleärcodierten Poly nukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ ID NO. 7 aufweist.
  • Die funktionellen Äquivalente der in d) iv. angegebene Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 7 werden von einer Aminosäuresequenz codiert, die die Aktivität einer nukleärcodierten Polynukleotidphosphorylase sowie wenigstens eine Identität von 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64% or 65% oder vorzugsweise von 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% oder 79%, stärker bevorzugt von 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% oder 90%, am meisten bevorzugt von 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit der SEQ ID NO. 8 aufweist.
  • Ein Beispiel für ein funktionelles Äquivalent der SEQ ID NO. 5 ist die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana (Gene Bank Acc. No AF450480). Diese Sequenz ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Weiterhin werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung pflanzliche Nukleinsäuresequenzen beansprucht,
    • I) codierend für eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend: a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 2 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder c) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die mit der SEQ ID No. 1 eine Identität von wenigstens 69%, vorzugsweise 69,495%, aufweist, oder d) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die wenigstens eine Identität von 65%, vorzugsweise 65,079%, mit der SEQ ID NO. 2 aufweist;
    • II) codierend für eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend: a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 4 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder c) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die mit der SEQ ID No. 3 eine Identität von wenigstens 73%, vorzugsweise 73,151%, aufweist, oder d) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die wenigstens eine Identität von 71 %, vorzugsweise 71,429%, mit der SEQ ID NO. 4 aufweist;
    • III) codierend für eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend: a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 6 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder c) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die mit der SEQ ID No. 5 eine Identität von wenigstens 73%, vorzugsweise 73,973%, aufweist, oder d) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die wenigstens eine Identität von 72%, vorzugsweise 72,8%, mit der SEQ ID NO. 6 aufweist;
  • Das funktionelle Äquivalent der in I c) angegebenen SEQ ID No. 1 weist wenigstens eine Identität von 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, bevorzugt wenigstens 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit SEQ ID No. 1 auf.
  • Die funktionellen Äquivalente der in I) d) angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID No. 1 sind von einer Aminosäuresequenz codiert, die die Aktivität einer nukleär codierten Polynukleotidphosphorylase und wenigstens eine Identität von 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, bevorzugt wenigstens 78%, 79%, 80%, 81 %, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, mit der SEQ ID No. 2 aufweist.
  • Das funktionelle Äquivalent der in II c) angegebenen SEQ ID No. 3 weist wenigstens eine Identität von 73%, 74%, bevorzugt wenigstens 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit SEQ ID No. 3 auf.
  • Die funktionellen Äquivalente der in II) d) angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID No. 3 sind von einer Aminosäuresequenz codiert, die die Aktivität einer nukleär codierten Polynukleotidphosphorylase und wenigstens eine Identität von 71 %, bevorzugt wenigstens 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, mit der SEQ ID No. 4 aufweist.
  • Das funktionelle Äquivalent der in III c) angegebenen SEQ ID No. 5 weist wenigstens eine Identität von 72%, 73%, 74%, bevorzugt wenigstens 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92% oder 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99%, mit SEQ ID No. 6 auf.
  • Die funktionellen Äquivalente der in I) d) angegebenen Nukleinsäuresequenz SEQ ID No. 5 sind von einer Aminosäuresequenz codiert, die die Aktivität einer nukleär codierten Polynukleotidphosphorylase und wenigstens eine Identität von 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, bevorzugt wenigstens 79%, 80%, 81 %, 82% oder 83%, vorzugsweise wenigstens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, besonders bevorzugt wenigstens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, mit der SEQ ID No. 6 aufweist.
  • Ebenso werden die von den oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen gemäß I c)-d), II c)-d) und III c)-d) codierten Polypeptide beansprucht. Die funktionellen Äquivalente, wie in c) und d) beschrieben, zeichnen sich durch die gleiche Funktionalität aus, d.h. sie weisen die Aktivität einer Polynukleotidphosphorylase auf.
  • Die Nukleinsäuresequenzen I c)-d), II c)-d) und III c)-d) werden im folgenden als NPNP-Sequenzen bezeichnet.
  • Der im folgenden verwendete Begriff "erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen" bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid codieren, welches die Aktivität von nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden aufweist, vorzugsweise eines Polypeptids, das die Aktivität von nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist, bei der es sich um
    • a) die von einer Nukleinsäuresequenz codierte Polynukleotidphosphorylase, die: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degenerie des genetischen Codes von der in SEQ ID NO. 2 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit SEQ ID NO. 1 von wenigstens 50% aufweist; oder iv) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz codiert wird, welche eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID NO. 2 aufweist, umfaßt, oder
    • b) die von einer Nukleinsäuresequenz codierte Polynukleotidphosphorylase, die: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degenerie des genetischen Codes von der in SEQ ID NO. 4 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit SEQ ID NO. 3 von wenigstens 50% aufweist; oder iv) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 3 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz codiert wird, welche eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID NO. 4 aufweist, umfaßt, oder
    • c) die von einer Nukleinsäuresequenz codierte Polynukleotidphosphorylase-Protease, die: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degenerie des genetischen Codes von der in SEQ ID NO. 6 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit SEQ ID NO. 5 von wenigstens 50% aufweist; oder iv) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz codiert wird, welche eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID NO. 6 aufweist, umfaßt, oder
    • d) die von einer Nukleinsäuresequenz codierte Polynukleotidphosphorylase, die: i) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO. 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, oder ii) eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degenerie des genetischen Codes von der in SEQ ID NO. 8 dargestellten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die eine Identität mit SEQ ID NO. 7 von wenigstens 50% aufweist; oder iv) ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID NO. 7 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die von einer Aminosäuresequenz codiert wird, welche eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID NO. 8 aufweist, umfaßt, handelt.
  • Ein Polypeptid, das die Aktivität von nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase aufweist und von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz codiert ist, wird im folgenden einfach als "PNP" bezeichnet.
  • Reduzierte Mengen an Polynukleotidphosphorylase PNPase verursachen Wachstumsretardierung sowie nekrotische und chlorotische Blätter in Pflanzen.
  • Die Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen neue Ziele für Herbizide dar, wodurch die Bereitstellung neuer Herbizide zur Bekämpfung unerwünschter Pflanzen ermöglicht wird. Zudem stellen die Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren neue Ziele für Wachstumsregulatoren dar, durch die Bereitstellung neuer Wachstumsregulatoren zur Regulation des Wachstums vom Pflanzen ermöglicht wird.
  • Unter unerwünschten Pflanzen sind im weitesten Sinne alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind, beispielsweise:
    dikotyle Unkräuter der Gattungen: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.
  • Monokotyle Unkräuter der Gattungen: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristylis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.
  • SEQ ID NO. 1, 3, 5 oder 7 läßt sich ganz oder teilweise zur Herstellung von Hybridisierungssonden verwenden. Die Herstellung dieser Sonden sowie die experimentelle Durchführung sind bekannt. Letztere kann beispielsweise über die gezielte Herstellung radioaktiver oder nichtradioaktiver Sonden mittels PCR und die Verwendung entsprechend markierter Oligonukleotide mit anschließenden Hybridisierungsexperimenten erfolgen. Die für diesen Zweck benötigten Technologien sind beispielsweise bei T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ausführlich beschrieben. Die betreffenden Sonden können weiterhin mittels Standardtechnologien (Lit. SDM bzw. Zufallsmutagenese) so modifiziert werden, daß sie für weitere Zwecke einsetzbar sind, beispielsweise als Sonde, die spezifisch mit mRNA und den entsprechenden codierenden Sequenzen hybridisiert, um die entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen zu analysieren.
  • Die oben erwähnten Sonden lassen sich zum Nachweis und zur Isolierung funktioneller Äquivalente der SEQ ID NO. 2, 4, 6 oder 8 aus anderen Pflanzenspezies auf der Grundlage von Sequenzidentitäten verwenden. Hierbei wird die Sequenz der betreffenden SEQ ID NO. 2 ganz oder teilweise als Sonde zum Screening einer genomischen oder cDNA-Bibliothek der betreffenden Pflanzenspezies oder in einer Computer-Recherche nach Sequenzen funktioneller Äquivalente in elektronischen Datenbanken verwendet.
  • Bevorzugte Pflanzenspezies sind dabei die unerwünschten Pflanzen, die bereits eingangs erwähnt wurden.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Expressionskassetten, umfassend
    • a) genetische Kontrollsequenzen in operativer Verknüpfung mit einer NPNP-Sequenz; oder
    • b) zusätzliche Funktionselemente, oder
    • c) eine Kombination aus a) und b);
    sowie die Verwendung von Expressionskassetten, umfassend
    • a) genetische Kontrollsequenzen in operativer Verknüpfung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz,
    • b) zusätzliche Funktionselemente, oder
    • c) eine Kombination aus a) und b);
    zur Expression einer PNPase, die sich in in-vitro-Testsystemen verwenden läßt. Beide Ausführungsformen der oben beschriebenen Expressionskassetten werden im folgenden als erfindungsgemäße Expressionskassetten bezeichnet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette am 5'-Ende der codierenden Sequenz einen Promotor sowie am 3'-Ende ein Transkriptionsterminationssignal und gegebenenfalls weitere genetische Kontrollsequenzen, welche mit der dazwischenliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft sind.
  • Unter den erfindungsgemäßen Expressionskassetten sind auch Analoge zu verstehen, die beispielsweise durch eine Kombination der einzelnen Nukleinsäuresequenzen auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte), auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Kotransformation) oder durch sequenzielle Transformation zustande kommen können.
  • Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen unter Punkt a) für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder für erfindungsgemäße Expressionskassetten umfassende Vektoren sind beispielsweise Promotoren, wie z.B. der cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder der λ-PL-Promotor, wobei sich die Promotoren jeweils zur Expression einer Polynukleotidphosphorylase in Gramnegativen Bakterienstämmen verwenden lassen.
  • Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen liegen beispielsweise in den Promotoren amy und SPO2, die sich jeweils zur Expression von Polynukleotid-phosphorylase in Gram-positiven Bakterienstämmen verwenden lassen, sowie in den Hefe- bzw. Pilzpromotoren AUG1, GPD-1, PX6, TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PHO5, AOX1, GAL10/CYC1, CYC1, OliC, ADH, TDH, Kex2, MFA oder NMT oder Kombinationen der oben genannten Promotoren (Degryse et al., Yeast, 15. Juni 1995; 11(7):629-40; Romanos et al. Yeast, Juni 1992;8(6):423-88; Benito et al. Eur. J. Plant Pathol. 104, 207-220 (1998); Cregg et al. Biotechnology (N Y), August 1993;11(8):905-10; Luo X., Gene, 22. Sept. 1995;163(1):127-31: Nacken et al., Gene, 10. Okt. 1996;175(1-2): 253-60; Turgeon et al., Mol Cell Biol, Sept. 1987;7(9):3297-305) oder den Transkriptions-terminatoren NMT, Gcy1, TrpC, AOX1, nos, PGK oder CYC1 (Degryse et al., Yeast, 15. Juni 1995; 11(7):629-40; Brunelli et al. Yeast, Dez. 1993 9(12): 1309-18; Frisch et al., Plant Mol. Biol. 27(2), 405-409 (1995); Scorer et al., Biotechnology (N.Y. 12 (2), 181-184 (1994), Genbank acc. number Z46232; Zhao et al. Genbank acc number AF049064; Punt et al., (1987) Gene 56 (1), 117-124) vor, wobei diese Sequenzen sich jeweils zur Expression von Polynukleotidphosphorylase in Hefestämmen verwenden lassen.
  • Für die Expression in Insektenzellen geeignete genetische Kontrollsequenzen sind beispielsweise der Polyhedrin-Promotor sowie der p10-Promotor (Luckow, V.A. und Summers, M.D. (1988) Bio/Techn. 6, 47-55).
  • Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression von PNP in Zellkultur sind neben Polyadenylierungssequenzes, wie beispielsweise aus Affenvirus 40, eukaryontische Promotoren viralen Ursprungs, wie z.B. Promotoren des Polyomavirus, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Affenvirus 40.
  • Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression nukleär codierter PNPase in Pflanzen liegen in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS; FBPaseP (WO 98/18940) oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor, wobei vorzugsweise insbesondere ein Pflanzenpromotor oder ein aus einem Pflanzenvirus stammender Promotor verwendet wird. Besonders bevorzugt sind Promotoren viralen Ursprungs, wie etwa der Promotor des 35S-Transkripts des Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294; Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812). Weitere bevorzugte konstitutive Promotoren sind beispielsweise der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobakterium, der TR Doppelpromotor, der OCS (Octopin-Synthase)-Promotor aus Agrobakterium, der Ubiquitin-Promotor, (Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995, 29:637-649), die Promotoren der vakuolären ATPase-Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991).
  • Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor als genetische Kontrollsequenz enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie etwa beispielsweise der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP-A-0388186), ein durch Tetracyclin induzierbarer Promotor (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor (WO 93/21334), können ebenso verwendet werden.
  • Geeignet sind weiterhin solche Promotoren, die eine gewebe- oder organspezifische Expression, beispielsweise in Antheren, Ovarien, Blüten und Blütenorganen, Blättern, Schließzellen, Trichomen, Stengel, Leitgeweben, Wurzeln und Samen, vermitteln. Ebenso geeignet sind neben den oben genannten konstitutiven Promotoren insbesondere solche Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind hier der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU (small subunit)-Promotor der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase) oder der ST-LSI-Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245). Bevorzugt sind weiterhin Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Phaseolin-Promotor ( US 5,504,200 , Bustos MM et al., Plant Cell. 1989;1(9):839-53), the Promotor des 2S-Albumin-Gens (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987, 262:12196-12201), der Legumin-Promotor (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989;215(2):326-331), der Promotor des USP (unknown seed protein) (Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991, 225(3):459-67), der Promotor des Napin-Gens (Stalberg K, et al., L. Planta 1996, 199:515-519), der Promotor des Saccharosebindungsproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128; Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090).
  • Weitere als genetische Kontrollsequenzen geeignete Promotoren sind beispielsweise spezifische Promotoren für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin-Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin-D-Inhibitors aus Kar toffel, der Promotor der Stärke-Synthase (GBSS1) oder der Sporamin-Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifungsspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifungsspezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Synthase-Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr-Gens (WO 98/22593), oder spezifische Plastiden- oder Chromoplasten-Promotoren, wie beispielsweise der RNA-Polymerase-Promotor (WO 97/06250), oder auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase aus Glycin max (siehe auch Genbank Accession Nr. U87999), oder ein anderer Nodien-spezifischer Promotor, wie in der EP-A 249676 beschrieben.
  • Unter zusätzlichen Funktionselementen b) sind beispielhaft, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Reportergene, Replikationsursprünge, Selektionsmarker und sogenannte Affinitäts-Tags, fusioniert mit Polynukleotidphosphorylase, direkt oder mittels eines Linkers, der optional eine Protease-Schnittstelle umfaßt, zu verstehen. Weitere geeignete zusätzliche Funktionselemente sind Sequenzen, die sicherstellen, daß das Produkt in die Apoplasten, in Plastiden, in die Vacuole, in das Mitochondrium, in das Peroxisom, in das endoplasmatische Reticulum (ER) geleitet wird oder aufgrund des Fehlens derartiger operativer Sequenzen im Kompartiment verbleibt, in dem es entstand, nämlich dem Cytosol, (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423).
  • Ebenso sind im Sinne der Erfindung Vektoren, die wenigstens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskassetten umfassen.
  • Außer Plasmiden sind unter Vektoren auch alle anderen, dem Fachmann geläufigen Vektoren, wie etwa beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide oder lineare oder zirkuläre DNA, zu verstehen. Dabei können diese Vektoren autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden; bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Vektors läßt sich das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen einführen und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integrieren. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder lediglich aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
  • Weitere prokaryontische oder eukaryontische Expressionssysteme sind in Kapitel 16 und 17 bei Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual." 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, genannt. Weitere vorteilhafte Vektoren sind bei Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
  • Die erfindungsgemäße Expressionskassette sowie davon abgeleitete Vektoren lassen sich zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien (z.B. der Gattung Synechocystis, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema und Nostoc), Proteobakterien, wie etwa Magnetococcus sp. MC1, Hefen, filamentösen Pilzen sowie Algen und eukaryontischen nichtmenschlichen Zellen (z.B. Insektenzellen) mit dem Ziel der rekombinanten Herstellung von PNP, einsetzen, wobei die Erzeugung einer geeigneten Expressionskassette von dem Organismus, in dem das Gen exprimiert werden soll, abhängt.
  • Eine NPNP-Sequenz umfassende Vektoren bilden einen Teil des Gegenstands der vorliegenden Erfindung.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingeführt werden.
  • Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen jeweils in einem Vektor in den Organismus eingeführt werden, wobei die unterschiedlichen Vektoren gleichzeitig oder nacheinander eingeführt werden können.
  • Dabei kann das Einführen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n), der Expressionskassette oder des Vektors in die betreffenden Organismen (Transformation) prinzipiell nach allen dem Fachmann geläufigen Verfahren erfolgen.
  • Im Falle von Mikroorganismen kann der Fachmann geeignete Verfahren den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Bnd. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, 1994, Academic Press, entnehmen. Bei der Transformation filamentöser Pilze bieten sich zum einen die Erzeugung von Protoplasten und Transformation mit Hilfe von PEG (Wiebe et al. (1997) Mycol. Res. 101 (7): 971-877; Proctor et al. (1997) Microbiol. 143, 2538-2591) und zum anderen die Transformation mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens (de Groot et al. (1998) Nat. Biotech. 16, 839-842) als Verfahren an.
  • Im Falle von dikotylen Pflanzen lassen sich die beschriebenen Verfahren zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation nutzen. Geeignete Verfahren sind dabei das biolistische Verfahren oder die Transformation von Protoplasten (vgl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, Hrsg.), Bd. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basle-Cambridge), Elektroporation, die Inkubation trockener Embryos in DNA-haltiger Lösung, Mikroinjektion sowie der durch Agrobakterium verbreitete Gentransfer. Die oben erwähnten Verfahren sind beispielsweise bei B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 und bei Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec.Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben.
  • Die Transformation mittels Agrobakterien sowie die zur Transformation zu verwendenden Vektoren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711. Die intermediären Vektoren lassen sich aufgrund von Sequenzen, die zu Sequenzen in der T-DNA homolog sind, mittels homologer Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integrieren. Dieses Plasmid enthält zusätzlich den für den Transfer der T-DNA benötigten vir-Bereich. Intermediäre Vektoren sind nicht in der Lage, in Agrobakterien zu replizieren. Mittels eines Helferplasmids läßt sich der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen sowie einen Linker oder Polylinker, die vom rechten und linken T-DNA-Grenzbereich eingerahmt werden. Sie lassen sich direkt in die Agrobakterien transformieren (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187), EP A 0 120 516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287).
  • Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Vektoren auf Agrobakterium-Basis wurde beschrieben (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al. Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11,(1992) 76-80; May et al. Biotechnology 13 (1995) 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992) 550-555; Ritchie et al. Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation monokotyler Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al. Biotechnology 11 (1992), 667-674; Ritala et al., Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), die Protoplastentransformation, die Elektroporation partiell permeabilisierter Zellen sowie die Einführung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais ist in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z.B. WO 95/06128; EP 0513849 A1 ; EP 0465875 A1 ; EP 0292435 A1 ; Fromm et al., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11(1993) 194-200; Moroc et al., Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).
  • Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, beispielsweise für Gerste (Wan und Lemaux, see above; Ritala et al., siehe oben (Nehra et al., Plant J. 5(1994) 285-297).
  • Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobacterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, wie etwa Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Kanola, Sonnenblume, Flax, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Pfefferschote, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
  • Die genetisch veränderten Planzenzellen lassen sich über alle dem Fachmann geläufigen Verfahren regenerieren. Derartige Verfahren können den oben erwähnten Veröffentlichungen von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
  • Die durch die Transformation mit einer der oben beschriebenen Ausführungsformen einer Expressionskassette, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder einem Vektor, umfassend die oben erwähnte Expressionskassette, erzeugten transgenen Organismen sowie die mittels Expression aus dem transgenen Organismus erhältliche rekombinante PNP bilden einen Teil des Gegenstands der vorliegenden Erfindung. Die Verwendung transgener Organismen, umfassend eine erfindungsgemäße Expressionskassette, beispielsweise zur Bereitstellung von rekombinantem Protein, und/oder die Verwendung dieser Organismen in in-vivo-Testsystemen bilden ebenfalls einen Teil des Gegenstands der vorliegenden Erfindung.
  • Bevorzugte Organismen für die rekombinante Expression sind nicht nur Bakterien, Hefen, Mose, Algen und Pilze, sondern auch eukaryontische Zellinien.
  • Bevorzugte Mose sind Physcomitrella patens oder weitere in Kryptogamen [Cryptogamia], Bd. 2, Moose, Farne [Mosses, Ferns], 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515) beschriebene Mose.
  • Innerhalb der Bakterien sind beispielsweise Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien, beispielsweise der Gattung Synechocystis, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema und Nostoc, besonders bevorzugt Synechocystis oder Anabaena, bevorzugt.
  • Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Schizosaccheromyces, Hansenula oder Pichia.
  • Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Bd. 37, Nr. 1,2 (1995) beschriebene Pilze.
  • Bevorzugte Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie beispielsweise Getreidearten wie Weizen, Gerste, Sorghum oder Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie Zuckerrohr. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie beispielsweise Brassicaceae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Kanola; Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuß, Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Pfefferschote; Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula; Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini, oder Lein, Baumwolle, Hanf, Flax, roter Pfeffer, Möhre, Zuckerrübe, oder verschiedene Baum-, Nuß- und Weinspezies.
  • Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet, wie beispielsweise C. elegans.
  • Ebenso bevorzugt ist die Verwendung von Expressionssystemen und Vektoren, die öffentlich zugänglich oder kommerziell erhältlich sind.
  • Zur Verwendung in E. coli-Bakterien sind die typischen vorteilhaften, kommerziell erhältlichen Fusions- und Expressionsvektoren pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) bzw. pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathione-S-Transferase (GST), Maltosebindungsprotein bzw. Protein A enthalten, die pTrc-Vektoren (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315), "pKK233-2" der Firma CLONTECH, Palo Alto, CA sowie die Vektorserien "pET" und "pBAD" der Firma Stratagene, La Jolla und die Vektorserie TOPO-TA der Firma Invitrogen zu nennen.
  • Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES-Derivate, pGAPZ- Derivate, pPICZ-Derivate sowie Vektoren des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren zur Verwendung in filamentösen Pilzen sind beschrieben bei: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • Alternativ können auch vorteilhafterweise Insektenzellenexpressionsvektoren verwendet werden, beispielsweise für die Expression in Sf9-, Sf21- oder Hi5-Zellen, die jeweils über rekombinante Baculoviren infiziert werden. Beispiele hierfür sind die Vektoren der pAc-Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL-Serie (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39). Weiter genannt seien die Baculovirus-Expressionssysteme "MaxBac 2.0 Kit" und "Insect Select System" der Firma Invitrogen, Carlsbad, USA, oder "BacPAK Baculovirus Expression System" der Firma CLONTECH, Palo Alto, CA, USA. Insektenzellen eignen sich in besonderer Weise zur Überexpression eukaryontischer Proteine, da sie posttranslational Modifikationen der Proteine durchführen, die in Bakterien und Hefen nicht möglich sind. Die Handhabung von Insektenzellen in Zellkultur sowie ihre Infektion zur Expression von Proteinen sind dem Fachmann geläufig und können in Analogie zu bekannten Verfahren erfolgen (Luckow und Summers, Bio/Tech. 6, 1988, S. 47-55; Glover und Hames (Hrsg.) in DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995, 205-244).
  • Des weiteren können zur Expression von Genen vorteilhafterweise Pflanzenzellen oder Algenzellen eingesetzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich, wie oben erwähnt, bei Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder bei Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
  • Zudem lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimieren. Beispiele für geeignete Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC, die in Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195 Erwähnung finden. Vorzugsweise zu verwendende Promotoren sind dabei viralen Ursprungs, wie beispielsweise Promotoren des Polyomavirus, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Affenvirus 40. Weitere prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme sind in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, genannt. Weitere vorteilhafte Vektoren sind bei Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
  • Die transgenen Organismen, die eine NPNP-Sequenz umfassen, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung beansprucht.
  • Sämtliche oben beschriebene Ausführungsformen der transgenen Organismen, die wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassen, fallen unter den Begriff "erfindungsgemäßer transgener Organismus".
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von PNP in einem Verfahren zur Identifizierung von Testverbindungen mit herbizider Wirkung.
  • Bevorzugt umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung die folgenden Schritte:
    • i. in Kontakt bringen von PNP mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbindung(en) an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder an PNP gestatten, und
    • ii. Nachweisen, ob die Testverbindung an die PNP aus i) bindet, oder
    • iii. Nachweisen, ob die Testverbindung die enzymatische oder biologische Aktivität von PNP aus i) reduziert oder blockiert, oder
    • iv. Nachweisen, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression von PNP aus i) reduziert oder blockiert.
  • Der Nachweis gemäß Schritt (ii) des obigen Verfahrens läßt sich unter Verwendung von Techniken, mit denen die Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und Liganden identifiziert werden kann, durchführen. Dabei kann entweder die Testverbindung oder das Enzym eine nachweisbare Markierung enthalten, wie beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung, ein Radioisotop, eine Chemilumineszenzmarkierung oder eine Enzymmakierung. Beispiele für Enzymmarkierungen sind Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Luziferase. Der anschließende Nachweis hängt von der Markierung ab und ist dem Fachmann bekannt.
  • In diesem Zusammenhang sind insbesondere fünf bevorzugte Ausführungsformen zu nennen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung auch für Verfahren mit hohem Durchsatz (high-throughput methods, HTS) geeignet sind:
    • 1. Die mittlere Diffusionsgeschwindigkeit eines Fluoreszenzmoleküls in Abhängigkeit von der Masse läßt sich in einem kleinen Probenvolumen über Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 11753-11575) bestimmen. FCS läßt sich zur Bestimmung von Protein/Ligand-Wechselwirkungen einsetzen, indem die Massenänderung bzw. die daraus resultierende veränderte Diffusionsgeschwindigkeit einer Testverbindung, wenn diese an PNP bindet, gemessen wird. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer mit einem Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren so konzipiert sein, daß eine mit einem Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch weitere Testverbindungen verdrängt wird ("Verdrängungs-Assay").
    • 2. Bei der Fluoreszenzpolarisation wird die Eigenschaft eines mit polarisiertem Licht angeregten ruhenden Fluorophors, ebenfalls wieder polarisiertes Licht zu emitieren, ausgenutzt. Läßt man allerdings den Fluorophor im angeregten Zustand rotieren, so geht die Polarisation des emitierten Fluoreszenzlichts mehr oder weniger verloren. Bei sonst gleichen Bedingungen (z.B. Temperatur, Viskosität, Lösungsmittel) ist die Rotation eine Funktion der Molekülgröße, womit man über das abgelesene Signal Erkenntnisse über die Größe des am Fluorophor gebundenen Rests gewinnen kann (Methods in Enzymology 246 (1995), S. 283-300). Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer mit einem Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung an die PNP aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungs-Assays" erfolgen.
    • 3. Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) basiert auf der strahlungslosen Energieübertragung zwischen zwei räumlich benachbarten Fluoreszenzmolekülen unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung dabei ist die Überlappung des Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des Akzeptormoleküls. Die Fluoreszenzmarkierung der PNP sowie Bindung der Testverbindung, die Bindung läßt sich mittels FRET messen (Cytometry 34, 1998, S. 159-179). Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungs-Assays" erfolgen. Eine besonders geeignete Ausführungsform der FRET-Technologie ist HTRF ("Homogeneous Time Resolved Fluorescence"), wie sie von der Firma Packard BioScience erhältlich ist.
    • 4. SELDI (Surface-enhanced laser desorption/ionization) in Kombination mit MALDITOF (time-of-flight mass spectrometer) ermöglicht die schnelle Analyse von Molekülen auf einem Träger und kann zur Analyse von Protein-Ligand-Wechselwirkungen verwendet werden (Worral et al., (1998) Anal. Biochem. 70:750-756). In einer bevorzugten Ausführungsform wird PNP auf einem geeigneten Träger immobilisiert und mit der Testverbindung inkubiert. Nach einem oder mehreren geeigneten Waschschritten lassen sich die an PNP zusätzlich gebundenen Moleküle der Testverbindung mittels der oben erwähnten Methodik nachweisen und somit an PNP gebundene Testverbindungen selektionieren.
    • 5. Die Messung von Oberflächenplasmonresonanz basiert auf der Änderung des Brechungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer Testverbindung an ein auf der Oberfläche mobilisiertes Protein. Da die Änderung des Brechungsinde xes für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, läßt sich dieses Verfahren im Prinzip auf jedes Protein ansetzen (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). Die Messung kann beispielsweise mit dem von der Firma Biacore (Freiburg) erhältlichen auf Oberflächenplasmonresonanz beruhenden Analyseautomaten mit einem Durchsatz von derzeit bis zu 384 Proben pro Tag durchgeführt werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer Testverbindung an PNP aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungs-Assays" erfolgen.
  • Die über die oben erwähnten Verfahren 1 bis 5 identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein. Sämtliche über die oben erwähnten Verfahren identifizierten Substanzen können anschließend in einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens auf ihre herbizide Wirkung überprüft werden.
  • Weiterhin besteht die Möglichkeit, über die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der PNP mittels Röntgenstrukturanalyse weitere potentielle herbizide Wirkstoffe über "Molecular Modelling" nachzuweisen. Die Herstellung von für die Röntgenstrukturanalyse benötigten Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen dieser Messungen, der Nachweis einer Bindungsstelle im Protein sowie die Vorhersage potentieller Inhibitorstrukturen sind dem Fachmann bekannt. Über "Molecular Modelling" ist prinzipiell auch eine Optimierung der mit dem oben erwähnten Verfahren identifizierten Verbindung möglich.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die auf den Schritten i) und ii) beruht, besteht darin, daß eine Testverbindung ausgewählt wird, die die Aktivität der PNP reduziert oder blockiert. Vorzugsweise wird hierbei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten PNP mit der Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten PNP verglichen.
  • Eine stärker bevorzugte Ausführungsform des auf den Schritten i) und ii) beruhenden Verfahrens besteht darin, daß man
    • i. PNP in einem erfindungsgemäßen transgenen Organismus exprimiert oder einen Organismus anzieht, der PNP natürlicherweise enthält,
    • ii. PNP aus Schritt i) entweder im Zellverdau des transgenen oder nichttransgenen Organismus, in teilgereinigter oder in homogen gereinigter Form mit einer Testverbindung in Kontakt bringt; und
    • iii. eine Verbindung auswählt, die die Aktivität der nukleär codierten PNPase reduziert oder blockiert. Vorzugsweise wird hierbei die Aktivität von mit der Testverbindung inkubierter PNP mit der Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten PNP verglichen.
  • Die PNP enthaltende Lösung kann aus dem Lysat des ursprünglichen Organismus oder des transgenen, mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformierten Organismus bestehen. Falls notwendig kann die PNP teilweise oder vollständig über gängige Verfahren aufgereinigt werden. Eine allgemeine Übersicht über derzeitige Proteinreinigungstechniken ist beispielsweise bei Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6, beschrieben. Bei einer rekombinanten Präparation kann die Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Proteins über eine Affinitätschromatographie, wie sie dem Fachmann bekannt ist, erfolgen.
  • Die für in-vitro-Verfahren benötigte PNP läßt sich somit entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen transgenen Organismus oder aus einem PNP enthaltenden Organismus, beispielsweise aus einer unerwünschten Pflanze, isolieren, wobei unter dem Begriff "unerwünschte Pflanze" die eingangs erwähnten Spezies zu verstehen sind.
  • Zur Identifizierung herbizider Verbindungen wird nun die PNP mit einer Testverbindung inkubiert. Nach einer Reaktionszeit wird die enzymatische Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten PNP im Vergleich zu einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten PNP bestimmt. Bei einer Hemmung der PNP wird eine signifikante Abnahme der Aktivität im Vergleich zur Aktivität des nicht gehemmten erfindungsgemäßen Polypeptids beobachtet, was zu einer Abnahme von wenigstens 10%, vorteilhafterweise wenigstens 20%, vorzugsweise wenigstens 30%, besonders bevorzugt wenigstens 50%, bis zu einer 100%igen Reduktion (Blockierung) führt. Dabei ist eine Hemmung von wenigstens 50% bei Konzentrationen der Testverbindung von 10–4M, vorzugsweise bei 10–5M, besonders bevorzugt von 10–6M, bezogen auf die Enzymkonzentration im mikromolaren Bereich bevorzugt.
  • Die enzymatische Aktivität von PNP läßt sich beispielsweise mit einem Aktivitätstest, bei dem die Zunahme des Produkts, die Abnahme des Substrats (oder Ausgangsmaterials) oder die Abnahme bzw. Zunahme des Kofaktors bestimmt werden, ober über eine Kombination aus wenigstens zwei der oben genannten Parameter als zeitlicher Verlauf über einen definierten Zeitraum bestimmen.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die auf den Schritten i) und iii) beruht, besteht aus den folgenden Schritten:
    • i. Erzeugen eines eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassenden erfindungsgemäßen transgenen Organismus, wobei PNP rekombinant exprimiert wird;
    • ii. Applizieren einer Testverbindung an den transgenen Organismus aus i) und an einen nichttransgenen Organismus der gleichen Spezies;
    • iii. Bestimmen des Wachstums oder der Lebensfähigkeit des transgenen und des nichttransgenen Organismus nach Applikation der Testsubstanz und
    • iv. Auswählen von Testverbindungen, die zu einem reduzierten Wachstum oder einer begrenzten Lebensfähigkeit des nichtransgenen Organismus im Vergleich zum Wachstum des transgenen Organismus führen.
  • Dabei beträgt der Wachstumsunterschied in Schritt iv) für die Auswahl eines Inhibitors mit herbizider Wirkung wenigstens 10%, bevorzugt 20%, vorzugsweise 30%, besonders bevorzugt 40% und ganz besonders bevorzugt 50%.
  • Bei dem transgenen Organismus handelt es sich in diesem Zusammenhang vorzugsweise um eine Pflanze, eine Alge, ein Cyanobakterium, beispielsweise der Gattung Synechocystis oder ein Proteobakterium wie beispielsweise Magnetococcus sp. MC1, vorzugsweise Pflanzen, die mittels herkömmlicher Techniken transformiert werden können, wie etwa Arabidopsis thaliana Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgare, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylvestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Secale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgare), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays, oder Cyanobakterien, die sich leicht transformieren lassen, wie etwa Synechocystis, in die jeweils die für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierende Sequenz durch Transformation eingebracht wurde. Diese transgenen Organismen weisen somit eine erhöhte Toleranz gegenüber Verbindungen auf, die das erfindungsgemäße Polypeptid hemmen. "Knock-out"-Mutanten, bei denen das in diesem Organismus natürlich vorhande ne analoge Gen für Polynukleotid- phosphorylase gezielt ausgeschaltet wurde, können ebenso verwendet werden.
  • Die oben genannte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich jedoch auch zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer Wirkung verwenden. Dabei wird als transgener Organismus eine Pflanze eingesetzt. Das Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer Wirkung umfaßt somit die folgenden Schritte:
    • i. Erzeugen einer eine für PNP codierende erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz umfassenden transgenen Pflanze, wobei PNP rekombinant exprimiert wird;
    • ii. Applizieren einer Testsubstanz auf die transgene Pflanze aus i) und auf eine nichttransgene Pflanze der gleichen Sorte,
    • iii. Bestimmen des Wachstums oder der Lebensfähigkeit der transgenen Pflanze sowie der nichttransgenen Pflanze nach Applikation der Testverbindung und
    • iv. Auswählen von Testsubstanzen, die zu einem reduzierten Wachstum der nichttransgenen Pflanze im Vergleich zum Wachstum der transgenen Pflanze führen.
  • Hierbei werden in Schritt iv) Testverbindungen ausgewählt, die zu einem veränderten Wachstum des nichttransgenen Organismus im Vergleich zum Wachstum des transgenen Organismus führen. Unter verändertem Wachstum ist dabei eine Hemmung des vegetativen Wachstums der Pflanzen zu verstehen, was sich insbesondere in einer Reduzierung des Längenwachstums äußern kann. Die behandelten Pflanzen weisen demgemäß einen gedrungenen Wuchs auf; außerdem ist eine dunklere Blattfärbung zu beobachten. Darüber hinaus ist unter verändertem Wachstum auch eine zeitliche Veränderung des Reifeverlaufs, die Hemmung oder Förderung seitlicher Verzweigungen der Pflanzen, die Verkürzung bzw. Verlängerung der Entwicklungsstadien, eine erhöhte Standfestigkeit, das Wachstum größerer Mengen an Knospen, Blüten, Blättern, Früchten, Samenkörnern, Wurzeln und Knollen, ein erhöhter Zuckergehalt in Pflanzen wie etwas Zuckerrüben, Zuckerrohr und Zitrusfrüchten, ein erhöhter Proteingehalt in Pflanzen wie etwa Getreide oder Soja oder eine Stimulierung des Latexflusses in Gummibäumen zu verstehen. Der Nachweis eines derartigen veränderten Wachstums ist dem Fachmann geläufig.
  • Ebenso besteht beim erfindungsgemäßen Verfahren die Möglichkeit, mehrere Testverbindungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen. Wenn durch eine Gruppe von Testverbindungen eine Beeinflussung des Ziels erfolgt, ist es entweder möglich, die einzelnen Testverbindungen direkt zu isolieren oder die Gruppe von Testverbindungen in verschiedene Untergruppen zu teilen, beispielsweise wenn sie aus einer Vielzahl unterschiedlicher Komponenten besteht, um so die Zahl der unterschiedlichen Testverbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren wird dann mit der einzelnen Testverbindung oder der jeweiligen Untergruppe von Testverbindungen wiederholt. Je nach der Komplexität der Probe lassen sich die oben beschriebenen Schritte wiederholt durchführen, vorzugsweise bis die im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierte Untergruppe nur noch eine geringe Anzahl von Testverbindungen oder tatsächlich gerade nur eine Testverbindung umfaßt.
  • Alle oben beschriebenen Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren mit herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung werden im folgenden als "erfindungsgemäße Verfahren" bezeichnet.
  • Sämtliche über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen lassen sich anschließend auf ihre herbizide bzw. wachstumsregulatorische Wirkung in-vivo überprüfen. Eine Möglichkeit zur Prüfung der Verbindungen auf herbizide Wirkung ist die Verwendung der Wasserrinsel Lemna minor in Mikrotiterplatten. Als Parameter können dabei Veränderungen des Chlorophyllgehalts und die Geschwindigkeit der Photosynthese gemessen werden. Es ist auch möglich, die Verbindung direkt auf unerwünschte Pflanzen zu applizieren, wobei die herbizide Wirkung beispielsweise über ein eingeschränkes Wachstum identifiziert werden kann.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich vorteilhafterweise auch in Verfahren mit hohem Durchsatz, sogenannten HTS-Verfahren, durchführen, wodurch das gleichzeitige Überprüfen einer Vielzahl unterschiedlicher Verbindungen ermöglicht wird.
  • Bei der praktischen Durchführung eines HTS-Verfahrens bietet sich die Verwendung von Trägern an, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, einen oder mehrere die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz enthaltende Vektoren, einen oder mehrere transgene Organismen, die wenigstens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, oder eines oder mehrere (Poly)peptide, die über die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen codiert sind, enthalten.
  • Träger, die eine oder mehrere der NPNP-Sequenzen, einen oder mehrere der die NPNP-Sequenzen umfassenden Vektoren, einen oder mehrere, wenigstens eine NPNP-Sequenz enthaltende transgene Organismen oder ein oder mehrere (Poly)peptide, die von den NPNP-Sequenzen codiert sind, enthalten, sind Teil der folgenden Erfindung.
  • Der verwendete Träger kann in fester oder flüssiger Form vorliegen, wobei es sich jedoch vorzugsweise um einen festen Träger und besonders bevorzugt um eine Mikrotiterplatte handelt. Die oben genannten Träger bilden ebenso einen Teil des Gegenstand der folgenden Erfindung. Im Sinne der am weitesten verbreiteten Technik werden 96-Loch-, 384-Loch- und 1536-Loch-Mikrotiterplatten verwendet, die in der Regel Volumen von jeweils 200 μl umfassen können. Neben den Mikrotiterplatten sind die weiteren Bestandteile eines HTS-Systems, die zu den entsprechenden Mikrotiterplatten passen, wie beispielsweise eine große Anzahl an Instrumenten, Materialien, automatischen Pipertiervorrichtungen, Robotern, automatischen Plattenablesegeräten und Plattenwaschgeräten, kommerziell erhältlich.
  • Neben den auf Mikrotiterplatten beruhenden HTS-Systemen können auch sogenannte "Tests im freien Format" ("free-format assays") oder Testsysteme, bei denen zwischen den Proben keine physischen Barrieren vorliegen, verwendet werden, wie beispielsweise bei Jayaickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 19 (1994) 161418; Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries", First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995); Salmon et al., Molecular Diversity 2 (1996), 5763 und US 5,976,813 .
  • Die Erfindung betrifft weiterhin nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbindungen mit herbizider Wirkung. Diese Verbindungen werden im folgenden als "ausgewählte Verbindungen" bezeichnet. Sie weisen ein Molekulargewicht von weniger als 1000 g/mol, vorteilhafterweise weniger als 500 g/mol, vorzugsweise weniger als 400 g/mol, besonders bevorzugt weniger als 300 g/mol auf. Verbindungen mit herbizider Wirkung weisen einen Ki-Wert von weniger als 1 mM, vorzugsweise weniger als 1 μM, besonders bevorzugt weniger als 0,1μM, ganz besonders bevorzugt weniger als 0,01 μM, auf.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbindungen mit wachstumsregulatorischer Wirkung. Auch diese Verbindungen werden im folgenden als "ausgewählte Verbindungen" bezeichnet.
  • Die ausgewählten Verbindungen können natürlich auch in Form ihrer landschaftlich brauchbaren Salze vorliegen. Unter landschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen Kationen oder die Säureadditionssalze derjenigen Säuren in Betracht, deren Kationen bzw. Anionen die herbizide Wirkung der über die erfindungsgemäße Verfahren identifizierten Verbindungen herbizider Wirkung nicht negativ beeinflussen.
  • Falls die ausgewählten Verbindungen asymmetrisch substituierte α-Kohlenstoffatome enthalten, so können sie weiterhin auch in Form von Racematen, Enantiomerengemi schen, reinen Enantiomeren oder, sofern sie chirale Substituenten aufweisen, auch in Form von Diastereomerengemischen vorliegen.
  • Bei den ausgewählten Verbindungen kann es sich um chemisch synthetisierte oder mikrobiell produzierte Substanzen handeln, die beispielsweise in Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen angetroffen werden können. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Verfahren sind dem Fachmann bekannt und sind in allgemeiner Weise beispielsweise bei Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17, beschrieben. Die ausgewählten Verbindungen können auch aus umfangreichen Stoffbibliotheken stammen.
  • Potentielle Testverbindungen können Expressionsbibliotheken, wie beispielsweise cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Substanzen, Hormone, PNAs oder dergleichen sein (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Literaturstellen).
  • Die ausgewählten Verbindungen lassen sich zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzenwuchs und/oder als Wachstumsregulatoren verwenden. Dabei bekämpfen herbizide Zusammensetzungen, die die ausgewählten Verbindungen umfassen, sehr gut den Pflanzenwuchs auf Nichtkulturflächen. Bei Kulturen, wie beispielsweise Weizen, Reis, Mais, Soja und Baumwolle, wirken sie gegen Unkräuter und Schadgräser, ohne die Kulturpflanzen dabei nennenswert zu schädigen. Dieser Effekt wird insbesondere bei niedrigen Aufwandmengen beobachtet. Die ausgewählten Verbindungen lassen sich zur Bekämpfung der oben bereits erwähnten Schadpflanzen verwenden.
  • Je nach dem verwendeten Applikationsverfahren lassen sich ausgewählte Verbindungen bzw. diese umfassende herbizide Zusammensetzungen vorteilhafterweise auch bei einer weiteren Anzahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung unerwünschter Pflanzen einsetzen. Dabei kommen beispielsweise folgende Kulturen in Betracht:
    Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgare, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N.rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Pha seolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylvestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Secale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgare), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.
  • Darüber hinaus können die ausgewählten Verbindungen auch bei Kulturen verwendet werden, die durch Züchtung, einschließlich rekombinanter Verfahren, gegenüber der Wirkung von Herbiziden tolerant sind. Die Erzeugung solcher Kulturen ist weiter unten beschrieben.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der oben bereits erwähnten herbiziden oder wachstumsregulatorischen Zusammensetzung, das die Formulierung ausgewählter Verbindungen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln umfaßt.
  • Die ausgewählten Verbindungen können beispielsweise in Form von direkt versprühbaren wäßrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochkonzentrierten wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, emulgierbaren Konzentraten, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln und Granulaten formuliert und mittels Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen appliziert werden. Die Anwendungsformen richten sich dabei nach dem Verwendungszweck sowie der Beschaffenheit der ausgewählten Verbindungen und sollten in jedem Fall die feinstmögliche Verteilung der ausgewählten Verbindungen gewährleisten. Die herbiziden Zusammensetzungen umfassen eine herbizidwirksame Menge wenigstens einer ausgewählten Verbindung sowie für die Formulierung herbizider Zusammensetzungen übliche Hilfsstoffe.
  • Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wäßrigen bzw. ölhaltigen Formulierungen sowie dispergierbaren Konzentraten (dispersible concentrates, DC), können die ausgewählten Verbindungen in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst oder dispergiert werden, wobei weitere Formulierungshilfsstoffe zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus ausgewählter Verbindung, gegebenenfalls Lösungsmittel oder Öl sowie optional weiteren Hilfsmitteln bestehende flüssige oder feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind. Zu nennen sind hier: emulgierbare Konzentrate (emulsifiable concentrates, EC, EW), Suspensionen (SC), lösliche Konzentrate (SL), dispergierbare Konzentrate (DC), Pasten, Pastillen, benetzbare Pulver oder Granulate, wobei die festen Formulierungen entweder in Wasser löslich oder dispergierbar (benetzbar) sein können. Darüber hinaus können geeignete Pulver oder Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den Abrieb oder eine vorzeitige Hilfsstofffreisetzung verhindernden Überzug versehen werden.
  • Prinzipiell sind unter dem Begriff "Hilfsmittel" folgende Verbindungsklassen zu verstehen: Antischäumungsmittel, Verdicker, Netzmittel, Haftmittel, Dispergiermittel, Emulgiermittel, Bakterizide und/oder thixotrophe Agentien. Die Bedeutung der oben genannten Mittel ist dem Fachmann geläufig.
  • SLs, EWs und ECs lassen sich durch einfaches Mischen der betreffenden Inhaltsstoffe herstellen; Pulver lassen sich durch Mischen oder Vermahlen in speziellen Mühlentypen (z.B. Hammermühlen) herstellen. DCs, SCs und Ses werden üblicherweise über Naßvermahlung ("wet milling") hergestellt, wobei ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organischen Phase, die weitere Hilfsmittel oder ausgewählte Verbindungen umfassen kann, hergestellt werden kann. Die Herstellung ist bekannt. Pulver-, Streu- und Stäubemittel lassen sich vorteilhafterweise durch Mischen oder gemeinsames Vermahlen der wirksamen Substanzen mit einem festen Trägerstoff herstellen. Granulate, beispielsweise Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der ausgewählten Verbindungen an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Weitere Einzelheiten hinsichtlich ihrer Herstellung sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise in den folgenden Veröffentlichungen aufgeführt: US 3,060,084 , EP-A 707445 (für flüssige Konzentrate), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, 4. Dez. 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4. Aufl., McGraw-Hill, New York, 1963, S. 8-57 und ff., WO 91/13546, US 4,172,714 , US 4,144,050 , US 3,920,442 , US 5,180,587 , US 5,232,701 , US 5,208,030 , GB 2,095,558 , US 3,299,566 , Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley und Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, B. Aufl., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 und Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Bundesrepublik Deutschland), 2001.
  • Dem Fachmann sind eine Vielzahl inerter flüssiger und/oder fester Trägerstoffe geläufig, die sich für die erfindungsgemäßen Formulierungen eignen, wie beispielsweise flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie etwa Kerosin oder Dieselöl, weiterhin Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol und Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, beispielsweise Amine wie N-Methylpyrrolidon, oder Wasser.
  • Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden, wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Brolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammonium-nitrat, Harnstoffe so wie Produkte pflanzlichen Ursprungs, wie etwa Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nußschalenmehl, Zellulosepulver, oder andere feste Trägerstoffe.
  • Dem Fachmann sind eine Vielzahl oberflächenaktiver Stoffe (Tenside), die sich für die erfindungsgemäßen Formulierungen eignen, geläufig, wie beispielsweise Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalze aromatischer Sulfonsäuren, z.B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanole sowie von Fettalkoholglykolethern, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Napththalin und seinen Derivaten mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte von Naphthalin oder der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglycolether, Alkylaryl- polyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalkohol-Ethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Lauryl- alkoholpolyglycoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfit-Ablaugen oder Methylcellulose.
  • Die Applikation der herbiziden Zusammensetzungen bzw. der ausgewählten Verbindungen kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind die ausgewählten Verbindungen für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Applikationstechniken angewandt werden, bei denen die ausgewählten Verbindungen mit Hilfe der Spritzgeräte so gespritzt werden, daß die Blätter der empfindlichen Kulturpflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die ausgewählten Verbindungen auf die Blätter darunterwachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen ("post-directed", "lay-by").
  • Die Aufwandmengen an ausgewählten Verbindungen betragen je nach Bekämpfungszweck, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0,001 bis 3,0, vorzugsweise 0,01 bis 1,0 kg/ha.
  • Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele in größerer Ausführlichkeit veranschaulicht, wobei die Beispiele nicht als beschränkend aufgefaßt werden sollten.
  • Allgemeine DNA-Manipulations- und Klonierungsverfahren
  • Klonierungsverfahren, wie beispielsweise Restriktionsschnitte, Agarosegelelektrophoresen, Reinigung von DNA-Fragmenten, Übertragung von Nukleinsäuren auf Nitrocellulose- und Nylonmembranen, Verknüpfung von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli-Zellen, Bakterienanzucht sowie Sequenzanalysen rekombinanter DNA, wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
  • Molekularbiologische Standardverfahren für Pflanzen sowie Pflanzentransformationsverfahren sind bei Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998), Reither et al., Methods in Arabidopsis Research, World scientific press (1992) und Arabidopsis: A Laboratory Manual (2001), ISBN 0-87969-573-0 beschrieben.
  • Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli DHS, XL-1 blue) wurden von den Firmen Stratagene, BRL Gibco bzw. Invitrogen, Carlsberg, CA, bezogen. Bei den zur Klonierung verwendeten Vektoren handelt es sich um pUC 19 von Amersham Pharmacia (Freiburg) und den Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, 1990, 221-230).
  • Beispiel 1:
  • Erzeugung einer cDNA-Bibliothek im Pflanzentransformationsvektor
  • Zur Erzeugung einer cDNA-Bibliothek (im folgenden "binäre cDNA-Bibliothek" genannt) in einem Vektor, der direkt zur Transformation von Pflanzen eingesetzt werden kann, wurde mRNA aus verschiedenen Pflanzengeweben isoliert und mit dem cDNA-Synthesekit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) in doppelsträngie cDNA transkribiert. Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit T12-18-Oligonukleotiden nach Herstellerangaben durchgeführt. Nach Größenfraktionierung und Ligation von EcoRI-NotI-Adaptern nach Herstellerangaben sowie Auffüllen der Überhänge mit Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) wurde die cDNA-Population normalisiert. Dabei wurde nach dem Verfahren von Kohci et al, 1995, Plant Journal 8, 771-776 vorgegangen, wobei die cDNA mittels PCR mit dem Oligonukleotid N1 unter den in der Tabelle 1 aufgeführten Bedingungen amplifiziert wurde.
  • Tabelle 1
    Figure 00430001
  • Figure 00430002
  • Das erhaltene PCR-Produkt wurde an die Säulenmatrix des PCR-Reinigungskits (Qiagen, Hilden) gebunden und mit 300 mM NaP Puffer, pH 7,0, 0,5 mM EDTA, 0,04% SDS eluiert. Die DNA wurde 5 Minuten im kochenden Wasserbad denaturiert und anschließend 24 Stunden bei 60°C renaturiert. 50μl der DNA wurden auf eine Hydroxylapatitsäule aufgetragen, wonach letztere dreimal mit jeweils 1 ml 10 mM NaP-Puffer, pH 6,8 gewaschen wurde. Die gebundene Einzelstrang-DNA wurde mit 130 mM NaP-Puffer, pH 6,8, eluiert, mit Ethanol gefällt und in 40 μl Wasser gelöst. Hiervon wurden 20 μl für eine weitere PCR-Amplification wie oben beschrieben verwendet. Nach einer weiteren Anreicherung von ssDNA wurde eine dritte PCR-Amplifikation wie oben beschrieben durchgeführt.
  • Die Erzeugung des Pflanzentransformationsvektors zur Aufnahme der wie oben beschrieben erzeugten cDNA-Population erfolgte über Restriktionsenzymspaltung des Vektors pUC18 mit SbfI und BamHI, Aufreinigung des Vektorfragments mit anschließendem Auffüllen der Überhänge mit Pfu-DNA-Polymerase und Religation mit T4-DNA-Ligase (Stratagene). Das entstandene Konstrukt wird im folgenden als pUC18SbfI- bezeichnet.
  • Der Vektor pBinAR wurde zunächst mit NotI gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert, mit SbfI gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert und im Anschluß daran mit EcoRI und HindIII gespalten. Das erhaltene Fragment wurde in ein Derivat des binären Pflanzentransformationsvektors pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25:989-994) ligiert, der eine Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens sowie die Verwendung der Kanamycinresistenz zum Nachweis von transgenen Pflanzen ermöglicht. Das so erzeugte Konstrukt wird im folgenden als pSun12/35S bezeichnet.
  • pUC18SbfI- wurde als Matrize in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) mit den Oligonukleotiden V1 und V2 (siehe Tabelle 2) sowie Pfu-DNA-Polymerase eingesetzt. Das erhaltene Fragment wurde in das mit SmaI geschnittene pSun12/35S ligiert, wodurch pSunblues2 gebildet wurde. Nach der Spaltung mit NotI, Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase aus Shrimp (Roche Diagnostics, Mannheim) sowie Aufreinigung des Vektorfragments wurde pSunblues2 mit der normalisierten und ebenfalls mit NotI geschnittenen cDNA-Population ligiert. Nach der Transformation in E. coli XI-1 blue (Stratagene) wurden die erhaltenen Klone in Mikrotiterplatten abgelegt. Die binäre cDNA-Bibliothek enthält cDNAs in "sense"- und in "antisense"-Orientierung unter der Kontrolle des 35S-Promotors aus Blumenkohlmosaikvirus, und diese cDNAs können dementsprechend nach der Transformation in Tabakpflanzen zu "Kosuppressions"- und "Antisense"-effekten führen.
  • Tabelle 2: verwendete Oligonukleotide
    Figure 00450001
  • Beispiel 2:
  • Transformation und Analyse von Tabakpflanzen
  • Ausgewählte Klone der binären cDNA-Bibliothek wurden in Agrobacterium tumefaciens C58C1:pGV2260 und (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13(1984), 4777-4788) transformiert und unter Streptomycin/Spectinomycin-Selektion inkubiert.
  • Bei dem für die Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) mit dem binären Klon Nt005010068r eingesetzten Material handelte es sich um ein Übernachtkultur einer mit YEB-Medium auf OD600 = 0,8-1,6 verdünnten Kultur von positiv transformiertem Agrobacterium tumefaciens. Blattscheiben steriler Pflanzen (jeweils ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale 5-10 Minuten mit einer 1:50 verdünnten Agrobakterienlösung inkubiert. Danach folgte eine zweitägige Inkubation in Dunkelheit bei 25°C auf Murashige-Skoog-Medium (Physiol. Plant. 15(1962), 473), das mit 2% Saccharose (2MS Medium) und 0,8% Bacto-Agar supplementiert war. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und im wöchentliche Rhythmus auf mit 500mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50mg/l Kanamycin, 1mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2mg/l Naphthylessigsäure und 1,6g/l Glucose supplementiertem MS-Medium fortgesetzt. Regenerierte Schößlinge wurden auf ein mit Kanamycin and Claforan supplementiertes MS-Medium übertragen. Auf diese Weise wurden transgene Pflanzen der Linie E 0000013430 erzeugt.
  • Die Integration der Klon-cDNA in das Genom der transgenen Linien wurde über PCR mit den Oligonukleotiden G1 und G2 (siehe Tabelle 2) sowie aus den betreffenden transgenischen Linien präparierter genomischer DNA nachgewiesen. Hierzu wurde vorzugsweise TAKARA-Taq-DNA-Polymerase nach den Angaben des Herstellers (MoBiTec, Göttingen) eingesetzt. Als Positivkontrolle diente der zur Transformation verwendete cDNA-Klon der binären cDNA-Bibliothek als Matrize für eine PCR- Reaktion. PCR-Produkte identischer Größe oder gegebenenfalls identischer Spaltungsmuster, die nach Spaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, dienten als Beweis für die Integration der entsprechenden cDNA des Klons Nt005010068r. Auf diese Weise wurden die Insertionen der Klone in der jeweiligen transgenen Pflanzenlinie E 0000013430 mit den unten aufgeführten Phänotypen nachgewiesen.
  • Nach Überführung der Schößlinge in Erde wurden die Pflanzen 1-20 Wochen im Gewächshaus auf die Ausprägung von Phänotypen hin beobachtet. Dabei stellte sich heraus, daß transgene Pflanzen der Linie E 0000013430 ähnliche Phänotypen aufwiesen. Die Pflanzen zeigten im Bezug auf Wildtyppflanzen starke Chlorose und eine gleichzeitige drastische Wachstumsretardierung.
  • Beispiel 3:
  • Sequenzanalyse der Klone
  • Die cDNA-Insertion des Klons Nt005010068r, deren Transformation in Tabakpflanzen zu den oben erwähnten Phänotypen führte, wurde vollständig sequenziert.
  • Die cDNA-Insertion des Klons Nt005010068r weist ein offenes Leseraster von 453 nt (SEQ ID No. 1, Pos. 1-453) auf, das für 151 Aminosäuren codiert (SEQ ID No. 2).
  • Mit Hilfe dieser Sequenzangaben wurden homologe Sequenzen aus Spinacea oleracea, Pisum sativum und Arabidopsis thaliana mit einem hohen Grad an Homologie (Tabelle 3) identifiziert. Dieser hohe Grad an Homologie zeigt, daß die codierten Proteine die gleiche Funktion erfüllen.
  • Tabelle 3
    Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Somit wurde zum ersten mal und auf überraschende Weise gezeigt, daß die natürliche Expression nukleär codierte Polynukleotidphosphorylase codierender Gene für Pflanzen essentiell ist und daß eine reduzierte Expression zu Schäden führen, wie sie an Hand der in Beispiel 2 genannten Phänotypen aufgezeigt wurden. Dies zeigt die Eignung nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase als Ziel für Herbizide.
  • Beispiel 4:
  • Expression in E.coli
  • Um die PNPase-Aktivität des von der SEQ ID No. 7 codierten Enzyms zu demonstrieren und eine PNPase-Aktivität in für Verfahren mit hohem Durchsatz (HTS) geeigneten Mengen zu erzeugen, wurden Fragmente der PNPase-cDNA von SEQ ID No. 7 mittels PCR amplifiziert und in die Expressionsvektoren subkloniert. Dabei wurden cDNA und cDNA-Bibliotheken aus Arabidopsis thaliana als Matrizen für die PCR verwendet, bei der Pfu und Pfu-ultra-Polymerase (Stratagene, Heidelberg) zum Einsatz kamen.
  • Hierzu wurden die in Tabelle 4 aufgeführten Oligonukleotide zur Amplifikation von cDNA-Fragmenten über die Polymerasekettenreaktion verwendet. Die PCR wurde nach Standardbedingungen (wie bei Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press beschrieben) in 33 Zyklen durchgeführt, wobei die Annealing-Temperaturen zwischen 50 und 57°C lagen und die Polymerisationszeit jeweils 60 Sekunden pro 1000Bp betrug.
  • Die produzierten Fragmente wurden in die Vektoren pMALc2x (New England Biolabs) und pET15b (Novagen) kloniert und zur Bestätigung der Sequenzidentität sequenziert. Die Expressionplasmide wurden in die E. coli-Stämme JM109 bzw. BL-21(DE3) (Novagen) transformiert. Die transformierten Stämme wurden über Nacht in LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C kultiviert. Größer volumige Tageskulturen wurden angeimpft und bis zu einer optischen Dichte von 0,4–0,7 bei 600 nm kultiviert. Die Kulturen wurden dann mit 0,5 bis 2 mM IPTG induziert und 2,5–5 hours kultiviert. Dabei wurde den Standardvorschriften (Invitrogen) gefolgt.
  • Zur Erhöhung des Expressionsniveaus ist die N-Terminalefusion mit einem Hexahistidin-Tag (His-Tag) oder einem Maltosebindungsprotein (MBP) vorteilhaft. Mittels des fusionierten His-Tags bzw. MBP-Tags ist eine Reinigung mit Ni-NTA (Nitrilotriessigsäure), wie bei His-Trap-Säulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) oder Amylose-Matrices (New England Biolabs), möglich.
  • Tabelle 4
    Figure 00480001
  • Beispiel 5:
  • Expression in Hefe
  • Die für eine PNPase gemäß SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7 codierende cDNA wird in Vektoren wie pYES/NT, der eine His-Tag-Expression in Hefen wie INVSc1 gestattet, kloniert. Die Hefetransformation wird nach Standardvorschriften (Invitrogen) oder nach Hinnen, Hicks und Fink, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 75, 1929-1933 durchgeführt. Dabei wird eine über Nacht bei 30°C angewachsene Kultur mit 2% Galactose induziert und bei 30°C weiter inkubiert. Das PNPase-Protein wird nach 2, 4, 8, 16 bzw. 24h Induktion extrahiert. Die Polynukleotidphosphorylase wird mittels des fusionierten His-Tag mit Ni-NTA-Matrices wie His-Trap-Säulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgereinigt.
  • Beispiel 6:
  • In-vitro Aktivitätstest
  • PNP katalysiert die reversible Polymerisierung von Nukleotiddiphosphaten zu Polyribonukleotiden und anorganischem Phosphat. Isolierte PNP-Aktivität wird mittels freigesetztem Phosphat in einem kolorimetrischen Test gemessen. Der HTS-Test beruht auf der Messung der Endpunktkonzentration von freigesetztem Phosphat in der PNPase-Reaktion nach Ausbildung des Malachitgreen – Molybdophosphat-Komplexes in saurer Lösung (Lanzetta et al., 1979, Analytical Biochemistry 100, pp 95-97; Cogan et al., 1999, Analytical Biochemistry 271, S. 29-35). Der Testansatz enthält 1 bis 10 μg gerei nigtes PNPase-Protein, 1 bis 5 μg Poly(C) (10mer) in 1 mM MgSO4, 100 mM NH4Cl, 10 mM KCl, 10 mM Mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,2 und 0,02 bis 0,05 mM UDP. Man startet die Reaktion durch Zugabe beider Lanzetta-Starter-Lösungen und stimuliert mit 30 mM Spermin. Die Ausbildung des Molybdophosphat-Komplexes ist wichtig, da freies Phosphat in Lösung die PNPase-Aktivität hemmen kann (Brishammar und Juntti, 1974, Archives of Biochemistry and Physics 164, S. 224-232 und Khan und Fraenkel-Conrat, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, S. 1311-1315). Der Malachitgreen-Molybdophosphat-Komplex wird mit dem BMG-Reader bei 640 nm analysiert.
  • In einer weiteren Ausführungsform eines Tests wird über die Rückwärtsreaktion die 3'-5'-Exoribonukleaseaktivität gemessen, wobei freie Nukleotiddiphosphate erzeugt werden. Diese Nukleotiddiphosphate werden dann über eine Reaktion, bei der Pyruvatkinase und Lactatdehydrogenase zum Einsatz kommen, so daß die Oxidation von NADH photometrisch verfolgt werden kann, gemessen. Das Reaktionsvolumen von 200μl enthält 20 mM Hepes, pH 7,9, 12 mM MgCl2 mM, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1,5 mM DTT, 1 fmol polyadenylierte RNA (ca. 500 Basen) und 15% Glycerin. Der Test wird bei 25°C über einen Zeitraum von bis zu 120 Min. durchgeführt. Die Freisetzung von ADP wird durch Zugabe von 1,5 U Pyruvatkinase (426 U/mg Protein; Sigma) und 1,2 U Lactatdehydrogenase (500 U/mg Protein; Sigma), 6 mM Phosphoenolpyruvat sowie 0,6 mM NADH verfolgt. Die Oxidation von NADH wird photometrisch bei 340 nm bestimmt.
  • In einer weiteren Ausführungsform eines Tests wird 3H-markiertes UDP in einen Einzelstrang-Poly-C-Primer eingebaut, wie bei Brishammar et al. (Brishammar und Juntti, 1974, Archives of Biochemistry and Physics 164, S. 224-232) beschrieben. Dabei enthält das Reaktionsvolumen von 200 μl 5 μg Primer, 1 bis 5 μg PNPase, 0,5 μCi 3H-UDP, 0,02 mM UDP, 1 mM MgSO4, 100 mM NH4Cl, 10 mM KCl, 10 mM Mercaptoethanol in 50 mM Tris-HCl, pH 8,2. Der Einbau wird mit einem Szintillationszähler bestimmt.
  • Die Tests eignen sich für das Screening mit hohem Durchsatz (HTS) in 96-Loch- und 384-Loch-Format. SEQUENCE LISTING
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  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polynukleotidphosphorylase (PNPase), deren Abwesenheit zu reduziertem Wachstum sowie chlorotischen Blättern führt, als Ziel für Herbizide. Zu diesem Zweck werden Nukleinsäuresequenzen, umfassend die SEQ. ID No. 1, sowie funktionelle Äquivalente der SEQ. ID No. 1 bereitgestellt. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polynukleotidphosphorylase in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizid- oder wachstumsregulierender Aktivität sowie die Verwendung der mit diesem Verfahren identifizierten Verbindungen als Herbizide oder Wachstumsregulatoren.

Claims (26)

  1. Verwendung nukleär codierter Polynukleotidphosphorylase (PNPase) in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die PNPase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polynukleotidphosphorylase codiert von einer Nukleinsäuresequenz, die die SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7 umfaßt,
  3. Eine pflanzliche Nukleinsäuresequenz, die für eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 1 von wenigstens 50% aufweist; oder iv. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 2 aufweist, codiert;
  4. Eine pflanzliche Nukleinsäuresequenz, die für eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 4 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 3 von wenigstens 50% aufweist; oder iv. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 4 aufweist, codiert;
  5. Eine pflanzliche Nukleinsäuresequenz, die für eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 6 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 5 von wenigstens 50% aufweist; oder iv. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 6 aufweist, codiert;
  6. Eine pflanzliche Nukleinsäuresequenz, die für eine Polynukleotidphosphorylase, umfassend i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 8 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 7 von wenigstens 50% aufweist; oder iv. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 8 aufweist, codiert.
  7. Ein Polypeptid mit der Aktivität einer nukleär codierten Polynukleotidphosphorylase, codiert von einem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 bis 6.
  8. Eine Expressionskassette umfassend a. genetische Kontrollsequenzen in operativer Verknüpfung mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe nach Anspruch 3,4,5 oder 6; oder b. zusätzliche funktionelle Elemente, oder c. eine Kombination von a) und b).
  9. Ein Vektor umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 8
  10. Ein transgener Organismus, umfassend wenigstens eine Nukleinsäuresequenz, nach Anspruch 3,4,5 oder 6 die für ein Polypeptid codiert mit der Aktivität einer Polynukleotidphosphorylase, einer Expressionskassette nach Anspruch 8 oder einem Vektor nach Anspruch 9, ausgewählt aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen Zellen oder pflanzlichen Zellen.
  11. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Aktivität, das die folgenden Schritte umfaßt: i. Inkontaktbringen einer nukleär codierten Polynukleotidphosphorylase mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die der Testverbindung bzw. den Testverbindungen gestatten, an das für PNPase codierende Nukleinsäuremolekül oder an die nukleär codierte PNPase zu binden, und ii. Nachweisen, ob die Testverbindung an die PNPase aus i) bindet, oder iii. Nachweisen, ob die Testverbindung die enzymatische oder biologische Aktivität der Polynukleotidphosphorylase aus i) reduziert oder blockiert, oder iv. Nachweisen, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression der Polynukleotidphosphorylase aus i) reduziert oder blockiert.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die PNPase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Polynukleotidphosphorylase codiert von einer Nukleinsäuresequenz, die die SEQ ID No. 1, 3, 5 oder 7 umfaßt,
  13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei a. die Polynukleotidphosphorylase von einer Nukleinsäuresequenz a, umfassend i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 2 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 1 von wenigstens 50% aufweist; oder iv. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 2 aufweist, codiert wird; b. eine pflanzliche Säuresequenz, die für eine Polynukleotidphosphorylase codiert, umfassend: i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 4 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 3 von wenigstens 50% aufweist; oder iv. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 4 aufweist; c. eine pflanzliche Säuresequenz, die für eine Polynukleotidphosphorylase codiert, umfassend: i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degenerieration des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 6 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 5 von wenigstens 50% aufweist; oder iv. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 5 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 6 aufweist; d. eine pflanzliche Säuresequenz, die für eine Polynukleotidphosphorylase codiert, umfassend: i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der in SEQ ID No. 8 gezeigten Aminosäuresequenz durch Rückübersetzung abgeleitet werden kann, oder iii. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das eine Identität mit SEQ ID No. 7 von wenigstens 50% aufweist; oder iv. ein funktionelles Äquivalent der in SEQ ID No. 7 gezeigten Nukleinsäuresequenz, das von einer Aminosäuresequenz codiert wird, die eine Identität von wenigstens 50% mit der SEQ ID No. 8 aufweist.
  14. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, wobei eine Testverbindung ausgewählt wird, die die enzymatische oder biologische Aktivität von Polynukleotidphosphorylase reduziert oder blockiert.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12, 13 oder 14, wobei i. entweder Polynukleotidphosphorylase in einem transgenen Organismus exprimiert oder ein Organismus, der Polynukleotidphosphorylase natürlicherweise enthält, hochgezüchtet wird, ii. die PNPase aus Schritt i) mit einer Testverbindung im Zellverdau des transgenen oder nichttransgenen Organismus in teilgereinigter Form oder in homogen gereinigter Form in Kontakt gebracht wird, iii. eine Testverbindung, die die enzymatische Aktivität der PNPase aus Schritt i) reduziert oder blockiert, ausgewählt wird.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12, 13, 14 oder 15, das die folgenden Schritte umfaßt: i. Erzeugen eines transgenen Organismus umfassend eine für Polynukleotidphosphorylase codierende Nukleinsäuresequenz, wobei PNPase rekombinant exprimiert wird; ii. Applizieren einer Testsubstanz auf den transgenen Organismus aus i) und auf einen nichttransgenen Organismus desselben Genotyps, iii. Bestimmen des Wachstums oder der Lebensfähigkeit der transgenen Pflanze und der nichttransgenen Pflanze nach Applikation der Testverbindung, und iv. Auswählen von Testsubstanzen, die im Vergleich mit dem Wachstum der transgenen Pflanze zu einem reduzierten Wachstum der nichttransgenen Pflanze führen.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, das in einem pflanzlichen Organismus, einem Cyanobakterium oder Proteobakterium durchgeführt wird.
  18. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulierender Aktivität, das die folgenden Schritte umfaßt: i. Erzeugen einer transgenen Pflanze umfassend eine Nukleinsäuresequenz Polynukleotidphosphorylase, wobei Polynukleotidphosphorylase rekombinant exprimiert wird; ii. Applizieren einer Testsubstanz auf die transgene Pflanze aus i) und auf eine nichttransgene Pflanze derselben Sorte, iii. Bestimmen des Wachstums oder der Lebensfähigkeit der transgenen Pflanze und der nichttransgenen Pflanze nach Applikation der Testverbindung, und iv. Auswählen von Testsubstanzen, die im Vergleich mit dem Wachstum der transgenen Pflanze zu einem reduzierten Wachstum der nichttransgenen Pflanze führen.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, wobei die Substanzen in einem Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz identifiziert werden
  20. Ein Träger umfassend eine oder mehrere Nukleinsäuremoleküle nach Anspruch 3,4,5 oder 6, eine oder mehrere Expressionskassetten nach Anspruch 8, einen oder mehrere Vektoren nach Anspruch 9, einen oder mehrere Organismen nach Anspruch 10 oder einen oder mehrere (Poly)peptide nach Anspruch 7.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei die Substanzen in einem Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz identifiziert werden unter Verwendung eines Trägers nach Anspruch 20.
  22. Verbindung mit herbizider Aktivität, identifiziert durch eines der Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, 19 und 21.
  23. Verbindung mit wachstumsregulierender Aktivität, identifiziert durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 21.
  24. Verfahren zur Herstellung einer agrochemischen Zusammensetzung umfassend: a. die Identifizierung einer Verbindung mit herbizider Aktivität durch eines der Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, 19 und 21 oder eine Verbindung mit wachstumsregulierender Aktivität nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 21, und b. Formulierung dieser Verbindung zusammen mit anderen Zusätzen, um Produkte zum Schutz von Ernte mit herbizider oder wachstumsregulierender Aktivität zu liefern.
  25. Verfahren zur Kontrollierung von unerwünschter Vegetation und/oder zur Regulierung des Wachstums von Pflanzen, umfassend die Zulassung von wenigstens einem PNPase-Hemmer nach Anspruch 22 oder 23 oder eine agrochemische Zusammensetzung, die einen PNPase-Hemmer umfasst nach Anspruch 22 oder 23, um auf Pflanzen, ihre Umgebung und/oder Samen zu wirken.
  26. Verwendung eines Polynukleotidphosphorylase-Hemmers nach Anspruch 22 oder 23 oder eine agrochemische Zusammensetzung, die einen PNPase-Hemmer umfasst nach Anspruch 22 oder 23 in einem Verfahren nach Anspruch 25.
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