DE10238434A1

DE10238434A1 - Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung

Info

Publication number: DE10238434A1
Application number: DE10238434A
Authority: DE
Inventors: Gunnar Dr. Plesch; Astrid Blau; Klaus Dr.rer.nat. Däschner
Original assignee: Metanomics GmbH
Current assignee: BASF Metabolome Solutions GmbH
Priority date: 2002-08-16
Filing date: 2002-08-16
Publication date: 2004-04-15
Also published as: AR040993A1; WO2004022780A2; US20060277619A1; WO2004022780A3; EP1530640A2; AU2003255324A1; CA2495555A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung. Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren, enthaltend die Nukleinsäurekonstrukte, transgene Organismen und deren Verwendung. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Substanzen, die mit dem vorgenannten Verfahren identifiziert wurden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung. Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren enthaltend die Nukleinsäurekonstrukte, transgene Organismen und deren Verwendung. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Substanzen, die mit dem vorgenannten Verfahren identifiziert wurden.
Eine moderne Landwirtschaft ist ohne den Einsatz von Herbiziden nicht denkbar. Gegenwärtig wird der Wert der auf der gesamten Welt eingesetzten Herbizide auf ca. 30 Mrd. DM geschätzt. Obwohl bereits eine ganze Reihe von hoch wirksamen und ökologisch unbedenklichen Herbiziden auf dem Markt sind, ergibt sich die Notwendigkeit für neue Herbizide zum einen aus der Tatsache, dass immer wieder Unkräuter eine Resistenz gegen bereits eingesetzte Herbizide entwickeln und diese somit zum Teil nicht mehr eingesetzt werden können, zum anderen aus der Tatsache, dass ein Teil der Herbizide ökologische Nachteile aufweist. Zum heutigen Zeitpunkt werden in vielen Fällen noch Herbizide als Mischungen eingesetzt werden, die mehrere aktive Wirkstoffkomponenten enthalten, was ökologisch wenig vorteilhaft ist und zudem besondere Anforderungen an die Formulierung stellt.
Neue Herbizide sollten sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Unbedenklichkeit sowie geringe Aufwandmengen auszeichnen.
Das bisherige Vorgehen bei der Identifizierung und Entwicklung neuer Herbizide ist durch die Applikation von potentiellen Wirkstoffen direkt auf geeignete Testpflanzen gekennzeichnet. Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, dass für die Tests relativ große Substanzmengen erforderlich sind. Dies ist im Zeitalter der kombinatorischen Chemie mit seiner in einer äußerst großen Vielfalt, aber nur in geringen Mengen herstellbaren Substanzen jedoch selten gegeben und stellt von daher eine wichtige Limitierung bei der Entwicklung neuer Herbizide dar. Zum anderen werden bei der direkten Applikation auf die zu testenden Pflanzen bereits im ersten Screeningschritt äußerst hohe Anforderungen an die Substanz gestellt, da nicht nur die Inhibierung oder sonstige Modulation der Aktivität eines zellulären Zieles (in der Regel ein Protein oder Enzym) erforderlich sind, sondern die Substanz dieses Ziel zunächst überhaupt erreichen muss, was bereits in diesem ersten Schritt Anforderungen an die Testsubstanz in Bezug auf Aufnahme durch die Pflanze, Permeabilität durch die verschiedenen Zellwände und Membranen, Persistenz zur Erreichung des gewünschten Effektes, und schließlich Inhibierung/Veränderung der Aktivität des gewünschten Zielenzyms erfordert.
Es ist angesichts dieser Erfordernisse daher nicht überraschend, dass zum einen die Identifizierung neuer Wirkstoffe immer höhere Kosten verursacht, zum anderen immer weniger Wirkstoffe entdeckt werden.
Es war deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Targets für die Identifizierung neuer Herbizide, sowie neue Herbizide und deren Verwendung zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die Expression oder die Aktivität des Genprodukts einer Nukleinsäure oder eines Gens umfassend: aa) Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz; bb) Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt; cc) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60 % Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist; dd) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Amino säuresequenzen codiert, die mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen; ee) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz codiert wird; ff) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert und das eine "Translation Releasing Factor"-Aktivität, eine Kobalamin-Synthese-Aktivität, Arginyl-tRNA-Synthase-Aktivität, eine RNA-Helicase-Aktivität, eine GTP-Bindeprotein-Aktivität, eine Pseudouridylat-Synthase-Aktivität oder eine Adenylatkinase-Aktivität hat; und/oder gg) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20 % Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder
b) die Expression oder Aktivität einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz nach aa) bis gg) codiert wird,

Unter "Expression" wird die Neusynthese in vitro und in vivo von Nukleinsäuren und durch Nukleinsäuren codierten Proteinen verstanden, insbesondere die der obengenannten Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen. Der Begriff "Expression" umfasst alle bis zum reifen Protein oder dessen Abbau führenden Biosyntheseschritte, z.B. Transkription, Translation, Modifizierung oder Prozessierung von Nukleinsäuren und/oder Proteinen, z.B. prae- oder posttranskriptionelle Prozessierungsschritte oder posttranslationale Modifikationen, z.B. Splicing, Editing, Polyadenylierung, Capping, Modifikationen von Aminosäuren, z.B. Glykosilierung, Methylierung, Acetylierung, Bindung von Coenzymen, Phosphorylierung, Ubiquitation, Bindung von Fettsäuren, Signalpeptidprozessierung, etc.
Wobei im Sinne der Erfindung unter "Transkription" die RNA-Synthese mithilfe einer RNA-Polymerase in 5'→ 3'-Richtung anhand einer DNA-Matrize zu verstehen ist. Unter "Translation" ist die Biosynthese von Proteinen in vitro und in vivo zu verstehen. Unter Genprodukt ist jedes Molekül und jede Substanz zu verstehen, die aufgrund der Expression, z.B. der Transkription oder Translation einer Nukleinsäure, z.B. einer DNA oder RNA, z.B. eines Gens, entsteht, wobei der Begriff auch die folgenden Prozessierungsprodukte, wie z.B. nach Splicing oder Modifizierung, umfasst. So wird unter Genprodukt z.B. eine prozessierte RNA, z.B. eine katalytische RNA wie ein Ribozym, eine funktionelle RNA, wie tRNAs oder rRNAs, oder eine codierende RNA, wie mRNA, verstanden. Als Folge der Translation einer mRNA wird ein Protein synthetisiert, das ebenfalls als "Genprodukt" verstanden wird. Proteine können während und nach der Translation verschiedenen Prozessierungsschritten unterworfen sein, wie oben beispielhaft aufgezählt. Unter "Aktivität des Genprodukts" ist die biologische Aktivität bzw. Funktion einer RNA oder eines Proteins, wie beispielsweise die enzymatische Aktivität, die Transporteraktivität, die regulatorische Aktivität, die Rezeptorbindungseigenschaft, die Fähigkeit, bestimmte Proteine, Nukleinsäuren oder Metaboliten zu binden, z.B. in Proteinkomplexen, das heißt z.B. die regulative Eigenschaft oder die Transporterfunktion des Proteins oder der RNA, um nur einige zu nennen, zu verstehen, wie sie im Organismus natürlicherweise vorkommt. Unter "Reduktion der Aktivität des Genprodukts" ist eine Verringerung der biologischen Aktivität im Vergleich zur natürlichen Aktivität des Genprodukts von mindestens 10 %, vorteilhaft mindestens 20 % oder 30 %, bevorzugt mindestens 40 %, 50 % oder 60 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 %, 80 % oder 90 % und ganz besonders bevorzugt um mindestens 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu verstehen. Blockierung der Aktivität des Genprodukts bedeutet die gänzliche, das heißt 100 %ige Inhibierung der Aktivität oder die teilweise Blockierung der Aktivität, bevorzugt eine mindestens 80 %ige oder 90%ige, besonders bevorzugt mindestens 91%ige, 92%ige, 93%ige, 94%ige oder 95%ige, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %ige, 96%ige, 97%ige, 98%ige oder 99%ige Blockierung der biologischen Aktivität.
Eine Reduktion der Aktivität des Genprodukts kann auch indirekt erfolgen, z.B. in dem die Bildung oder Aktivität von Interaktionspartnern gehemmt wird, z.B. in dem die Stoffwechselkette, in die das Genprodukt eingebunden ist, beeinflusst wird. Z.B. kann eine Hemmung nicht nur des fraglichen Enzyms, sondern auch eines in derselben Stoffwechselkette stehenden Enzyms oder Proteins erfolgen, die zu einer Blockierung des folgenden, vorhergehenden oder eines anderen involvierten Enzyms führt und somit des hierin beschriebenen Genproduktes, z.B. durch Substrat- oder Produkthemmung. Solche Reduktionen durch indirekte Beeinflussung der Aktivität eines Enzyms ist z.B. für die Wechselwirkung der Glykolyseproteine und -metaboliten ausführlich beschrieben worden und leicht übertragbar auf andere Stoffwechselwege, in denen die hierin beschriebenen Genprodukte eine Rolle spielen. Genauso kann ein erfindungsgemäß verwendetes Genprodukt in seiner Aktivität reduziert oder gehemmt werden, in dem die Aktivität von Interaktionspartnern, z.B. anderen Proteinen in einem Proteinkomplex oder in einer Substrattransportkette mit dem hierin beschriebenen Genprodukt reduziert oder gehemmt wird. Das kann dazu führen, dass der gesamte Komplex oder der Substrattransport nicht mehr aktiviert oder nicht oder nur teilweise entsteht bzw. funktioniert oder nicht mehr regulierbar ist. Beispiele für solche Beeinflussung der Aktivität sind z.B. für Spleißosomen, Polymerasen, Ribosomen etc. beschrieben.
Unter "Fragment" wird eine Teilsequenz einer hierin beschriebenen Sequenz verstanden, die weniger Nukleotide oder Aminosäuren umfasst, als die hierin beschriebenen Sequenzen. Ein Fragment kann z.B. 1 %, 5 %, 10 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % der ursprünglichen Sequenz umfassen. Vorzugsweise umfasst ein Fragment 100, mehr bevorzugt 50, noch mehr bevorzugt weniger as 20 Aminosäuren der entsprechenden Nukleinsäuren.
Die Bedeutung der einzelnen Biosyntheseschritten ist dem Fachmann bekannt und kann z.B. in "Molecular Biology of the cell", Alberts, New York, 1998, "Biochemie" Stryer, 1988, New York, "Biochemieatlas", Michal, Heidelberg, 1999 oder in "Dictionary of Biotechnology", Coombs, 1992, nachgelesen werden.
Eine Ausführungsform betrifft somit ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Expression oder die Aktivität der genannten Nukleinsäuren oder Aminosäuren dadurch reduziert oder blockiert wird, dass die Transkription, Translation, Prozessierung und/oder Modifikation mindestens einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz reduziert oder blockiert wird. Erfindungsgemäß können ein, zwei, drei oder mehr Sequenzen in ihrer Aktivität reduziert oder blockiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen oder vorteilhaft in einem High-Throughput-Screening (HTS) durchgeführt werden und zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden. Im vorgenannten Verfahren können vorteilhaft auch Substanzen identifiziert werden, die mit den oben genannten Nukleinsäuren bzw. mit deren Genprodukten interagieren, diese Substanzen sind potentielle Herbizide, die über die klassische chemische Synthese in ihrer Wirkung weiter verbessert werden können.
Nach dem Verfahren identifizierte bzw. ausgewählte Substanzen können vorteilhaft auf eine Pflanze verbracht werden, um die herbizide Aktivität der Substanzen zu testen. Es werden solche Substanzen auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens können die Substanzen auch neben dem vorgenannten in vivo-Testverfahren auch in einem in vitro Test identifiziert werden. Ein derartiger in vitro Test mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. deren Genprodukten hat den Vorteil, dass die Substanzen rasch und einfach auf ihre biologische Wirkung hin gescreent werden können. Derartige Test eignen sich auch vorteilhaft für das sog. HTS.
Das Verfahren kann mit freien Nukleinsäuren wie DNA oder RNA, freien Genprodukten oder vorteilhaft in einem Organismus durchgeführt werden, wobei als Organismus eukaryontische oder prokaryontische Organismen wie vorteilhaft gram-negative oder gram-positive Bakterien, Hefen, Pilze oder vorteilhaft Pflanzen wie monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden. Als Organismen werden vorteilhaft konditionale oder natürliche Mutanten verwendet, die die Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 betreffen. Unter konditionalen Mutanten sind Mutanten zu verstehen, die erst nach Induktion eine Reduktion der Expression, z.B. der Transkription oder der Translation der vorher genannten Nukleinsäuren oder der durch sie codierten Genprodukte, aufweisen. Ein Beispiel derartiger konditionaler Mutanten sind Mutanten, in denen die Nukleinsäuren hinter einem temperatursensitiven Promotor liegen, der bei höheren Temperaturen nicht mehr funktionell ist, das heißt der die Transkription bei höheren Temperaturen beispielsweise oberhalb 37°C verhindert. Ebenfalls möglich ist beispielsweise eine Expressionsregulation durch ein Effektor-Molekül, z.B. bei Kontrolle der Expression durch einen regulierbaren Promotor, wie z.B. der im Tet-Systeme (Gatz et al., Plant J. 2, 1992:397-404, Tetracyclin-induzierbar) verwendete oder die in EP-A-0 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), EP-A-0 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten von Proteinen, die durch eine Nukleinsäuresequenz wie sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz,
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt,
c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60 % Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist;
d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz codiert wird;
f) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert wird und das eine "Translation Releasing Factor"-Aktivität, eine Kobalamin-Synthese-Aktivität, Arginyl-tRNA-Synthase-Aktivität, eine RNA-Helicase-Aktivität, eine GTP-Bindeprotein-Aktivität, eine Pseudou ridylat-Synthase-Aktivität oder eine Adenylatkinase-Aktivität hat; und/oder
g) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20 % Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder

i) Inkontaktbringen von Zellen, die das Protein exprimieren, oder des Proteins mit einem Kandidatenstoff;
ii) Testen der biologischen Aktivität des Protein;
iii) Vergleichen der biologischen Aktivität des Proteins mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei eine Verringerung der biologischen Aktivität des Proteins anzeigt, dass der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.

Unter ii) wird das Testen einer der oben beschriebenen biologischen Aktivitäten beschrieben, z.B. eine Enzymaktivität, wie sie in den Beispielen angegeben ist oder eine Bindung, vorzugsweise eine starke Bindung zwischen Protein- und Kandidatenstoff.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens wird/werden der/die unter Buchstabe iii) identifizierte(n) Antagonist en) auf eine Pflanze verbracht, um seine/ ihre herbizide Aktivität zu testen und der/die Antagonist en) ausgewählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen in vivo oder in vitro und/oder vorteilhaft gemeinsam oder besonders vorteilhaft in einem High-Throughput-Screening durchgeführt werden und zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten bzw. selektierten Nukleinsäuresequenzen sind für das Wachstum und die Entwicklung von höheren Pflanzen essentiell. Die Unterdrückung der Bildung der Genprodukte, d.h. der Expression, z.B. durch die spezifische Beeinflussung von z.B. Translation, Transkription oder Prozessierung und/oder der Unterdrückung der von den codierten Genprodukten ausgeübten Funktion bzw. biologischen Aktivität in intakten Pflanzen durch Substanzen vorteilhaft niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, vorteilhaft mit einem Ki-Wert von kleiner 10^–7, vorteilhaft kleiner 10^–8, bevorzugt kleiner 10^–9 M, vorteilhaft sollte dabei diese Hemmwirkung auf ein spezifische Hemmung des biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine zurückzuführen sein, das heißt es sollte keine Hemmung durch diese niedermolekularen Substanzen weiterer nahe verwandter Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine erfolgen. Weiterhin sollten die niedermolekulare Substanzen vorteilhaft ein Molekulargewicht von größer 50 Dalton, bevorzugt größer 100 Dalton, besonders bevorzugt größer 150 Dalton, ganz besonders bevorzugt größer 200 Dalton haben. Vorteilhaft sollten die niedermolekularen Substanzen weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring haben. Weiterhin sollten auch keine freie(n) Säure- oder Lacton-Gruppe(n) sowie keine Phosphatgruppe und nicht mehr als eine Aminogruppe im Molekül enthalten sein. Auch Basen wie Adenosin im Molekül sind weniger bevorzugt. Die über das erfindungsgemäße Verfahren identifizierten Substanzen vorteilhaft die niedermolekularen Substanzen, aber auch proteinogene Substanzen oder Sense- oder Antisense-RNA oder Antikörper oder Antikörperfragment führen durch ihre inhibitorischen Wirkungen vorteilhaft zu einer massiven Veränderungen des Wachstums und der Entwicklung der behandelten bzw. betroffenen Pflanzen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen sind deshalb in der Landwirtschaft als Herbizide geeignet.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 sind essentiell für Organismen, bevorzugt für Pflanzen. Ihre Unterbrechung bzw. die Blockierung ihrer Expression stoppt die Entwicklung von Pflanzen in einem frühen Entwicklungsstadium. Die Genprodukte der genannten Sequenzen sind z.B. den Polypeptiden der Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 zu entnehmen.
SEQ ID NO: 1, deren Expression in Linie 303317 blockiert ist, codiert für ein Protein (F2809.40), das Ähnlichkeiten zu translation releasing factor RF-2 aus Synechocystis sp. (PIR:S76448) aufweist und das auf Chromosom 3 (BAC ATF2809, Accession AL137080) von Arabidopsis liegt. Weiterhin besitzt das Protein die araC-Familiensignature.
SEQ ID NO: 3, deren Expression in Linie 304149 blockiert ist, codiert für ein "Kobalamin-Synthese"-Protein (MSH 12.9), das auf Chromosom 5 (P1-Klon MSH12, Accession AB006704) von Arabidopsis liegt.
SEQ ID NO: 5, deren Expression in Linie 120701 blockiert ist, codiert für einen ORF (T25K17.110) auf Chromosom 4 (BAC ATT25K17, Accession AL049171), der möglicherweise für eine Arginyl-tRNA-Synthetase codiert. Dieser ORF beinhaltet den EST: gb:AA404880, T76307.
SEQ ID NO: 7, deren Expression in Linie 126548 blockiert ist und auf Chromosom 4 des Arabidopsis Genoms (BAC ATF17A8, Accession AL049482) lokalisiert ist, codiert für ein putatives Protein (F17A8.80) mit Ähnlichkeit zu einer RNA-Helicase aus Maus (Mus musculus, PIR2:I84741).
Von SEQ ID NO: 9, deren Expression in Linie 127023 blockiert ist, wird ein putatives Protein (AT4g39780) codiert, das auf Chromosom 4 (BAC ATT19P19, Accession number AL022605) lokalisiert ist und das Homologien zu dem die AP2-Domäne enthaltenden Protein RAP 2.4 aus Arabidopsis thaliana hat. Zudem beinhaltet der ORF die ESTs gb:T46584 und AA394543.
SEQ ID NO: 11, deren Expression in Linie 127235 blockiert ist, codiert für den ORF F9K20.4, der auf Chromosom 1 (BAC F9K20, Accession A0005679) von Arabidopsis lokalisiert ist. Dieser ORF F9K20.4 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu gi|1786244 einem hypothetischen 24.9 kD Protein in der surA-hepA intergenischen Region yab0 des Escherichia coli Genoms und zu gb|AE000116 einem hypothetischen Protein der YABO Familie PF|00849. Weiterhin besitzt das durch den ORF F9K20.4 codierte Protein eine konservierte Pseudouridylat-Synthase-Domäne, welche an der Modifizierung von Uracil in RNA-Molekülen beteiligt ist. Demnach zeigt der ORF F9K20.4 im blastp-Vergleich unter Standardbedingungen signifikante Homologie zu verschiedenen Pseudouridylat-Synthasen.
SEQ ID NO: 13, deren Expression in Linie 218031 blockiert ist, codiert für eine putative Adenylatkinase (At2g37250). Der ORF At2g37250 ist auf Chromosom 2 des Klons F3G5 (Accession AC005896) von Arabidopsis lokalisiert.
Das von SEQ ID NO: 15 codierte putative Protein (ORF T29H11_270, Accession AL049659), dessen Expression in Linie 171042 blockiert ist, zeigt Ähnlichkeit zu dem pol Polyprotein des "Equipe Infectious Anemia Virus (PIR:GNLJEV). Die Sequenz befindert sich auf Chromosom 3 des BAC-Klons T29H11 von Arabidopsis.
SEQ ID No: 17, dessen Expression in Linie KO_T3_02-33338-3 blockiert ist, befindet sich auf Chromosom 5 des P1-Klons MJE7 (Accession AB020745). Die Sequenz codiert für ORF MEJ7.11. Bei ORF MEJ7.11 handelt es sich um ein unbekanntes Protein.
SEQ ID No: 19, dessen Expression in Linie KO_T3_02-33885-2 blockiert ist, codiert für ein unbekanntes Protein (= ORF F14G9.26). Der ORF befindet sich auf Chromosom 1 des BAC-Klons F14G8 mit der Accession AC069159.
SEQ ID No: 21, dessen Expression in Linie KO_T3_02-35172-2 blockiert ist, codiert für ein unbekanntes Protein. Der ORF MAB16.6 hat nur Homologien zu anderen unbekannten Proteinen. Die Sequenz befindet sich auf Chromosom 5 des P1-Klons MAB16 mit der Accession AB018112.
Die genannten Sequenzen wurden alle in Arabidopsis identifiziert.
Die Unterdrückung der Bildung der Genprodukte bzw. Unterdrückung der von den codierten Genprodukten ausgeübten Funktion oder Aktivität in intakten Pflanzen durch eine niedermolekulare Substanz führt zur Reduzierung, bevorzugt zur Unterdrückung des Wachstums; die Entwicklung der Pflanze wird massiv verändert und unterdrückt. Sie sind deshalb zur Identifizierung von Herbiziden vorteilhaft geeignet.
Die vorgenannten Sequenzen oder funktionale Teile davon ermöglichen die Identifizierung von in der Landwirtschaft nutzbaren Herbiziden beispielsweise über ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellung zweier Linien eines Organismus, die die Genprodukte, die durch eine für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Sequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 codiert werden oder den beschriebenen Derivaten oder Fragmenten davon, die die biologische Aktivität dieser Sequenzen aufweisen, funktional exprimieren, wobei die Expression der Linien unterschiedlich hoch ist, z.B. durch Mutagenese einer Linie und Identifizierung einer Mutante mit erhöhter oder erniedrigter Expression und/oder Aktivität des genannten Genprodukts im Vergleich zur Ausgangslinie oder, z.B. durch Erzeugung von rekombinanten Organismen, vorteilhaft transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben wie Geweben von beispielsweise Blatt, Wurzel, Spross oder Stamm, Pflanzensamen, Pflanzenkalli oder Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäß beschriebenen Sequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 oder Derivate oder Fragmente davon, die die biologische Aktivität dieser Sequenzen besitzen, funktional exprimieren;
b) Zugabe von chemischen Verbindungen (die auf ihre Herbizidaktivität getestet werden sollen) zu den Linien mit den unterschiedlichen Expressions- oder Aktivitätsleveln des Genprodukts, z.B. zu den unter a) genannten rekombinanten Organismen und nicht-rekombinanten Ausgangsorganismen mit einem anderen, vorzugsweise geringeren Expressions- oder Aktivitätslevel des Genprodukts;
c) Bestimmung der biologischen Aktivität, beispielsweise der enzymatischen Aktivität, des Wachstums oder der Vitalität der beiden Linien, z.B. der rekombinanten Organismen, im Vergleich zu den nicht-rekombinanten Ausgangsorganismen, nach Zugabe von chemischen Verbindungen gemäß Punkt b); und
d) Selektion der chemischen Verbindungen, die die biologische Aktivität, beispielsweise die enzymatische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Linie mit der geringeren Aktivität reduziert oder vollständig hemmt bzw. blockiert, z.B. die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der nicht rekombinanten Organismen, der gemäß Punkt c) bestimmten chemischen Verbindungen, im Vergleich zu den behandelten rekombinanten Organismen reduzieren oder vollständig hemmen bzw. blockieren.

Ein in der Landwirtschaft nutzbares Herbizid kann auch identifiziert werden, wenn die oben in a) erzeugten rekombinanten Organismen in einem Verfahren getestet werden, das folgende SChritte umfasst:

(b) Zugabe von chemischen Verbindungen, die auf ihre Herbizidaktivität getestet werden sollen, zu den unter (a) genannten rekombinanten Organismen; und
(c) Bestimmung der biologischen Aktivität, beispielsweise der enzymatischen Aktivität, des Wachstums oder der Vitalität der rekombinanten Organismen nach Zugabe von chemischen Verbindungen gemäß (b) im Vergleich zu denselben nicht behandelten rekombinanten Organismen; und
(d) Selektion der chemischen Verbindung, die die biologische Aktivität, z.B. die enzymatische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der behandelten Organismen im Vergleich zu den unbehandelten Organismen reduziert oder vollständig hemmt oder blockiert.

Unter chemischen Verbindungen, die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Organismen reduzieren, sind Verbindungen zu verstehen, die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Organismen mindestens um 10 %, 20 % oder 30 %, vorteilhaft um mindestens 40 %, 50 % oder 60 %, bevorzugt um mindestens 70 %, 80 oder 90 %, besonders bevorzugt um mindestens 91 %. 92 %, 93 %, 94 % oder 95 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % hemmen, d.h. reduzieren oder blockieren.
Vorteilhaft ist insbesondere eine Substanz, die die Zelllinien mit geringer Aktivität schädigen oder, vorzugsweise, die letal ist, jedoch nicht Zelllinien, die eine höhere Aktivität des Genproduktes aufweisen, schädigt oder für diese letal ist.
Allgemein können in dem genannten Verfahren Linien von Organismen eingesetzt werden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen und insbesondere die Genprodukte, die durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren codiert werden, exprimieren, die jedoch nicht rekombinant sind, solange eine Linie eine höhere Genexpression oder Aktivität des Genprodukts aufweist als eine andere Linie. Solche Linien können natürlich auftreten oder durch Mutagenesen erzeugt werden.
Assaysysteme, die die Identifizierung von Substanzen, die die Bildung der Genprodukte und/oder die von den Genprodukten ausgeübten Funktionen oder die Aktivität der Genprodukte in intakten Pflanzen, Pflanzenteilen, -geweben oder Pflanzenzellen unterdrücken, sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft sei hier auf Testsysteme für die Inhibierung von Enzymen wie der Adenylat-Kinase wie von Skoblov et al. (FEBS Letters, 395 (2-3), 1996: 283-285), von Russel et al. (J. Enzyme Inhib., 9 (3), 1995: 179-194 und ), Wiesmüller et al. (FEBS Letters, 363, 1995: 22-24) oder Schlattner et al. (Phytochemistry, 42, 1996: 589-594) beschrieben, verwiesen. Diese Testsysteme können beispielsweise vorteilhaft für sog. Inhibierungsassays für beispielsweise das in Linie 218031 identifizierte Genprodukt verwenden.
Weitere vorteilhafte Assaysysteme sind beispielsweise die Fluoreszenz-Korrelationsspectroskopie (= FCS). Mit Hilfe der FCS (Brock et al., PNAS, 1999, 96, 10123-10128; Lamb et al., J. Phys. Org. Chem., 2000, 13654-658) ist es möglich, die zeitliche Diffusion von Molekülen zu messen bzw. die Differenz der gebundenen gegenüber den freien Molekülen zu ermitteln. Hierzu werden die zu untersuchenden Moleküle fluoreszenzmarkiert und beispielsweise ein definiertes Volumen in Mikrotiterplatten gegeben. Die Fluktuation der Moleküle wird in den Proben dabei von der Braunschen Molekularbewegung getrieben. Durch einen in der Probe fokusierten Laser lassen sich die translateralen bzw. rotationale Diffusion und Konformationsänderungen der Moleküle verfolgen und über eine Korrelation analysieren. Durch Bindung an andere Substanzen ändert sich der Diffusionskoeffizient der Moleküle. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen lässt sich die Bindung der Moleküle über die Änderung des Diffusionskoeffizienten ermitteln bzw. quantifizieren. Mit dieser Methode kann in einem breiten Konzentrationsbereich vorteilhaft gemessen werden. Die Methode eignet sich vorteilhaft für die Messung von rekombinanten Proteinen, die vorteilhaft mit einem sog. His-Tag zur leichteren Aufreinigung über handelsübliche Chromatographie-Säulen (Porath et al., Nature 1975, 258, 598-599) versehen sind. Das so gereinigte Protein wird schließlich mit einem Fluoreszenzmarker wie z.B. Carboxytetramethylrhodamin oder BODIPY^® (z.B. BODIPY 576/589 Angiotensin II, NEN^® Life Science Products, Boston, MA, USA) versehen. Die zu untersuchende Verbindung bzw. Substanz wird zu dem Protein anschließend in einem Überschuss zugegeben. Die Diffusion des so markierten Proteins wird schließlich mit einem FCS-System (z.B. ConfoCor2 mit LSM 510, Carl Zeiss Mikroskop, Jena, Deutschland) ermittelt.
Eine weitere vorteilhafte Detektions-Methode für das erfindungsgemäße Verfahren ist die sog. "Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation"-Methode (= SELDI ProteinChip^®). Diese Methode wurde von Hutchens und Yip (1980) erstmals beschrieben. Mit dieser Methode, die für die reproduzierbare, gleichzeitige Identifi zierung von Biomarkern oder Antigenen entwickelt wurden (Hutchens und Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom, 1993, 7, 576-580), kann die Ligand-Protein-Bindung über Massenspektrometrie analysiert werden. Dabei erfolgt die Detektion über normale TOF-Detektion (= time of flight). Auch bei dieser Methode können rekombinant exprimierte Proteine wie oben beschrieben exprimiert und gereinigt werden. Zur Messung wird das Protein auf den SELDI Protein-Chips^® immobilisiert, beispielsweise über die schon zur Reinigung verwendeten His-Tags oder über Ionen- oder hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Chip. Auf diesen so vorbereiteten Chip werden anschließend die Liganden mit beispielsweise einem Autosampler gegeben. Nach einem oder mehreren Waschschritten mit Puffern verschiedener Ionenstärke werden die gebundenen Liganden mit dem LDI-Laser analysiert. Dabei wird die Bindungsstärke der Liganden nach jedem Waschschritt ermittelt.
Als weitere vorteilhafte Dektionsmethode sei die sog. Biacore-Methode genannt, bei der der Refraktionsindes an der Oberfläche bei Bindung von Liganden and das an der Oberfläche gebundene Protein analysiert wird. Bei dieser Methode wird eine Kollektion von kleinen Liganden sequentiell in eine Messzelle mit dem gebundenen Protein gegeben. Die Bindung an der Oberfläche wird über eine erhöhte sog. "Plasmon-Resonanz" (= SPR) über die Aufzeichnung der Laserrefraktion von der Oberfläche ermittelt. Im allgemeinen ist die Refraktionsindexänderung, die für eine Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche, ermittelt wird für alle Proteine oder Polypeptide gleich, das heißt diese Methode kann vorteilhaft für die verschiedensten Proteine verwendet werden. (Liedberg et al., Sens. Actuators, 1984, 4, 299-304). Wie oben beschrieben werden auch hier vorteilhaft rekombinant exprimierte Proteine verwendet, die an den Biacore Chip (Upsala, Schweden) beispielsweise über Histidin-Reste (z.B. His-Tag) gebunden werden. Der so hergestellte Chip wird wieder mit den Liganden in Verbindung gebracht z.B. mit einem Autosampler und die Bindung über ein von Biacore vertriebenes Detektionssystem mit Hilfe des SPR-Signals d.h. über die Änderung des Refraktionsindex gemessen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren haben eine Reihe von Vorteilen wie beispielsweise:

– neue potentielle Angriffsorte für herbizide Wirkstoffe können identifiziert werden,
– Identifizierung von Herbiziden, die eine möglichst umfassende, Pflanzenspezies unabhängige Wirkung haben,
– Substanzen, die mittels der kombinatorischen Chemie erzeugt wurden, und die sich durch eine hohe Vielfalt, aber geringe zur Verfügung stehende Mengen auszeichnen, können effizient auf Inhibitoren der neu identifizierten Angriffsorte geprüft werden
– sie erlauben, landwirtschaftlichen Nutzpflanzen im Fall von z.B. sehr breite Wirksamkeit aufweisenden Herbiziden (Totalherbiziden oder auch selektiven Herbiziden) Resistenz gegenüber diesen zu vermitteln (siehe Beschreibung im folgenden)

Z.B. können Substanzen, die besonders spezifisch mit z.B. einem Protein oder Proteinfragment binden, das von einer Nukleinsäure codiert wird, deren Expression essentiell für das Wachstum der Pflanzen ist, mit den genannten Verfahren isoliert werden. Dies ermöglicht eine vereinfachte Identifikation möglicher Inhibitoren, die Proteine, z.B. in ihren Enzymeigenschaften, Bindeeigenschaften oder sonstigen Aktivitäten hemmen, z.B. auch durch die Inhibierung ihrer Prozessierung, wie oben beschrieben, oder ihren Transport innerhalb der Zelle oder Im- und Export aus Organellen oder Zellen verhindern. Die so identifizierten Substanzen können auch in einem weiteren Schritt in Screening-Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, auf Pflanzen aufgebracht werden und auf ihre Beeinflussung des Wachstums und der Entwicklung hin untersucht werden. Somit wird eine Auswahl aus der unendlichen Zahl chemischen Verbindungen, die sich für ein Screeningverfahren eignen würden, getroffen, die es dem Fachmann wesentlich erleichtert, herbizide Substanzen zu identifizieren.
Unter "spezifische Bindung" versteht man die Spezifität von Interaktionen zwischen zwei Partnern, z.B. Proteinen untereinander oder von Protein (Enzym) und Substrat (Substratspezifität). Sie beruht auf einer bestimmten molekularen räumlichen Struktur. Wird sie zerstört, spricht man von Denaturierung, die oftmals irreversibel ist und wodurch die Spezifität meistens verloren gehen kann. Diese biologische Aktivität ist stark abhängig von den Umgebungsbedingungen (Puffer, Temperatur, Kontakte zu unphysiologische Oberflächen wie Glas oder fehlende Cofaktoren). Bei Enzym-Substrat oder Cofaktor, bei Rezeptor-Ligand oder bei Antikörper-Antigen Bindungen spricht man von spezifischen Bindungen. Die Enzym-Substrat Wechselwirkung wird thermodynamisch im einfachsten Fall mit der Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben. Sie beschreibt die Enzymaktivität über die sog. Michaelis-Menten-Konstante, die wiederum die Kinetik wiederspiegelt. Diese Konstante ist auch die Maßeinheit für die Enzymaktivität, die wiederum die Spezifität wiederspiegelt. Definition der Enzymaktivitätseinheit (nach IUB): Eine Einheit U entspricht derjenigen Enzymmenge, welche die Umsetzung von einem Mikromol Substrat pro Minute unter genau festgelegten Versuchsbedingungen katalysiert. Die spezifische Aktivität wird meist in U/mg angegeben.
In einem weiteren Schritt können dann die identifizierten Substanzen auf Pflanzen, Mikroorganismen oder Zellen aufgebracht werden, z.B. auf Pflanzenzellen, und dann die Beeinflussung des Stoffwechsels dieser Pflanzen beobachtet werden, z.B. Enzymaktivitäten, Photosyntheseaktivitäten, Stoffwechselaktivität, Fixierungsrate, Gasaustausch, DNA-Synthese, Wachstumsraten. Diese und viele andere dem Fachmann bekannte Methoden eignen sich, um die Viabilität von Zellen zu untersuchen. Substanzen, die das Wachstum, z.B. von Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, reduzieren, insbesondere blockieren, eignen sich dann bevorzugt als Auswahl für herbizide Mittel.
Weiterhin können schon in einem sehr frühen Stadium Untersuchungen zu den Aufwandmengen der gefundenen Herbizide gemacht werden. Außerdem kann die hohe Spezifität und Effizienz gegenüber Unkräutern leicht ermittelt werden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren pflanzlicher Proteine, die durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen codiert werden, mit potentiell herbizider Wirkung indem man die Genprodukte kloniert, in einer geeigneten Expressionskassette – beispielsweise in Insektenzellen – zur Überexpression bringt, die Zellen öffnet und den Zellextrakt direkt bzw. nach Anreicherung oder Isolierung des Proteins in einem Testsystem zur Messung der biologischen Aktivität in Gegenwart von niedermolekularen chemischen Verbindungen einsetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb Substanzen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanzen vorteilhaft niedermolekulare Substanzen mit einem Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, vorteilhaft mit einem Ki-Wert von kleiner 10^–7, vorteilhaft kleiner 10^–8, bevorzugt kleiner 10^–9 M sind, vorteilhaft sollte dabei diese Hemmwirkung auf ein spezifische Hemmung des biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine zurückzuführen sein, das heißt es sollte keine Hemmung durch diese niedermolekularen Substanzen weiterer nahe verwandter Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine erfolgen. Weiterhin sollten die bevorzugten niedermolekularen Substanzen vorteilhaft ein Molekulargewicht von größer 50 Dalton, bevorzugt größer 100 Dalton, besonders bevorzugt größer 150 Dalton, ganz besonders bevorzugt größer 200 Dalton haben. Vorteilhaft sollten die niedermolekularen Substanzen weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring haben. Weiterhin sollten keine freie(n) Säure- oder Lacton-Gruppe(n) sowie keine Phosphatgruppe und nicht mehr als eine Aminogruppe im Molekül enthalten sein. Auch Basen wie Adenosin im Molekül sind weniger bevorzugt.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Substanzen handelt es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz, um eine Antisense-RNA, eine inhibierende oder eine interferierende RNA (RNAi).
Der Begriff "sense" bezieht sich auf den Strang einer doppelsträngigen DNA der homolog zu dem mRNA-Transkript ist. Der "Antisense"-Strang enthält eine invertierte Sequenz, die komplementär zu der des "Sense"-Strangs ist. Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül umfasst z.B. eine Nukletidsequenz, die komplementär zu dem "Sense"-Nukleinsäuremolekül ist, das ein Protein oder eine aktive RNA codiert, z.B. komplementär zu dem codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz. Folglich kann ein Antisense-Nukleinsäuremolekül Wasserstoffbrückenbindungen zu einem Sense-Nukleinsäuremolekül ausbilden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu jedem hier gezeigten codierenden Strang sein, oder nur zu einem Teil davon. Der Begriff "codierende Region" bezieht sich auf die Region einer Nukleinsäuresequenz, deren Codone in Aminosäuren translatiert werden. Auch kann das Antisense-Nukleinsäuremolekül komplementär zu "nicht-codierenden Regionen" des codierenden Strangs der gezeigten Nukleinsäuremoleküle sein. Der Begriff "nicht-codierende Region" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die codierende Region flankieren und die nicht in ein Polypeptid translatiert werden (z.B. auch bezeichnet als 5'- und 3'-nicht-translatierte Regionen). Das Nukleinsäuremolekül, das eine Antisensesequenz umfasst, kann auch weitere für die Expression und Stabilität des Moleküls wichtige Elemente umfassen, z.B. Capping-Strukturen, poly A-tails etc.
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu der gesamten codierenden Region einer mRNA sein, aber es kann auch ein Oligonukleotid sein, welches komplementär zu nur einem Teil der codierenden oder nicht-codierenden Region der mRNA ist. Z.B. kann ein Antisense-Oligonukleotid komplementär zu der Region sein, die den Translationsstart der mRNA umfasst oder umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann vorteilhaft z.B. 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45- oder 50-Nukleotide lang sein. Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligation nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Eine Antisense-Nukleinsäuremolekül kann chemisch synthetisiert werden unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder auf verschiedene Arten modifizierten Nukleotiden, so dass die biologische Stabilität der Moleküle erhöht ist oder die physikalische Stabilität des Duplex, die sich zwischen der Antisense- und Sense-Nukleinsäure bildet, verstärkt ist, z.B. können Phosphorothioatderivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die für die Herstellung von Antisense-Nukleinsäuren verwendet werden können, umfassen 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracil, Hypoxanthine, Xanthine, 4-Acetylcytosine, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2 -thiouridine, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-galactosylqueosine, Inosine, N6-Isopentenyladenine, 1-Methylguanine, 1-Methylinosine, 2,2-Dimethylguanine, 2-Methyladenine, 2-Methylguanine, 3-Methylcytosine, 5-Methylcytosine, N6-Adenine, 7-Methylguanine, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-mannosylqueosine, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenine, Uracil-5-oxyacetic acid (v), Wybutoxosine, Pseudouracil, Queosine, 2-Thiocytosine, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyaceticacidmethylester, Uracil-5-oxyacetic acid (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurine.
Alternativ können Antisense-Nukleinsäuremoleküle biologisch hergestellt werden unter Verwendung von Expressionsvektoren, in welche Polynukleotide kloniert wurden, deren Orientation gegenläufig ist (so dass RNA, transkribiert von dem inserierten Polynukleotid, in einer Antisenseorientierung zu einem Zielpolynukleotid wie es weiter oben beschrieben wurde, ist).
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein "α-Anomeric" Nukleinsäuremolekül sein. Ein "α-Anomeric" Nukleinsäuremolekül formt spezifische Doppelstranghybride mit komplementären RNAs, in denen, im Gegensatz zu gewöhnlichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander laufen. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann 2-0-Methylribonukleotide oder chimäre RNA-DNA-Analoge umfassen.
Weiterhin kann das Antisense-Nukleinsäuremolekül ein Ribozym sein. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit einer Ribonukleaseaktivität, die dazu fähig sind, einzelsträngige Nukleinsäuren, wie z.B. mRNA, zu denen sie eine komplementäre Region haben, zu schneiden. Ribozyme (z.B. Hammerheadribozyme) können dazu verwendet werden katalytisch oder nichtkatalytisch mRNA der hierin beschriebenen Sequenzen zu schneiden und somit die Translation der mRNA zu verhindern. Ein Ribozym, das zu einer der hierin genannten Nukleinsäuresequenzen spezifisch ist, kann aufgrund der hier gezeigten cDNA-Sequenzen konstruiert werden oder auf Basis von heterologen Sequenzen, die nach den hierin beschriebenen Methoden identifiziert werden können. Z.B. kann ein Derivat der Tetrahymena L-19 IVSRNA hergestellt werden, indem die Nukletidsequenz der aktiven Region komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer codierenden mRNA geschnitten wird. Alternativ kann auch eine der hierin beschriebenen codierenden oder nicht-codierenden Sequenzen oder einer mRNA davon verwendet werden, um eine katalytische RNA aus einem Pool von RNAs auszuwählen (s. z.B. Bartel, 1993, Science, 261, 1411). Alternativ kann die Expression auch inhibiert werden, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zu einer regulatorischen Region der hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen ist (z.B. ein Promotor oder Enhancer) eine triple-helikale Struktur bildet, die die Transkription des folgenden Gens verhindert (z.B. Helene, 1991, Anticance-Drug Des. 6, 596; Helene, 1992, Ann. NY Acad. Sci. 660, 27, oder Maher, 1992, Bioassays, 14, 807.
Die dsRNAi-Methode (= "double-stranded RNA interference") wurde vielfach in tierischen und pflanzlichen Organismen beschrieben (z.B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Eine effiziente Gensuppression kann auch bei transienter Expression oder nach transienter Transformation beispielsweise infolge einer biolistischen Transformation gezeigt werden (Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). dsRNAi-Verfahren beruhen auf dem Phänomen, dass durch gleichzeitiges Einbringen von komplementären Strang- und Gegenstrang eines Gentranskriptes eine hocheffiziente Unterdrückung der Expression des entsprechenden Gens bewirkt wird. Der bewirkte Phänotyp kommt dem einer entsprechenden knock-out Mutanten sehr ähnlich (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13959-64).
Das dsRNAi-Verfahren kann vorteilhaft zur Verminderung der Expression der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21, ihrer Derivate und Fragmente verwendet werden. Wie u.a. in WO 99/32619 beschrieben sind dsRNAi-Ansätze klassischen antisense-Ansätzen deutlich überlegen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich daher auf doppelsträngige RNA-Moleküle (dsRNA-Moleküle), die bei Einführung in einen Organismus vorteilhaft einer Pflanze (oder eine davon abgeleitete Zelle, Gewebe, Organ oder Samen) die Verminderung der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21, ihrer Derivate oder Fragmente oder der durch sie codierten Proteine bewirken. Das doppelsträngiges RNA-Molekül zur Verminderung der Expression eines Proteins, das durch die Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 codiert ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass

i) einer der beiden RNA Stränge im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil einer Nukleinsäuresequenz mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21, und
ii) der jeweils andere RNA Strang im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil des komplementären Stranges einer der unter (i) genannten Nukleinsäuresequenz.

"Im wesentlichen identisch" meint, dass die dsRNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der Zielsequenz (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21) aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirken. Bevorzugt beträgt die Homologie nach obiger Definition mindestens 75 %, bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % am meisten bevorzugt 100 % zwischen dem "sense"-Strang einer inhibitorischen dsRNA und einem Teilabschnitt einer Nukleinsäuresequenz mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 (bzw. zwischen dem "antisense"-Strang dem komplementären Strang einer Nukleinsäuresequenz der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21). Die Länge des Teilabschnittes beträgt mindestens 10 Basen, bevorzugt mindestens 25 Basen, besonders bevorzugt mindestens 50 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 200 Basen oder mindestens 300 Basen. Alternativ, kann eine "im wesentlichen identische" dSRNA auch als Nukleinsäuresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines Gentranskriptes der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 zu hybridisieren (z.B. in 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA bei 50°C oder 70°C für 12 bis 16 h).
Die dsRNA kann aus einem oder mehr Strängen polymerisierter Ribonukleotide bestehen. Es können ferner Modifikationen sowohl des Zucker-Phosphat-Gerüstes als auch der Nukleoside vorliegen. Beispielsweise können die Phosphodiesterbindungen der natürlichen RNA dahingehend modifiziert sein, dass sie zumindest ein Stickstoff oder Schwefel-Heteroatom umfassen. Basen können dahingehend modifiziert werden, dass die Aktivität beispielsweise von Adenosindeaminase eingeschränkt wird. Solche und weitere Modifikationen sind weiter unten bei den Verfahren zur Stabilisierung von antisense-RNA beschrieben.
Die dSRNA kann enzymatisch oder ganz oder teilweise chemischsynthetisch hergestellt werden.
Die doppelsträngige Struktur kann ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären Strang oder ausgehend von zwei komplementären Strängen gebildet werden. Bei einem einzelnen, selbstkomplementären Strang, können "sense"- und "antisense"-Sequenz durch eine verbindende Sequenz ("Linker") verknüpft sein und beispielsweise eine Haarnadelstruktur ausbilden. Bevorzugt kann die verbindende Sequenz ein Intron sein, das nach Synthese der dSRNA herausgespleißt wird. Die Nukleinsäuresequenz codierend für eine dsRNA kann weitere Elemente beinhalten, wie beispiels weise Transkriptionsterminationssignale oder Polyadenylierungssignale. Sollen die zwei Stränge der dsRNA in einer Zelle oder einem Organismus vorteilhaft einer Pflanze zusammengebracht werden, so kann dies auf verschiedene Art geschehen:

a) Transformation der Zelle oder des Organismus vorteilhaft einer Pflanze mit einem Vektor, der beide Expressionskassetten umfasst,
b) Kotransformation (= Co-Transformation) der Zelle oder des Organismus vorteilhaft einer Pflanze mit zwei Vektoren, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst.
c) Kreuzung von zwei Organismen vorteilhaft von Pflanzen, die mit jeweils einem Vektor transformiert wurden, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-Strang umfasst.

Die Bildung der RNA Duplex kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden. Wie in WO 99/53050 kann die dsRNA auch eine Haarnadelstruktur umfassen, indem "sense"- und "antisense"-Strang durch einen "Linker" (beispielsweise ein Intron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dsRNA-Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression eines Konstruktes erfordern und die komplementären Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen.
Die Expressionskassetten codierend für den "antisense"- oder "sense"-Strang einer dsRNA oder für den selbstkomplementären-Strang der dSRNA, werden bevorzugt in einen Vektor insertiert und mit den unten beschriebenen Verfahren stabil (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkern) in das Genom einer Pflanze insertiert, um eine dauerhafte Expression der dSRNA zu gewährleisten.
Die dsRNA kann unter Verwendung einer Menge eingeführt werden, die zumindest ein Kopie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z.B. mindestens 5, 10, 100, 500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizienter Verminderung bewirken.
Wie bereits beschrieben, ist eine 100%ige Sequenzidentität zwischen dsRNA und einem Gentranskript der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der Expression der genannten Sequenzen zu bewirken. Demzufolge besteht der Vorteil, dass das Verfahren tolerant ist gegenüber Sequenzabweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Polymorphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. So ist es beispielsweise möglich mit der dsRNA, die ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 des einen Organismus generiert wurde, die Expression der Sequenzen in einem anderen Organismus zu unterdrücken. Die hohe Sequenzhomologie zwischen den Sequenzen aus verschiedenen Organismen lässt auf einen hohen Konservierungsgrad dieser Proteine innerhalb von beispielsweise Pflanzen schließen, so dass die Expression einer dSRNA abgeleitet von einer der offenbarten Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 auch einen vorteilhaften Effekt in anderen Pflanzenarten haben dürfte.
Die dsRNA kann entweder in vivo oder in vitro synthetisiert werden. Dazu kann eine DNA-Sequenz codierend für eine dSRNA in eine Expressionskassette unter Kontrolle mindestens eines genetischen Kontrollelementes (wie beispielsweise Promotor, Enhancer, Silencer, Splice-Donor oder -Akzeptor, Polyadenylierungssignal) gebracht werden. Entsprechend vorteilhafte Konstruktionen sind weiter unten beschrieb. Eine Polyadenylierung ist nicht erforderlich, ebenso müssen keine Elemente zur Initiierung einer Translation vorhanden sein.
Eine dsRNA kann chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Dazu können zelluläre RNA Polymerasen oder Bakteriophagen RNA Polymerasen (wie z.B. T3-, T7- oder SP6 RNA-Polymerase) verwendet werden. Entsprechende Verfahren zu in vitro Expression von RNA sind beschrieben (WO 97/32016; US 5,593,874 ; US 5,698,425 , US 5,712,135 , US 5,789,214 , US 5,804,693 ). Eine chemisch oder enzymatisch in vitro syntetisierte dsRNA kann vor der Einführung in eine Zelle, Gewebe oder Organismus aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektrophorese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren ganz oder teilweise aufgereinigt werden. Die dsRNA kann unmittelbar in die Zelle eingeführt werden oder aber auch extrazellulär (z.B. in den interstitialen Raum) appliziert werden.
Unter "Antikörpern" sind beispielsweise polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper zu verstehen. Unter erfindungsgemäßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ oder IgG_M. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen Igel oder IgG_2b. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genmanipulierte nichtverkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden. Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden. Antikörper können auch Teil eines Fusionsproteins sein.
Die identifizierten Substanzen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z.B. in Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten. Weiterhin können die genannten Stoffe zwar im Stand der Technik bekannt sein, aber bisher nicht bekannt sein als Herbizid. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3^rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17. Die genannten Stoffe können z.B. zu dem Reaktionsgemisch oder dem Kulturmedium zugegeben werden oder den Zellen injiziert werden oder auf eine Pflanze gesprüht werden.
Wenn eine Probe, die ein nach der erfindungsgemäßen Methode aktive Substanz beinhaltet, identifiziert wurde, dann ist es entweder möglich, den Stoff direkt von der ursprünglichen Probe zu isolieren oder man kann die Probe in verschiedene Gruppen teilen, z.B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu reduzieren und dann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer solchen "Unterprobe" der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Probe nur noch eine geringe Anzahl von Substanzen oder nur noch eine Substanz umfasst. Vorzugsweise wird der gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Stoff oder Derivate davon weiter formuliert, so, dass er für die Anwendung in der Pflanzenzüchtung oder Pflanzenzell- oder Gewebekultur geeignet ist.
Die Stoffe, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet und identifiziert wurden, können beispielsweise sein: Expressionsbibliotheken, z.B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen). Diese Stoffe könne auch funktionelle Derivate oder Analogon der bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten oder Analogon sind dem Fachmann bekannt. Die genannten Derivate und Analogon können gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik getestet werden. Weiterhin kann computergestütztes Design oder Peptidomimetics zur Herstellung geeigneter Derivate und Analogon verwendet werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine erfindungsgemäße Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wie in den oben genannten Ausführungsformen beschrieben.
Unter Derivate(n) (der Plural und der Singular seien für diese Anmeldung und deren Definitionen äquivalent) der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sind beispielsweise funktionelle Homologe der von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 codierten Proteine oder deren biologischer Aktivität, das heißt Proteine, die dieselben biologischen Reaktionen wie die von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 codierten Proteine ausführen, zu verstehen. Diese Derivate bzw. Gene sind ebenfalls als herbizide Targets geeignet.
Die hierin erfindungsgemäß beschriebenen Sequenzen codieren für Homologe zu den in den Beispielen beschriebenen Proteinen und haben vorzugsweise die für die Homologe angegebenen Aktivitäten.
SEQ ID NO: 1 codiert für ein Protein, das zum Translation Realising Factor RF-2 Ähnlichkeiten aufweist. Die Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 2 wiedergegeben. SEQ ID NO: 3 codiert für ein Kobalamin-Synthese Protein, dessen Proteinsequenz SEQ ID NO: 4 zu entnehmen ist. SEQ ID NO: 5 codiert für eine Arginyl-tRNA-Synthetase, die Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt. SEQ ID NO: 7 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit z0 einer RNA-Helicase aus Mus musculus, dessen Proteinsequenz in SEQ ID NO: 8 wiedergegeben ist. SEQ ID NO: 9 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu dem die AP2-Domäne enthaltenden Protein RAP 2.4 aus Arabidopsis thaliana, dessen Proteinsequenz SEQ ID NO: 10 zu entnehmen ist. SEQ ID NO: 11 codiert für ein Protein, das Homologien zu verschiedenen Pseudouridylat-Synthasen aufweist. Die Proteinsequenz ist SEQ ID NO: 12 zu entnehmen. Von SEQ ID NO: 13 wird ein Protein codiert, das Ähnlichkeiten mit einer putativen Adenylatkinase hat. SEQ ID NO: 14 gibt die Proteinsequenz wieder. Für ein Protein, mit der in SEQ ID NO: 16 gezeigten Sequenz, codiert die Sequenz SEQ ID NO: 15. Dieses durch SEQ ID NO: 15 codierte hypothetische Protein hat Ähnlichkeit zu dem pol-Polyprotein des "Equine Infectious Anemia Virus". SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 und SEQ ID NO: 21 codieren für unbekannte Proteine. Den Sequenzen SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 und SEQ ID NO: 22 sind die jeweiligen Proteinsequenzen zu entnehmen.
Unter Derivaten werden auch solche Peptide verstanden, die eine Homologie zu den Polypeptiden mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 gezeigten Sequenzen von mindestens 20 %, vorzugsweise 30 %, 40 % oder 50 %, mehr bevorzugt 60 %, 70 % oder 80 %, noch mehr bevorzugt 90 %, mehr bevorzugt 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder 95 %, am meisten bevorzugt 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr haben, und die eine äquivalente biologische Aktivität in anderen Organismen besitzen und somit als funktionelle Homologe anzusehen sind. Diese funktionelle Homologie oder Äquivalenz lässt sich z.B. durch die mögliche Komplementation von Mutanten in diesen Funktionen demonstrieren.
Die oben genannten Nukleinsäuresequenz(en) oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer Sequenzen wie z.B. genomische, cDNA oder sonstige Sequenzen, die als Herbizidtarget geeignet sind, über Homologiescreening verwendet werden.
Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen, insbesondere eukaryontischen Organismen wie monokotylen oder dikotylen Pflanzen, wie speziell Algen, Moosen, Dinoflagellaten, Nutzpflanzen wie Monokotyle wie Mais, Weizen, Hafer, Roggen, Gerste oder Hirse oder Dikotyle wie Kartoffel, Tabak, Salat, Tomate, Karotte um nur einige zu nennen oder Pilze, isolieren.
Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 genannten Sequenzen beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, vorteilhaft mindestens 70 % Homologie, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder 95 % Homologie, ganz besonders bevorzugt 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE bzw. BACKTRANSLATE (= Bestandteil des Programmpaketes UWGCG, Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Deverux et al., Nucleic. Acid Res., 12, 1984: 387-395) verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleitete Aminosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 zu entnehmen. Unter Homologie ist Identität zu verstehen, das heißt die Aminosäuresequenzen sind zu mindestens 40, 50, 60 oder 70 %, mehr bevorzugt 80 %, 85 % oder 90 %, noch mehr bevorzugt 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder 95 %, am meisten bevorzugt 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr identisch. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auf Nukleinsäureebene mindestens 45 oder 55 % homolog, bevorzugt mindestens 60 oder 65 %, besonders bevorzugt 75 % oder 80 %, ganz besonders bevorzugt mindesten 85 % oder 90 %, noch mehr bevorzugt 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr homolog.
Weiterhin umfasst der Begriff Derivate sowie der Begriff "Fragmente" auch Teilbereiche oder Fragmente der aufgeführten Sequenzen oder deren homologen Sequenzen von mindestens 50 Aminosäuren, vorteilhaft von mindestens 40 Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt von mindestens 20 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 10 Aminosäuren, die es ermöglichen, selektiv interagierende Substanzen zu identifizieren. Der Begriff "Fragment", "Sequenzfragment" oder "Teilsequenz" bedeutet eine verkürzte Sequenz der Originalsequenz. Die verkürzte Sequenz (Nukleinsäure oder Protein) kann unterschiedliche Längen haben, die minimale Sequenzlänge ist eine Sequenzlänge, die wenigstens eine vergleichbare Funktion, z.B. Bindungseigenschaften, oder Aktivität der Originalsequenz hat. Entsprechende Verfahren sind z.B. wie oben beschrieben SELDI, FCS oder Biocore und sind dem Fachmann bekannt.
Ebenfalls umfasst sind somit Nukleinsäuren, die ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codieren, das spezifisch an einem Antikörper bindet, der spezifisch an eine, als erfindungsgemäß beschriebenes Polypeptid bindet, insbesondere das von einer der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz codiert wird. Fragment oder Epitope eines Polypeptides, die mit einem solchen Antikörper spezifisch interagieren, weisen eine signifikante Homologie in der räumlichen Struktur zu den hierin beschriebenen Polypeptiden, zumindest in Teilbereichen, auf. Vorzugsweise besitzen sie ebenfalls eine hohe Homologie auf Aminosäureebene zu den genannten Sequenzen, vorzugsweise 20 %, mehr bevorzugt sind 40 %, mehr bevorzugt 60 %, noch mehr 80 %, am meisten bevorzugt sind 90 % oder mehr. Die räumliche Struktur eines Polypeptides ist jedoch im wesentlichen mitverantwortlich für die Interaktionen des Polypeptides mit anderen Verbindungen sowie ggf. für seine enzymatische Aktivität. Folglich können in den erfindungsgemäßen Verfahren oder Fragmenten eingesetzt werden, deren Sequenz nur eine geringe Homologie zu den beschriebenen Polypeptiden aufweist, deren räumliche Struktur jedoch eine hohe Homologie zu den beschriebenen Polypeptiden aufweist, also solche, die Epitope der hierin beschriebenen Sequenzen enthalten, um Interaktionspartner zu finden, die dann die hierin beschriebenen Polypeptide inhibieren oder inaktivieren. Fragmente, die Epitope der erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, können auch verwendet werden, um die Interaktionspartner der erfindungsgemäßen Polypeptide zu "besetzen", d.h. ihre Interaktion mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden zu verhindern. Hierzu ist es dann vorteilhaft, wenn die Fragmente eine höhere Affinität zu einem Bindungspartner haben als das natürlich vorkommende Polypeptid. Ebenfalls umfasst sind Fragmente, die von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert werden und eine der oben genannten biologischen Aktivitäten umfassen.
Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die biologische, z.B. enzymatische Aktivität oder Bindungseigenschaften der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.
Solche DNA-Sequenzen lassen sich mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, z.B. ausgehend von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise Mikroorganismen wie Hefen, Pilzen, Ciliaten, Pflanzen wie Algen, Moosen oder sonstigen Pflanzen, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide, beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.
Außerdem sind unter Homologen der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 Derivate wie beispielsweise Varianten aus anderen Organismen beispielsweise anderen Pflanzen zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. die biologische Aktivität der Varianten beeinträchtigt wird. Vorzugsweise haben sie eine Homologie von mindestens 20 %, vorteilhaft, 30 %, 40 %, 50 % oder 60 %, bevorzugt 70 %, 80 % oder 90 %, besonders bevorzugt von 95 % und eine äquivalente biologische Aktivität.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 und deren Fragmente und Derivate sind deshalb vorteilhaft dafür geeignet um weitere essentielle, neue Gene aus anderen Organismen bevorzugt Pflanzen zu isolieren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 und deren durch sie codierte Genprodukte werden im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Sie können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen Expression der heterologen Gene. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Ein Beispiel für Corynebacterium glutamicum ist gegeben in: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Die Durchführung solcher Experimente sind mit Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Funktionell äquivalente Sequenzen, die für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, das heißt die biologische Aktivität der Proteine besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, insbesondere an den Codon-Gebrauch einer Pflanze angepasste, künstliche Nukleotid-Sequenzen.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, zu Produkten führen, die die oben genannten Aktivitäten oder die gewünschte Eigenschaft, beispielsweise die Bindung an einen Rezeptor oder die enzymatische Aktivität vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Mögliche Techniken zur in vitro-Evolution von DNA zur Veränderung bzw. Verbesserung der DNA-Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P.A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733(1997) oder bei Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347( 1997). Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Codon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Codon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Für das erfindungsgemäße Verfahren sind vorteilhaft Aminosäuresequenzen zu verstehen, die eine in den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die biologische Aktivität des in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird. Unter nicht wesentlich reduziert sind alle Proteine zu verstehen, die noch mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt 30 %, 50 %, 70 %, 90 % oder mehr, der biologischen Aktivität des Ausgangsproteins aufweisen. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.
Unter Derivaten sind auch funktionelle Äquivalente zu verstehen, die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der verwendeten Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 beinhalten, welche weiterhin die gewünschte Funktion, das heißt deren biologische Aktivität nicht wesentlich reduziert ist, zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der genannten Nukleotidsequenzen erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt (= nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist (= Enzymaktivität stärker als die Aktivität des Ausgangsenzym, das heißt Aktivität ist höher als 100 %, bevorzugt höher als 150 %, besonders bevorzugt höher als 180 %).
Die Nukleinsäuresequenz kann dabei vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt (= Expressionskassette oder Nukleinsäurefragment) geeignete codierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für ein Protein mit den oben beschriebenen Sequenzen codieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion des Proteins und damit seiner biologischen Funktion verleihen. Diese Sequenzen können homologen oder heterologen Ursprungs sein.
Daher ist ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ein Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, z.B. ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt,
c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60 % Homologie auf Nukleinsäureebene aufweisen; oder
d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz codiert wird;
f) Nukleinsäuresequenz, die ein Fragment einer in a) dargestellten Nukleinsäure codiert und das eine eine "Translation Releasing Factor"-Aktivität, eine Kobalamin-Synthese-Aktivität, Arginyl-tRNA-Synthase-Aktivität, eine RNA-Helicase-Aktivität, eine GTP-Bindeprotein-Aktivität, eine Pseudouridylat-Synthase-Aktivität oder eine Adenylatkinase-Aktivität hat; und/oder
g) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20 % Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt;

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, z.B. die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 genannten Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Regulation, insbesondere Erhöhung, der Genexpression funktionell verknüpft wurden und welche die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene bzw. der Proteine ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es konstitutiv exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kann auch vorteilhaft nur aus der natürlichen gentechnologisch veränderten Regulationsregion am 5'- und/oder 3'-Ende bestehen. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform kann die Expression jedoch auch gezielt reduziert oder blockiert werden.
Als Promotoren in der Expressionskassette sind grundsätzlich alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organismen vorteilhaft in Pflanzen oder Pilzen steuern können. Vorzugsweise verwendet man insbesondere ein pflanzliche Promotoren oder Promotoren, die aus einem Pflanzenvirus entstammen. Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q– T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression der Nukleinsäuresequenzen im erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt in den Organismen vorteilhaft in den Pflanzen zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der PRP1-Promotor [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366], ein durch Benzensulfonamidinduzierbarer ( EP 388186 ), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Abscisinsäureinduzierbarer ( EP 335528 ) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodienspezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.
In der Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäurekonstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um Biosynthesegene des Stoffwechsels wie Gene die an den Stoffwechselwegen der durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codierten Proteine beteiligt sind. Es können aber auch Biosynthesegene anderer Stoffwechselwege sein wie der Fettsäure-, der Aminosäure- oder der Vitaminbiosynthese oder Regulationsgene um nur einige zu nennen.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungsgemäße Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie unten beschrieben, verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteine codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche können vorteilhaft gegeneinander ausgetauscht werden.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, -primerrepair-, Restriktion oder Ligation verwendet werden.
Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, -chewing- back- oder Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u.a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder entsprechende funktionelle Äquivalente.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Nukleinsäuresequenz sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen beinhalten alle Sequenzmerkmale, die notwendig sind, um eine für den Ort der biologischen Wirkung bzw. Aktivität korrekte Lokalisation zu erreichen. Daher sind keine weiteren Targetingsequenzen per se notwendig. Allerdings kann eine solche Lokalisation wünschenswert und vorteilhaft sein und daher künstlich verändert oder verstärkt werden, so dass auch solche Fusionskonstrukte eine bevorzugte vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sind.
Vorteilhaft sind dafür beispielsweise Sequenzen, die ein Targeting in Plastiden gewährleisten. Unter bestimmten Umständen kann auch ein Targeting in andere Kompartimente (referiert: Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423) z.B. in in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER), Peroxisomen, Lipidkörper oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen ein Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, wünschenswert sein.
Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika-oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das β-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose- 6-Phosphat-Phosphatasegen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Weitere vorteilhafte Antibiotika- oder Herbizidresistenzen sind Resistenzen gegen z.B. Imidazolinon oder Sulfonylharnstoff; die Antibiotikaresistenzen gegen z.B. Bleomycin, Streptomycin, Kanamycin, Tetracyclin, Chlorampenicol, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin um nur einige zu nennen. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quantifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5'-Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteinen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation in Plastiden. Aber auch Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (= ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten sind bei Bedarf einsetzbar sowie Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor beispielsweise den 355-, 34S- oder eine Ubiquitin-Promotor, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Die Expressionskassette wird zur Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR-Serie wie z.B. pBR322, pUC-Serie wie pUC18 oder pUC19, M113mp-Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos, M.A. et al., [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] und von van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi] sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte Hefepromotoren sind beispielsweise 2 μM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEM-BLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, 5.71-119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium replizieren.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation. Umfasst sind funktionelle und nicht-funktionelle Vektoren.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäure konstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit oder ohne einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der verwendeten Nukleinsäuresequenzen und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts.
Beispielhaft kann das Nukleinsäurekonstrukt in den Tabak-Transformationsvektor pBinAR eingebaut werden und unter der Kontrolle des 35S-, 34S- oder Ubiquitin-Promotor oder des USP-Promotor stehen.
Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor) auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. durch Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.
Weitere vorteilhafte Vektoren enthalten in Pflanzen oder Pflanzenkulturen nutzbare Resistenzen wie die Phosphinotricin-(= bar-Resistenz), die Methioninsulfoximin-, die Sulfonylharnstoff- (= ilv-Resistenz, ind S. cerevisiae ilv2), die Phenoxyphenoxyherbizid- (= ACCase-Resistenz), die Glyphosate- oder Clearfieldresistenz (AHAS-Resistenz) bzw. die Gene, die für diese Resistenzen codieren. Diese Resistenzen sind in ganzen Pflanzen zur Selektion von transgenen Pflanzen nutzbar. Nur Pflanzen, die über eine Transformation, diese Resistenzen erhalten haben, können in Gegenwart der selektierenden Substanz wachsen. In Zellkulturen auf Agarplatten können nach Transformation in planta – beispielsweise Infiltration der Samenvorläuferzellen – auch beispielsweise Kanamycin oder Hygromycin als selektierendes Agenz verwendet werden. Darüber hinaus können vorteilhafte Vektoren Sequenzen für die Integration in das Genom der Organismen bevorzugt der Pflanzen enthalten. Beispiele für derartige Sequenzen sind die sog. T-DNA-Borders. Außerdem können vorteilhafte Vektoren noch Promotoren und Terminatoren, wie beispielsweise die oben beschriebenen, enthalten. Auch sogenannte PolyA-Sequenzen können im Vektor enthalten sein. Vorteilhafte Vektoren sind beispielsweise 1, 2 und 3 zu entnehmen. SEQ ID NO: 25 gibt die vorteilhafte Sequenz des Vektors pMTX 1a300 wieder. Dieser enthält eine Kanamycin-Resistenz (Nukleotid 4922-5713), eine Phosphinotricin-Resistenz (Nukleotid 6722-7288), das LacZalpha-Fragment (Nukleotid 7630-7864), einen Teil von pVS1sta (Nukleotid 945-1945), einen Teil von pBR322bom (Nukleotid 3948-4208), eine T-Border-Sequenz (links, Nukleotid 6138-6163), eine T-Border-Sequenz (rechts, Nukleotid 7924-7949), ein PolyA-Teil (Nukleotid 7292 – 7503), den mas2'1'-Promotor (Nukleotid 6241-6718) und zwei Replikations-Origins pVSlrep (Nukleotid 6241-6718) sowie pBR322ori (Nukleotid 43-4628).
In Prokaryoten verwendete Expressionsvektoren nutzen häufig induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteinen bzw Fusionsoligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C-terminal oder anderen nutzbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen in der Regel dazu: i.) die Expressionsrate der RNA zu erhöhen ii.) die erzielbare Proteinsytheserate zu erhöhen, iii.) die Löslichkeit des Proteins zu erhöhen, iv.) oder die Reinigung durch einen für die Affinitätschromatographie nutzbare Bindesequenz zu vereinfachen. Häufig werden auch proteolytische Spaltstellen über Fusionsproteine eingeführt, was die Abspaltung eines Teils des Fusionsproteins auch der Reinigung ermöglicht. Solche Erkennungssequenzen für Proteasen erkennen sind z.B. Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX [Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A.
Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] und pET Vektoren [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande].
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYep-Sec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES-Derivate (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39).
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispielsweise in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone – die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer vorteilhaft erfolgt der Gentransfer in der vorliegenden Erfindung mit beispielsweise dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV 3101 pMP90. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Im folgenden ist eine vorteilhafte Ausführungsform wiedergegeben. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, wird die einzuführende Nukleinsäure bzw. DNA in spezielle Plasmide cloniert, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EPA-0 120 516 ; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobakterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vergl. z.B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).)
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobacterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al, Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al; Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11,(1992) 76-80; May et al; Biotechnology 13 (1995) 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992) 550-555; Ritchie et al; Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al; Biotechnology 11 (1992), 667-674; Ritala et al, Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spencer et al, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631) die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen; die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z.B.
WO 95/06128; EP 0513849 A1 ; EP 0465875 A1 ; EP 0292435 A1 ; Fromm et al, Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al, Biotechnology 11(1993) 194-200; Moroc et al, Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben z.B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al, s.o.; Weizen (Nehra et al, Plant J. 5(1994) 285-297).
Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspezies verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Unter Pflanzen im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke zu verstehen.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren zu exprimieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Cyanobakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Beispielsweise seien Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume genannt. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch nicht-humane transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.
Bevorzugt sind transgene Pflanzen, die ein erfindungsgemäßes funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt oder einen erfindungsgemäßen funktionellen oder nicht funktionellen Vektor enthalten. Unter funktionell ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder im Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor exprimiert werden und ein biologisch aktives Genprodukt hergestellt wird. Unter nicht funktionell ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder im Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor nicht transcribiert, nicht exprimiert werden und/oder ein biologisch inaktives Genprodukt hergestellt wird. In diesem Sinne handelt es sich bei den sogenannten Antisense-RNAs auch um nicht funktionelle Nukleinsäuren bzw. bei Insertion in das Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor um ein nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt oder nicht funktionellen Vektor. Sowohl das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt als auch der erfindungsgemäße Vektor kann zur Herstellung von transgenen Organismen bevorzugt Pflanzen vorteilhaft verwendet werden.
Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Tansgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Gleiches gilt für das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor.
Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Verwendbare Expressionsstämme z.B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, z.B. der unter den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargelegten Nukleotidsequenzen zur Erstellung von genetisch veränderten Pflanzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie veränderte Proteine, der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 codierten Proteine enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind dass sie eine sehr viele geringere Interaktion mit dem Herbizid aufweisen bzw. in ihrer Aktivität nicht durch das Herbizid beeinträchtigt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21, deren aufgrund des degenerierten genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen sowie deren Derivate wurden aus einer Populationen transgener Pflanzen identifiziert, die zum einen dadurch gekennzeichnet war, dass sie mittels des Agrobacterium transformiert worden sind und im Rahmen dieses Prozesses neue DNA im Chromosomen an zufälliger Stelle integriert worden war. Durch Rückkreuzungen wurden schließlich Pflanzen isoliert, die die identifizierten Nukleinsäuren auf beiden homologen Chromosomen enthalten. Diese Pflanzen sind lethal, daher sterben sie entweder schon als Embryo oder aber als Keimling. Es konnten keine homozygoten Linien gewonnen werden. Darüber hinaus sind diese Pflanzen dadurch gekennzeichnet, dass sie im Verlauf des Screenings als für lethale Mutationen segregierende Linien identifiziert worden sind. Diese Pflanzen weisen als Ergebnis der homozygoten Situation der Integration der neuen DNA starke Behinderungen im Wachstum und oder Entwicklung auf. Es ist davon auszugehen, dass diese Wachstums- und Entwicklungsbehinderungen darauf zurückzuführen sind, dass die neu inserierte DNA in für Wachstum und Entwicklung wichtige Gene integriert hat, wodurch in der homozygoten Situation deren biologische Funktion eingeschränkt oder blockiert wird. Dieses bedeutet, dass diese Gene sowie deren aufgrund des degenerierten genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen sowie deren Derivate für Proteine codieren, welche in analoger Weise wie für die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 beschrieben, geeignete Zielproteine für neu zu entwickelnde Herbizide darstellen.
Zur Erzeugung veränderter Proteine werden in einer vorteilhaften Ausführungsform die genannten Nukleinsäuren überexprimiert und folgende Prozessschritte werden vorteilhaft durchlaufen:

a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 oder von einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt, oder von Derivaten oder Fragmenten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 %, 60 %, vorzugsweise 70 %, 80 %, 90 % oder mehr Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, codierten Proteine in einem heterologen System beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Bakterium der Gattung Escherichia wie E. coli XL1-Red oder in einem zellfreien System.
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion oder der biologischen Aktivität des veränderten Proteins mit dem Herbizid bzw. in Gegenwart des Herbizids,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion oder eine wenig beeinflusste biologische Aktivität aufweisen,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides.

Vorteilhaft erfolgt die Überführung des so erhaltenen veränderten Proteins bzw. der veränderten Nukleinsäure, z.B. der unter SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 aufgeführten Sequenzen sowie der weiteren oben beschriebenen erfindungsgemäßen Sequenzen, z.B. Derivate und Fragmente, z.B. von anderen Pflanzen, in einen Organismus vorteilhaft in eine Pflanze, bevorzugt pflanzliche Zellen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung veränderter Genprodukte, die von den hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Prozessschritte umfasst:

a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 codierten Proteine oder Derivate oder Fragmente, z.B. von anderen Pflanzen, davon in einem heterologen System oder in einem Zellfreiensystem
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid oder der biologischen Aktivität des veränderten Genprodukts in Gegenwart des Herbizids,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen oder in ihrer Aktivität weniger beeinflusst sind,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides,
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die oder deren Genprodukte eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid, vorzugsweise eine verringerte Hemmung durch das Herbizid oder geringere Interaktion mit dem Herbizid, aufweisen.

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren nach ausgewählten Sequenzen können vorteilhaft in einen Organismus eingebracht werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein nach diesem Verfahren hergestellter Organismus, bevorzugt ist der Organismus eine Pflanze. Das Verfahren eignet sich auch für die Genexpression der oben genannten biologisch aktiven Derivate und Fragmente.
Anschließend erfolgt die Regeneration ganzer Pflanzen und Überprüfung der Resistenz gegenüber dem Herbizid in intakten Pflanzen.
Veränderte Proteine und/oder Nukleinsäuren, die in Pflanzen Resistenz gegen Herbizide vermitteln können, können aus den hierin beschriebenen, erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere aus den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 oder deren Derivaten aus anderen Pflanzen auch über die sogenannte "site directed mutagenesis" hergestellt werden. Durch diese Mutagenese kann beispielsweise die Stabilität und/oder enzymatische Aktivität von Enzymen oder die Eigenschaften wie Bindung von niedermolekularen Verbindungen mit kleiner 1000 Molekulargewicht gezielt verändert und vorteilhaft verringert werden. Vorteilhaft sollte das Molekulargewicht der Verbindungen kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton sein, vorteilhaft mit einem Ki-Wert von kleiner 10^–7, vorteilhaft kleiner 10^–8, bevorzugt kleiner 10^–9 M, vorteilhaft sollte dabei diese Hemmwirkung auf ein spezifische Hemmung des biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine zurückzuführen sein, das heißt es sollte keine Hemmung durch diese niedermolekularen Substanzen weiterer nahe verwandter Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine erfolgen. Weiterhin sollten die niedermolekulare Substanzen vorteilhaft ein Molekulargewicht von größer 50 Dalton, bevorzugt größer 100 Dalton, besonders bevorzugt größer 150 Dalton, ganz besonders bevorzugt größer 200 Dalton haben. Vorteilhaft sollten die niedermolekularen Substanzen weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring haben. Weiterhin sollten auch keine freie(n) Säure- oder Lacton-Gruppe(n) sowie keine Phosphatgruppe und nicht mehr als eine Aminogruppe im Molekül enthalten sein. Auch Basen wie Adenosin im Molekül sind weniger bevorzugt. Auch die Stabilität und/oder enzymatische Aktivität von Enzymen oder die Eigenschaften wie Bindung von Proteinen oder Antisense-RNA kann so sehr gezielt verbessern bzw. verändert werden.
Weiterhin können Veränderungen über die von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3, 1993: 777-78) beschriebenen PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese erzielt werden oder durch die von Rellos et al. (Protein Expr. Purif., 5, 1994: 270-277) weiter verbessert Methode.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung dieser veränderten Proteine und/oder von Nukleinsäuren ist eine von Stemmer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 1994: 10747-10751) beschriebene "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution oder die von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14, 1996: 458-467) beschriebene Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode.
Ein weiterer Weg zur Mutagenese von Nukleinsäuren bzw. Proteinen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (Vol. 57, 1996: 375-385) beschrieben. In EP-A-O 909 821 wird eine Methode zur Veränderung von Proteinen unter Verwendung des Mikroorganismus E. coli XL-1 Red beschrieben. Dieser Mikroorganismus erzeugt bei der Replikation Mutationen in den eingeführten Nukleinsäuren und führt so zu einer Veränderung der genetischen Information. Über Isolierung der veränderten Nukleinsäuren bzw. der veränderten Proteine und Testung auf Resistenz lassen sich leicht vorteilhafte Nukleinsäuren und die durch sie codierten Proteine und umgekehrt identifizieren. Diese können dann nach Einbringen in Pflanzen dort die Resistenz ausprägen und so zur Resistenz gegen die Herbizide führen.
Weitere Methoden der Mutagenese und Selektion sind beispielsweise Methoden wie die in vivo Mutagenese von Samen oder Pollen und Selektion resistenter Allele in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Inhibitoren, gefolgt von genetischer und molekularer Identifizierung des veränderten, resistenten Allels. Weiterhin die Mutagenese und Selektion von Resistenzen in der Zellkultur durch Vermehrung der Kultur in Anwesenheit von sukzessiv steigenden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Dabei kann die Erhöhung der spontanen Mutationsrate durch chemische/physikalische mutagene Behandlung ausgenutzt werden. Wie vorgehend beschrieben lassen sich auch mit Mikroorgansimen, die eine endogene oder rekombinante Aktivität der durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codierten Proteine haben, und die gegenüber den erfindungsgemäß identifizierten Inhibitoren sensitiv sind, veränderte Gene isolieren. Die Anzucht der Mikroorgansimen auf Medien mit steigenden Konzentrationen von erfindungsgemäßen Inhibitoren erlaubt die Selektion und Evolution von resistenten Varianten der erfindungsgemäßen Targets. Die Frequenz der Mutationen kann wiederum durch mutagenen Behandlungen erhöht werden.
Daneben stehen Verfahren zur gezielten Veränderungen von Nukleinsäuren zur Verfügung (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, 8768-8773 und Beethem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 96, 8774-8778). Diese Methoden ermöglichen es, in den Proteinen solche Aminosäuren, die für die Bindung von Inhibitoren von Bedeutung sind, durch funktionell äquivalente Aminosäuren zu ersetzen, die jedoch die Bindung des Inhibitors verhindern.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist weiterhin ein Verfahren zur Erstellung von Nukleotidsequenzen welche für Genprodukte codieren, die eine veränderte biologische Aktivität aufweisen, wobei die biologische Aktivität dahingegen verändert wurde, dass eine erhöhte Aktivität vorliegt. Unter erhöhter Aktivität ist eine gegenüber dem Ausgangsorganismus bzw. gegenüber dem Ausgangsgenprodukt um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 30 %, besonders bevorzugt um mindestens 50 % oder 70 %, ganze besonders bevorzugt um mindestens 100 % höhere Aktivität zu verstehen. Weiterhin kann die biologische Aktivität dahingegen verändert worden sein, dass die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel nicht mehr oder nicht mehr richtig an die Nukleinsäuresequenzen und/oder die durch sie codierten Genprodukte binden. Unter nicht mehr oder nicht mehr richtig ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die Substanzen um mindestens 30 %, bevorzugt mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 80 % oder gar nicht mehr an die veränderten Nukleinsäuren und/oder Genprodukte im Vergleich zum Ausgangsgenprodukt oder den Ausgangsnukleinsäuren binden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine nach dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren genetisch veränderte transgene Pflanze.
Genetisch veränderten transgene Pflanzen, die gegen die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen und/oder Mittel enthaltend diese Substanzen resistent sind, können auch durch Überexpression der in den erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 erzeugt werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden wurden, resistent sind, dadurch gekennzeichnet, dass in diesen Pflanzen erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit einer der beschriebenen biologischen Aktivität, insbesondere mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 überexprimiert werden. Ein ähnliches Verfahren wird beispielhaft in Lermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75-83 beschrieben. Natürlich können auch die hierin genannten Derivate und Fragmente, z.B. aus anderen Pflanzen, verwendet werden, die die gewünschte Aktivität aufweisen.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung resistenter Pflanzen ermöglichen die Entwicklung neuer Herbizide, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung aufweisen (sog. Totalherbizide), in Kombination mit der Entwicklung von gegenüber dem Totalherbizid resistenten Nutzpflanzen. Gegenüber Totalherbiziden resistente Nutzpflanzen sind bereits verschiedentlich beschrieben worden. Dabei können mehrere Prinzipien zur Erzielung einer Resistenz unterschieden werden:

a) Resistenzerzeugung in einer Pflanze über Mutationsverfahren oder gentechnische Verfahren, indem das als Zielort für das Herbizid dienende Protein deutlich überproduziert wird und indem auf Grund des großen Überschusses des als Zielort für das Herbizid dienende Protein, die von diesem Protein in der Zelle ausgeübte Funktion auch nach Applikation des Herbizides beibehalten wird.
b) Veränderung der Pflanze dahingehend, dass eine modifizierte Version des als Zielort des Herbizid fungierenden Proteins eingeführt wird und dass das neu eingeführte modifizierte Protein vom Herbizid nicht in seiner Funktion beeinträchtigt wird.
c) Veränderung der Pflanze dahingehend, dass ein neues Protein/ eine neue RNA eingeführt wird, welche s) dadurch gekennzeichnet ist, dass die für die herbizide Wirkung der niedermolekularen Substanz verantwortliche chemische Struktur des Proteins oder der Nukleinsäure, wie der RNA oder der DNA, so verändert wird, dass durch die veränderte Struktur keine herbizide Wirkung mehr entfaltet werden kann, oder das Herbizid in der veränderten Pflanze inaktiviert oder modifiziert wird, z.B. abgebaut wird, nicht aufgenommen oder nicht transportiert wird oder in die Vakuole transportiert wird, etc., d.h. die Interaktion des Herbizids mit dem Zielort nicht mehr erfolgen kann.
d) dass die Funktion des Targets durch eine neue in die Pflanze eingebrachte Nukleinsäure, z.B. ein Gen ersetzt wird, wobei die Nukleinsäure für ein Genprodukt codiert, das geringer oder gar nicht von der herbiziden Substanz in seiner Funktion getrennt wird. So kann z.B. ein sogenannter "alternativer Pathway" geschaffen werden.
e) dass die Funktion des Targets durch ein anderes in der Pflanze vorhandenes oder in die Pflanze eingebrachtes Gen bzw. dessen Genprodukt übernommen wird.

Die vorliegende Erfindung umfasst daher weiterhin die Verwendung von Pflanzen, die durch die T-DNA Insertion getroffene Gene mit den in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 oder die weiteren genannten Sequenzen, z.B. Fragmente und Derivate, z.B. aus anderen Pflanzen, enthalten, zur Entwicklung von neuen Herbiziden. Dem Fachmann sind alternative Verfahren zur Identifizierung von homologen Nukleinsäuren beispielsweise in anderen Pflanzen mit ähnlichen Sequenzen wie unter Verwendung von Transposons, bekannt. Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch die Verwendung von alternativen Insertionsmutageneseverfahren zur Insertion von fremder Nukleinsäure in die hierin beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 in von diesen Sequenzen aufgrund des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen und/oder deren Derivate oder Fragmente z.B. aus anderen Pflanzen..
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb wie oben beschrieben Substanzen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanz ein Verbindungen vorteilhaft eine niedermolekulare Verbindung ist mit kleiner 1000 Molekulargewicht, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, vorteilhaft mit einem Ki-Wert von kleiner 10^–7, vorteilhaft kleiner 10^–8, bevorzugt kleiner 10^–9 M, vorteilhaft sollte dabei diese Hemmwirkung auf ein spezifische Hemmung des biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine zurück zuführen sein, das heißt es sollte keine Hemmung durch diese niedermolekularen Substanzen weiterer nahe verwandter Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine erfolgen. Weiterhin sollten die niedermolekulare Substanzen vorteilhaft ein Molekulargewicht von größer 50 Dalton, bevorzugt größer 100 Dalton, besonders bevorzugt größer 150 Dalton, ganz besonders bevorzugt größer 200 Dalton haben. Vorteilhaft sollten die niedermolekularen Substanzen weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring haben. Weiterhin sollten auch keine freie(n) Säure- oder Lacton-Gruppe(n) sowie keine Phosphatgruppe und nicht mehr als eine Aminogruppe im Molekül enthalten sein. Auch Basen wie Adenosin im Molekül sind weniger bevorzugt. Bei den Substanzen kann es sich auch vorteilhaft um eine proteinogene Substanz wie einem Antikörper oder um eine Antisense-RNA handelt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind Substanzen, die nach den erfindungsgemäßen oben beschriebenen Verfahren identifiziert wurden und wobei es sich bei den Substanzen um einen Antikörper gegen das durch die Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 codierte Protein oder Derivate oder Fragmente davon handelt.
Die Antikörper können auch mehrere der genannten Sequenzen binden, solange die Bindung spezifisch ist, d.h. nach den oben genannten Verfahren identifiziert oder getestet werden können.
Diese Substanzen zeichnen sich vorteilhaft durch ihre herbizide Wirkung, die mit den oben beschriebenen Verfahren identifizierbar sind.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind Mittel, enthaltend eine herbizid wirksame Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren oder eines Antagonisten identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
Eine weitere Ausführungsform sind Mittel, enthaltend eine das Wachstum regulierende Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren oder eines Antagonisten identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
Diese erfindungsgemäßen Substanzen oder Mittel mit ihrer herbiziden Wirkung können als Defoliants, Desiccants, Krautabtötungsmittel und insbesondere als Unkrautvernichtungsmittel verwendet werden. Unter Unkraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind. Ob die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen bzw. Wirkstoffe als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt unter anderem von der angewandten Menge, ihrer Selektivität und weiteren Faktoren ab. Die Substanzen können beispielsweise gegen folgende Unkräuter verwendet werden:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen:
Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen:
Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen bzw. sie enthaltende Mittel vorteilhaft noch in einer weiteren Zahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung unerwünschter Pflanzen eingesetzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctorius, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineensis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgare, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N. rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylestre, Ricinus communis, Saccharum officinarum, Secale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgare), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen können vorteilhaft auch in Kulturen verwandt werden, die durch Züchtung einschließlich gentechnischer Methoden gegen die Wirkung von Herbiziden tolerant sind.
Die erfindungsgemäßen Substanzen bzw. die sie enthaltenden herbiziden Mittel können beispielsweise in Form von direkt versprühbaren wässrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wässrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen oder Dispersionen, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken; sie sollten in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe gewährleisten.
Als inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe kommen flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z.B. Amine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser in Frage.
Weitere vorteilhafte Anwendungsformen der erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel sind wässrige Anwendungsformen wie Emulsionskonzentrate, Suspensionen, Pasten, netzbaren Pulvern oder wasserdispergierbaren Granulaten, die beispielsweise durch Zusatz von Wasser bereitet werden können. Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder Öldispersionen können die Substanzen und/oder Mittel die sog. Substrate als solche oder in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst, mittels Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel in Wasser homogenisiert werden. Es können aber auch aus wirksamer Substanz, Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel und eventuell Lösungsmittel oder Öl bestehende Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind.
Als oberflächenaktive Stoffe kommen die Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z.B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglykolether, Alkylarylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalkoholethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Laurylalkoholpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfitablaugen oder Methylcellulose in Betracht.
Pulver-, Streu- und Stäubemittel können als feste Trägerstoffe vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermahlen der wirksamen Substanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden.
Granulate, z.B. Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der Wirkstoffe an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nussschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe.
Die Konzentrationen der erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel in den anwendungsfertigen Zubereitungen können in weiten Bereichen variiert werden. Die Formulierungen enthalten im allgemeinen 0,001 bis 98 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 95 Gew.-%, mindestens eines Wirkstoffs. Die Wirkstoffe werden dabei in einer Reinheit von 90 % bis 100 %, vorzugsweise 95 % bis 100 % (nach NMR-Spektrum) eingesetzt.
Die Applikation der herbiziden Mittel bzw. der Substanzen kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind die Wirkstoffe für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Ausbringungstechniken angewandt werden, bei welchen die herbiziden Mittel oder Substanzen mit Hilfe der Spritzgeräte so gespritzt werden, dass die Blätter der empfindlichen Kulturpflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die Wirkstoffe auf die Blätter darunter wachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen (post-directed, lay-by).
Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums und zur Erzielung synergistischer Effekte können die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel mit zahlreichen Vertretern anderer herbizider oder wachstumsregulierender Wirkstoffgruppen gemischt und gemeinsam ausgebracht werden. Beispielsweise kommen als Mischungspartner 1,2,4-Thiadiazole, 1,3,4-Thiadiazole, Amide, Aminophosphorsäure und deren Derivate, Aminotriazole, Anilide, (Het)-Aryloxyalkansäure und deren Derivate, Benzoesäure und deren Derivate, Benzothiadiazinone, 2-Aroyl-1,3-cyclohexandione, Hetaryl-Aryl-Ketone, Benzylisoxazolidinone, Meta-CF3-phenylderivate, Carbamate, Chinolinsäure und deren Derivate, Chloracetanilide, Cyclohexan-1,3-dionderivate, Diazine, Dichlorpropionsäure und deren Derivate, Dihydrobenzofurane, Dihydrofuran-3-one, Dinitroaniline, Dinitrophenole, Diphenylether, Dipyridyle, Halogencarbonsäuren und deren Derivate, Harnstoffe, 3-Phenyluracile, Imidazole, Imidazolinone, N-Phenyl-3,4,5,6-tetrahydrophthalimide, Oxadiazole, Oxirane, Phenole, Aryloxy- oder Heteroaryloxyphenoxypropionsäureester, Phenylessigsäure und deren Derivate, Phenylpropionsäure und deren Derivate, Pyrazole, Phenylpyrazole, Pyridazine, Pyridincarbonsäure und deren Derivate, Pyrimidylether, Sulfonamide, Sulfonylharnstoffe, Triazine, Triazinone, Triazolinone, Triazolcarboxamide, Uracile in Betracht.
Außerdem kann es von Nutzen sein, die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel allein oder in Kombination mit anderen Herbiziden auch noch mit weiteren Pflanzenschutzmitteln gemischt, gemeinsam auszubringen, beispielsweise mit Mitteln zur Bekämpfung von Schädlingen oder phytopathogenen Pilzen bzw. Bakterien. Von Interesse ist ferner die Mischbarkeit mit Mineralsalzlösungen, welche zur Behebung von Ernährungs- und Spurenelementmängeln eingesetzt werden. Es können auch nichtphytotoxische Öle und Ölkonzentrate zugesetzt werden.
Die Aufwandmengen an Wirkstoff (= Substanzen und/oder Mittel) betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0,001 bis 3,0, vorzugsweise 0,01 bis 1,0 kg/ha aktive Substanz.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist die Verwendung einer Substanz identifiziert nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren oder Mittel enthaltend diese Substanzen als Herbizid oder zur Wachstumsregulierung von Pflanzen.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Kit, umfassend das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt, der erfindungsgemäßen Substanzen, z.B. den erfindungsgemäßen Antikörper, das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül und/oder einen Antagonisten und/oder eine herbizide Substanz identifiziert gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren sowie die unten beschriebene Zusammensetzung.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist eine Zusammensetzung, enthaltend die erfindungsgemäße Substanz, den erfindungsgemäßen Antikörper, das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäurekonstrukt und/oder einen erfindungsgemäßen Antagonisten und/oder eine erfindungsgemäße Substanz identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten.
Beispiele
a) Molekularbiologische Methoden
Molekularbiologische Methoden wie sie hier eingesetzt wurden entsprechen dem Stand der Technik und sind an verschiedenen Stellen, wie bspw. Sambrock et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Reiter et al., Methods in Arabidopsis Research, World Sientific Press (1992), Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998) und Martinez-Zapater und Salinas, Methods in Molecular Biology, Vol. 82: Arabidopsis Protocols eds., Humana Press Inc., Totowa, NJ. Diese Referenzen beschreiben die gängigen Standardmethoden für die Produktion, Identifizierung und Klonierung von durch T-DNA-Insertionen hervorgerufenen Mutanten. Zusätzlich wurde für die Identifizierung von Insertionsstellen auf eine weitere gängige Methode, wie sie u.a. von Spertini et al., Biotechniques 27: 308-314 (1999) beschrieben wurde, zurückgegriffen. Die Sequenzierungen erfolgten durch die Firma DNA LandMarks Inc., Quebec, Kanada.
b) Material
Die verwendeten Chemikalien wurden, wenn im Text nicht gesondert angegeben, in p.A.-Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deideshofen) bezogen. Lösungen wurden unter Verwendung von reinem pyrogenfreiem Wasser, das mit einer Ionenaustauschanlage der Firma (TKA, Niederelbert) hergestellt wurde. Restriktionsnukleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits und Oligonukleotide wurden bezogen von den Firmen Amersham Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Dynal (Hamburg), Gibco-BRL (Gaithersburg, MD., USA), Invitrogen (Groningen, Niederlande), MBI Fermentas (St. Leon Rot), New England Biolabs (Schwalbach, Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Qiagen (Hilden), Roche Diagnostics (Mannheim), Stratagene (Amsterdam, Niederlande), TIB-Molbiol (Berlin). Falls nicht anders beschrieben wurden die Produkte nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1: Herstellung einer KO-Population und Identifizierung von Linien, die für lethale Mutation segregieren
Ausgehend von dem Grundgerüst der pPZP-Vektoren [Hajukiewicz, P. et al., (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol. Biol. 25, 989-994], wurde ein modifizierter binärer Vektor konstruiert, welcher das Kanamycin-Resistenzgen für die Selektion in Bakterien enthielt. Zwischen der linken und der rechten T-DNA-Border befand sich nur eine Selektionskassette, bestehend aus dem Resistenz Gen für die Clearfieldresistenz (Imidazolinon- bzw. AHAS-Resistenz) unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors mas1' (Velten et al., 1984, EMBO J. 3, 2723-2730; Mengiste, Amedeo and Paszkowski, 1997, Plant J., 12, 945-948.). Alternativ können anderen Resistenzgene wie die Hebizidresistenzgene wie die Phosphinotricin-(= bar-Resistenz), die Methioninsulfoximin-, die Sulfonylharnstoff- (= ilv-Resistenz, ind S. cerevisiae ilv2) oder die Phenoxyphenoxyherbizidresistenzgene (= ACCase-Resistenz) oder Antibiotikaresistenzgene verwendet werden. Auch sind dem Fachmann anderen konstitutive Promotoren bekannt, die anstelle des verwendeten mas1'-Promotors verwendet werden können wie der 34S-, der 35S- oder der Ubiquitin-Promotor aus Petersilie. Dem Fachmann sind die verschiedenen für die Transformation von Arabi dopsis mittels Agrobakterium verwendbaren Vektoren bekannt. Eine detaillierte Beschreibung der einsetzbaren Vektoren und Agrobakterienstämme findet man in Hellens et al., (Trends in Plant Science, 2000, Vol 5, 446-451). Die Plasmide wurden mittels eines Hitze-Schock Protokolls in Agrobakterien hier in den Agrobacterium tumefaciens Stamms GV3101pMP90 (Koncz and Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204:383-396) transfomiert. Transformierte Kolonien der Baktierien wurden auf YEP-Medium, welche die entsprechenden Antibiotika enthielten, für 2 Tage bei 28°C angezogen. Diese Agrobakterien wurden dann für die Transformationen einer großen Zahl an Arabidopsis-Pflanzen des Ökotyps C24 (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK ; NASC Stock N906) eingesetzt, wobei nach einer modifizierten Version der „in-planta" Transformationsmethode (Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. 1993. In planta Agrobakterium mediated gene transfer by infiltration of Arabidopsis thaliana plants, C.R. Acad. Sci. Paris. 316:1194-1199; Clough, JC and Bent, AF. 1998 Floral dip: a simplified method for Agrobakterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J.. 16:735-743) verfahren wurde. Transformierte Pflanzen wurden mittels des Selektionsagenz, gegen welches das auf der T-DNA codierte Resistenzgen eine Resistenz vermittelt, selektiert.
Von diesen transformierten Pflanzen wurden ca. 100 bis 200 Samen (T2) auf Agarplatten mit Selektionsagenz ausgelegt. Diese Platten wurden für 2 Tage bei 4°C stratefiziert und für ca. 7 bis 10 Tage bei 20°C und Dauerlicht inkubiert. Anschließend wurde die Zahl an gegenüber dem Selektionsagenz resistenten und sensitiven Keimlingen bestimmt. Zudem wurden gegebenenfalls die Zahl an nicht pigmentierten Pflanzen (Albinos) bestimmt. Diese ließen sich auf Grund ihrer Farbe eindeutig von den sensitiven Keimlingen unterscheiden. Es wurden nur solche Linien weiter untersucht, die offensichtlich für einen Insertionsort segregierten, das heißt in denen ungefähr ein Drittel bis zu einem Viertel der Pflanzen eine Sensitivität gegenüber der Selektion zeigten und in denen eine sehr enge Kopplung, das heißt, dass eine Cosegregation zwischen der die Resistenz vermittelnde T-DNA und der den Phänotyp erzeugenden Mutation gefunden wurde. Eine solche sehr enge Kopplung zwischen der T-DNA und der Mutation lag vor, wenn ein Zahlenverhältnis von 2:1 zwischen resistenten und sensitiven Keimlingen gefunden wurde. Dieses von einer normalen 3:1 Spaltung für einen Insertionsort abweichende Zahlenverhältnis kommt nur vor, wenn die homozygot resistenten Pflanzen quantitativ fehlen, weil sie entweder schon als Embryo sterben bzw. sich nicht entwickeln oder aber weil sie einen Albinophänotyp ausprägen. Demnach ist es sehr wahrscheinlich, dass die Insertion der T-DNA an dem jeweiligen Ort im Genom die Ursache für die embryonallethale bzw. die Albinomutation darstellt. Entsprechend kann das essentielle Gen durch Bestimmung des Insertionsort und des dort vorhandenen Gens identifiziert werden.
Beispiel 2: Molekulare Analyse von Linien mit embryo- oder albinolethalem Phänotyp
Von den ausgewählten Linien, die für eine albinolethale oder embryolethale Mutation segregierten und für die eine Cosegregation zwischen T-DNA und Mutation bestimmt wurde, wurde aus ca. 50 mg Blattmaterial genomische DNA mittels Standardverfahren (entweder Säulen der Firma Qiagen, Hilden, Germany oder Phytopure Kit der Firma Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) isoliert. Die Amplifikation der Insertionsstelle der T-DNA erfolgte durch eine modifizierte Version der Adaptor-PCR-Methode wie sie von Spertini D, Béliveau C. and Bellemare, 1999, Biotechniques, 27, 308-314 publiziert worden ist. Etwa jeweils 50 bis 100 ng der genomischen DNA wurden parallel mit den Restriktionsenzymen MunI, Bg1II, BspI (= Bsp119I), PspI (= Psp1406I) und SpeI verdaut und mit einem Adaptor ligiert, der aus den annealten Oligos 5'CTAA-TACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGGGCAGGT-3' und 5'NN_(2-4)ACCTGCCCAA-3' bestand, wobei 5'NN_(2-4) den zum jeweiligen Enzym passenden Überhang repräsentierten. Ein μl dieser mit Adaptoren versehenen genomischen DNA wurde für eine Amplifikation der zu den T-DNAs flankierend liegenden Sequenzen unter Verwendung eines adaptorspezifischen (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3') und jeweils eines genspezifischen Primers für jede Border eingesetzt. Dem Fachmann ist bekannt, wie man genspezifische Primer für die T-DNA, welche zur Pflanzentransformation verwendet wurde, designt und synthetisiert. Die PCR wurde unter Standardbedingungen für 7 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 72°C und für 32 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 65°C in 25 μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Das erhaltene Amplifikat wurde 1:50 in H₂O verdünnt und ein μl dieser Verdünnung für eine zweite Amplifikationsrunde (5 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 67°C und 28 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 60°C) eingesetzt. Hierzu wurden „eingerückte" daher auf dem PCR-Produkt weiter innenliegende Primer eingesetzt, wodurch die Spezifität und Selektivität der Amplifikation erhöht wurde. Von dem in 50 μl Reaktionsvolumen erhaltenen Amplifikaten wurde ein Aliquot einer gelelektrophoretischen Analyse unterzogen. Es wurden jeweils ein oder mehrere spezifische PCR-Produkte für die linke und/oder die rechte T-DNA erhalten. Die Produkte wurden mittels Standardmethoden (Firma Qiagen, Hilden) gereinigt und mit Hilfe weiterer T-DNA-spezifischer Primer sequenziert. Durch einen Blast-Vergleich (BLASTN, Altschul, et al., 1990, J Mol. Biol. 215:403-410) der isolierten Sequenz mit der publizierten Genomsequenzen von Arabidopsis (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000, Nature, 408:796-815) wurde jeweils die Insertionsstelle der T-DNA im Genom bestimmt. Da diese Sequenzen in annotierten Form in verschiedenen Datenbanken, die dem Fachmann bekannt sind, zur Verfügung stehen, konnten auch die jeweils inaktivierten ORFs bestimmt werden. Die erfolgreiche Identifizierung eines inaktivierten ORFS wurde durch eine PCR-Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA spezifischen Primer verifiziert. Der Erhalt des PCR-Produkts der erwarteten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA.
Beispiel 3: Identifizierung und Analyse der Linie 303317 die für eine lethale Mutation segregiert
Die Linie 303317 wurde wie oben beschrieben (Beispiele 1 und 2) als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25 % der Nachkommen den Albinophänotyp, 25 % der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50 % der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge den Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Die Kopplung wurde weiterhin in einer Cosegregationsanalyse überprüft. Dazu wurden von 40 wildtypischen, resistenten Pflanzen der Linie 303317 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nachkommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand lässt den Schluss zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit) übereinstimmen. Die molekularbiologische Analyse wurde wie für Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für die Linie 303317 wurde für das Enzym MunI ein 1400 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Der Erhalt des PCR-Produkts der vorhergesagten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenz (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Mol. Biol. 215:403-410) demonstrierte die Insertion der T-DNA in Position 6628 des BAC-Klons ATF2809 mit der Accession Number AL137080. Nach der Annotation dieses Bereichs ist die Integration in einen ORF (F2809.40, SEQ ID NO: 1) erfolgt, der Ähnlichkeit zum "Translation Releasing Factor" RF-2 aus Synechocystis sp. (PIR:S76448) hat. Weiterhin besitzt das Protein (SEQ ID NO: 2) eine araC-Familiensignatur. Die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle und des inaktivierten ORFs wurde durch eine PCR- Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierende Sequenz und einem für die T-DNA-spezifischen Primer verifiziert.
Beispiel 5: Identifizierung und Analyse der Linien 304149, 120701, 126548, 127023, 127235, 218031, 171042, KO_T3_02-33338-3, KO_T3_02-33885-2 und KO_T3-02-35172-2, die für eine lethale Mutation segregieren
Analog den vorgenannten Beispielen 1 bis 4 wurden die Klone 304149, 120701, 126548, 127023, 127235, 218031, 171042, KO_T3_02-33338-3, KO_T3_02-33885-2 und KO_T3-02-35172-2, als Linien identifiziert, die für embryo- oder keimlingslethale Mutationen segregieren. Die Aufspaltung erfolgt bei allen Linien wie unter Beispiel 3 beschrieben. Die molekularbiologischen Arbeiten bzw. Analysen wurden wie unter Beispiel 1 bis 4 beschrieben durchgeführt.
Die Linie 304149 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 304149 wurde für das Enzym MunI ein 750 bp-großes Fragment, für die Enzyme Psp1406I/Bsp119I ein 300 bp-großes Fragment und für das Enzym SpeI ein 950 bp großes Fragment jeweils für die linke T-DNA-Border identifiziert. Für die rechte T-DNA-Border wurde mit dem Enzym SpeI ein 300 bp großes Fragment identifiziert. Die Sequenzierung dieser Fragmente offenbarte den gleichen Insertionsort. Die T-DNA ist auf Chromosom 5 in Position 35398 des P1-K1ons MSH12, Accession AB006704 inseriert. Durch die Insertion 110 bp stromaufwärts vom Startcodon des ORFs MSH12.9 wird höchstwahrscheinlich die Transkription unterbunden bzw. die Transkriptstabilität verringert und damit die Funktionalität des ORFs verringert oder vollständig zerstört. Dieser ORF MSH12.9 codiert für ein Kobalamin-Synthese-Protein.
Die Linie 120701 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 120701 wurde für das Enzym BglII ein 500 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 4 in Position 55170 des Bac-Klons ATT25K17, Acession AL049171 inseriert. Durch die Insertion innerhalb des codierende Bereichs wir der ORF T25K17.110 unterbrochen und damit inaktiviert. Dieser ORF T25K17.110 codiert für eine Arginyl-tRNA-Synthetase Dieser ORF beinhaltet den EST: gb:AA404880, T76307.
Die Linie 126548 segregiert für eine embryolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 126548 wurde für die Enzyme Psp1406I/Bsp119I ein 1000 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Für die rechte T-DNA-Border wurden mit den Enzymen Psp1406I/ Bsp119I ein 900 bp-großes Fragment und mit dem Enzym BglII ein 300 bp-großes Fragment identifiziert. Die Sequenzierung aller PCR-Produkte demonstrierte die Insertion der T-DNA am gleichen genomischen Ort. Die T-DNA ist auf Chromsom 4 in Position 36872 des Bac-Klons ATF17A8, Acession AL049482 inseriert. Durch die Insertion innerhalb des codierende Bereichs wir der ORF F17A8.80 unterbrochen und damit inaktiviert. Dieser ORF F17A8.80 codiert für putatives Protein mit Ähnlichkeit zu einer RNA-Helicase aus Maus (Mus musculus), PIR2:I84741.
Die Linie 127023 segregiert für eine embryolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 127023 wurde für das Enzym BglII ein 350 bp-großes Fragment und für die Enzyme Psp1406I/Bsp119I ein 900 bp-großes Fragment jeweils für die linke T-DNA-Border identifiziert. Beide Fragmente identifizierten nach der Sequenzierung den identischen Insertionsort. Die T-DNA ist auf Chromsom 4 in Position 61403 des BAC-Klons ATT19P19, Acession AL022605 inseriert. Durch diese Insertion wird der ORF AT4g39780 unterbrochen und damit inaktiviert. Dieser ORF AT4g39780 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zum dem die AP2-Domäne enthaltenden Protein RAP 2.4 aus Arabidopsis thaliana. Zudem beinhaltet dieser ORF die ESTs gb:T46584 und AA394543.
Die Linie 127235 segregiert für eine embryolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 127235 wurde für das Enzym MunI ein 1600 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Für die rechte T-DNA-Border wurde mit dem Enzym Bg1II eine 600 bp-großes Fragment identifiziert. Beide Fragmente identifizierten nach der Sequenzierung den identischen Insertionsort. Die T-DNA ist auf Chromsom 1 in Position 10776 des BAC-Klons F9K20, Accession AC005679 inseriert. Durch diese Insertion wird der ORF F9K20.4 unterbrochen und damit inaktiviert. Dieser ORF F9K20.4 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu dem gi|1786244 hypothetischen 24.9 kD Protein in der surA-hepA intergenischen Region yab0 des Escherichia coli Genoms gb|AE000116, und zu dem hypothetischen Protein der YABO Familie PF|00849. Weiterhin besitzt das durch den ORF F9K20.4 codierte Protein eine konservierte Pseudouridylat-Synthase-Domäne, welche an der Modifizierung von Uracil in RNA-Molelkülen beteiligt ist. Demnach zeigt der ORF F9K20.4 im blastp-Vergleich unter Standardbedingungen signifikante Homologie zu verschiedenen Pseudouridylat-Synthasen.
Die Linie 218031 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 218031 wurde für das Enzym Bg1II ein 400 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert und dieses anschließend sequenziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 2 in Position 11909 des Klons F3G5 mit der Accession AC005896 inseriert. Durch die Insertion im codierenden Bereich wir der ORF At2g37250 inaktiviert. Dieser ORF codiert für eine putative Adenylatkinase.
Die Linie 171042 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 171042 wurde für die Enzyme Psp1406I/Bsp119I ein 1600 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert und dieses anschließend sequenziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 3 in Position 97005 des Bac-Klons T29H11 mit der Accession AL049659 inseriert. Durch die Insertion im codierenden Bereich wir der ORF T29H11 270 inaktiviert. Dieser ORF T29H11 270 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu dem pol Polyprotein des equine infectious anemia virus (PIR:GNLJEV).
Die Linie KO_T3_02-33338-3 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO_T3_02-33338-3 wurde für das Enzym MunI ein 624 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert und dieses anschließend sequenziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 5 in Position 39500 des P1-Klons MJE7 mit der Accession AB020745 inseriert. Durch die Insertion 64 Basenpaare stromabwärts vom Stop-Codon des ORFs MEJ7.11 wird vermutlich das Transkript dieses ORFs verändert und damit die Transkriptstabilität reduziert. Demnach ist von einer reduzierten oder gänzlich blockierten Genfunktion für diesen ORF auszugehen. Der ORF MEF7.11 codiert für ein unbekanntes Protein.
Die Linie KO_T3_02-33885-2 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO_T3_02-33885-2 wurde für die Enzyme Psp1406I/Bsp119I ein 450 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Für die rechte T-DNA-Border wurde mit den Enzymen Psp1406I/Bsp119I ein 650 bp-großes Fragment identifiziert. Beide Fragmente identifizierten nach der Sequenzierung den identischen Insertionsort. Die T-DNA ist auf Chromsom 1 in Position 76356 des Bac-Klons F14G9 mit der Accession AC069159 inseriert. Durch die Insertion im codierenden Bereich des ORFs F14G9.26 wird dieser ORF in dieser Linien inaktiviert. Der ORF F14G9.26 codiert für ein unbekanntes Protein.
Die Linie KO_T3_02-35172-2 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO_T3_02-35172-2 wurde für das Enzym MunI ein 700 bp-großes Fragment für die rechte T-DNA-Border identifiziert und dieses anschließend sequenziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 5 in Position 24422 des P1-K1ons MAB16 mit der Accession AB018112 inseriert. Durch diese Insertion 87bp stromaufwärts des ORFs MAB16.6 wird die Transkription dieses ORFs höchstwahrscheinlich blockiert und damit das Gen ausgeschaltet. Der ORF MAB16.6 codiert für ein Protein, welches nur Homologie zu anderen unbekannten Proteinen zeigt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass: a) die Expression oder die Aktivität des Genprodukts einer Nukleinsäure oder eines Gens umfassend: aa) Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz; bb) Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt; cc) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60 % Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist; dd) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen; ee) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21 dargestellten Sequenz codiert wird; ff) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert und das eine "Translation Releasing Factor"-Aktivität, eine Kobalamin-Synthese-Aktivität, Arginyl-tRNA-Synthase-Aktivität, eine RNA-Helicase-Aktivität, eine GTP-Bindeprotein-Aktivität, eine Pseudouridylat-Synthase-Aktivität oder eine Adenylatkinase-Aktivität hat; und/oder gg) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 oder SEQ ID NO: 22 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20 % Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder b) die Expression oder Aktivität einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz nach aa) bis gg) codiert wird, beeinflusst wird und solche Substanzen ausgewählt werden, die die Expression oder die Aktivität reduzieren oder blockieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Expression oder die Aktivität der Nukleinsäure oder des Proteins dadurch reduziert oder blockiert wird, dass die a) Transcription, b) Translation, c) Prozessierung und/oder d) Modifikation der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz in Anspruch 1 reduziert oder blockiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aktivität der Nukleinsäure oder des Proteins durch eine niedermolekulare Substanz reduziert oder blockiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High-Throughput-Screening (HTS) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die ausgewählten Substanzen auf eine Pflanze verbringt, um die herbizide Aktivität der Substanzen zu testen und die Substanzen auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem Organismus durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Organismus Bakterien, Hefen, Pilze oder Pflanzen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus verwendet wird, der eine konditionale oder natürliche Mutante einer der in Anspruch 1 beschriebenen Sequenzen ist.
Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, dargestellt in Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Substanz ein Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton und größer 50 Dalton und einen Ki-Wert kleiner 10^–7 M hat.
Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz oder um eine Antisense-RNA handelt.
Substanz nach Anspruch 11, wobei es sich um einen Antikörper gegen das durch eine der in Anspruch 9 dargestellten Sequenz codiertes Protein handelt.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, wobei im Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten sind.
Vektor enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 9 oder 13.
Organismus enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 9 oder 13 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 14.
Organismus nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, einen Mikroorganismus oder ein nicht humanes Tier handelt.
Transgene Pflanze enthaltend ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 9 oder 13 oder einen Vektor gemäß Anspruch 14.
Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 9 oder 13 oder eines Vektors gemäß Anspruche 14 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten von Proteinen, die durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 9 oder 13 codiert werden indem folgende Verfahrensschritte durchlaufen werden i) Inkontaktbringen von Zellen, die das Protein exprimieren, oder des Proteins mit einem Kandidatenstoff; ii) Testen der biologischen Aktivität des Protein; iii) Vergleichen der biologischen Aktivität des Proteins mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei eine Verringerung der biologischen Aktivität des Proteins anzeigt, dass der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man den nach Anspruch 19 Buchstabe iii) identifizierten Antagonisten auf eine Pflanze verbringt, um seine herbizide Aktivität zu testen und die Antagonisten auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.
Verfahren zur Bekämpfung unerwünschten Pflanzenwuchses, dadurch gekennzeichnet, dass man eine herbizid wirksame Menge einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 8 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 auf Pflanzen oder deren Lebensraum oder auf Pflanzen und deren Lebensraum einwirken lässt.
Verwendung einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 als Herbizid oder zur Wachstumsregulierung von Pflanzen.
Verfahren zur Erzeugung veränderter Genprodukte, die von den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21, deren Derivate oder Fragmente gemäß Anspruch 1 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Prozessschritte umfasst: a) Expression der von den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 oder SEQ ID NO: 21, deren Derivate oder Fragmente gemäß Anspruch 1 codierten Proteine in einem heterologen System oder in einem Zellfreien System b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure, c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid oder der biologischen Aktivität des veränderten Genproduktes in Gegenwart des Herbizids, d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen oder in ihrer Aktivität weniger beeinflusst sind, e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides, f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die oder deren Genprodukte eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die gemäß Anspruch 23 f) ausgewählten Sequenzen in einen Organismus eingebracht werden.
Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen gefunden nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 resistent sind, dadurch gekennzeichnet, dass in diesen Pflanzen Nukleinsäuren mit den in Anspruch 1 beschriebenen Sequenzen überexprimiert werden.
Organismus hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 25.
Mittel, enthaltend eine herbizid wirksame Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
Mittel, enthaltend eine das Wachstum regulierende Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
Zusammensetzung, enthaltend die Substanz nach einem der Ansprüche 10 bis 12 oder einen Antagonisten identifiziert gemäß Anspruch 19.
Kit, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9 oder 13, die Substanz nach einem der Ansprüche 10 bis 12, einen Antagonisten identifiziert gemäß Anspruch 19 oder 20 die Zusammensetzung nach Anspruch 29.