EP1530640A2 - Verfahren zur identifizierung von substanzen mit herbizider wirkung - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von substanzen mit herbizider wirkung

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Publication number
EP1530640A2
EP1530640A2 EP03793655A EP03793655A EP1530640A2 EP 1530640 A2 EP1530640 A2 EP 1530640A2 EP 03793655 A EP03793655 A EP 03793655A EP 03793655 A EP03793655 A EP 03793655A EP 1530640 A2 EP1530640 A2 EP 1530640A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
activity
nucleic acid
protein
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03793655A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gunnar Plesch
Astrid Blau
Klaus DÄSCHNER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Metabolome Solutions GmbH
Original Assignee
Metanomics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Metanomics GmbH filed Critical Metanomics GmbH
Publication of EP1530640A2 publication Critical patent/EP1530640A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying compounds with herbicidal activity.
  • the invention further relates to nucleic acid constructs, vectors containing the nucleic acid constructs, transgenic organisms and their use.
  • the present invention relates to substances that have been identified by the aforementioned method.
  • New herbicides should be characterized by the broadest possible range of activity, ecological and toxicological harmlessness and low application rates.
  • SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51;
  • SEQ ID NO: 2 Codes from the by back-translating the SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO: 34,
  • SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 amino acid sequences shown can be derived;
  • cc nucleic acid sequence which is a derivative or a fragment of the in
  • dd nucleic acid sequence which is suitable for derivatives or fragments of the polypeptides with those in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
  • SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 encoded amino acid sequences shown that have at least 50% homology at the amino acid level;
  • nucleic acid sequence which codes for a fragment or an epitope of a polypeptide which specifically binds to an antibody, the antibody specifically binding to a polypeptide which is derived from that described in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15,
  • SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51
  • Nucleic acid encodes and a "translation releasing factor" activity, a kobalamin synthesis activity, arginyl tRNA synthase activity, a
  • RNA helicase activity a GTP binding protein activity, a pseudo uridylate synthase activity, an adenylate kinase activity a preprotein-translocase secA precursor protein activity, a DCL protein activity, an arginine tRNA ligase activity, plastid gluthathione reductase activity, transcription factor sigma activity, calmudulin
  • SEQ ID NO: 34 encoded amino acid sequences shown, which has at least 20% homology at the amino acid level and has an equivalent biological activity; or
  • “Expression” is understood to mean the new synthesis in vitro and in vivo of nucleic acids and proteins encoded by nucleic acids, in particular that of the abovementioned nucleic acid and amino acid sequences.
  • expression encompasses all biosynthetic steps leading up to the mature protein or its degradation, e.g. Transcription, translation, modification or processing of nucleic acids and / or proteins, e.g. pre- or post-transcriptional processing steps or post-translational modifications, e.g. Splicing, editing, polyadenation, capping, modifications of amino acids, e.g. Glycosylation, methylation, acetylation, binding of coenzymes, phosphorylation, ubiquitation, binding of fatty acids, signal peptide processing, etc.
  • transcription means RNA synthesis with the aid of an RNA polymerase in the 5 "'3' direction using a DNA template.
  • RNA for example a catalytic RNA such as a ribozyme, a functional RNA such as tRNAs or rRNAs, or a coding RNA such as mRNA.
  • a protein is synthesized, which is also understood as a "gene product”.
  • Proteins can undergo various processing steps during and after translation. be thrown as enumerated above as an example.
  • Activity of the gene product is the biological activity or function of an RNA or a protein, such as, for example, the enzymatic activity, the transporter activity, the regulatory activity, the receptor binding property, the ability to bind certain proteins, nucleic acids or metabolites, for example in protein complexes
  • the regulatory property or the transporter function of the protein or the RNA to name just a few, how it naturally occurs in the organism.
  • Reduction of the activity of the gene product is a reduction in the biological activity compared to the natural activity of the gene product of at least 10%, advantageously at least 20% or 30%, preferably at least 40%, 50% or 60%, particularly preferably by at least 70 %, 80% or 90% and very particularly preferably to understand at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • Blocking the activity of the gene product means the complete, that is, 100% inhibition of the activity or the partial blocking of the activity, preferably an at least 80% or 90%, particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94% or 95%, very particularly preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99% blocking of the biological activity.
  • the activity of the gene product can also be reduced indirectly, e.g. in which the formation or activity of interaction partners is inhibited, e.g. in which the metabolic chain in which the gene product is integrated is influenced.
  • the metabolic chain in which the gene product is integrated is influenced.
  • Such reductions by indirectly influencing the activity of an enzyme are e.g. for the interaction of the glycolysis proteins and metabolites has been described in detail and is easily transferable to other metabolic pathways in which the gene products described herein play a role.
  • a gene product used according to the invention can be reduced or inhibited in its activity, in which the activity of interaction partners, e.g. other proteins in a protein complex or in a substrate transport chain is reduced or inhibited with the gene product described herein.
  • interaction partners e.g. other proteins in a protein complex or in a substrate transport chain
  • the gene product described herein can lead to the fact that the entire complex or the substrate transport is no longer activated or does not or only partially arises or functions or can no longer be regulated. Examples of such influencing of the activity are e.g. described for spliceosomes, polymerases, ribosomes etc.
  • “Fragment” is understood to mean a partial sequence of a sequence described here which comprises fewer nucleotides or amino acids than that described here sequences.
  • a fragment can comprise, for example, 1%, 5%, 10%, 30%, 50%, 70%, 90% of the original sequence.
  • a fragment preferably comprises 100, more preferably 50, even more preferably less than 20 amino acids of the corresponding nucleic acids.
  • One embodiment thus relates to a method according to the invention, the expression or the activity of the nucleic acids or amino acids mentioned being reduced or blocked by reducing or blocking the transcription, translation, processing and / or modification of at least one of the nucleic acid sequence or amino acid sequence according to the invention.
  • one, two, three or more sequences can be reduced or blocked in their activity.
  • the method according to the invention can be carried out in individual separate method approaches or advantageously in a high-throughput screening (HTS) and can be used to identify substances with herbicidal activity or antagonists.
  • HTS high-throughput screening
  • substances can also advantageously be identified that interact with the above-mentioned nucleic acids or with their gene products. These substances are potential herbicides, the effects of which can be further improved via classic chemical synthesis.
  • Substances identified or selected by the method can advantageously be placed on a plant in order to test the herbicidal activity of the substances. Those substances are selected which show herbicidal activity.
  • the substances can also be identified in an in vitro test in addition to the aforementioned in vivo test method.
  • Such an in vitro test with the nucleic acids according to the invention or their gene products has the advantage that the substances can be quickly and easily screened for their biological effect. Such tests are also advantageous for the so-called HTS.
  • the method can be carried out with free nucleic acids such as DNA or RNA, free gene products or advantageously in an organism, the organism being eukaryotic or prokaryotic organisms such as advantageously gram-negative or gram-positive bacteria, yeasts, fungi or advantageously plants such as monocotyledonous or dicotyledonous plants be used.
  • free nucleic acids such as DNA or RNA
  • free gene products or advantageously in an organism, the organism being eukaryotic or prokaryotic organisms such as advantageously gram-negative or gram-positive bacteria, yeasts, fungi or advantageously plants such as monocotyledonous or dicotyledonous plants be used.
  • conditional or natural mutants which contain the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51.
  • Conditional mutants are to be understood as mutants which have a reduction in expression, for example transcription or translation, of the aforementioned nucleic acids or of the gene products encoded by them only after induction.
  • An example of such conditional mutants are mutants in which the nucleic acids lie behind a temperature-sensitive promoter that is no longer functional at higher temperatures, that is to say that prevents transcription at higher temperatures, for example above 37 ° C.
  • Expression regulation by an effector molecule is also possible, for example when the expression is controlled by a regulatable promoter, such as that in Tet systems (Gatz et al., Plant J.
  • Another embodiment according to the invention is a method for identifying an antagonist of proteins, which is selected by a nucleic acid sequence as used in the method according to the invention, in particular selected from the group:
  • SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47,
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
  • SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 derived amino acid sequences
  • nucleic acid sequence which is a derivative or a fragment of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37,
  • SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 is the nucleic acid sequences shown, and at least 60 % Has homology at the nucleic acid level;
  • SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 encoded amino acid sequences shown that have at least 50% homology at the amino acid level;
  • nucleic acid sequence which codes for a fragment or an epitope of a polypeptide which specifically binds to an antibody, the antibody specifically binding to a polypeptide which the one in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:
  • Nucleic acid sequence which is coded for a fragment of a nucleic acid shown in aa) and which has a "translation releasing factor" activity, a kobalamin synthesis activity, arginyl tRNA synthase activity, an RNA helicase activity, a GTP binding protein activity, a pseudouridylate synthase activity, an adenylate kinase activity, an adenylate kinase activity, a preprotein translocase secA precursor protein activity, a DCL protein activity, an arginine tRNA ligase activity,
  • nucleic acid sequence which is suitable for derivatives of the polypeptides with the in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12,
  • SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 encoded amino acid sequences shown, which has at least 20% homology at the amino acid level and has an equivalent biological activity; or
  • the testing of one of the biological activities described above is described, for example an enzyme activity as stated in the examples or a bond, preferably a strong bond between protein and candidate substance.
  • the antagonist (s) identified under letter iii) is / are placed on a plant in order to test his / her herbicidal activity and the antagonist (s) are selected which show herbicidal activity.
  • the method according to the invention can be carried out in separate separate method approaches in vivo or in vitro and / or advantageously together or particularly advantageously in a high-throughput screening and can be used to identify substances with herbicidal activity or antagonists.
  • the nucleic acid sequences identified or selected in the method according to the invention are essential for the growth and development of higher plants.
  • this inhibitory effect should advantageously be due to a specific inhibition of the biological activity of the nucleic acids according to the invention and / or of the proteins coded by these nucleic acids, i.e. there should be no inhibition by these low molecular weight substances of other closely related nucleic acids and / or by this Proteins encoded nucleic acids are made.
  • the low molecular weight substances should advantageously have a molecular weight of greater than 50 daltons, preferably greater than 100 daltons, particularly preferably greater than 150 daltons, very particularly preferably greater than 200 daltons.
  • the low molecular weight substances should advantageously have fewer than three hydroxyl groups on a ring containing carbon atoms.
  • nucleic acids SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 , SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 are essential for organisms, preferably for plants.
  • the gene products of the sequences mentioned are, for example, the polypeptides of the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52.
  • SEQ ID NO: 1 the expression of which is blocked in line 303317, codes for a protein (F2809.40) which is similar to translation releasing factor RF-2 from Synechocystis sp. (PIR: S76448) and that is located on chromosome 3 (BAC ATF2809, Accession AL137080) from Arabidopsis.
  • the protein also has the araC family signature.
  • SEQ ID NO: 3 the expression of which is blocked in line 304149, codes for a "cobalt amine synthesis" protein (MSH 12.9) which is located on chromosome 5 (P1 clone MSH12, Accession AB006704) from Arabidopsis.
  • SEQ ID NO: 5 the expression of which is blocked in line 120701, codes for an ORF (T25K17.110) on chromosome 4 (BAC ATT25K17, Accession AL049171), which possibly codes for an arginyl tRNA synthetase.
  • This ORF includes the EST: gb: AA404880, T76307.
  • SEQ ID NO: 7 whose expression is blocked in line 126548 and is located on chromosome 4 of the Arabidopsis genome (BAC ATF17A8, Accession AL049482), encoded for a putative protein (F17A8.80) with similarity to a mouse RNA helicase ( Mus musculus, PIR2: I84741).
  • a putative protein (AT4g39780), which is located on chromosome 4 (BAC ATT19P19, Accession number AL022605) and which is homologous to the AP2 domain, is encoded by SEQ ID NO: 9, the expression of which is blocked in line 127023 containing protein RAP 2.4 from Arabidopsis thaliana.
  • ORF also includes ESTs gb: T46584 and AA394543.
  • ORF F9K20.4 which is located on chromosome 1 (BAC F9K20, Accession AC005679) from Arabidopsis.
  • This ORF F9K20.4 codes for a putative protein similar to gill 786244, a hypothetical 24.9 kD protein in the surA-hepA intergenic region yabO of the Escherichia coli genome and to gblAE000116 a hypothetical protein of the YABO family PFI00849.
  • the protein encoded by ORF F9K20.4 has a conserved pseudouridylate synthase domain, which is involved in the modification of uracil in RNA molecules. Accordingly, the ORF F9K20.4 shows significant homology to various pseudouridylate synthases in a blastp comparison under standard conditions.
  • SEQ ID NO: 13 the expression of which is blocked in line 218031, codes for a putative adenylate kinase (At2g37250).
  • the ORF At2g37250 is located on chromosome 2 of the clone F3G5 (Accession AC005896) from Arabidopsis.
  • the putative protein (ORF T29H11_270, Accession AL049659) encoded by SEQ ID NO: 15, the expression of which is blocked in line 171042, shows similarity to the pol polyprotein of the "Equine Infectious Anemia Virus (PIR: GNLJEV).
  • PIR Equine Infectious Anemia Virus
  • the sequence is located on chromosome 3 of Arabidopsis BAC clone T29H11.
  • SEQ ID NO: 17 whose expression is blocked in line KO_T3_02-33338-3, is located on chromosome 5 of the P1 clone MJE7 (Accession AB020745).
  • the sequence encodes ORF MEJ7.11.
  • ORF MEJ7.11 is an unknown protein.
  • the ORF is located on chromosome 1 of the BAC clone F14G8 with the accession AC069159.
  • the ORF MAB16.6 only has homologies to other unknown proteins.
  • the sequence is located on chromosome 5 of the P1 clone MAB16 with the accession AB018112.
  • SEQ ID NO: 23 the expression of which is blocked in line 305861, codes for a
  • Preprotein Translocase secA Precursor protein, therefore for a chloroplast SecA protein for protein transport across the thylakoid membrane.
  • This ORF finds with the Accession T7B11.6, AC007138, on the BAC clone T7B11 of chromosome 4.
  • This ORF with the accession T5N23.20 is annotated on the BAC clone T5N23, accession number AL138650 on chromosome 3.
  • This ORF with the accession F22O13.2 is annotated on the BAC clone T22O13, accession number AC003981, on chromosome 1.
  • This ORF with the accession At2g15680 is annotated on the BAC clone F9O13 with the accession number AC006248 on chromosome 2.
  • This ORF with the accession F28O9.140 is annotated on BAC clone F28O9, accession number AL137080, on chromosome 3.
  • This ORF with the Accesion F28O9.150 is located on the BAC clone F28O9, Accession Number AL137080, on chromosome 3.
  • This ORF with the accession MKN22.2 is located on the BAC clone MKN22, accession number AB019234 of chromosome 5.
  • This ORF with accession MEE6.19 is annotated on chromosome 5 on BAC clone MEE6, accession number AB010072.
  • This ORF with the accession At2g26150 is located on the BAC clone T19L18, accession number AC004747, on chromosome 2 ..
  • This ORF At2g28030 is annotated on BAC clone T1 E2, accession number AC006929, on chromosome 2 ..
  • This ORF with the accession AT4g08990 is annotated on chromosome 4 on the BAC clone ATCHRIV25, accession number AL161513.
  • This ORF with the accesion F12B17_70 is located on the BAC clone F12B17, accession number AL353995, on chromosome 5. The sequences mentioned were all identified in Arabidopsis.
  • recombinant organisms advantageously transgenic plants, plant tissues such as tissues of, for example, leaf, root, shoot or stem, plant seeds, plant calli or plant cells which contain the sequences described in accordance with the invention, in particular SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,
  • SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 or derivatives or fragments thereof which have the biological activity of these sequences, functionally express them;
  • Organisms and non-recombinant starting organisms with a different, preferably lower expression or activity level of the gene product;
  • Chemical compounds which reduce the biological activity, the growth or the vitality of the organisms are to be understood as compounds which reduce the biological activity, the growth or the vitality of the organisms by at least 10%, 20% or 30%, advantageously by at least 40 %, 50% or 60%, preferably by at least 70%, 80 or 90%, particularly preferably by at least 91%. 92%, 93%, 94% or 95%, most preferably inhibit by at least 96%, 97%, 98% or 99%, i.e. reduce or block.
  • Particularly advantageous is a substance that damages or, preferably, is lethal to the cell lines with low activity, but does not damage or is lethal to cell lines that have a higher activity of the gene product.
  • lines of organisms can be used in the method mentioned which express the sequences according to the invention and in particular the gene products which are encoded by nucleic acids according to the invention, but which are not recombinant, as long as one line has a higher gene expression or activity of the gene product than another Line.
  • Such lines can of course occur or be generated by mutagenesis.
  • Assay systems which suppress the identification of substances which suppress the formation of the gene products and / or the functions exercised by the gene products or the activity of the gene products in intact plants, plant parts, plant tissues or plant cells are known to the person skilled in the art. Examples here are test systems for the inhibition of enzymes such as adenylate kinase as described by Skoblov et al.
  • test systems can, for example, advantageously be used for so-called inhibition assays for, for example, the gene product identified in line 218031.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the translational or rotational diffusion and changes in the conformation of the molecules can be tracked and analyzed using a correlation. Binding to other substances changes the diffusion coefficient of the molecules. With the help of various algorithms, the binding of the molecules can be determined or quantified by changing the diffusion coefficient.
  • This method can be used to measure advantageously in a wide concentration range. The method is advantageously suitable for the measurement of recombinant proteins, which are advantageously provided with a so-called His tag for easier purification on commercially available chromatography columns (Porath et al., Nature 1975, 258, 598-599). The protein purified in this way is finally treated with a fluorescent marker such as e.g.
  • Carboxytetramethylrhodamine or BODIPY® (e.g. BODIPY 576/589 Angiotensin II, NEN® Life Science Products, Boston, MA, USA).
  • the compound or substance to be examined is then added to the protein in excess.
  • the diffusion of the protein labeled in this way is finally determined using an FCS system (e.g. ConfoCor2 with LSM 510, Carl Zeiss microscope, Jena, Germany).
  • SELDI Protein-Chip® surface enhanced laser desorption ionization
  • Hutchens and Yip (1980) Hutchens and Yip (1980).
  • the ligand-protein binding can be analyzed by mass spectrometry.
  • recombinantly expressed proteins can also be expressed and purified as described above.
  • the protein is immobilized on the SELDI ProteinChips®, for example via the
  • the ligands are then placed on this chip prepared in this way using, for example, an autosampler. After one or more washing steps with buffers of different ionic strength, the bound ligands are analyzed with the LDI laser. The binding strength of the ligands is determined after each washing step.
  • Biacore so-called Biacore method
  • SPR so-called plasma resonance
  • the refractive index change which is determined for a change in the mass concentration at the surface, is the same for all proteins or polypeptides, that is to say this method can be used advantageously for a wide variety of proteins.
  • recombinantly expressed proteins are also advantageously used here, which are bound to the Biacore chip (Upsala, Sweden), for example via histidine residues (e.g. His-Tag).
  • the chip thus produced is again connected to the ligands, e.g. with an autosampler and binding via a detection system sold by Biacore using the SPR signal i.e. measured by changing the refractive index.
  • substances that are particularly specific with e.g. bind a protein or protein fragment which is encoded by a nucleic acid, the expression of which is essential for the growth of the plants can be isolated using the methods mentioned.
  • This enables a simplified identification of possible inhibitors, the proteins, e.g. inhibit in their enzyme properties, binding properties or other activities, e.g. also by inhibiting their processing, as described above, or preventing their transport within the cell or import and export from organelles or cells.
  • the substances identified in this way can also be applied to plants in a further step in screening processes, as are known to the person skilled in the art, and their influence on growth and development can be examined.
  • a selection is made from the infinite number of chemical compounds that would be suitable for a screening process, which makes it considerably easier for the person skilled in the art to identify herbicidal substances.
  • Specific binding means the specificity of interactions between two partners, for example proteins with one another or between protein (enzyme) and substrate (substrate specificity). It is based on a certain molecular spatial structure. If it is destroyed, one speaks of denaturation, which is often irreversible and as a result of which the specificity can usually be lost. This biological activity is strongly dependent on the environmental conditions (buffer, temperature, contacts to non-physiological surfaces such as glass or missing cofactors). With enzyme substrate or cofactor, with receptor ligand or with antibody-antigen bonds one speaks of specific bonds. The enzyme-substrate interaction is described thermodynamically in the simplest case using the Michaelis-Menten equation.
  • a unit U corresponds to the amount of enzyme that catalyzes the conversion of one micromole of substrate per minute under precisely defined test conditions.
  • the specific activity is usually given in U / mg.
  • the identified substances can then be applied to plants, microorganisms or cells, for example to plant cells, and the influence on the metabolism of these plants can then be observed, for example enzyme activities, photosynthetic activities, metabolic activity, fixation rate, gas exchange, DNA synthesis, growth rates.
  • the invention furthermore relates to a method for identifying inhibitors of plant proteins which are encoded by the nucleic acid sequences used in the method according to the invention and which have a potentially herbicidal action by cloning the gene products and overexpressing the cells in a suitable expression cassette, for example in insect cells opens and uses the cell extract directly or after enrichment or isolation of the protein in a test system for measuring biological activity in the presence of low molecular weight chemical compounds.
  • the invention therefore furthermore relates to substances identified by the processes according to the invention, the substances advantageously having low molecular weight substances with a molecular weight of less than 1000 daltons, advantageously less than 900 daltons, preferably less than 800, particularly preferably less than 700, very particularly preferably less than 600 daltons with a Ki value of less than 10 "7 , advantageously less than 10 " 8 , preferably less than 10 '9 M, this inhibitory effect should advantageously be attributed to a specific inhibition of the biological activity of the nucleic acids according to the invention and / or of the proteins coded by these nucleic acids , that is, there should be no inhibition by these low molecular weight substances of other closely related nucleic acids and / or the proteins encoded by these nucleic acids.
  • the preferred low molecular weight substances should advantageously have a molecular weight of greater than 50 daltons, preferably greater than 100 daltons, particularly preferably greater than 150 daltons, very particularly preferably greater than 200 daltons.
  • the low molecular weight substances should advantageously have fewer than three hydroxyl groups on a ring containing carbon atoms.
  • no free acid or lactone group (s), no phosphate group and no more than one amino group should be contained in the molecule.
  • Bases such as adenosine in the molecule are also less preferred.
  • the substance is a proteinogenic substance, an antisense RNA, an inhibitory or an interfering RNA (RNAi).
  • the term "sense” refers to the strand of double-stranded DNA that is homologous to the mRNA transcript.
  • the "antisense” strand contains an inverted sequence that is complementary to that of the "sense” strand.
  • An antisense nucleic acid molecule comprises, for example, a nuclide sequence which is complementary to the "sense” nucleic acid molecule which encodes a protein or an active RNA, for example complementary to the coding strand of a double-stranded cDNA molecule or complementary to an mRNA sequence. Consequently, an antisense nucleic acid molecule can form hydrogen bonds to a sense nucleic acid molecule.
  • the antisense nucleic acid molecule can be complementary to any coding strand shown here, or only a part thereof.
  • the term "coding region” refers to the region of a nucleic acid sequence whose codons are translated into amino acids.
  • the antisense nucleic acid molecule can also be complementary to “non-coding regions” of the coding strand of the nucleic acid molecules shown.
  • non-coding region refers to 5 'and 3' sequences which flank the coding region and which are not translated into a polypeptide (eg also referred to as 5 1 - and 3 'non-translated regions)
  • the nucleic acid molecule which comprises an antisense sequence can also comprise further elements which are important for the expression and stability of the molecule, for example capping structures, poly A-tails etc.
  • the antisense nucleic acid molecule can be complementary to the entire coding region of an mRNA, but it can also be an oligonucleotide which is complementary to only a part of the coding or non-coding region of the mRNA.
  • an antisense oligonucleotide can be complementary to the region that encompasses or surrounds the translation start of the mRNA.
  • An antisense oligonucleotide can advantageously be, for example, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides long.
  • An antisense nucleic acid molecule can be produced by chemical synthesis and enzymatic ligation according to methods known to the person skilled in the art.
  • An anti-sense nucleic acid molecule can be chemically synthesized using from naturally occurring nucleotides or nucleotides modified in various ways, so that the biological stability of the molecules is increased or the physical stability of the duplex, which forms between the antisense and sense nucleic acid, is increased, for example phosphorothioate derivatives and acridine-substituted nucleotides be used.
  • modified nucleotides that can be used for the production of antisense nucleic acids include 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthines, xanthines, 4-acetylcytosines, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5 -Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridines, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosyl-queosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine , 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosine,
  • antisense nucleic acid molecules can be biologically produced using expression vectors into which polynucleotides have been cloned whose orientation is opposite (so that RNA transcribed from the inserted polynucleotide is in an antisense orientation to a target polynucleotide as described above).
  • the antisense nucleic acid molecule can also be an " ⁇ -anomeric" nucleic acid molecule.
  • An " ⁇ -anomeric" nucleic acid molecule forms specific double-stranded hybrids with complementary RNAs, in which, in contrast to conventional ⁇ -units, the strands run parallel to one another.
  • the antisense nucleic acid molecule can include 2-0 methyl ribonucleotides or chimeric RNA-DNA analogs.
  • the antisense nucleic acid molecule can be a ribozyme.
  • Ribozymes are catalytic RNA molecules with ribonuclease activity that are capable of cutting single-stranded nucleic acids, such as mRNA, to which they have a complementary region. Ribozymes (eg hammerhead ribozymes) can be used to catalytically or non-catalytically cut the mRNA of the sequences described herein and thus to prevent translation of the mRNA.
  • a ribozyme which is specific to one of the nucleic acid sequences mentioned here can be constructed on the basis of the cDNA sequences shown here or on the basis of heterologous sequences which are identified by the methods described here can be.
  • a derivative of the Tetrahymena L-19 IVSRNA can be produced in that the nucleotide sequence of the active region is complementary to the nucleotide sequence which is cut in a coding mRNA.
  • one of the coding or non-coding sequences described herein or an mRNA thereof can also be used to select a catalytic RNA from a pool of RNAs (see, for example, Bartel, 1993, Science, 261, 1411).
  • nucleotide sequences which are complementary to a regulatory region of the nucleic acid sequences described here form a triple-helical structure which prevents transcription of the following gene (for example Helene, 1991 , Anticance-Drug Des. 6, 596; Helene, 1992, Ann. NY Acad. Sci. 660, 27, or Mower, 1992, Bioassays, 14, 807.
  • the procedures and methods described in the quotations are expressly referred to. Efficient gene suppression can also be shown in the case of transient expression or after transient transformation, for example as a result of a biolistic transformation (Schweizer P et al.
  • dsRNAi methods are based on the phenomenon that the simultaneous introduction of complementary strand and counter strand of a gene transcript results in highly efficient suppression of the expression of the corresponding gene.
  • the phenotype caused is very similar to that of a corresponding knock-out mutant (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95: 13959-64).
  • the dsRNAi method can advantageously be used to reduce the expression of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51, their derivatives and fragments can be used.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ
  • the invention therefore also relates to double-stranded RNA molecules (dsRNA molecules) which, when introduced into an organism, advantageously a plant (or a cell, tissue, organ or seed derived therefrom).
  • dsRNA molecules double-stranded RNA molecules
  • the double-stranded RNA molecule for reducing the expression of a protein which is represented by the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52, is characterized in that
  • one of the two RNA strands is essentially identical to at least part of a nucleic acid sequence with the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27,
  • SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51, and
  • the other RNA strand is essentially identical to at least part of the complementary strand of one of the nucleic acid sequences mentioned under (i).
  • dsRNA sequence also contains insertions, deletions and individual point mutations in comparison to the target sequence (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51) and nevertheless bring about an efficient reduction in expression.
  • the homology according to the above definition is preferably at least 75%, preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90%, most preferably 100% between the “sense” strand of an inhibitory dsRNA and a portion of a nucleic acid sequence with the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 (or between the "antisense” strand the complementary strand of a nucleic acid
  • the length of the section is at least 10 bases, preferably at least 25 bases, particularly preferably at least 50 bases, very particularly preferably at least 100 bases, most preferably at least 200 bases or at least 300 bases.
  • an "essentially identical" dsRNA can also be defined as a nucleic acid sequence which is capable of carrying out part of a gene transcript of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO:
  • the dsRNA can consist of one or more strands of polymerized ribonucleotides.
  • modifications of both the sugar-phosphate structure and the nucleosides For example, the phosphodiester bonds of natural RNA can be modified to include at least one nitrogen or sulfur heteroatom.
  • Bases can be modified so that the activity is restricted, for example, by adenosine deaminase. Such and other modifications are described below in the methods for stabilizing antisense RNA.
  • the dsRNA can be produced enzymatically or completely or partially chemically-synthetically.
  • the double-stranded structure can be formed from a single, self-complementary strand or from two complementary strands.
  • the “sense” and “antisense” sequence can be linked by a connecting sequence (“linker”) and, for example, form a hairpin structure.
  • the connecting sequence can preferably be an intron which is spliced out after synthesis of the dsRNA.
  • the nucleic acid sequence coding for a dsRNA can contain further elements, such as, for example, transcription termination signals or polyadenylation signals. If the two strands of the dsRNA are advantageously brought together in a cell or an organism of a plant, this can be done in different ways:
  • Strand includes.
  • the formation of the RNA duplex can be initiated either outside the cell or inside it.
  • the dsRNA can also comprise a hairpin structure in that the “sense” and “antisense” strand are connected by a “linker” (for example an intron).
  • linker for example an intron.
  • the self-complementary dsRNA structures are preferred since they only require the expression of a construct and always comprise the complementary strands in an equimolar ratio.
  • the expression cassettes coding for the "antisense” or “sense” strand of a dsRNA or for the self-complementary strand of the dsRNA are preferably inserted into a vector and stable in the genome of one using the methods described below (for example using selection markers) Plant inserted to ensure permanent expression of the dsRNA.
  • the dsRNA can be introduced using an amount that allows at least one copy per cell. Larger quantities (e.g. at least 5, 10, 100, 500 or 1000 copies per cell) can possibly result in an efficient reduction.
  • dsRNA and a gene transcript of the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 , SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 are not absolutely necessary in order to bring about an efficient reduction in
  • the method is tolerant of sequence deviations, such as may arise as a result of genetic mutations, polymorphisms or evolutionary divergences.
  • the dsRNA which, starting from the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 of one organism was generated to suppress the expression of the sequences in another organism.
  • SEQ ID NO: 1 The high sequence homology between the sequences from different organisms suggests a high degree of conservation of these proteins within, for example, plants, so that the expression of a dsRNA derived from one of the disclosed sequences according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 , SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 also have an advantageous effect in other plant species likely.
  • the dsRNA can be synthesized either in vivo or in vitro.
  • a DNA sequence coding for a dsRNA can be brought into an expression cassette under the control of at least one genetic control element (such as promoter, enhancer, silencer, splice donor or acceptor, polyadenylation signal).
  • at least one genetic control element such as promoter, enhancer, silencer, splice donor or acceptor, polyadenylation signal.
  • a dsRNA can be synthesized chemically or enzymatically.
  • Cellular RNA polymerases or bacteriophage RNA polymerases (such as T3, T7 or SP6 RNA polymerase) can be used for this purpose.
  • Appropriate procedures for in vitro Expression of RNA are described (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693).
  • a chemically or enzymatically synthesized in vitro dsRNA can be wholly or partially purified from the reaction mixture, for example by extraction, precipitation, electrophoresis, chromatography or combinations of these methods, before being introduced into a cell, tissue or organism.
  • the dsRNA can be introduced directly into the cell or it can also be applied extracellularly (eg into the interstitial space).
  • Antibodies include, for example, single-chain polyclonal, monoclonal, human or humanized or recombinant antibodies or fragments thereof
  • Antibodies according to the invention or their fragments are in principle to be understood as meaning all immunoglobulin classes such as IgM, IgG, IgD, IgE, IgA or their subclasses such as the subclasses of the IgG or their mixtures.
  • IgG and its subclasses such as, for example, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 or IgGM are preferred.
  • the IgG subtypes IgG1 or IgG2b are particularly preferred.
  • Fragments include all shortened or modified antibody fragments with one or two binding sites complementary to the antigen, such as antibody parts with a binding site formed by light and heavy chains corresponding to the antibody, such as Fv, Fab or F (ab ') 2 fragments or single-strand fragments , Shortened double-strand fragments such as Fv, Fab or F (ab ') 2 are preferred.
  • These fragments can be obtained, for example, enzymatically by cleaving off the Fc part of the antibodies with enzymes such as papain or pepsin, by chemical oxidation or by genetic engineering manipulation of the antibody genes. Genetically manipulated, unabridged fragments can also be used advantageously.
  • the antibodies or fragments can be used alone or in mixtures. Antibodies can also be part of a fusion protein.
  • the identified substances can be chemically synthesized or microbiologically produced substances and e.g. in cell extracts of e.g. Plants, animals or
  • the reaction mixture can be a cell-free extract or can comprise a cell or cell culture. Suitable methods are known to the person skilled in the art and are described, for example, in general in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), for example chapter 17.
  • the substances mentioned can, for example, be added to the reaction mixture or the culture medium or injected into the cells or onto one Plant to be sprayed.
  • a sample which contains a substance active according to the method according to the invention has been identified, then it is either possible to isolate the substance directly from the original sample or the sample can be divided into different groups, for example if it consists of a large number of different ones Components exist so as to reduce the number of different substances per sample and then to repeat the method according to the invention with such a "sub-sample" of the original sample.
  • the steps described above can be repeated several times, preferably until the sample identified according to the method according to the invention only comprises a small number of substances or only one substance.
  • the substance or derivative thereof identified according to the method according to the invention is preferably further formulated in such a way that it is suitable for use in plant breeding or plant cell or tissue culture.
  • the substances which have been tested and identified according to the method according to the invention can be, for example: Expression libraries, e.g. cDNA expression libraries, peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic substances, hormones, PNAs or the like (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 and references cited therein). These substances can also be functional derivatives or analogs of the known inhibitors or activators. Methods for the production of chemical derivatives or analogs are known to the person skilled in the art. The derivatives and analogs mentioned can be tested according to methods according to the prior art.
  • Expression libraries e.g. cDNA expression libraries, peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic substances, hormones, PNAs or the like (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245;
  • the cell or tissue which can be used for the method according to the invention is preferably a host cell, plant cell or a plant tissue according to the invention, as described in the above-mentioned embodiments.
  • the derivatives (s) (the plural and the singular are equivalent for this application and their definitions) of the nucleic acids used in the methods according to the invention include, for example, functional homologues of those from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 encoded proteins or their biological activity, i.e.
  • SEQ ID NO: 1 proteins which the same biological reactions as those of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 encoded proteins. These derivatives or genes are also suitable as herbicidal targets.
  • sequences described herein in accordance with the invention code for homologs to the proteins described in the examples and preferably have the activities indicated for the homologs.
  • SEQ ID NO: 1 codes for a protein which is similar to the translation realizing factor RF-2.
  • the protein sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 3 codes for a cobalamin synthesis protein, the protein sequence of which can be found in SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 5 codes for an arginyl tRNA synthetase, the protein sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 7 codes for a putative protein with similarity to an RNA helicase from Mus musculus, the protein sequence of which is shown in SEQ ID NO: 8.
  • SEQ ID NO: 9 codes for a putative protein with similarity to the protein RAP 2.4 from Arabidopsis thaliana containing the AP2 domain, the protein sequence of which can be found in SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 11 codes for a protein which has homologies to various pseudouridylate synthases. The protein sequence can be found in SEQ ID NO: 12.
  • SEQ ID NO: 13 encodes a protein which is similar to a putative adenylate kinase.
  • SEQ ID NO: 14 represents the protein sequence. For a protein with the sequence shown in SEQ ID NO: 16, the sequence codes SEQ ID NO: 15.
  • SEQ ID NO: 15 This hypothetical protein, coded by SEQ ID NO: 15, is similar to the pol polyprotein of the "Equine Infectious Anemia Virus".
  • SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 51 code for unknown proteins.
  • the sequences SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 52 show the respective protein sequences.
  • SEQ ID NO: 23 codes for a Preprotein Translocase secA precursor protein. So it is a chloroplast SecA protein that is involved in protein transport across the thylakoid membrane.
  • the protein sequence can be found in SEQ ID NO: 24.
  • SEQ ID NO: 25 encodes a protein with significant homology to the DCL protein from tomato (PIR: S71749). This protein has a so-called HMG signature, which occurs in high mobility group proteins and can bind to DNA.
  • the protein sequence is shown in SEQ ID NO: 26.
  • SEQ ID NO: 29 encodes a plastid gluthathione reductase, the protein sequence of which is shown in SEQ ID NO: 30.
  • SEQ ID NO: 31 codes for a protein which is a homologue of the transcription factor Sigma, ie it is a vegetable homologue to the Sigma subunit of the bacterial RNA polymerase. The corresponding protein sequence can be found in SEQ ID NO: 32.
  • a calmudulin-like protein is encoded by SEQ ID NO: 33, the sequence of which is shown in SEQ ID NO: 34.
  • SEQ ID NO: 37 codes for a protein which is very similar to INT6, a breast cancer-associated protein, and which is similar to an “initiator factor 3” protein.
  • SEQ ID NO: 38 shows the protein sequence.
  • a protein is encoded by SEQ ID NO: 39 which bears great similarity to the DNA helicase YGL150c from Saccharomyces.
  • SEQ ID NO: 40 represents the corresponding protein sequence.
  • a protein similar to an RNA binding protein is encoded by SEQ ID NO: 41.
  • the protein sequence is shown in SEQ ID NO: 42.
  • SEQ ID NO: 45 codes for a putative heat shock transcription factor, the protein sequence of which can be found in SEQ ID NO: 46.
  • SEQ ID NO: 47 A putative, chloroplastic protein which binds to the DNA nucleoid is encoded by SEQ ID NO: 47.
  • SEQ ID NO: 48 represents the corresponding protein sequence.
  • SEQ ID NO: 49 encodes a protein that is similar to a putative Met2-type cytosine DNA methyl transferase. This methyltransferase is very similar to a DNA (cytosine-5 -) methyltransferase from Arabidopsis thaliana. The protein sequence is shown in SEQ ID NO: 50.
  • Derivatives are also understood to mean those peptides which have homology to the polypeptides with those in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 , SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 sequences of at least 20%, preferably 30%, 40% or 50%, more preferably 60%, 70% or 80%, even more preferably 90%, more preferably 91%, 92%, 93%, 94% or 95%, most preferably 96%, 97%,
  • nucleic acid sequence (s) or fragments thereof can advantageously be used to isolate further sequences such as e.g. genomic, cDNA or other sequences which are suitable as herbicide target can be used via homology screening.
  • the derivatives mentioned can be obtained, for example, from other organisms, in particular eukaryotic organisms such as monocotyledon or dicotyledonous plants, such as, in particular, algae, mosses, dinoflagellates, useful plants such as monocotyledons such as maize, wheat, oats, rye, barley or millet or dicotyledons such as potatoes, tobacco, lettuce Isolate tomato, carrot to name a few or mushrooms.
  • eukaryotic organisms such as monocotyledon or dicotyledonous plants, such as, in particular, algae, mosses, dinoflagellates, useful plants such as monocotyledons such as maize, wheat, oats, rye, barley or millet or dicotyledons such as potatoes, tobacco, lettuce Isolate tomato, carrot to name a few or mushrooms.
  • derivatives or functional derivatives include those in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41,
  • allelic variants which have at least 60% homology at the derived amino acid level, advantageously at least 70% Homology, preferably at least 80% homology, particularly preferably at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% or 95% homology, very particularly preferably 96%, 97%, 98% or 99% homology.
  • the homology was calculated over the entire amino acid range.
  • amino acid sequences derived from the nucleic acids mentioned are sequence SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52.
  • Homology is to be understood as identity, that is to say the amino acid sequences are at least 40, 50, 60 or 70%, more preferably 80%, 85% or 90%, even more preferably 91%, 92%, 93%, 94% or
  • sequences according to the invention are at least 45 or 55% homologous at the nucleic acid level, preferably at least 60 or 65%, particularly preferably 75% or 80%, very particularly preferably at least 85% or 90%, even more preferably 95%,
  • fragments also comprise partial regions or fragments of the listed sequences or their homologous sequences of at least 50 amino acids, advantageously of at least 40 amino acids, preferably of at least 30 amino acids, particularly preferably of at least 20 amino acids, very particularly preferably of at least 10 amino acids, which make it possible to identify selectively interacting substances.
  • fragment means a shortened sequence of the original sequence.
  • the shortened sequence (nucleic acid or protein) can have different lengths, the minimum sequence length is a sequence length that has at least one comparable function, e.g. Has binding properties, or activity of the original sequence.
  • Appropriate methods are e.g. as described above, SELDI, FCS or Biocore and are known to the person skilled in the art.
  • nucleic acids that encode a fragment or an epitope of a polypeptide that specifically binds to an antibody that specifically binds to a polypeptide as described according to the invention, in particular that of one of the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7,
  • polypeptides also preferably have high homology at the amino acid level to the sequences mentioned, preferably 20%, more preferably 40%, more preferably 60%, even more 80%, most preferred are 90% or more.
  • the spatial structure of a polypeptide is essentially responsible for the interactions of the polypeptide with other compounds and, if applicable, for its enzymatic activity. Consequently, it is possible to use in the methods or fragments according to the invention whose sequence has only a low homology to the polypeptides described, but whose spatial structure has a high homology to the polypeptides described, that is to say those which contain epitopes of the sequences described here, in order to interact with one another find, which then inhibit or inactivate the polypeptides described herein.
  • Fragments comprising epitopes of the polypeptides according to the invention can also be used to "occupy" the interaction partners of the polypeptides according to the invention, ie to prevent their interaction with the polypeptides according to the invention. For this it is advantageous if the fragments have a higher affinity for a binding partner than the naturally occurring polypeptide. Also included are fragments which are encoded by nucleic acids according to the invention and which comprise one of the above-mentioned biological activities.
  • Allelic variants include, in particular, functional variants which are obtained by deleting, inserting or substituting nucleotides from the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,
  • SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 are available sequence, the biological, eg enzymatic activity or binding properties of the derived synthesized proteins is retained.
  • DNA sequences can be generated with the aid of the nucleic acid sequences according to the invention, for example starting from those in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 described DNA sequences or parts of these sequences, for example with conventional hybridization methods or the PCR technique from other eukaryotes such as, for example, microorganisms such as yeasts , Mushrooms, ciliates, plants such
  • DNA sequences hybridize to the sequences mentioned under standard conditions.
  • short oligonucleotides are advantageously used, for example the conserved or other areas, which are compared with other related genes can be determined in a manner known to those skilled in the art.
  • longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences can also be used for the hybridization.
  • These standard conditions vary depending on the nucleic acid used: oligonucleotide, longer fragment or complete sequence or depending on the type of nucleic acid DNA or RNA used for the hybridization.
  • the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 30 ° C. to 55 ° C., preferably between approximately 45 ° C.
  • derivatives include homologs of the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47 , SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 for example eukaryotic homologs, shortened sequences, single-stranded DNA of the coding and to understand the non-coding DNA sequence or RNA of the coding and non-coding DNA sequence.
  • variants can be changed by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), but without the functionality or the biological activity of the variants being impaired. They preferably have a homology of at least 20%, advantageously 30%, 40%, 50% or 60%, preferably 70%, 80% or 90%, particularly preferably 95% and an equivalent biological activity.
  • nucleic acids used in the method according to the invention in particular SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 and their fragments and derivatives are therefore advantageously suitable for isolating further essential, new genes from other organisms, preferably plants.
  • nucleic acid sequences according to the invention in particular SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 and their gene products encoded by them are used in the method according to the invention.
  • Function-equivalent sequences which code for the nucleic acids used in the method according to the invention are those derivatives of the sequences according to the invention which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions, that is to say the biological activity of the proteins.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. artificial nucleotide sequences obtained by chemical synthesis, in particular adapted to the codon use of a plant.
  • artificial DNA sequences are suitable as long as they lead, as described above, to products which mediate the above-mentioned activities or the desired property, for example binding to a receptor or the enzymatic activity.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translation of proteins constructed using molecular modeling or by in vitro selection. Possible techniques for the in vitro evolution of DNA to change or improve the DNA sequences are described in Patten, P.A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997) or Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997).
  • Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant are particularly suitable.
  • the specific codon usage can easily be determined by a person skilled in plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • amino acid sequences which are one in the sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 are advantageous , SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 or an amino acid sequence shown or a sequence obtainable therefrom by substitution, inversion, insertion or deletion of one or more amino acid residues, the biological Activity of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
  • proteins which still have at least 10%, preferably 20%, particularly preferably 30%, 50%, 70%, 90% or more of the biological activity of the starting protein.
  • certain amino acids can be replaced by those with similar physicochemical properties (space filling, basicity, hydrophobicity, etc.).
  • arginine residues are exchanged for lysine residues, valine residues for isoleucine residues or aspartic acid residues for glutamic acid residues.
  • one or more amino acids can also be exchanged, added or removed in order, or several of these measures can be combined with one another.
  • Derivatives are also to be understood as functional equivalents which in particular also include natural or artificial mutations of the nucleic acid sequences used SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9,
  • SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51, which furthermore show the desired function, that is to say their biological activity is not significantly reduced. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying the nucleotide sequences mentioned.
  • the aim of such a modification can e.g. further narrowing down the coding sequence contained therein or e.g. also the insertion of further restriction enzyme interfaces.
  • nucleic acid construct containing a nucleic acid sequence of the invention, e.g. selected from the group:
  • SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51, or
  • SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52.
  • nucleic acid sequence which is a derivative or a fragment of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27,
  • SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 is the nucleic acid sequences shown, and have at least 60% homology at the nucleic acid level; or d) Nucleic acid sequence which is suitable for derivatives or fragments of the polypeptides with those in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,
  • SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 encoded amino acid sequences which have at least 50% homology at the amino acid level;
  • nucleic acid sequence which codes for a fragment or an epitope of a polypeptide which specifically binds to an antibody, the antibody specifically binding to a polypeptide which the one in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13,
  • SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 is encoded sequence;
  • a GTP binding protein activity a pseudouridylate synthase activity, an adenylate kinase activity, a preprotein translocase secA precursor protein activity, a DCL protein activity, an arginine tRNA ligase activity, a plastid Gluthathione reductase activity, a transcription factor Sigma activity, a Calmudulin activity, an INT6 activity, a helicase YGL150c activity, an RNA binding activity, a heat shock transcription factor activity, a chloroplastid DNA nucleoid binding activity or has a Met2-type cytosine DNA methyltransferase activity; and or
  • SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 encoded amino acid sequences which has at least 20% homology at the amino acid level and has an equivalent biological activity;
  • nucleic acid sequence is linked to one or more regulatory signals.
  • the aforementioned terms have the meaning given above.
  • nucleic acids according to the invention e.g. those in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5,
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51, which result as a result of the genetic code and / or to understand their functional or non-functional derivatives which have been functionally linked to one or more regulation signals advantageously for regulating, in particular increasing, gene expression and which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • regulatory sequences are intended to enable the targeted expression of the genes or the proteins. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed and / or overexpressed after induction, or that it is constitutively expressed and / or overexpressed.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present in front of the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the nucleic acid construct according to the invention can also advantageously consist only of the natural genetically modified regulatory region at the 5 'and / or 3' end.
  • the gene construct can also have a simpler structure, that is to say no additional regulation signals have been inserted in front of the nucleic acid sequence or its derivatives, and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence was mutated so that regulation no longer takes place and / or gene expression is increased.
  • the gene construct can also advantageously one or more so-called “enhancer sequences” contain functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the expression can also be specifically reduced or blocked.
  • promoters which can advantageously control the expression of foreign genes in organisms in plants or fungi are suitable as promoters in the expression cassette.
  • a plant-based promoter or promoters which originate from a plant virus are preferably used.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, Iacl q , T7, T5 and T3 -, gal-, tre-, ara-, SP6-, ⁇ -P R - or contained in the ⁇ -P L promoter, which are advantageously used ingram-negative bacteria.
  • the expression cassette can also contain a chemically inducible promoter through which the expression of the nucleic acid
  • Sequences in the nucleic acid construct according to the invention in the organisms can advantageously be controlled in the plants at a specific point in time.
  • Such advantageous plant promoters are, for example, the PRP1 promoter [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366], a benzene sulfonamide-inducible (EP 388186), a tetracycline-inducible (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), a by Salicylic acid inducible promoter (WO 95/19443), an abscisic acid inducible (EP 335528) or ethanol or cyclohexanone inducible (WO 93/21334) promoter.
  • Further plant promoters are, for example, the promoter of the cytosolic FBPase from potato, the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), the promoter of the phospho- Ribosylpyrophosphate amidotransferase from Glycine max (see also Genbank Accession number U87999) or a node-specific promoter as in EP 249676 can advantageously be used.
  • DNA fragments When preparing an expression cassette, various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions can expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp within the regulatory areas, often less than 60 bp, but at least 5 bp.
  • the promoter can be native or homologous as well as foreign or heterologous to the host organism, for example to the host plant.
  • the expression cassette contains in the 5'-3 'transcription direction the promoter, a DNA sequence which codes for the proteins used in the method according to the invention and a region for the transcriptional termination. Different termination areas can advantageously be interchanged.
  • Preferred polyadenylation signals are vegetable polyadenylation signals, preferably those which essentially comprise T-DNA polyadenylation signals
  • Agrobacterium tumefaciens in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH ⁇ (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) or corresponding functional equivalents.
  • An expression cassette is produced by fusion of a suitable one
  • Promoters with a suitable nucleic acid sequence and a polyadenylation signal according to common recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention contain all sequence features which are necessary in order to achieve a localization which is correct for the location of the biological action or activity. Therefore no further targeting sequences per se are necessary. However, such localization can be desirable and advantageous and therefore artificially changed or enhanced are, so that such fusion constructs are a preferred advantageous embodiment of the invention.
  • sequences that ensure targeting in plastids are advantageous.
  • targeting in other compartments e.g. in the vacuole, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER), peroxisomes, lipid bodies or, due to the lack of corresponding operative sequences, it is desirable to remain in the compartment of formation, the cytosol.
  • the nucleic acid sequences according to the invention are advantageously cloned together with at least one reporter gene into an expression cassette which is introduced into the organism via a vector or directly into the genome.
  • This reporter gene should be easily detectable via a growth, fluorescence, chemo, bioluminescence or resistance assay or via a photometric
  • reporter genes are antibiotic or herbicide resistance genes, hydrolase genes, fluorescence protein genes, bioluminescence genes, sugar or nucleotide metabolism genes or biosynthesis genes such as the Ura3 gene, the Ilv2 gene, the luciferase gene, the ⁇ -galactosidase gene, the 6-despoxyglucose, the gfp gene glucose, phosphate-phosphatase gene, the ß-glucuronidase gene, ß-lactamase gene, the
  • Further advantageous antibiotic or herbicide resistance are resistance to e.g. Imidazolinone or sulfonylurea; antibiotic resistance to e.g. Bleomycin, streptomycin, kanamycin, tetracycline, chlorampenicol, gentamycin, geneticin (G418), spectinomycin or blasticidin to name but a few.
  • These genes enable the transcription activity and thus the expression of the genes to be easily measured and quarifiable. This enables genome sites to be identified that show different levels of productivity.
  • an expression cassette comprises a promoter upstream, that is to say at the 5 'end of the coding sequence, and a polyadenylation signal and, if appropriate, further regulatory elements which match the coding sequence in between for the process according to the invention proteins used are operatively linked.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
  • the preferred sequences for the operative linkage are targeting sequences Ensuring subcellular localization in plastids.
  • An expression cassette can contain, for example, a constitutive promoter, for example the 35S, 34S or an ubiquitin promoter, the gene to be expressed and the ER retention signal.
  • the amino acid sequence KDEL lysine, aspartic acid, glutamic acid, leucine is preferably used as the ER retention signal.
  • the expression cassette is advantageously inserted into a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables optimal expression of the genes in the host organism.
  • a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables optimal expression of the genes in the host organism.
  • Suitable plasmids are, for example, in E.
  • Examples of algae or plant promoters are pLGV23, pGHIac + , pBIN19, pAK2004, pVKH or pDH51 (see Schmidt, R. and Willmitzer, L, 1988)
  • the above-mentioned vectors or derivatives of the above-mentioned vectors represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds.
  • vectors are so-called shuttle vectors or binary vectors that replicate in E. coli and Agrobacterium.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • phages viruses
  • viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA.
  • nucleic acid construct according to the invention can also advantageously be in the form of a linear DNA
  • Organisms are introduced and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the nucleic acid construct as a vector or the nucleic acid sequences used.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention can also be introduced into an organism alone.
  • nucleic acid sequences in addition to the nucleic acid sequences, further genes are to be introduced into the organism, all of them can be introduced into the organism together with a reporter gene in a single vector or each individual gene with or without a reporter gene in each vector, the different vectors being introduced simultaneously or successively can be.
  • the vector advantageously contains at least one copy of the nucleic acid sequences used and / or the nucleic acid construct according to the invention.
  • the nucleic acid construct can be incorporated into the tobacco transformation vector pBinAR and be under the control of the 35S, 34S or ubiquitin promoter or the USP promoter.
  • phosphinotricin bar resistance
  • AHAS resistance glyphosate or clearfield resistance
  • advantageous vectors can contain sequences for integration into the genome of the organisms, preferably of the plants. Examples of such sequences are the so-called T-DNA borders.
  • advantageous vectors can also contain promoters and terminators, such as those described above. So-called PolyA sequences can also be contained in the vector.
  • Advantageous vectors can be found, for example, in FIGS. 1, 2 and 3.
  • SEQ ID NO: 25 shows the advantageous sequence of the vector pMTX 1a300.
  • Fusion vectors used in prokaryotes frequently use inducible systems with and without fusion proteins or fusion oligopeptides, it being possible for these fusions to take place both at the N-terminal and at the C-terminal or other usable domains of a protein.
  • Such fusion vectors generally serve: i.) To increase the expression rate of the RNA ii.) To increase the achievable protein synthesis rate, iii.) To increase the solubility of the protein, iv.) Or to purify it by means of a binding sequence that can be used for affinity chromatography simplify.
  • proteolytic cleavage sites are also introduced via fusion proteins, which also makes it possible to purify part of the fusion protein.
  • recognition sequences for proteases are e.g. Factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • Typical advantageous fusion and expression vectors are pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) which contains glutathione S-transferase (GST), maltose binding protein, or protein A.
  • GST glutathione S-transferase
  • E. coli expression vectors are pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315] and pET vectors [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Netherlands].
  • vectors for use in yeast are pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES derivatives (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors for use in filamentous fungi are described in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., Eds., P. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • insect cell expression vectors can also be used advantageously, e.g. for expression in Sf 9 cells. These are e.g. the vectors of the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • plant cells or algal cells can advantageously be used for gene expression.
  • plant expression vectors can be found in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 or in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be expressed in mammalian cells.
  • Examples of corresponding expression vectors are pCDM ⁇ and pMT2PC named in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 or Kauf man et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • Promoters to be used are preferably of viral origin, e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or simian virus 40. Further prokaryotic and eukaryotic expression systems are mentioned in chapters 16 and 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
  • nucleic acids according to the invention can be introduced into organisms, for example in ligands, by all methods known to the person skilled in the art.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are the protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun - the so-called particle bombardment method, the electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, the microinjection and the gene transfer mediated by agrobaeterium the gene transfer takes place in the present invention with, for example, the Agrobaeterium tumefaeiens strain GV 3101 pMP90.
  • the methods mentioned are described, for example, in B.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobaeterium tumefaeiens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as e.g.
  • nucleic acid or DNA to be introduced is cloned into special plasmids, either in an intermediate vector or in a binary vector.
  • the intermediate vectors can be due to
  • Sequences that are homologous to sequences in the T-DNA can be integrated into the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria by homologous recombination. This also contains the vir region necessary for the transfer of the T-DNA.
  • Intermediate vectors cannot replicate in agrobacteria.
  • the intermediate vector can be transferred to Agrobaeterium tumefaeiens (conju- gation).
  • Binary vectors can replicate in both E. coli and agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or polylinker, which are framed by the right and left T-DNA border region. They can be transformed directly into the agrobacteria (Holsters et al. Mol.
  • the agrobacterium serving as the host cell is said to contain a plasmid which carries a vir region.
  • the vir region is necessary for the transfer of the T-DNA into the plant cell. Additional T-DNA may be present.
  • the agrobacterium transformed in this way is used to transform plant cells.
  • T-DNA for the transformation of plant cells has been intensively investigated and is sufficiently described in EPA-0 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287.
  • plant explants can expediently be cultivated with Agrobaeterium tumefaeiens or Agrobaeterium rhizogenes.
  • Whole plants can then be regenerated from the infected plant material (e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plant cells) in a suitable medium, which can contain antibiotics or biocides for the selection of transformed cells.
  • the plants thus obtained can then be examined for the presence of the introduced DNA.
  • Other possibilities of introducing foreign DNA using the biolistic method or by protoplast transformation are known (cf., for example, Willmitzer, L, 1993 Transgenic plants. In: Bioteehnology, A MultiVolume Comprehensive Treatise (H. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P . Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).)
  • Agrobacteria transformed with a vector according to the invention can also be used in a known manner to transform plants such as test plants such as Arabidopsis or crop plants such as cereals, maize, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, Potato, tobacco, tomato, carrot, bell pepper, rapeseed, tapioca, cassava, arrowroot, tagetes, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • test plants such as Arabidopsis or crop plants
  • crop plants such as cereals, maize, oats, rye, barley, wheat, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, Potato, tobacco, tomato, carrot, bell pepper, rapeseed, tapioca,
  • the genetically modified plant cells can be regenerated using all methods known to the person skilled in the art. Appropriate methods can be found in the above-mentioned writings by S.D. Kung and R. Wu, Potrykus or Höfgen and Willmitzer can be found.
  • Plants in the sense of the invention are to be understood as meaning plant cells, tissue, organs or whole plants such as seeds, tubers, flowers, pollen, fruits, seedlings, roots, leaves, stems or other parts of plants. Plants are also understood to mean propagation material such as seeds, fruits, seedlings, cuttings, tubers, cuts or rhizomes.
  • all organisms which are able to express the nucleic acids used according to the invention or are suitable for the expression of recombinant genes are advantageously suitable as organisms or host organisms for the nucleic acid according to the invention, the expression cassette or the vector.
  • Examples include plants such as Arabidopsis, Asteraceae such as Calendula or crop plants such as soybean, peanut, castor oil, sunflower, maize, cotton, flax, rapeseed, coconut, oil palm, safflower (Carthamus tinetorius) or cocoa bean, microorganisms such as fungi, for example the genus Mortierella, Saprolegnia Pythium, bacteria such as the genus Escherichia, yeasts such as the genus Saccharomyces, cyanobacteria, ciliates, algae or protozoa such as dinoflagellates such as Crypthecodinium.
  • fungi for example the genus Mortierella, Saprolegnia Pythium
  • bacteria such as the genus Escherichia
  • yeasts such as the genus Saccharomyces
  • cyanobacteria ciliates
  • algae or protozoa such as dinoflagellates such as Crypthecodin
  • non-human transgenic animals are also suitable as host organisms, for example C. elegans.
  • Transgenic plants are preferred which contain a functional or non-functional nucleic acid construct according to the invention or a functional or non-functional vector according to the invention.
  • functional is to be understood to mean that the nucleic acids used in the method are expressed alone or in the nucleic acid construct or in the vector and that a biologically active gene product is produced.
  • non-functional means that the nucleic acids used in the method, alone or in the nucleic acid construct or in the vector, are not transcribed, are not expressed and / or a biologically inactive gene product is produced.
  • the so-called antisense RNAs are also nonfunctional nucleic acids or, when inserted into the nucleic acid construct or the vector, a nonfunctional nucleic acid construct or nonfunctional vector.
  • Both the nucleic acid construct according to the invention and the vector according to the invention can advantageously be used to produce transgenic organisms, preferably plants.
  • transgene in the sense of the invention is to be understood that the nucleic acids used in the method are not in their natural place in the genome of an organism, and the nucleic acids can be expressed homologously or heterologously.
  • Tansgen also means that the nucleic acids according to the invention are in their natural place in the genome of an organism, but that the sequence has been changed compared to the natural sequence and / or that the regulatory sequences of the natural sequences have been changed.
  • Transgenic is preferably to be understood as meaning the expression of the nucleic acids at a non-natural location in the genome, that is to say that the nucleic acids are homologous or preferably heterologous. The same applies to the nucleic acid construct according to the invention or the vector.
  • the invention also includes the use of the nucleic acids according to the invention, for example those under SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 set out nucleotide sequences for creating genetically modified Ranzanzen, which are characterized in that they are modified proteins by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 51
  • nucleic acids used in the method according to the invention in particular SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51, their sequences derived on the basis of the degenerate genetic code and their derivatives were identified from a population of transgenic plants which was characterized on the one hand by the fact that they were transformed by means of the agrobaeterium and in As part of this process, new DNA had been randomly integrated into the
  • nucleic acids mentioned are overexpressed in an advantageous embodiment and the following process steps are advantageously carried out:
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31,
  • SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48,
  • SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: 52 can be derived, or from derivatives or fragments of the SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 , SEQ ID NO: 27,
  • SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51, the nucleic acid sequences shown for polypeptides with the in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
  • SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 or SEQ ID NO: encode 52 amino acid sequences shown and have at least 50%, 60%, preferably 70%, 80%, 90% or more homology at the amino acid level, encoded proteins in a heterologous system, for example a microorganism such as a bacterium of the genus Escherichia such as E. coli XL1-Red or in a cell-free system.
  • a heterologous system for example a microorganism such as a bacterium of the genus
  • the modified protein or the modified nucleic acid e.g. that under SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 and the other sequences according to the invention described above, for example Derivatives and fragments, e.g. from other plants, into an organism advantageously into a plant, preferably plant cells.
  • Another embodiment of the invention is a method for producing modified gene products which are derived from the nucleic acid sequences according to the invention described herein, in particular SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51, characterized in that it comprises the following process steps:
  • Fragments e.g. from other plants, of which in a heterologous system or in a cell-free system
  • sequences selected according to the method described above can advantageously be introduced into an organism. Therefore, another object of the invention is an organism produced by this method, the organism is preferably a plant.
  • the method is also suitable for gene expression of the above-mentioned biologically active derivatives and fragments.
  • Modified proteins and / or nucleic acids which can impart resistance to herbicides in plants can be obtained from the sequences according to the invention described herein, in particular from the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 , SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 or their derivatives from other plants can also be produced via the so-called "site directed mutagenesis".
  • This mutagenesis can, for example, specifically change and advantageously reduce the stability and / or enzymatic activity of enzymes or the properties such as binding of low molecular weight compounds with less than 1000 molecular weight.
  • the molecular weight of the compounds should advantageously be less than 900 daltons, preferably less than 800, particularly preferably less than 700, very particularly preferably less than 600 daltons, advantageously with a Ki value of less than 10 "7 , advantageously less than 10 " 8 , preferably less than 10 "9 M, this inhibitory effect should advantageously be due to a specific inhibition of the biological activity of the nucleic acids according to the invention and / or of the proteins encoded by these nucleic acids, i.e.
  • the low molecular weight substances should advantageously have a molecular weight of greater than 50 daltons, preferably greater than 100 daltons, particularly preferably greater than 150 daltons, very particularly preferably greater than 200 daltons.
  • the low molecular weight substances should advantageously have less than three hydroxyls have yl groups on a ring containing carbon atoms.
  • Bases such as adenosine in the molecule are also less preferred.
  • the stability and / or enzymatic activity of enzymes or the properties such as binding of proteins or antisense RNA can also be improved or changed in a very targeted manner.
  • EP-A-0909821 describes a method for changing proteins using using the microorganism E. coli XL-1 Red. During replication, this microorganism creates mutations in the introduced nucleic acids and thus leads to a change in the genetic information. By isolating the modified nucleic acids or the modified proteins and testing for resistance, it is easy to identify advantageous nucleic acids and the proteins encoded by them and vice versa. These can then express resistance there after introduction into plants and thus lead to resistance to the herbicides.
  • mutagenesis and selection are, for example, methods such as the in vivo mutagenesis of seeds or pollen and selection of resistant alleles in the presence of the inhibitors according to the invention, followed by genetic and molecular identification of the modified, resistant alien egg. Furthermore, mutagenesis and selection of resistances in cell culture by multiplying the culture in the presence of successively increasing concentrations of the inhibitors according to the invention. This can increase the spontaneous
  • Mutation rate can be exploited by chemical / physical mutagenic treatment.
  • modified genes can also be isolated with microorganisms which have an endogenous or recombinant activity of the proteins encoded by the nucleic acids used in the method according to the invention and which are sensitive to the inhibitors identified according to the invention.
  • the cultivation of the microorganisms on media with increasing concentrations of inhibitors according to the invention allows the selection and evolution of resistant variants of the targets according to the invention.
  • the frequency of the mutations can in turn be increased by mutagenic treatments.
  • methods for the targeted modification of nucleic acids are available (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol.
  • Another subject of the invention is a method for creating nucleotide sequences which code for gene products which have a changed biological activity, the biological activity being changed in contrast to the fact that there is increased activity.
  • Increased activity is to be understood as meaning an activity which is at least 10%, preferably at least 30%, particularly preferably at least 50% or 70%, very particularly preferably at least 100% higher than that of the starting organism or of the starting gene product.
  • the biological activity may have been changed so that the substances and / or agents according to the invention are no longer or no longer correct bind to the nucleic acid sequences and / or the gene products encoded by them.
  • no longer or no longer correctly means that the substances have at least 30%, preferably at least 50%, particularly preferably at least 70%, very particularly preferably at least 80% or not at all of the modified nucleic acids and / or bind gene products in comparison to the starting gene product or the starting nucleic acids.
  • Yet another aspect of the invention therefore relates to a transgenic plant genetically modified by the method according to the invention described above.
  • nucleic acids used in the method according to the invention in particular SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 , SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51.
  • a further subject of the invention is therefore a method for producing transgenic plants which are resistant to substances which have been found by a method according to the invention, characterized in that nucleic acids according to the invention with one of the described biological activities, in particular with the sequences SEQ, are present in these plants ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 overexpressed.
  • a similar method is described by way of example in Lermantova
  • Plants enable the development of new herbicides that have the most comprehensive possible plant species independent effect (so-called total herbicides), in combination with the development of crops resistant to the total herbicide.
  • Crop-resistant crops are already diverse have been described. Several principles can be distinguished to achieve resistance:
  • a new protein / a new RNA is introduced, which is characterized in that the chemical structure of the protein or nucleic acid, such as RNA or DNA, which is responsible for the herbicidal action of the low molecular weight substance is changed in such a way that the modified structure no longer has a herbicidal action, or the herbicide in the modified plant is inactivated or modified, for example is broken down, not taken up or not transported or transported into the vacuole, etc., i.e. the interaction of the herbicide with the destination can no longer take place.
  • the chemical structure of the protein or nucleic acid, such as RNA or DNA which is responsible for the herbicidal action of the low molecular weight substance is changed in such a way that the modified structure no longer has a herbicidal action, or the herbicide in the modified plant is inactivated or modified, for example is broken down, not taken up or not transported or transported into the vacuole, etc., i.e. the interaction of the herbicide with the destination can no longer
  • nucleic acid coding for a gene product that is less or not at all separated from the herbicidal substance in its function.
  • a so-called “alternative pathway” can be created.
  • the present invention therefore also includes the use of plants which genes hit by the T-DNA insertion with the nucleic acid sequences used in the method according to the invention, in particular SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 or the other sequences mentioned, for example fragments and derivatives, for example from other plants, for the development of new herbicides.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3
  • Another object of the invention are therefore substances identified by the methods according to the invention, the substance being a compound, advantageously a low molecular weight compound with less than 1000 molecular weight, advantageously less than 900 Daltons, preferably less than 800, particularly preferably less than 700, very particularly preferably less than 600 Daltons, advantageously with a Ki value of less than 10 "7 , advantageously less than 10 " 8 , preferably less than 10 "9 M, this inhibitory effect should be advantageous for a specific inhibition of the biological activity of the nucleic acids according to the invention and / or of these nucleic acids encoded proteins can be attributed, that is, there should be no inhibition by these low molecular weight substances of further closely related nucleic acids and / or the proteins encoded by these nucleic acids Furthermore, the low molecular weight substances should advantageously have a molecular weight of greater than 50 Dalton, preferably greater than 100 Dalton, particularly preferably greater than 150 Dalton, very particularly preferably greater than 200 Dalton.
  • the low-molecular substances should advantageously have fewer than three hydroxyl groups on a ring containing carbon atoms. Furthermore, there should also be no free acid or lactone group (s), no phosphate group and no more than one amino group in the molecule. Bases such as adenosine in the molecule are also less preferred.
  • the substances can also advantageously be a proteinogenic substance such as an antibody or an antisense RNA.
  • a further embodiment of the invention are substances which have been identified by the methods according to the invention described above and which are an antibody against the sequence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 or SEQ ID NO: 51 encoded protein or derivatives or fragments thereof.
  • the antibodies can also bind several of the said sequences as long as the binding is specific, i.e. can be identified or tested using the above methods.
  • a further embodiment are agents containing a growth-regulating amount of at least one substance identified by the method according to the invention or an antagonist identified by a method according to the invention and at least one inert liquid and / or solid carrier and optionally at least one surface-active substance.
  • These substances or compositions according to the invention with their herbicidal activity can be used as defoliants, desiccants, haulm killers and in particular as weed killers. Weeds in the broadest sense are all plants that grow up in places where they are undesirable. Whether the substances or active substances found with the aid of the processes according to the invention act as total or selective herbicides depends, inter alia, on the amount used, their selectivity and other factors. The substances can be used against the following weeds, for example:
  • Echinochloa Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Sphenocium, Ihenoceaum Agrostis, Alopecurus, Apera.
  • the substances identified or agents containing them in the process according to the invention can advantageously also be used in a further number of crop plants for eliminating undesirable substances
  • Plants are used. The following crops are considered, for example:
  • the substances found by the process according to the invention can advantageously also be used in crops which, by breeding, including genetic engineering methods, are tolerant of the action of herbicides.
  • the substances according to the invention or the herbicidal compositions comprising them can be, for example, in the form of directly sprayable aqueous solutions, powders, suspensions, and also high-strength aqueous, oily or other Suspensions or dispersions, emulsions, old dispersions, pastes, dusts, sprinkles or granules by spraying, atomizing, dusting, scattering or pouring can be used.
  • the application forms depend on the purposes; in any case, they should ensure the finest possible distribution of the active compounds according to the invention.
  • Inert liquid and / or solid carriers include liquid additives such as mineral oil fractions from medium to high boiling points, such as kerosene or diesel oil, furthermore coal tar oils and oils of vegetable or animal origin, aliphatic, cyclic and aromatic hydrocarbons, e.g. Paraffin, tetrahydronaphthalene, alkylated naphthalenes or their derivatives, alkylated benzenes or their derivatives, alcohols such as methanol, ethanol, propanol, butanol, cyclohexanol, ketones such as cyclohexanone or strongly polar solvents, e.g. Amines such as N-methylpyrrolidone or water are possible.
  • liquid additives such as mineral oil fractions from medium to high boiling points, such as kerosene or diesel oil, furthermore coal tar oils and oils of vegetable or animal origin, aliphatic, cyclic and aromatic hydrocarbons, e.g. Paraffin, tetra
  • aqueous forms of use such as emulsion concentrates, suspensions, pastes, wettable powders or water-dispersible granules, which can be prepared, for example, by adding water.
  • emulsion concentrates such as suspensions, pastes, wettable powders or water-dispersible granules
  • the substances and / or agents, the so-called substrates as such or dissolved in an oil or solvent can be homogenized in water by means of wetting agents, adhesives, dispersants or emulsifiers.
  • concentrates consisting of an active substance, wetting agent, tackifier, dispersant or emulsifier and possibly solvent or oil, which are suitable for dilution with water.
  • the surface-active substances are the alkali metal, alkaline earth metal and ammonium salts of aromatic sulfonic acids, for example lignin, phenol, naphthalene and dibutylnaphthalenesulfonic acid, and of fatty acids, alkyl and alkylarylsulfonates, alkyl, lauryl ether and fatty alcohol sulfates, and salts of sulfated Hexa-, hepta- and octadecanols as well as of fatty alcohol glycol ether, condensation products of sulfonated naphthalene and its derivatives with formaldehyde, condensation products of naphthalene or naphthalenesulfonic acids with phenol and formaldehyde, polyoxyethylene octylphenol ether, ethoxylated isooctyl, octyl or nonylphenyl, alkylphenol, alkylphenol, al
  • Granules e.g. Coated, impregnated and homogeneous granules can be produced by binding the active ingredients to solid carriers.
  • Solid carriers are, for example, mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate , Ureas and vegetable products such as flour, tree bark, wood and nutshell flour, cellulose powder or other solid carriers.
  • mineral earths such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammoni
  • the concentrations of the substances and / or agents according to the invention in the ready-to-use preparations can be varied within a wide range.
  • the formulations generally contain 0.001 to 98% by weight, preferably 0.01 to 95% by weight, of at least one active ingredient.
  • the active ingredients are used in a purity of 90% to 100%, preferably 95% to 100% (according to the NMR spectrum).
  • the herbicidal compositions or the substances can be applied pre- or post-emergence. If the active ingredients are less compatible with certain crop plants, application techniques can be used in which the herbicidal compositions or substances are sprayed with the aid of sprayers in such a way that the leaves of the sensitive crop plants are not struck wherever possible, while the active ingredients grow on the leaves below them unwanted plants or the uncovered floor area (post-directed, lay-by).
  • the substances and / or compositions according to the invention can be mixed with numerous representatives of other herbicidal or growth-regulating active compound groups and applied together.
  • 1, 2,4-thiadiazoles, 1, 3,4-thiadiazoles, amides, aminophosphoric acid and their derivatives, aminotriazoles, anilides, (het) -aryloxyalkanoic acid and their derivatives, benzoic acid and their derivatives, benzothiadiazinones, 2-aroyl come as mixing partners -1, 3-cyclohexanediones, hetaryl aryl ketones, benzylisoxazolidinones, meta-CF3-phenyl derivatives, carbamates, quinolinic acid and their derivatives, chloroacetanilides, cyclohexane-1, 3-dione derivatives, diazines, dichloropropionic acid and their derivatives, 3-dihydrobenzurane
  • the application rates of active ingredient are 0.001 to 3.0, preferably 0.01 to 1.0, kg / ha of active substance, depending on the control target, the season, the target plants and the growth stage.
  • Another object of the invention is the use of a substance identified by one of the methods or agents according to the invention containing these substances as a herbicide or for regulating the growth of plants.
  • the invention also relates to a kit comprising the nucleic acid construct according to the invention, the substances according to the invention, e.g. the antibody according to the invention, the antisense nucleic acid molecule according to the invention and / or an antagonist and / or a herbicidal substance identified according to the methods according to the invention and the composition described below.
  • the substances according to the invention e.g. the antibody according to the invention, the antisense nucleic acid molecule according to the invention and / or an antagonist and / or a herbicidal substance identified according to the methods according to the invention and the composition described below.
  • Another object of the invention is a composition comprising the substance according to the invention, the antibody according to the invention, the antisense nucleic acid construct according to the invention and / or an antagonist according to the invention and / or a substance according to the invention identified by a method according to the invention.
  • Example 1 Generation of a KO population and identification of lines that segregate for lethal mutation
  • T2 About 100 to 200 seeds (T2) of these transformed plants were placed on agar plates with selection agent. These plates were stratified for 2 days at 4 ° C and incubated for about 7 to 10 days at 20 ° C and steady light. The number of seedlings resistant and sensitive to the selection agent was then determined. In addition, the number of unpigmented plants (albinos) was determined if necessary. Due to their color, these could be clearly distinguished from the sensitive seedlings. Only those lines were further investigated which obviously segregated for an insertion site, ie in which about a third to a quarter of the plants showed sensitivity to the selection and in which very close coupling, that is to say, cosegregation between the resistance mediating T-DNA and the phenotype producing mutation.
  • Example 2 Molecular analysis of lines with an embryo or albinolethal phenotype
  • genomic DNA was converted from approx. 50 mg leaf material using standard methods (either columns from Qiagen, Hilden, Germany or Phytopure Kit from Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) isolated.
  • the T-DNA insertion site was amplified using a modified version of the adapter PCR method as published by Spertini D, Beliveau C. and Bellemare, 1999, Biotechniques, 27, 308-314.
  • the PCR was carried out under standard conditions for 7 cycles at an annealing temperature of 72 ° C. and for 32 cycles at an annealing temperature of 65 ° C. in 25 ⁇ l reaction volume.
  • the amplificate obtained was diluted 1:50 in H 2 0 and one ⁇ l of this dilution was used for a second round of amplification (5 cycles at an annealing temperature of 67 ° C. and 28 cycles at an annealing temperature of 60 ° C.).
  • Example 3 Identification and analysis of line 303317 that segregates for a lethal mutation
  • Line 303317 was identified as described above (Examples 1 and 2) as a line that segregates for a seedling lethal mutation. The exact count of the cleavage showed that 25% of the offspring showed the albino phenotype, 25% of the offspring showed sensitivity to the selection and 50% of the offspring showed resistance to the selection. This cleavage ratio is expected when only the homozygously resistant seedlings show the phenotype, so the T-DNA insertion is very closely linked to the lethal mutation. The coupling was further checked in a cosegregation analysis. The descendants of 40 wild-type, resistant plants of the 303317 line were analyzed. In all cases, albinos could be found in the offspring.
  • Example 4 Identification and analysis of lines 304149, 120701, 126548, 127023, 127235, 218031, 171042, KO-T3-02-33338-3, KO-T3-02-33885-2 and
  • clones 304149, 120701, 126548, 127023, 127235, 218031, 171042, KO-T3-02-33338-3, KO-T3-02-33885-2 and KO-T3-02- 35172-2 identified as lines that segregate for embryonic or seedling lethal mutations.
  • the splitting was carried out for all lines as described in Example 3 or analogously to Example 3 for embryolethal mutations.
  • the embryolethal mutation means that the plants homozygous for the mutation stop their development at the emby stage and therefore do not germinate. Accordingly, the number ratio shifts to one third sensitive and two third resistant plants compared to the selection.
  • the molecular biological work and analyzes were carried out as described in Examples 1 to 3.
  • Line 304149 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • a 750 bp fragment was identified for line 304149 for the Muni enzyme, a 300 bp fragment for the Psp1406l / Bsp1191 enzymes and a 950 bp fragment for the Spei enzyme for the left T-DNA border.
  • a 300 bp fragment was identified for the right T-DNA border with the Spei enzyme. Sequencing of these fragments revealed the same insertion site.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 5 in position 35398 of the P1 clone MSH12, accession AB006704.
  • ORF MSH12.9 codes for a kobalamin synthesis protein.
  • Line 120701 segregates for an albinolethal mutation that cosegregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • line 120701 a 500 bp fragment for the left T-DNA border was identified for the enzyme BglII.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 4 in position 55170 of Bac clone ATT25K17, acession AL049171.
  • the ORF T25K17.110 is interrupted by the insertion within the coding area and thus deactivated.
  • This ORF T25K17.110 codes for an arginyl tRNA synthetase.
  • This ORF contains the EST: gb: AA404880, T76307.
  • Line 126548 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • a 1000 bp fragment for the left T-DNA border was identified for the enzymes Psp1406l / Bsp119l.
  • a 900 bp fragment was identified with the enzymes Psp1406l / Bsp1191 and a 300 bp fragment with the enzyme Bglll.
  • the sequencing of all PCR products demonstrated the insertion of the T-DNA at the same genomic site.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 4 in position 36872 of Bac clone ATF17A8, acession AL049482.
  • the ORF F17A8.80 is interrupted by the insertion within the coding area and thus inactivated.
  • This ORF F17A8.80 codes for putative protein similar to an RNA helicase from mouse (Mus musculus), PIR2: I84741.
  • Line 127023 segregates for an embryoiethal mutation that cosegregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • a 350 bp fragment was identified for the enzyme Bglll and a 900 bp fragment for the enzymes Psp1406l / Bsp1191, each for the left T-DNA border.
  • both fragments identified the identical insertion site.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 4 in position 61403 of the BAC clone ATT19P19, acession AL022605. This insertion interrupts the ORF AT4g39780 and thus deactivates it.
  • This ORF AT4g39780 codes for a putative protein with similarity to the protein RAP 2.4 from Arabidopsis thaliana which contains the AP2 domain.
  • This ORF also includes ESTs gb: T46584 and AA394543.
  • Line 127235 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • a 1600 bp fragment for the left T-DNA border was identified for line 127235 for the enzyme Muni.
  • a 600 bp fragment was identified for the right T-DNA border with the enzyme BglII. After sequencing, both fragments identified the identical insertion site.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 1 in position 10776 of BAC clone F9K20, accession AC005679. This insertion interrupts the ORF F9K20.4 and thus deactivates it.
  • This ORF F9K20.4 codes for a putative protein similar to the gill 786244 hypothetical 24.9 kD protein in the surA-hepA intergenic region yabO of the Escherichia coli genome gblAE000116, and to the hypothetical protein of the YABO family PFI00849. Furthermore, the protein encoded by ORF F9K20.4 has a conserved pseudouridylate synthase domain, which is involved in the modification of uracil in RNA molecules. Accordingly, the ORF F9K20.4 shows significant homology to various pseudouridylate synthases in a blastp comparison under standard conditions.
  • Line 218031 segregates for an albinolethal mutation that cosegregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • a 400 bp fragment for the left T-DNA border was identified for line 218031 for the enzyme BglII and this was then sequenced.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 2 in position 11909 of clone F3G5 with accession AC005896.
  • the ORF At2g37250 is inactivated by the insertion in the coding area. This ORF codes for a putative adenylate kinase.
  • Line 171042 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus the T-DNA.
  • a 1600 bp fragment for the left T-DNA border was identified for line 171042 for the enzymes Psp1406l / Bsp119l and this was then sequenced.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 3 in position 97005 of the Bac clone T29H11 with the accession AL049659.
  • the ORF T29H11_270 is deactivated by the insertion in the coding area. This ORF T29H11_270 codes for a putative protein similar to the pol polyprotein of the equine infectious anemia virus (PIR: GNLJEV).
  • the line KO-T3-02-33338-3 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • a 624 bp fragment for the left T-DNA border was identified for the enzyme Muni for the line KO-T3-02-33338-3 and this was then sequenced.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 5 in position 39500 of the P1 clone MJE7 with the accession AB020745.
  • the transcript of this ORF is presumably changed and thus the transcript stability is reduced. Accordingly, a reduced or completely blocked gene function for this ORF can be assumed.
  • the ORF MEF7.11 codes for an unknown protein.
  • the line KO-T3-02-33885-2 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • a 450 bp fragment for the left T-DNA border was identified for the enzymes Pspl 406I / Bsp1191 for the line KO-T3-02-33885-2.
  • a 650 bp fragment was identified for the right T-DNA border with the enzymes Psp1406l / Bsp119l. Both fragments identified the identical insertion site after sequencing.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 1 in position 76356 of Bac clone F14G9 with accession AC069159. By insertion in the coding area of ORF F14G9.26, this ORF is inactivated in these lines.
  • the ORF F14G9.26 codes for an unknown protein.
  • the line KO-T3-02-35172-2 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • a 700 bp fragment for the right T-DNA border was identified for the enzyme Muni and this was then sequenced.
  • the T-DNA is inserted on chromosome 5 in position 24422 of the P1 clone MAB16 with the accession AB018112. This 87bp insertion upstream of the ORF MAB16.6 most likely blocks the transcription of this ORF and thus switches off the gene.
  • the ORF MAB16.6 codes for a protein which only shows homology to other unknown proteins.
  • Example 5 Identification and analysis of lines 305861, 303814, KO-T3-02-132241, KO-T3-02-15114-2, KO-T3-02- 18601-1 and 304143 used for albinolethale
  • Line 305861 segregates for an albinolethal mutation that cosegregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • An approximately 1300 bp fragment for the left T-DNA border was identified for line 305861 for the enzyme combination Bgl II. Sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 16326 of the BAC T7B11, Accession AC007138 on chromosome 4.
  • the ORF T7B11.6 is interrupted and inactivated by the insertion into the open reading frame.
  • This ORF codes for a "preprotein translocase secA precursor" protein, it is therefore a chloroplastidA SecA protein which is responsible for the protein transport across the thylakoid membrane.
  • the insertion of the T-DNA into the named ORF was carried out by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • Line 303814 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • An approximately 1300 bp fragment for the left T-DNA border was identified for line 303814 for the enzyme combination Mun I.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 2027 of the BACs F2G19, Accession AC083835 on chromosome 1.
  • the ORF F2G19.1 is interrupted and inactivated by the insertion into the open reading frame.
  • This ORF codes for a protein with significant homology to the DCL protein from tomato, PIR: S71749. Furthermore, the protein has a so-called HMG signature, the high mobility group proteins that bind to DNA can bind.
  • the insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • the line KO-T3-02-13224-1 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • an approximately 500 bp fragment for the left T-DNA border was identified for the enzyme combination Bgl II.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 55170 of the BAC T25K17, Accession AL049171 on chromosome 4.
  • the insertion into the open reading frame interrupts and inactivates the ORF T25K17.110.
  • This ORF codes for an arginine tRNA ligase.
  • the insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • the line KO-T3-02-15114-2 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • An approximately 350 bp fragment for the left T-DNA border was identified for the enzyme combination Mun I for the line KO-T3-02-15114-2.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 6984 of the BAC T5N23, Accession AL138650 on chromosome 3.
  • the ORF T5N23.20 is interrupted and inactivated by the insertion into the open reading frame. This ORF encodes a plastid gluthathione reductase.
  • the insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • the line KO-T3-02-18601-1 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • An approximately 600 bp fragment for the right T-DNA border was identified for the enzyme combination Bgl II for the line KO-T3-02-18601-1.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 4026 of the BACs F22O13, Accession AC003981 on chromosome 1.
  • the insertion into the open reading frame interrupts and inactivates the ORF F22O13.2.
  • This ORF encodes a transcription initiation factor Sigma Homolog, hence a plant homologue to the Sigma subunit of bacterial RNA polymerase.
  • Line 304143 segregates for an albinolethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • an approximately 950 bp fragment for the right T-DNA border was identified for the enzyme Bgl II.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 79156 of the BACs F9O13 map mi398, accession AC006248 on chromosome 2. The insertion into the promoter, therefore approx.
  • the ORF At2g15680 codes for a putative calmudulin-like protein.
  • the insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • Example 6 Identification and analysis of lines KO-T3-02-403222-2, KO-T3-02-40309-1, KO-T3-02-40309-2, KO-T4-02-00666-4, KO- T4-02-00666-5, KO-T3-02-41568-2, KO-T3-02-42903-1,
  • Example 3 describe for seedling-lethal lines.
  • embrolethal mutation means that the plants homozygous for the mutation stop their development at the embyrost stage and therefore do not germinate. Accordingly, the number ratio shifts to one third sensitive and two third resistant plants compared to the selection.
  • the molecular-biological work and analyzes were carried out as described in Examples 1 to 3.
  • the line KO-T3-02-40322-2 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • an approximately 620 bp fragment for the left T-DNA border was identified for the restriction enzyme Mun I by means of adapter PCR. Sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 5261 of the BACs MPX5, Accession AP002048 on chromosome 3.
  • This ORF encodes a protein that is similar to an unknown protein.
  • the Insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • the line KO-T3-02-40309-1 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • an approximately 900 bp fragment for the right T-DNA border was identified by means of adapter PCR for the enzyme Mun I.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 38553 of the BACs F28O9, Accession AL137080 on chromosome 3.
  • the insertion in the promoter region about 24 bp upstream of the reading frame, prevents the transcription of the ORF F28O9.140 and thereby switched off the gene function.
  • This ORF codes for a protein with great similarity to INT6, a breast cancer-associated protein and with similarity to an "initiation factor 3" protein.
  • the insertion of the T-DNA into the named ORF was carried out by means of a control PCR which was carried out with a T- DNA-specific and an ORF-specific primer provided a fragment of the expected size, confirmed.
  • the line KO-T3-02-40309-1 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • KO-T3-02-40309-1 was identified by means of adapter PCR for the enzyme Mun I, an approximately 900 bp fragment for the right T-DNA border.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 38553 of the BAC F28O9, Accession AL137080 on chromosome 3.
  • the insertion in the promoter region approx. 515 bp upstream of the reading frame, prevents the transcription of the ORF F28O9.150 and thereby switched off the gene function.
  • This ORF codes for a protein with great similarity to the DNA helicase YGL150c from Saccharomyces.
  • the insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • KO-T4-02-00666-4 was identified by means of adapter PCR for the enzyme Bgl II an approximately 390 bp fragment for the left T-DNA border. Sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 9358 of the BACs MKN22, Accession AB019234 on chromosome 5. The insertion in the 3'-UTR region, approx. 82 bp downstream of the reading frame, most likely makes the transcript of the ORF MKN22.2 destabilized and thereby the gene function switched off. This ORF encodes a protein similar to an RNA binding protein. The insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • the line KO-T4-02-00666-4 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • an approximately 650 bp fragment for the left T-DNA border was identified by means of adapter PCR for the enzyme Spe I.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 48978 of the BACs MEE6, Accession AB010072 on chromosome 5.
  • the insertion into the open reading frame interrupts and inactivates the ORF MEE6.19.
  • This ORF encodes a protein that is very similar to an unknown protein.
  • the insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • the line KO-T3-02-41568-2 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • an approximately 500 bp fragment for the right T-DNA border was identified by means of adapter PCR for the enzyme Bgl II. Sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 6993 of the BAC T19L18, accession AC004747 on chromosome 2.
  • the insertion in the 3 ' UTR region approx. 285 bp downstream of the reading frame, most likely makes the transcript of the ORF At2g26150 destabilized and thereby switched off the gene function.
  • This ORF encodes a putative heat shock transcription factor.
  • the insertion of the T-DNA into the named ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • the line KO-T3-02-42903-1 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • an approximately 1300 bp fragment for the left T-DNA border was identified by TAIL-PCR for the degenerate primer ADP3 (5'-WGTGNAGWANCANAGA-3 ' ). Sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 25933 of the BAC T1 E2, Accession AC006929 on chromosome 2.
  • the ORF At2g28030 is interrupted and inactivated by the insertion into the open reading frame.
  • This ORF codes for a putative, chloroplastic protein that binds to the DNA nucleoid.
  • the insertion of the T-DNA into the named ORF was carried out by means of a control PCR which was carried out with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer provided a fragment of the expected size, confirmed.
  • the line KO-T3-02-41395-1 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • KO-T3-02-41395-1 was identified by means of adapter PCR for the enzyme Mun I, an approximately 910 bp fragment for the left T-DNA border.
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 153501 of the BACs ATCHRIV25, Accession AL161513 on chromosome 4.
  • the insertion into the gene interrupts and inactivates the ORF AT4g08990.
  • This ORF codes for a protein similar to a putative Met2-type cytosine DNA methyltransferase which is very similar to a DNA (cytosine-5 -) methyltransferase from Arabidopsis thaliana.
  • the insertion of the T-DNA into the mentioned ORF was confirmed by means of a control PCR, which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.
  • the line KO-T3-02-44634-4 segregates for an embryoiethal mutation that co-segregates with the resistance marker and thus with the T-DNA.
  • an approximately 800 bp fragment for the left T-DNA border was identified by TAIL-PCR for the degenerate primer ADP8 (5 ' -NTGCGASWGANWAGAA-3 ' ).
  • the sequencing of this fragment revealed the insertion of the T-DNA in this line at base pair position 16225 of the BACs F12B17, Accession AL353995 on chromosome 5.
  • the insertion into the open reading frame interrupts and inactivates the ORF F12B17_70.
  • This ORF codes for a putative protein similar to a postulated protein from Arabidopsis thaliana.
  • the insertion of the T-DNA into the named ORF was carried out by means of a control PCR; which provided a fragment of the expected size with a T-DNA-specific and an ORF-specific primer.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung. Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren enthaltend die Nukleinsäurekonstrukte, transgene Organismen und deren Verwendung. Ausserdem betrifft die vorliegende Erfindung Substanzen, die mit dem vorgenannten Verfahren identifiziert wurden.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung. Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren enthaltend die Nukleinsäurekonstrukte, transgene Organismen und deren Verwendung. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Substanzen, die mit dem vorgenannten Verfahren identifiziert wurden.
Eine moderne Landwirtschaft ist ohne den Einsatz von Herbiziden nicht denkbar. Gegenwärtig wird der Wert der auf der gesamten Welt eingesetzten Herbizide auf ca. 30 Mrd. DM geschätzt. Obwohl bereits eine ganze Reihe von hoch wirksamen und ökologisch unbedenklichen Herbiziden auf dem Markt sind, ergibt sich die Notwendig- keit für neue Herbizide zum einen aus der Tatsache, dass immer wieder Unkräuter eine Resistenz gegen bereits eingesetzte Herbizide entwickeln und diese somit zum Teil nicht mehr eingesetzt werden können, zum anderen aus der Tatsache, dass ein Teil der Herbizide ökologische Nachteile aufweist. Zum heutigen Zeitpunkt werden in vielen Fällen noch Herbizide als Mischungen eingesetzt werden, die mehrere aktive Wirkstoffkomponenten enthalten, was ökologisch wenig vorteilhaft ist und zudem besondere Anforderungen an die Formulierung stellt.
Neue Herbizide sollten sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Unbedenklichkeit sowie geringe Aufwandmengen aus- zeichnen.
Das bisherige Vorgehen bei der Identifizierung und Entwicklung neuer Herbizide ist durch die Applikation von potentiellen Wirkstoffen direkt auf geeignete Testpflanzen gekennzeichnet. Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, dass für die Tests relativ große Substanzmengen erforderlich sind. Dies ist im Zeitalter der kombinatorischen Chemie mit seiner in einer äußerst großen Vielfalt, aber nur in geringen Mengen herstellbaren Substanzen jedoch selten gegeben und stellt von daher eine wichtige Limitierung bei der Entwicklung neuer Herbizide dar. Zum anderen werden bei der direkten Applikation auf die zu testenden Pflanzen bereits im ersten Screeningschritt äußerst hohe Anforderungen an die Substanz gestellt, da nicht nur die Inhibierung oder sonstige Modulation der Aktivität eines zellulären Zieles (in der Regel ein Protein oder Enzym) erforderlich sind, sondern die Substanz dieses Ziel zunächst überhaupt erreichen muss, was bereits in diesem ersten Schritt Anforderungen an die Testsubstanz in Bezug auf Aufnahme durch die Pflanze, Permeabilität durch die ver- schiedenen Zellwände und Membranen, Persistenz zur Erreichung des gewünschten Effektes, und schließlich Inhibierung/Veränderung der Aktivität des gewünschten Zielenzyms erfordert.
Es ist angesichts dieser Erfordernisse daher nicht überraschend, dass zum einen die Identifizierung neuer Wirkstoffe immer höhere Kosten verursacht, zum anderen immer weniger Wirkstoffe entdeckt werden.
Es war deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Targets für die Identifizierung neuer Herbizide, sowie neue Herbizide und deren Verwendung zur Verfügung zu stellend Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass
a) die Expression oder die Aktivität des Genprodukts einer Nukleinsäure oder eines Gens umfassend:
aa) Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35,
SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz;
bb) Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen
Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34,
SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt;
cc) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Nukleinsäure- sequenzen ist, und mindestens 60 % Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist;
dd) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 ,SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
ee) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das von der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15,
SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten
Sequenz codiert wird;
ff) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten
Nukleinsäure codiert und das eine "Translation Releasing Factor"-Aktivität, eine Kobalamin-Synthese-Aktivität, Arginyl-tRNA-Synthase-Aktivität, eine
RNA-Helicase-Aktivität, eine GTP-Bindeprotein-Aktivität, eine Pseudo uridylat-Synthase-Aktivität, eine Adenylatkinase-Aktivität eine Preprotein- Translocase secA Precursorprotein-Aktivität, eine DCL-Protein-Aktivität, eine Arginin-tRNA-Ligase-Aktivität, eine plastidäre Gluthathion-Reduktase- Aktivität, eine Transkriptionsfaktor Sigma-Aktivität, eine Calmudulin-
Aktivität, eine INT6-Aktivität, eine Helikase YGL150c- Aktivität, eine RNA- bindende Aktivität, eine Hitzeschock-Transkriptionsfaktor-Aktivität, eine chloroplastidäre DNA-Nukleoid bindende Aktivität oder eine Met2-Typ Cytosin DNA Methyltransferase-Aktivität hat; und/oder gg) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20 % Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder
b) die Expression oder Aktivität einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz nach aa) bis gg) codiert wird,
beeinflusst wird und solche Substanzen ausgewählt werden, die die Expression oder die Aktivität reduzieren oder blockieren.
Unter "Expression" wird die Neusynthese in vitro und in vivo von Nukleinsäuren und durch Nukleinsäuren codierten Proteinen verstanden, insbesondere die der obenge- nannten Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen. Der Begriff "Expression" umfasst alle bis zum reifen Protein oder dessen Abbau führenden Biosyntheseschritte, z.B. Transkription, Translation, Modifizierung oder Prozessierung von Nukleinsäuren und/oder Proteinen, z.B. prae- oder posttranskriptionelle Prozessierungssch ritte oder posttranslationale Modifikationen, z.B. Splicing, Editing, Polyadenyiierung, Capping, Modifikationen von Aminosäuren, z.B. Glykosilierung, Methylierung, Acetylierung, Bindung von Coenzymen, Phosphorylierung, Ubiquitation, Bindung von Fettsäuren, Signalpeptidprozessierung, etc.
Wobei im Sinne der Erfindung unter "Transkription" die RNA-Synthese mithilfe einer RNA-Polymerase in 5"' 3'-Richtung anhand einer DNA-Matrize zu verstehen ist.
Unter "Translation" ist die Biosynthese von Proteinen in vitro und in vivo zu verstehen. Unter Genprodukt ist jedes Molekül und jede Substanz zu verstehen, die aufgrund der Expression, z.B. der Transkription oder Translation einer Nukleinsäure, z.B. einer DNA oder RNA, z.B. eines Gens, entsteht, wobei der Begriff auch die folgenden Prozessierungsprodukte, wie z.B. nach Splicing oder Modifizierung, umfasst. So wird unter Genprodukt z.B. eine prozessierte RNA, z.B. eine katalytische RNA wie ein Ribozym, eine funktionelle RNA, wie tRNAs oder rRNAs, oder eine codierende RNA, wie mRNA, verstanden. Als Folge der Translation einer mRNA wird ein Protein synthetisiert, das ebenfalls als "Genprodukt" verstanden wird. Proteine können während und nach der Translation verschiedenen Prozessierungsschritten unter- worfen sein, wie oben beispielhaft aufgezählt. Unter "Aktivität des Genprodukts" ist die biologische Aktivität bzw. Funktion einer RNA oder eines Proteins, wie beispielsweise die enzymatische Aktivität, die Transporteraktivität, die regulatorische Aktivität, die Rezeptorbindungseigenschaft, die Fähigkeit, bestimmte Proteine, Nukleinsäuren oder Metaboliten zu binden, z.B. in Proteinkomplexen, das heißt z.B. die regulative Eigenschaft oder die Transporterfunktion des Proteins oder der RNA, um nur einige zu nennen, zu verstehen, wie sie im Organismus natürlicherweise vorkommt. Unter "Reduktion der Aktivität des Genprodukts" ist eine Verringerung der biologischen Aktivität im Vergleich zur natürlichen Aktivität des Genprodukts von mindestens 10 %, vorteilhaft mindestens 20 % oder 30 %, bevorzugt mindestens 40 %, 50 % oder 60 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 %, 80 % oder 90 % und ganz besonders bevorzugt um mindestens 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu verstehen. Blockierung der Aktivität des Genprodukts bedeutet die gänzliche, das heißt 100 %ige Inhibierung der Aktivität oder die teilweise Blockierung der Aktivität, bevorzugt eine mindestens 80 %ige oder 90%ige, besonders bevorzugt mindestens 91%ige, 92%ige, 93%ige, 94%ige oder 95%ige, ganz besonders bevorzugt mindestens 95 %ige, 96%ige, 97%ige, 98%ige oder 99%ige Blockierung der biologischen Aktivität.
Eine Reduktion der Aktivität des Genprodukts kann auch indirekt erfolgen, z.B. in dem die Bildung oder Aktivität von Interaktionspartnern gehemmt wird, z.B. in dem die Stoffwechselkette, in die das Genprodukt eingebunden ist, beeinflusst wird. Z.B. kann eine Hemmung nicht nur des fraglichen Enzyms, sondern auch eines in derselben Stoffwechselkette stehenden Enzyms oder Proteins erfolgen, die zu einer Blockierung des folgenden, vorhergehenden oder eines anderen involvierten Enzyms führt und somit des hierin beschriebenen Genproduktes, z.B. durch Substrat- oder Produkthemmung. Solche Reduktionen durch indirekte Beeinflussung der Aktivität eines Enzyms ist z.B. für die Wechselwirkung der Glykolyseproteine und -metaboliten ausführlich beschrieben worden und leicht übertragbar auf andere Stoffwechselwege, in denen die hierin beschriebenen Genprodukte eine Rolle spielen. Genauso kann ein erfindungsgemäß verwendetes Genprodukt in seiner Aktivität reduziert oder gehemmt werden, in dem die Aktivität von Interaktionspartnern, z.B. anderen Proteinen in einem Proteinkomplex oder in einer Substrattransportkette mit dem hierin beschriebenen Genprodukt reduziert oder gehemmt wird. Das kann dazu führen, dass der gesamte Komplex oder der Substrattransport nicht mehr aktiviert oder nicht oder nur teilweise entsteht bzw. funktioniert oder nicht mehr regulierbar ist. Beispiele für solche Beeinflussung der Aktivität sind z.B. für Spleißosomen, Polymerasen, Ribosomen etc. beschrieben.
Unter "Fragment" wird eine Teilsequenz einer hierin beschriebenen Sequenz ver- standen, die weniger Nukleotide oder Aminosäuren umfasst, als die hierin beschrie- benen Sequenzen. Ein Fragment kann z.B. 1 %, 5 %, 10 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % der ursprünglichen Sequenz umfassen. Vorzugsweise umfasst ein Fragment 100, mehr bevorzugt 50, noch mehr bevorzugt weniger as 20 Aminosäuren der entsprechenden Nukleinsäuren.
Die Bedeutung der einzelnen Biosyntheseschritten ist dem Fachmann bekannt und kann z.B. in "Molecular Biology of the cell", Alberts, New York, 1998, "Biochemie" Stryer, 1988, New York, "Biochemieatlas", Michal, Heidelberg, 1999 oder in "Dictionary of Biotechnology", Coombs, 1992, nachgelesen werden.
Eine Ausführungsform betrifft somit ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Expression oder die Aktivität der genannten Nukleinsäuren oder Aminosäuren dadurch reduziert oder blockiert wird, dass die Transkription, Translation, Prozessierung und/oder Modifikation mindestens einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz reduziert oder blockiert wird. Erfindungsgemäß können ein, zwei, drei oder mehr Sequenzen in ihrer Aktivität reduziert oder blockiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen oder vorteilhaft in einem High-Throughput-Screening (HTS) durchgeführt werden und zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden. Im vorgenannten Verfahren können vorteilhaft auch Substanzen identifiziert werden, die mit den oben genannten Nukleinsäuren bzw. mit deren Genprodukten interagieren, diese Substanzen sind potentielle Herbizide, die über die klassische chemische Synthese in ihrer Wirkung weiter verbessert werden können.
Nach dem Verfahren identifizierte bzw. ausgewählte Substanzen können vorteilhaft auf eine Pflanze verbracht werden, um die herbizide Aktivität der Substanzen zu testen. Es werden solche Substanzen auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen. In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens können die Substanzen auch neben dem vorgenannten in vivo-Testverfahren auch in einem in vitro Test identifiziert werden. Ein derartiger in vitro Test mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. deren Genprodukten hat den Vorteil, dass die Substanzen rasch und einfach auf ihre biologische Wirkung hin gescreent werden können. Derartige Test eignen sich auch vorteilhaft für das sog. HTS.
Das Verfahren kann mit freien Nukleinsäuren wie DNA oder RNA, freien Genprodukten oder vorteilhaft in einem Organismus durchgeführt werden, wobei als Organismus eukaryontische oder prokaryontische Organismen wie vorteilhaft gram-negative oder gram-positive Bakterien, Hefen, Pilze oder vorteilhaft Pflanzen wie monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden. Als Organismen werden vorteilhaft konditionale oder natürliche Mutanten verwendet, die die Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 betreffen. Unter konditionalen Mutanten sind Mutanten zu verstehen, die erst nach Induktion eine Reduktion der Expression, z.B. der Transkription oder der Translation der vorher genannten Nukleinsäuren oder der durch sie codierten Genprodukte, aufweisen. Ein Beispiel derartiger konditionaler Mutanten sind Mutanten, in denen die Nukleinsäuren hinter einem temperatursensitiven Promotor liegen, der bei höheren Temperaturen nicht mehr funktioneil ist, das heißt der die Transkription bei höheren Temperaturen beispielsweise oberhalb 37°C verhindert. Ebenfalls möglich ist beispielsweise eine Expressionsregulation durch ein Effektor-Molekül, z.B. bei Kontrolle der Expression durch einen regulierbaren Promotor, wie z.B. der im Tet-Systeme (Gatz et al., Plant J. 2, 1992:397-404, Tetracyclin-induzierbar) verwendete oder die in EP-A-0 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), EP-A-0335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten von Proteinen, die durch eine Nukleinsäuresequenz wie sie in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz,
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt,
c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37,
SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Nuklein- säuresequenzen ist, und mindestens 60 % Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist;
d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz codiert wird; f) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert wird und das eine "Translation Releasing Factor"-Aktivität, eine Kobalamin-Synthese-Aktivität, Arginyl-tRNA-Synthase-Aktivität, eine RNA- Helicase-Aktivität, eine GTP-Bindeprotein-Aktivität, eine Pseudouridylat- Synthase-Aktivität, eine Adenylatkinase-Aktivität, eine Adenylatkinase-Aktivität, eine Preprotein-Translocase secA Precursorprotein-Aktivität, eine DCL-Protein- Aktivität, eine Arginin-tRNA-Ligase-Aktivität, eine plastidäre Gluthathion- Reduktase-Aktivität, eine Transkriptionsfaktor Sigma-Aktivität, eine Calmudulin- Aktivität, eine INT6- Aktivität, eine Helikase YGL150c- Aktivität, eine RNA- bindende Aktivität, eine Hitzeschock-Transkriptionsfaktor-Aktivität, eine chloro- plastidäre DNA-Nukleoid bindende Aktivität oder eine Met2-Typ Cytosin DNA Methyltransferase-Aktivität hat; und/oder
g) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12,
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20 % Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder
codiert werden, indem folgende Verfahrensschritte durchlaufen werden
i) Inkontaktbringen von Zellen, die das Protein exprimieren, oder des Proteins mit einem Kandidatenstoff;
ii) Testen der biologischen Aktivität des Protein;
iii) Vergleichen der biologischen Aktivität des Proteins mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei eine Verringerung der biologischen Aktivität des Proteins anzeigt, dass der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.
Unter ii) wird das Testen einer der oben beschriebenen biologischen Aktivitäten beschrieben, z.B. eine Enzymaktivität, wie sie in den Beispielen angegeben ist oder eine Bindung, vorzugsweise eine starke Bindung zwischen Protein- und Kandidatenstoff. In einer vorteilhaften Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens wird/werden der/die unter Buchstabe iii) identifizierte(n) Antagonist(en) auf eine Pflanze verbracht, um seine/ihre herbizide Aktivität zu testen und der/die Antagonist(en) ausgewählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen in vivo oder in vitro und/oder vorteilhaft gemeinsam oder besonders vorteilhaft in einem High-Throughput-Screening durchgeführt werden und zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten bzw. selektierten Nukleinsäure- sequenzen sind für das Wachstum und die Entwicklung von höheren Pflanzen essentiell. Die Unterdrückung der Bildung der Genprodukte, d.h. der Expression, z.B. durch die spezifische Beeinflussung von z.B. Translation, Transkription oder Prozessierung und/oder der Unterdrückung der von den codierten Genprodukten ausgeübten Funktion bzw. biologischen Aktivität in intakten Pflanzen durch Substanzen vorteilhaft niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, vorteilhaft mit einem Ki-Wert von kleiner 10"7, vorteilhaft kleiner 10"8, bevorzugt kleiner 10"9 M, vorteilhaft sollte dabei diese Hemmwirkung auf ein spezifische Hemmung des biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine zurückzuführen sein, das heißt es sollte keine Hemmung durch diese niedermolekularen Substanzen weiterer nahe verwandter Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine erfolgen. Weiterhin sollten die niedermolekulare Substanzen vorteilhaft ein Molekulargewicht von größer 50 Dalton, bevorzugt größer 100 Dalton, besonders bevorzugt größer 150 Dalton, ganz besonders bevorzugt größer 200 Dalton haben. Vorteilhaft sollten die niedermolekularen Substanzen weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom- enthaltenden Ring haben. Weiterhin sollten auch keine freie(n) Säure- oder Lacton- Gruppe(n) sowie keine Phosphatgruppe und nicht mehr als eine Aminogruppe im Molekül enthalten sein. Auch Basen wie Adenosin im Molekül sind weniger bevorzugt. Die über das erfindungsgemäße Verfahren identifizierten Substanzen vorteilhaft die niedermolekularen Substanzen, aber auch proteinogene Substanzen oder Sense- oder Antisense-RNA oder Antikörper oder Antikörperfragment führen durch ihre inhibitorischen Wirkungen vorteilhaft zu einer massiven Veränderungen des Wachstums und der Entwicklung der behandelten bzw. betroffenen Pflanzen. Die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen sind deshalb in der Landwirtschaft als Herbizide geeignet. Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 sind essentiell für Organismen, bevorzugt für Pflanzen. Ihre Unterbrechung bzw. die Blockierung ihrer Expression stoppt die Entwicklung von Pflanzen in einem frühen Entwicklungsstadium. Die Genprodukte der genannten Sequenzen sind z.B. den Polypeptiden der Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 zu entnehmen.
SEQ ID NO: 1 , deren Expression in Linie 303317 blockiert ist, codiert für ein Protein (F2809.40), das Ähnlichkeiten zu translation releasing factor RF-2 aus Synechocystis sp. (PIR:S76448) aufweist und das auf Chromosom 3 (BAC ATF2809, Accession AL137080) von Arabidopsis liegt. Weiterhin besitzt das Protein die araC-Familien- signature.
SEQ ID NO: 3, deren Expression in Linie 304149 blockiert ist, codiert für ein "Kobal- amin-Synthese"-Protein (MSH 12.9), das auf Chromosom 5 (P1-Klon MSH12, Accession AB006704) von Arabidopsis liegt.
SEQ ID NO: 5, deren Expression in Linie 120701 blockiert ist, codiert für einen ORF (T25K17.110) auf Chromosom 4 (BAC ATT25K17, Accession AL049171), der möglicherweise für eine Arginyl-tRNA-Synthetase codiert. Dieser ORF beinhaltet den EST: gb:AA404880, T76307.
SEQ ID NO: 7, deren Expression in Linie 126548 blockiert ist und auf Chromosom 4 des Arabidopsis Genoms (BAC ATF17A8, Accession AL049482) lokalisiert ist, codiert für ein putatives Protein (F17A8.80) mit Ähnlichkeit zu einer RNA-Helicase aus Maus (Mus musculus, PIR2:I84741).
Von SEQ ID NO: 9, deren Expression in Linie 127023 blockiert ist, wird ein putatives Protein (AT4g39780) codiert, das auf Chromosom 4 (BAC ATT19P19, Accession number AL022605) lokalisiert ist und das Homologien zu dem die AP2-Domäne enthaltenden Protein RAP 2.4 aus Arabidopsis thaliana hat. Zudem beinhaltet der ORF die ESTs gb:T46584 und AA394543.
SEQ ID NO: 11, deren Expression in Linie 127235 blockiert ist, codiert für den ORF F9K20.4, der auf Chromosom 1 (BAC F9K20, Accession AC005679) von Arabidopsis lokalisiert ist. Dieser ORF F9K20.4 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu gill 786244 einem hypothetischen 24.9 kD Protein in der surA-hepA intergenischen Region yabO des Escherichia coli Genoms und zu gblAE000116 einem hypothetischen Protein der YABO Familie PFI00849. Weiterhin besitzt das durch den ORF F9K20.4 codierte Protein eine konservierte Pseudouridylat-Synthase-Domäne, welche an der Modifizierung von Uracil in RNA-Molekülen beteiligt ist. Demnach zeigt der ORF F9K20.4 im blastp- Vergleich unter Standardbedingungen signifikante Homologie zu verschiedenen Pseudouridylat-Synthasen.
SEQ ID NO: 13, deren Expression in Linie 218031 blockiert ist, codiert für eine putative Adenylatkinase (At2g37250). Der ORF At2g37250 ist auf Chromosom 2 des Klons F3G5 (Accession AC005896) von Arabidopsis lokalisiert.
Das von SEQ ID NO: 15 codierte putative Protein (ORF T29H11_270, Accession AL049659), dessen Expression in Linie 171042 blockiert ist, zeigt Ähnlichkeit zu dem pol Polyprotein des "Equine Infectious Anemia Virus (PIR:GNLJEV). Die Sequenz befindert sich auf Chromosom 3 des BAC-Klons T29H11 von Arabidopsis.
SEQ ID NO: 17, dessen Expression in Linie KO_T3_02-33338-3 blockiert ist, befindet sich auf Chromosom 5 des P1 -Klons MJE7 (Accession AB020745). Die Sequenz codiert für ORF MEJ7.11. Bei ORF MEJ7.11 handelt es sich um ein unbekanntes Protein.
SEQ ID NO: 19, dessen Expression in Linie KO_T3_02-33885-2 blockiert ist, codiert für ein unbekanntes Protein (= ORF F14G9.26). Der ORF befindet sich auf Chromosom 1 des BAC-Klons F14G8 mit der Accession AC069159.
SEQ ID NO: 21 , dessen Expression in Linie KO_T3_02-35172-2 blockiert ist, codiert für ein unbekanntes Protein. Der ORF MAB16.6 hat nur Homologien zu anderen unbekannten Proteinen. Die Sequenz befindet sich auf Chromosom 5 des P1 -Klons MAB16 mit der Accession AB018112.
SEQ ID NO: 23, dessen Expression in Linie 305861 blockiert ist, codiert für ein
„Preprotein Translocase secA Precursor" Protein, daher für ein chloroplastidäres SecA-Protein für den Proteintransport über die Thylakoidmembran . Dieser ORF findet sich mit der Accession T7B11.6, AC007138, auf dem BAC-Klon T7B11 des Chromosoms 4.
Das von SEQ ID NO: 25 (= Linie 303814) codierte Protein mit der Accession F2G19.1 , das signifikante Homologie zum DCL-Protein aus Tomate hat (PIR: S71749), findet sich auf dem BAC-Klon F2G19,Accession-Number AC083835, des Chromosoms 1.
SEQ ID NO: 27 (= Linie KO-T3-02-13224-1 ) kodiert für eine Arginin-tRNA-Ligase mit der Accession T25K17.110. Dieser ORF liegt auf dem BAC-Klon T25K17 mit der Accession-Number AL049171 und damit auf Chromosom 4.
SEQ ID NO: 29 (= Linie KO-T3-02-15114-2) codiert für eine plastidäre Gutha- thion-Reduktase. Dieser ORF mit der Accession T5N23.20 ist auf dem BAC- Klon T5N23, Accession-Number AL138650 auf Chromosom 3 annotiert.
SEQ ID NO: 31 (= Linie KO-T3-02-18601-1) codiert für ein Transkriptionsinitiations- faktor Sigma Homologes. Dieser ORF mit der Accssion F22O13.2 ist auf dem BAC- Klon T22O13, Accession-Number AC003981 , auf Chromosom 1 annotiert.
Durch SEQ ID NO: 33 (= Linie 304143) wird ein putatives Calmudulin-ähnliches Protein codiert. Dieser ORF mit der Accession At2g15680 ist auf dem BAC-Klons F9O13 mit der Accession-Number AC006248 auf Chromosom 2 annotiert.
Der von SEQ ID NO: 35 (= Linie KO-T3-02-40322-2) codierte unbekannte ORF MPX5.1 ist auf dem BAC-KlonMPX5 ,Accession-Number AP002048, auf Chromosom 3 annotiert.
SEQ ID NO: 37 (= Linie KO-T3-02-40309-1 ) codiert für ein Protein mit großer Ähnlichkeit zu INT6, einem brustkrebsassoziierten Protein und mit Ähnlichkeit zu einem „Initiationsfaktor 3" Protein. Dieser ORF mit der Accession F28O9.140 ist auf dem BAC-Klon F28O9, Accession-Number AL137080, auf Chromosom 3 annotiert.
Das von SEQ ID NO: 39 (= Linie KO-T3-02-40309-1 ) codierte Protein hat große Ähnlichkeit zur DNA Helikase YGL150C aus Saccharomyces. Dieser ORF mit der Accesion F28O9.150 ist auf dem BAC-Klon F28O9, Accession-Number AL137080, auf Chromosom 3 lokalisiert.
SEQ ID NO: 41 (= Linie KO-T4-02-00666-4) codiert für ein Protein mit Ähnlichkeit zu einem RNA-bindenden Protein. Dieser ORF mit der Accession MKN22.2 befindet sich auf dem BAC-Klon MKN22, Accession-Nummer AB019234 des Chromosoms 5. Von SEQ ID NO: 43 (= Linie KO-T4-02-00666-4) wird ein unbekanntes Protein codiert. Dieser ORF mit der Accession MEE6.19 ist auf demBAC-Klon MEE6, Accession- Number AB010072, auf Chromosom 5 annotiert.
SEQ ID NO: 45 (= Linie KO-T3-02-41568-2) codiert für einen putativen Hitzeschock- Transkriptionsfaktor. Dieser ORF mit der Accession At2g26150 ist auf dem BAC- Klon T19L18, Accession-Number AC004747, auf Chromosom 2 lokalisiert..
Der in SEQ ID NO: 47 (= Linie KO-T3-02-42903-1 ) dargestellte ORF At2g28030 codiert für ein putatives chloroplastidäres an das DNA-Nukleoid bindende Protein. Dieser ORF At2g28030 ist auf dem BAC-Klon T1 E2, Accession-Number AC006929, auf Chromosom 2 annotiert..
SEQ ID NO: 49 (= Linie KO-T3-02-41395-1) codiert für ein Protein mit Ähnlichkeit zu einer putativen Met2-Typ Cystosin DNA-Methyltransferase und weist starke Ähnlichkeit zu einer DNA-(cystosin-5-)-Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana auf.. Dieser ORF mit der Accession AT4g08990 ist auf dem BAC-Klon ATCHRIV25, Accession- Number AL161513, auf Chromosom 4 annotiert.
Von SEQ ID NO: 51 (= Linie KO-T3-02-44634-4) wird ein Protein codiert, das große Ähnlichkeit zu einem postulierten Protein aus Arabidopsis thaliana hat. Dieser ORF mit der Accesion F12B17_70 ist auf dem BAC-Klon F12B17, Accession-Number AL353995, auf Chromosom 5 lokalisiert. Die genannten Sequenzen wurden alle in Arabidopsis identifiziert.
Die Unterdrückung der Bildung der Genprodukte bzw. Unterdrückung der von den codierten Genprodukten ausgeübten Funktion oder Aktivität in intakten Pflanzen durch eine niedermolekulare Substanz führt zur Reduzierung, bevorzugt zur Unterdrückung des Wachstums; die Entwicklung der Pflanze wird massiv verändert und unterdrückt. Sie sind deshalb zur Identifizierung von Herbiziden vorteilhaft geeignet.
Die vorgenannten Sequenzen oder funktionale Teile davon ermöglichen die Identifizierung von in der Landwirtschaft nutzbaren Herbiziden beispielsweise über ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellung zweier Linien eines Organismus, die die Genprodukte, die durch eine für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Sequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 codiert werden oder den beschriebenen
Derivaten oder Fragmenten davon, die die biologische Aktivität dieser Sequenzen aufweisen, funktional exprimieren, wobei die Expression der Linien unterschiedlich hoch ist, z.B. durch Mutagenese einer Linie und Identifizierung einer Mutante mit erhöhter oder erniedrigter Expression und/oder Aktivität des genannten Genprodukts im Vergleich zur Ausgangslinie oder, z.B. durch
Erzeugung von rekombinanten Organismen, vorteilhaft transgenen Pflanzen, Pflanzengeweben wie Geweben von beispielsweise Blatt, Wurzel, Spross oder Stamm, Pflanzensamen, Pflanzenkalli oder Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäß beschriebenen Sequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 oder Derivate oder Fragmente davon, die die biologische Aktivität dieser Sequenzen besitzen, funktional exprimieren;
b) Zugabe von chemischen Verbindungen (die auf ihre Herbizidaktivität getestet werden sollen) zu den Linien mit den unterschiedlichen Expressions- oder Aktivi- tätsleveln des Genprodukts, z.B. zu den unter a) genannten rekombinanten
Organismen und nicht-rekombinanten Ausgangsorganismen mit einem anderen, vorzugsweise geringeren Expressions- oder Aktivitätslevel des Genprodukts;
c) Bestimmung der biologischen Aktivität, beispielsweise der enzymatischen Aktivität, des Wachstums oder der Vitalität der beiden Linien, z.B. der rekombinanten Organismen, im Vergleich zu den nicht-rekombinanten Ausgangsorganismen, nach Zugabe von chemischen Verbindungen gemäß Punkt b); und
d) Selektion der chemischen Verbindungen, die die biologische Aktivität, beispiels- weise die enzymatische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Linie mit der geringeren Aktivität reduziert oder vollständig hemmt bzw. blockiert, z.B. die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der nicht rekombinanten Organismen, der gemäß Punkt c) bestimmten chemischen Verbindungen, im Vergleich zu den behandelten rekombinanten Organismen reduzieren oder vollständig hemmen bzw. blockieren. Ein in der Landwirtschaft nutzbares Herbizid kann auch identifiziert werden, wenn die oben in
a) erzeugten rekombinanten Organismen in einem Verfahren getestet werden, das folgende Schritte umfasst:
(b) Zugabe von chemischen Verbindungen, die auf ihre Herbizidaktivität getestet werden sollen, zu den unter (a) genannten rekombinanten Organismen; und
(c) Bestimmung der biologischen Aktivität, beispielsweise der enzymatischen Aktivität, des Wachstums oder der Vitalität der rekombinanten Organismen nach Zugabe von chemischen Verbindungen gemäß (b) im Vergleich zu denselben nicht behandelten rekombinanten Organismen; und
(d) Selektion der chemischen Verbindung, die die biologische Aktivität, z.B. die enzymatische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der behandelten Organismen im Vergleich zu den unbehandelten Organismen reduziert oder vollständig hemmt oder blockiert.
Unter chemischen Verbindungen, die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Organismen reduzieren, sind Verbindungen zu verstehen, die die biologische Aktivität, das Wachstum oder die Vitalität der Organismen mindestens um 10 %, 20 % oder 30 %, vorteilhaft um mindestens 40 %, 50 % oder 60 %, bevorzugt um mindestens 70 %, 80 oder 90 %, besonders bevorzugt um mindestens 91 %. 92 %, 93 %, 94 % oder 95 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % hemmen, d.h. reduzieren oder blockieren.
Vorteilhaft ist insbesondere eine Substanz, die die Zelllinien mit geringer Aktivität schädigen oder, vorzugsweise, die letal ist, jedoch nicht Zelllinien, die eine höhere Aktivität des Genproduktes aufweisen, schädigt oder für diese letal ist.
Allgemein können in dem genannten Verfahren Linien von Organismen eingesetzt werden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen und insbesondere die Genprodukte, die durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren codiert werden, exprimieren, die jedoch nicht rekombinant sind, solange eine Linie eine höhere Genexpression oder Aktivität des Genprodukts aufweist als eine andere Linie. Solche Linien können natürlich auftreten oder durch Mutagenesen erzeugt werden. Assaysysteme, die die Identifizierung von Substanzen, die die Bildung der Genprodukte und/oder die von den Genprodukten ausgeübten Funktionen oder die Aktivität der Genprodukte in intakten Pflanzen, Pflanzenteilen, -geweben oder Pflanzenzellen unterdrücken, sind dem Fachmann bekannt. Beispielhaft sei hier auf Testsysteme für die Inhibierung von Enzymen wie der Adenylat-Kinase wie von Skoblov et al. (FEBS Letters, 395 (2-3), 1996: 283-285), von Rüssel et al. (J. Enzyme Inhib., 9 (3), 1995: 179-194 und ), Wiesmüller et al. (FEBS Letters, 363, 1995: 22-24) oder Schlattner et al. (Phytochemistry, 42, 1996: 589-594) beschrieben, verwiesen. Diese Testsysteme können beispielsweise vorteilhaft für sog. Inhibierungsassays für beispielsweise das in Linie 218031 identifizierte Genprodukt verwenden.
Weitere vorteilhafte Assaysysteme sind beispielsweise die Fluoreszenz-Korrelations- spectroskopie (= FCS). Mit Hilfe der FCS (Brock et al., PNAS, 1999, 96, 10123-10128; Lamb et al., J. Phys. Org. Chem., 2000, 13654-658) ist es möglich, die zeitliche Diffusion von Molekülen zu messen bzw. die Differenz der gebundenen gegenüber den freien Molekülen zu ermitteln. Hierzu werden die zu untersuchenden Moleküle fluoreszenzmarkiert und beispielsweise ein definiertes Volumen in Mikrotiterplatten gegeben. Die Fluktuation der Moleküle wird in den Proben dabei von der Braunschen Molekularbewegung getrieben. Durch einen in der Probe fokusierten Laser lassen sich die translateralen bzw. rotationale Diffusion und Konformationsänderungen der Moleküle verfolgen und über eine Korrelation analysieren. Durch Bindung an andere Substanzen ändert sich der Diffusionskoeffizient der Moleküle. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen lässt sich die Bindung der Moleküle über die Änderung des Diffusionskoeffizienten ermitteln bzw. quantifizieren. Mit dieser Methode kann in einem breiten Konzentrationsbereich vorteilhaft gemessen werden. Die Methode eignet sich vorteilhaft für die Messung von rekombinanten Proteinen, die vorteilhaft mit einem sog. His- Tag zur leichteren Auf reinigung über handelsübliche Chromatographie-Säulen (Porath et al., Nature 1975, 258, 598-599) versehen sind. Das so gereinigte Protein wird schließlich mit einem Fluoreszenzmarker wie z.B. Carboxytetramethylrhodamin oder BODIPY® (z.B. BODIPY 576/589 Angiotensin II, NEN® Life Science Products, Boston, MA, USA) versehen. Die zu untersuchende Verbindung bzw. Substanz wird zu dem Protein anschließend in einem Überschuss zugegeben. Die Diffusion des so markierten Proteins wird schließlich mit einem FCS-System (z.B. ConfoCor2 mit LSM 510, Carl Zeiss Mikroskop, Jena, Deutschland) ermittelt.
Eine weitere vorteilhafte Detektions-Methode für das erfindungsgemäße Verfahren ist die sog. "Surface Enhanced Laser Desorption lonisation"-Methode (= SELDI Protein- Chip®). Diese Methode wurde von Hutchens und Yip (1980) erstmals beschrieben. Mit dieser Methode, die für die reproduzierbare, gleichzeitige Identifizierung von Bio- markern oder Antigenen entwickelt wurden (Hutchens und Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom, 1993, 7, 576-580), kann die Ligand-Protein-Bindung über Massenspektro- metrie analysiert werden. Dabei erfolgt die Detektion über normale TOF-Detektion (= time of flight). Auch bei dieser Methode können rekombinant exprimierte Proteine wie oben beschrieben exprimiert und gereinigt werden. Zur Messung wird das Protein auf den SELDI ProteinChips® immobilisiert, beispielsweise über die schon zur
Reinigung verwendeten His-Tags oder über Ionen- oder hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Chip. Auf diesen so vorbereiteten Chip werden anschließend die Liganden mit beispielsweise einem Autosampier gegeben. Nach einem oder mehreren Waschschritten mit Puffern verschiedener lonenstärke werden die gebundenen Liganden mit dem LDI-Laser analysiert. Dabei wird die Bindungsstärke der Liganden nach jedem Waschschritt ermittelt.
Als weitere vorteilhafte Dektionsmethode sei die sog. Biacore-Methode genannt, bei der der Refraktionsindes an der Oberfläche bei Bindung von Liganden and das an der Oberfläche gebundene Protein analysiert wird. Bei dieser Methode wird eine Kollektion von kleinen Liganden sequentiell in eine Messzelle mit dem gebundenen Protein gegeben. Die Bindung an der Oberfläche wird über eine erhöhte sog. "Plasmon- Resonanz" (= SPR) über die Aufzeichnung der Laserrefraktion von der Oberfläche ermittelt. Im allgemeinen ist die Refraktionsindexänderung, die für eine Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche, ermittelt wird für alle Proteine oder Polypeptide gleich, das heißt diese Methode kann vorteilhaft für die verschiedensten Proteine verwendet werden. (Liedberg et al., Sens. Actuators, 1984, 4, 299-304). Wie oben beschrieben werden auch hier vorteilhaft rekombinant exprimierte Proteine verwendet, die an den Biacore Chip (Upsala, Schweden) beispielsweise über Histidin- Reste (z.B. His-Tag) gebunden werden. Der so hergestellte Chip wird wieder mit den Liganden in Verbindung gebracht z.B. mit einem Autosampier und die Bindung über ein von Biacore vertriebenes Detektionssystem mit Hilfe des SPR-Signals d.h. über die Änderung des Refraktionsindex gemessen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren haben eine Reihe von Vorteilen wie beispielsweise:
* neue potentielle Angriffsorte für herbizide Wirkstoffe können identifiziert werden,
* Identifizierung von Herbiziden, die eine möglichst umfassende, Pflanzenspezies unabhängige Wirkung haben,
* Substanzen, die mittels der kombinatorischen Chemie erzeugt wurden, und die sich durch eine hohe Vielfalt, aber geringe zur Verfügung stehende Mengen auszeichnen, können effizient auf Inhibitoren der neu identifizierten Angriffsorte geprüft werden * sie erlauben, landwirtschaftlichen Nutzpflanzen im Fall von z.B. sehr breite Wirksamkeit aufweisenden Herbiziden (Totalherbiziden oder auch selektiven Herbiziden) Resistenz gegenüber diesen zu vermitteln (siehe Beschreibung im folgenden)
Z.B. können Substanzen, die besonders spezifisch mit z.B. einem Protein oder Proteinfragment binden, das von einer Nukleinsäure codiert wird, deren Expression essentiell für das Wachstum der Pflanzen ist, mit den genannten Verfahren isoliert werden. Dies ermöglicht eine vereinfachte Identifikation möglicher Inhibitoren, die Proteine, z.B. in ihren Enzymeigenschaften, Bindeeigenschaften oder sonstigen Aktivitäten hemmen, z.B. auch durch die Inhibierung ihrer Prozessierung, wie oben beschrieben, oder ihren Transport innerhalb der Zelle oder Im- und Export aus Organellen oder Zellen verhindern. Die so identifizierten Substanzen können auch in einem weiteren Schritt in Screening-Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, auf Pflanzen aufgebracht werden und auf ihre Beeinflussung des Wachstums und der Entwicklung hin untersucht werden. Somit wird eine Auswahl aus der unendlichen Zahl chemischen Verbindungen, die sich für ein Screeningverfahren eignen würden, getroffen, die es dem Fachmann wesentlich erleichtert, herbizide Substanzen zu identifizieren.
Unter "spezifische Bindung" versteht man die Spezifität von Interaktionen zwischen zwei Partnern, z.B. Proteinen untereinander oder von Protein (Enzym) und Substrat (Substratspezifität). Sie beruht auf einer bestimmten molekularen räumlichen Struktur. Wird sie zerstört, spricht man von Denaturierung, die oftmals irreversibel ist und wodurch die Spezifität meistens verloren gehen kann. Diese biologische Aktivität ist stark abhängig von den Umgebungsbedingungen (Puffer, Temperatur, Kontakte zu unphysiologische Oberflächen wie Glas oder fehlende Cofaktoren). Bei Enzym- Substrat oder Cofaktor, bei Rezeptor-Ligand oder bei Antikörper-Antigen Bindungen spricht man von spezifischen Bindungen. Die Enzym-Substrat Wechselwirkung wird thermodynamisch im einfachsten Fall mit der Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben. Sie beschreibt die Enzymaktivität über die sog. Michaelis-Menten-Konstante, die wiederum die Kinetik wiederspiegelt. Diese Konstante ist auch die Maßeinheit für die Enzymaktivität, die wiederum die Spezifität wiederspiegelt. Definition der Enzym- aktivitätseinheit (nach IUB): Eine Einheit U entspricht derjenigen Enzymmenge, welche die Umsetzung von einem Mikromol Substrat pro Minute unter genau festgelegten Versuchsbedingungen katalysiert. Die spezifische Aktivität wird meist in U/mg angegeben. In einem weiteren Schritt können dann die identifizierten Substanzen auf Pflanzen, Mikroorganismen oder Zellen aufgebracht werden, z.B. auf Pflanzenzellen, und dann die Beeinflussung des Stoffwechsels dieser Pflanzen beobachtet werden, z.B. Enzymaktivitäten, Photosyntheseaktivitäten, Stoffwechselaktivität, Fixierungsrate, Gasaus- tausch, DNA-Synthese, Wachstumsraten. Diese und viele andere dem Fachmann bekannte Methoden eignen sich, um die Viabilität von Zellen zu untersuchen. Substanzen, die das Wachstum, z.B. von Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, reduzieren, insbesondere blockieren, eignen sich dann bevorzugt als Auswahl für herbizide Mittel.
Weiterhin können schon in einem sehr frühen Stadium Untersuchungen zu den Aufwandmengen der gefundenen Herbizide gemacht werden. Außerdem kann die hohe Spezifität und Effizienz gegenüber Unkräutern leicht ermittelt werden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Substanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren pflanzlicher Proteine, die durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen codiert werden, mit potentiell herbizider Wirkung indem man die Genprodukte kloniert, in einer geeigneten Expressionskassette - beispielsweise in Insektenzellen - zur Überexpression bringt, die Zellen öffnet und den Zellextrakt direkt bzw. nach Anreicherung oder Isolierung des Proteins in einem Testsystem zur Messung der biologischen Aktivität in Gegenwart von niedermolekularen chemischen Verbindungen einsetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb Substanzen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanzen vorteilhaft niedermolekulare Substanzen mit einem Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, vorteilhaft mit einem Ki-Wert von kleiner 10"7, vorteilhaft kleiner 10"8, bevorzugt kleiner 10'9 M sind, vorteilhaft sollte dabei diese Hemmwirkung auf ein spezifische Hemmung des biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine zurückzuführen sein, das heißt es sollte keine Hemmung durch diese niedermolekularen Substanzen weiterer nahe verwandter Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine erfolgen. Weiterhin sollten die bevorzugten nieder- molekularen Substanzen vorteilhaft ein Molekulargewicht von größer 50 Dalton, bevorzugt größer 100 Dalton, besonders bevorzugt größer 150 Dalton, ganz besonders bevorzugt größer 200 Dalton haben. Vorteilhaft sollten die niedermolekularen Substanzen weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring haben. Weiterhin sollten keine freie(n) Säure- oder Lacton-Gruppe(n) sowie keine Phosphatgruppe und nicht mehr als eine Aminogruppe im Molekül enthalten sein. Auch Basen wie Adenosin im Molekül sind weniger bevorzugt.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Substanzen handelt es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz, um eine Antisense-RNA, eine inhibierende oder eine interferierende RNA (RNAi).
Der Begriff "sense" bezieht sich auf den Strang einer doppelsträngigen DNA der homolog zu dem mRNA-Transkript ist. Der "Antisense"-Strang enthält eine invertierte Sequenz, die komplementär zu der des "Sense"-Strangs ist. Ein Antisense-Nuklein- säuremolekül umfasst z.B. eine Nukletidsequenz, die komplementär zu dem "Sense"- Nukleinsäuremolekül ist, das ein Protein oder eine aktive RNA codiert, z.B. komplementär zu dem codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz. Folglich kann ein Antisense-Nukleinsäure- molekül Wasserstoffbrückenbindungen zu einem Sense-Nukleinsäuremolekül aus- bilden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu jedem hier gezeigten codierenden Strang sein, oder nur zu einem Teil davon. Der Begriff "codierende Region" bezieht sich auf die Region einer Nukleinsäuresequenz, deren Codone in Aminosäuren translatiert werden. Auch kann das Antisense-Nukleinsäuremolekül komplementär zu "nicht-codierenden Regionen" des codierenden Strangs der gezeig- ten Nukleinsäuremoleküle sein. Der Begriff "nicht-codierende Region" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die codierende Region flankieren und die nicht in ein Polypeptid translatiert werden (z.B. auch bezeichnet als 51- und 3'-nicht-translatierte Regionen). Das Nukleinsäuremolekül, das eine Antisensesequenz umfasst, kann auch weitere für die Expression und Stabilität des Moleküls wichtige Elemente umfassen, z.B. Capping-Strukturen, poly A-tails etc.
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu der gesamten codierenden Region einer mRNA sein, aber es kann auch ein Oligonukleotid sein, welches komplementär zu nur einem Teil der codierenden oder nicht-codierenden Region der mRNA ist. Z.B. kann ein Antisense-Oligonukleotid komplementär zu der Region sein, die den Translationsstart der mRNA umfasst oder umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann vorteilhaft z.B. 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45- oder 50-Nukleotide lang sein. Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligation nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden. Eine Anti- sense-Nukleinsäuremolekül kann chemisch synthetisiert werden unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder auf verschiedene Arten modifizierten Nukleotiden, so dass die biologische Stabilität der Moleküle erhöht ist oder die physikalische Stabilität des Duplex, die sich zwischen der Antisense- und Sense- Nukleinsäure bildet, verstärkt ist, z.B. können Phosphorothioatderivate und Acridin- substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die für die Herstellung von Antisense-Nukleinsäuren verwendet werden können, umfassen 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-lodouracil, Hypoxanthine, Xanthine, 4-Acetylcytosine, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2- thiouridine, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-galactosyl- queosine, Inosine, N6-lsopentenyladenine, 1 -Methylguanine, 1-Methylinosine, 2,2-Di- methylguanine, 2-Methyladenine, 2-Methylguanine, 3-Methylcytosine, 5-Methyl- cytosine, N6-Adenine, 7-Methylguanine, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxy- aminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-mannosylqueosine, δ'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenine, Uracil-5-oxyacetic acid (v), Wybutoxosine, Pseudouracil, Queosine, 2-Thiocytosine, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thio- uracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyaceticacidmethylester, Uracil-5- oxyacetic acid (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurine.
Alternativ können Antisense-Nukleinsäuremoleküle biologisch hergestellt werden unter Verwendung von Expressionsvektoren, in welche Polynukleotide kloniert wurden, deren Orientation gegenläufig ist (so dass RNA, transkribiert von dem inserierten Polynukleotid, in einer Antisenseorientierung zu einem Zielpolynukleotid wie es weiter oben beschrieben wurde, ist).
Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein "α-Anomeric" Nukleinsäuremolekül sein. Ein "α-Anomeric" Nukleinsäuremolekül formt spezifische Doppelstranghybride mit komplementären RNAs, in denen, im Gegensatz zu gewöhnlichen ß-Einheiten, die Stränge parallel zueinander laufen. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann 2-0-Methylribonukleotide oder Chimäre RNA-DNA-Analoge umfassen.
Weiterhin kann das Antisense-Nukleinsäuremolekül ein Ribozym sein. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit einer Ribonukleaseaktivität, die dazu fähig sind, einzelsträngige Nukleinsäuren, wie z.B. mRNA, zu denen sie eine komplementäre Region haben, zu schneiden. Ribozyme (z.B. Hammerheadribozyme) können dazu verwendet werden katalytisch oder nichtkatalytisch mRNA der hierin beschriebenen Sequenzen zu schneiden und somit die Translation der mRNA zu verhindern. Ein Ribozym, das zu einer der hierin genannten Nukleinsäuresequenzen spezifisch ist, kann aufgrund der hier gezeigten cDNA-Sequenzen konstruiert werden oder auf Basis von heterologen Sequenzen, die nach den hierin beschriebenen Methoden identifiziert werden können. Z.B. kann ein Derivat der Tetrahymena L-19 IVSRNA hergestellt werden, indem die Nukletidsequenz der aktiven Region komplementär zu der Nukleo- tidsequenz ist, die in einer codierenden mRNA geschnitten wird. Alternativ kann auch eine der hierin beschriebenen codierenden oder nicht-codierenden Sequenzen oder einer mRNA davon verwendet werden, um eine katalytische RNA aus einem Pool von RNAs auszuwählen (s. z.B. Bartel, 1993, Science, 261 , 1411). Alternativ kann die Expression auch inhibiert werden, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zu einer regulatorischen Region der hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen ist (z.B. ein Promotor oder Enhancer) eine triple-helikale Struktur bildet, die die Transkrip- tion des folgenden Gens verhindert (z.B. Helene, 1991 , Anticance-Drug Des. 6, 596; Helene, 1992, Ann. NY Acad. Sei. 660, 27, oder Mäher, 1992, Bioassays, 14, 807.
Die dsRNAi-Methode (= "double-stranded RNA interference") wurde vielfach in tierischen und pflanzlichen Organismen beschrieben (z.B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43:401 -415; Fire A. et al (1998) Nature 391 :806-811 ; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Eine effiziente Gensuppression kann auch bei transienter Expression oder nach transienter Transformation beispielsweise infolge einer biolistischen Transformation gezeigt werden (Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). dsRNAi-Verfahren beruhen auf dem Phänomen, dass durch gleichzeitiges Einbringen von komplementären Strang- und Gegenstrang eines Gentranskriptes eine hocheffiziente Unterdrückung der Expression des entsprechenden Gens bewirkt wird. Der bewirkte Phänotyp kommt dem einer entsprechenden knock-out Mutanten sehr ähnlich (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95:13959-64).
Das dsRNAi-Verfahren kann vorteilhaft zur Verminderung der Expression der Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 , ihrer Derivate und Fragmente verwendet werden. Wie u.a. in WO 99/32619 beschrieben sind dsRNAi-Ansätze klassischen antisense- Ansätzen deutlich überlegen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich daher auf doppelsträngige RNA- Moleküle (dsRNA-Moleküle), die bei Einführung in einen Organismus vorteilhaft einer Pflanze (oder eine davon abgeleitete Zelle, Gewebe, Organ oder Samen) die Ver- minderung der Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 , ihrer Derivate oder Fragmente oder der durch sie codierten Proteine bewirken. Das doppelsträngiges RNA-Molekül zur Verminderung der Expression eines Proteins, das durch die Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 codiert ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass
i) einer der beiden RNA Stränge im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil einer Nukleinsäuresequenz mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27,
SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 , und
ii) der jeweils andere RNA Strang im wesentlichen identisch ist zu zumindest einem Teil des komplementären Stranges einer der unter (i) genannten Nukleinsäuresequenz.
"Im wesentlichen identisch" meint, dass die dsRNA Sequenz auch Insertionen, Deletionen sowie einzelne Punktmutationen im Vergleich zu der Zielsequenz (SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51) aufweisen kann und dennoch eine effizient Verminderung der Expression bewirken. Bevorzugt beträgt die Homologie nach obiger Definition mindestens 75 %, bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % am meisten bevorzugt 100 % zwischen dem "sense"-Strang einer inhibitorischen dsRNA und einem Teilabschnitt einer Nukleinsäuresequenz mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 (bzw. zwischen dem "antisense"-Strang dem komplementären Strang einer Nukleinsäuresequenz der Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51). Die Länge des Teilabschnittes beträgt mindestens 10 Basen, bevorzugt mindestens 25 Basen, besonders bevorzugt mindestens 50 Basen, ganz besonders bevorzugt mindestens 100 Basen, am meisten bevorzugt mindestens 200 Basen oder mindestens 300 Basen. Alternativ, kann eine "im wesentlichen identische" dsRNA auch als Nukleinsäuresequenz definiert werden, die befähigt ist, mit einem Teil eines Gentranskriptes der Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 zu hybridisieren (z.B. in 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA bei 50°C oder 70°C für 12 bis 16 h).
Die dsRNA kann aus einem oder mehr Strängen polymerisierter Ribonukleotide bestehen. Es können ferner Modifikationen sowohl des Zucker-Phosphat-Gerüstes als auch der Nukleoside vorliegen. Beispielsweise können die Phosphodiesterbindungen der natürlichen RNA dahingehend modifiziert sein, dass sie zumindest ein Stickstoff oder Schwefel-Heteroatom umfassen. Basen können dahingehend modifiziert werden, dass die Aktivität beispielsweise von Adenosindeaminase eingeschränkt wird. Solche und weitere Modifikationen sind weiter unten bei den Verfahren zur Stabilisierung von antisense-RNA beschrieben.
Die dsRNA kann enzymatisch oder ganz oder teilweise chemisch-synthetisch hergestellt werden.
Die doppelsträngige Struktur kann ausgehend von einem einzelnen, selbstkomplementären Strang oder ausgehend von zwei komplementären Strängen gebildet werden. Bei einem einzelnen, selbstkomplementären Strang, können "sense"- und "antisense"-Sequenz durch eine verbindende Sequenz ("Linker") verknüpft sein und beispielsweise eine Haarnadelstruktur ausbilden. Bevorzugt kann die verbindende Sequenz ein Intron sein, das nach Synthese der dsRNA heraus- gespleißt wird. Die Nukleinsäuresequenz codierend für eine dsRNA kann weitere Elemente beinhalten, wie beispielsweise Transkriptionsterminationssignale oder Polyadenylierungssignale. Sollen die zwei Stränge der dsRNA in einer Zelle oder einem Organismus vorteilhaft einer Pflanze zusammengebracht werden, so kann dies auf verschiedene Art geschehen:
a) Transformation der Zelle oder des Organismus vorteilhaft einer Pflanze mit einem Vektor, der beide Expressionskassetten umfasst,
b) Kotransformation (= Co-Transformation) der Zelle oder des Organismus vorteilhaft einer Pflanze mit zwei Vektoren, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "anti- sense"-Strang umfasst.
c) Kreuzung von zwei Organismen vorteilhaft von Pflanzen, die mit jeweils einem Vektor transformiert wurden, wobei der eine die Expressionskassetten mit dem "sense"-Strang, der andere die Expressionskassetten mit dem "antisense"-
Strang umfasst.
Die Bildung der RNA Duplex kann entweder außerhalb der Zelle oder innerhalb derselben initiiert werden. Wie in WO 99/53050 kann die dsRNA auch eine Haarnadel- Struktur umfassen, indem "sense"- und "antisense"-Strang durch einen "Linker" (beispielsweise ein Intron) verbunden werden. Die selbstkomplementären dsRNA- Strukturen sind bevorzugt, da sie lediglich die Expression eines Konstruktes erfordern und die komplementären Stränge stets in einem äquimolaren Verhältnis umfassen.
Die Expressionskassetten codierend für den "antisense"- oder "sense"-Strang einer dsRNA oder für den selbstkomplementären-Strang der dsRNA, werden bevorzugt in einen Vektor insertiert und mit den unten beschriebenen Verfahren stabil (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkem) in das Genom einer Pflanze insertiert, um eine dauerhafte Expression der dsRNA zu gewährleisten.
Die dsRNA kann unter Verwendung einer Menge eingeführt werden, die zumindest ein Kopie pro Zelle ermöglicht. Höhere Mengen (z.B. mindestens 5, 10, 100, 500 oder 1000 Kopien pro Zelle) können ggf. eine effizienter Verminderung bewirken. Wie bereits beschrieben, ist eine 100%ige Sequenzidentität zwischen dsRNA und einem Gentranskript der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 nicht zwingend erforderlich, um eine effiziente Verminderung der Expression der genannten Sequenzen zu bewirken. Demzufolge besteht der Vorteil, dass das Verfahren tolerant ist gegenüber Sequenz- abweichungen, wie sie infolge genetischer Mutationen, Polymorphismen oder evolutionärer Divergenzen vorliegen können. So ist es beispielsweise möglich mit der dsRNA, die ausgehend von den Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 des einen Organismus generiert wurde, die Expression der Sequenzen in einem anderen Organismus zu unterdrücken. Die hohe Sequenzhomologie zwischen den Sequenzen aus verschiedenen Organis- men lässt auf einen hohen Konservierungsgrad dieser Proteine innerhalb von beispielsweise Pflanzen schließen, so dass die Expression einer dsRNA abgeleitet von einer der offenbarten Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 auch einen vorteilhaften Effekt in anderen Pflanzenarten haben dürfte.
Die dsRNA kann entweder in vivo oder in vitro synthetisiert werden. Dazu kann eine DNA-Sequenz codierend für eine dsRNA in eine Expressionskassette unter Kontrolle mindestens eines genetischen Kontrollelementes (wie beispielsweise Promotor, Enhancer, Silencer, Splice-Donor oder -Akzeptor, Polyadenylierungssignal) gebracht werden. Entsprechend vorteilhafte Konstruktionen sind weiter unten beschrieb. Eine Polyadenylierung ist nicht erforderlich, ebenso müssen keine Elemente zur Initiierung einer Translation vorhanden sein.
Eine dsRNA kann chemisch oder enzymatisch synthetisiert werden. Dazu können zelluläre RNA Polymerasen oder Bakteriophagen RNA Polymerasen (wie z.B. T3-, T7- oder SP6 RNA-Polymerase) verwendet werden. Entsprechende Verfahren zu in vitro Expression von RNA sind beschrieben (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Eine chemisch oder enzymatisch in vitro syntetisierte dsRNA kann vor der Einführung in eine Zelle, Gewebe oder Organismus aus dem Reaktionsgemisch beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektro- phorese, Chromatographie oder Kombinationen dieser Verfahren ganz oder teilweise aufgereinigt werden. Die dsRNA kann unmittelbar in die Zelle eingeführt werden oder aber auch extrazellulär (z.B. in den interstitialen Raum) appliziert werden.
Unter "Antikörpern" sind beispielsweise polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, Single chain
Antikörper oder auch synthetische Antikörper zu verstehen. Unter erfindungsgemäßen Antikörpern oder deren Fragmente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispiels- weise lgG1 , lgG2, lgG2a, lgG2b, lgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen lgG1 oder lgG2b. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')2. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genmanipulierte nichtverkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden. Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden. Antikörper können auch Teil eines Fusionsproteins sein.
Die identifizierten Substanzen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z.B. in Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder
Mikroorganismen auftreten. Weiterhin können die genannten Stoffe zwar im Stand der Technik bekannt sein, aber bisher nicht bekannt sein als Herbizid. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z.B. Kapitel 17. Die genannten Stoffe können z.B. zu dem Reaktionsgemisch oder dem Kulturmedium zugegeben werden oder den Zellen injiziert werden oder auf eine Pflanze gesprüht werden. Wenn eine Probe, die ein nach der erfindungsgemäßen Methode aktive Substanz beinhaltet, identifiziert wurde, dann ist es entweder möglich, den Stoff direkt von der ursprünglichen Probe zu isolieren oder man kann die Probe in verschiedene Gruppen teilen, z.B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu reduzieren und dann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer solchen "Unterprobe" der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Probe nur noch eine geringe Anzahl von Substanzen oder nur noch eine Substanz umfasst. Vorzugsweise wird der gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Stoff oder Derivate davon weiter formuliert, so, dass er für die Anwendung in der Pflanzenzüchtung oder Pflanzenzell- oder Gewebekultur geeignet ist.
Die Stoffe, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet und identifiziert wurden, können beispielsweise sein: Expressionsbibliotheken, z.B. cDNA-Expressions- bibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen). Diese Stoffe könne auch funktioneile Derivate oder Analogon der bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten oder Analogon sind dem Fachmann bekannt. Die genannten Derivate und Analogon können gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik getestet werden. Weiterhin kann computergestütztes Design oder Peptidomimetics zur Herstellung geeigneter Derivate und Analogon verwendet werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine erfindungsgemäße Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wie in den oben genannten Ausführungsformen beschrieben.
Unter Derivate(n) (der Plural und der Singular seien für diese Anmeldung und deren Definitionen äquivalent) der in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren sind beispielsweise funktionelle Homologe der von SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 codierten Proteine oder deren biologischer Aktivität, das heißt Proteine, die dieselben biologischen Reaktionen wie die von SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 codierten Proteine ausführen, zu verstehen. Diese Derivate bzw. Gene sind ebenfalls als herbizide Targets geeignet.
Die hierin erfindungsgemäß beschriebenen Sequenzen codieren für Homologe zu den in den Beispielen beschriebenen Proteinen und haben vorzugsweise die für die Homologe angegebenen Aktivitäten.
SEQ ID NO: 1 codiert für ein Protein, das zum Translation Realising Factor RF-2 Ähnlichkeiten aufweist. Die Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 2 wiedergegeben. SEQ ID NO: 3 codiert für ein Kobalamin-Synthese Protein, dessen Proteinsequenz SEQ ID NO: 4 zu entnehmen ist. SEQ ID NO: 5 codiert für eine Arginyl-tRNA- Synthetase, die Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt. SEQ ID NO: 7 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu einer RNA-Helicase aus Mus musculus, dessen Proteinsequenz in SEQ ID NO: 8 wiedergegeben ist. SEQ ID NO: 9 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu dem die AP2-Domäne enthaltenden Protein RAP 2.4 aus Arabidopsis thaliana, dessen Proteinsequenz SEQ ID NO: 10 zu entneh- men ist. SEQ ID NO: 11 codiert für ein Protein, das Homologien zu verschiedenen Pseudouridylat-Synthasen aufweist. Die Proteinsequenz ist SEQ ID NO: 12 zu entnehmen. Von SEQ ID NO: 13 wird ein Protein codiert, das Ähnlichkeiten mit einer putativen Adenylatkinase hat. SEQ ID NO: 14 gibt die Proteinsequenz wieder. Für ein Protein, mit der in SEQ ID NO: 16 gezeigten Sequenz, codiert die Sequenz SEQ ID NO: 15. Dieses durch SEQ ID NO: 15 codierte hypothetische Protein hat Ähnlichkeit zu dem pol-Polyprotein des "Equine Infectious Anemia Virus". SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 und SEQ ID NO: 51 codieren für unbekannte Proteine. Den Sequenzen SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44 und SEQ ID NO: 52sind die jeweiligen Proteinsequenzen zu entnehmen.
SEQ ID NO: 23 codiert für ein Preprotein Translocase secA Precursor-Protein. Es handelt sich also um ein chloroplastidäres SecA-Protein, das am Proteintransport über die Thylakoidmembran beteiligt ist. Die Proteinsequenz ist SEQ ID NO: 24 zu ent- nehmen.
Von SEQ ID NO: 25 wird ein Protein mit signifikanter Homologie zum DCL-Protein aus Tomate (PIR: S71749) codiert. Dieses Protein besitzt eine sogenannte HMG-Signatur, die in high mobility group Proteinen vorkommt und die an DNA binden kann. Die Proteinsequenz wird in SEQ ID NO: 26 wiedergegeben. Durch SEQ ID NO: 29 wird eine plastidäre Gluthathion-Reduktase codiert, deren Proteinsequenz in SEQ ID NO: 30 dargestellt wird. SEQ ID NO: 31 codiert für ein Protein, das ein Homolog des Transkriptionsfaktors Sigma ist, d.h. es ist ein pflanz- liches Homolog zur Sigma-Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase. Die entsprechende Proteinsequenz ist SEQ ID NO: 32 zu entnehmen.
Von SEQ ID NO: 33 wird ein Calmudulin-ähnliches Protein codiert, deren Sequenz in SEQ ID NO: 34 dargestellt wird.
SEQ ID NO: 37 codiert für ein Protein mit großer Ähnlichkeit zu INT6, einem brustkkrebsassoziierten Protein, mit mit Ähnlichkeit zu einem „initiatiorfaktor 3" Protein. SEQ ID NO: 38 gibt die Proteinsequenz wieder.
Von SEQ ID NO: 39 wird ein Protein codiert, das große Ähnlichkeit zur DNA Helikase YGL150c aus Saccharomyces hat. SEQ ID NO: 40 stellt die entsprechende Proteinsequenz dar.
Ein Protein mit Ähnlichkeit zu einem RNA-bindenden Protein wird durch SEQ ID NO: 41 codiert. Die Proteinsequenz wird in SEQ ID NO: 42 wiedergegeben.
SEQ ID NO: 45 codiert für einen putativen Hitzeschock-Transkriptionsfaktor, dessen Proteinsequenz SEQ ID NO: 46 zu entnehmen ist.
Von SEQ ID NO: 47 wird ein putatives, chloroplastidäres an das DNA-Nukleoid bindende Protein codiert. SEQ ID NO: 48 gibt die entsprechende Proteinsequenz wieder.
SEQ ID NO: 49 codiert für ein Protein, das Ähnlichkeit zu einer putativen Met2-Typ Cytosin DNA-Methyltransferase hat. Diese Methyltransferase hat starke Ähnlichkeiten zu einer DNA(cytosine-5-)-Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana. Die Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 50 dargestellt.
Unter Derivaten werden auch solche Peptide verstanden, die eine Homologie zu den Polypeptiden mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 gezeigten Sequenzen von mindestens 20 %, vorzugsweise 30 %, 40 % oder 50 %, mehr bevorzugt 60 %, 70 % oder 80 %, noch mehr bevorzugt 90 %, mehr bevorzugt 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder 95 %, am meisten bevorzugt 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr haben, und die eine äquivalente biologische Aktivität in anderen Organismen besitzen und somit als funktionelle Homologe anzusehen sind. Diese funktionelle Homologie oder Äquivalenz lässt sich z.B. durch die mögliche Komplementation von Mutanten in diesen Funktionen demonstrieren.
Die oben genannten Nukleinsäuresequenz(en) oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer Sequenzen wie z.B. genomische, cDNA oder sonstige Sequenzen, die als Herbizidtarget geeignet sind, über Homologiescreening verwendet werden.
Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen, insbesondere eukaryontischen Organismen wie monokotylen oder dikotylen Pflanzen, wie speziell Algen, Moosen, Dinoflagellaten, Nutzpflanzen wie Monokotyle wie Mais, Weizen, Hafer, Roggen, Gerste oder Hirse oder Dikotyle wie Kartoffel, Tabak, Salat, Tomate, Karotte um nur einige zu nennen oder Pilze, isolieren.
Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 ,
SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 genannten Sequenzen beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, vorteilhaft mindestens 70 % Homologie, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder 95 % Homologie, ganz besonders bevorzugt 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE bzw. BACKTRANSLATE (= Bestandteil des Programmpaketes UWGCG, Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Deverux et al., Nucleic. Acid Res., 12, 1984: 387-395) verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Für Nukleinsäuren wurden folgende Einstellungen verwendet: Gap Weight: 50, Length Weight: 3. Für Proteine waren die Einstellungen: Gap Weight: 8, Length Weight: 2. Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleitete Aminosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 zu entnehmen. Unter Homologie ist Identität zu verstehen, das heißt die Aminosäuresequenzen sind zu mindestens 40, 50, 60 oder 70 %, mehr bevorzugt 80 %, 85 % oder 90 %, noch mehr bevorzugt 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder
95 %, am meisten bevorzugt 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr identisch. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auf Nukleinsäureebene mindestens 45 oder 55 % homolog, bevorzugt mindestens 60 oder 65 %, besonders bevorzugt 75 % oder 80 %, ganz besonders bevorzugt mindesten 85 % oder 90 %, noch mehr bevorzugt 95 %,
96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder mehr homolog.
Weiterhin umfasst der Begriff Derivate sowie der Begriff "Fragmente" auch Teilbereiche oder Fragmente der aufgeführten Sequenzen oder deren homologen Sequenzen von mindestens 50 Aminosäuren, vorteilhaft von mindestens 40 Aminosäuren, bevorzugt von mindestens 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt von mindestens 20 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 10 Aminosäuren, die es ermöglichen, selektiv interagierende Substanzen zu identifizieren. Der Begriff "Fragment", "Sequenzfragment" oder "Teilsequenz" bedeutet eine verkürzte Sequenz der Originalsequenz. Die verkürzte Sequenz (Nukleinsäure oder Protein) kann unterschiedliche Längen haben, die minimale Sequenzlänge ist eine Sequenzlänge, die wenigstens eine vergleichbare Funktion, z.B. Bindungseigenschaften, oder Aktivität der Originalsequenz hat. Entsprechende Verfahren sind z.B. wie oben beschrieben SELDI, FCS oder Biocore und sind dem Fachmann bekannt.
Ebenfalls umfasst sind somit Nukleinsäuren, die ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codieren, das spezifisch an einem Antikörper bindet, der spezifisch an eine, als erfindungsgemäß beschriebenes Polypeptid bindet, insbesondere das von einer der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7,
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz codiert wird. Fragment oder Epitope eines Polypeptides, die mit einem solchen Antikörper spezifisch inter- agieren, weisen eine signifikante Homologie in der räumlichen Struktur zu den hierin beschriebenen Polypeptiden, zumindest in Teilbereichen, auf. Vorzugsweise besitzen sie ebenfalls eine hohe Homologie auf Aminosäureebene zu den genannten Sequen- zen, vorzugsweise 20 %, mehr bevorzugt sind 40 %, mehr bevorzugt 60 %, noch mehr 80 %, am meisten bevorzugt sind 90 % oder mehr. Die räumliche Struktur eines Polypeptides ist jedoch im wesentlichen mitverantwortlich für die Interaktionen des Polypeptides mit anderen Verbindungen sowie ggf. für seine enzymatische Aktivität. Folglich können in den erfindungsgemäßen Verfahren oder Fragmenten eingesetzt werden, deren Sequenz nur eine geringe Homologie zu den beschriebenen Polypeptiden aufweist, deren räumliche Struktur jedoch eine hohe Homologie zu den beschriebenen Polypeptiden aufweist, also solche, die Epitope der hierin beschriebenen Sequenzen enthalten, um Interaktionspartner zu finden, die dann die hierin beschriebenen Polypeptide inhibieren oder inaktivieren. Fragmente, die Epitope der erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, können auch verwendet werden, um die Interaktionspartner der erfindungsgemäßen Polypeptide zu "besetzen", d.h. ihre Interaktion mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden zu verhindern. Hierzu ist es dann vorteilhaft, wenn die Fragmente eine höhere Affinität zu einem Bindungspartner haben als das natürlich vorkommende Polypeptid. Ebenfalls umfasst sind Fragmente, die von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codiert werden und eine der oben genannten biologischen Aktivitäten umfassen.
Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die biologische, z.B. enzymatische Aktivität oder Bindungseigenschaften der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.
Solche DNA-Sequenzen lassen sich mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenzen, z.B. ausgehend von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise Mikroorganismen wie Hefen, Pilzen, Ciliaten, Pflanzen wie Algen, Moosen oder sonstigen Pflanzen, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide, beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungs- bedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperatur- werte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C- Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.
Außerdem sind unter Homologen der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 Derivate wie beispielsweise Varianten aus anderen Organismen beispielsweise anderen Pflanzen zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch lnsertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. die biologische Aktivität der Varianten beeinträchtigt wird. Vorzugsweise haben sie eine Homologie von mindestens 20 %, vorteilhaft, 30 %, 40 %, 50 % oder 60 %, bevorzugt 70 %, 80 % oder 90 %, besonders bevorzugt von 95 % und eine äquivalente biologische Aktivität.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesondere SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 und deren Fragmente und Derivate sind deshalb vorteilhaft dafür geeignet um weitere essentielle, neue Gene aus anderen Organismen bevorzugt Pflanzen zu isolieren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 und deren durch sie codierte Genprodukte werden im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Sie können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen Expression der heterologen Gene. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Ein Beispiel für Corynebacterium glutamicum ist gegeben in: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Die Durchführung solcher Experimente sind mit Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.
Funktionen äquivalente Sequenzen, die für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, das heißt die biologische Aktivität der Proteine besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, insbesondere an den Codon-Gebrauch einer Pflanze angepasste, künstliche Nukleotid- Sequenzen.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, zu Produkten führen, die die oben genannten Aktivitäten oder die gewünschte Eigenschaft, beispielsweise die Bindung an einen Rezeptor oder die enzymatische Aktivität vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine oder durch in vitro- Selektion ermittelt werden. Mögliche Techniken zur in vitro- Evolution von DNA zur Veränderung bzw. Verbesserung der DNA-Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P.A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733(1997) oder bei Moore, J.C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347( 1997). Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Codon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Codon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu trans- formierenden Pflanze leicht ermitteln.
Für das erfindungsgemäße Verfahren sind vorteilhaft Aminosäuresequenzen zu verstehen, die eine in den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz enthalten, wobei die biologische Aktivität des in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird. Unter nicht wesentlich reduziert sind alle Proteine zu verstehen, die noch mindestens 10 %, bevorzugt 20 %, besonders bevorzugt 30 %, 50 %, 70 %, 90 % oder mehr, der biologischen Aktivität des Ausgangsproteins aufweisen. Dabei können beispielsweise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydro- phobizität etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihen- folge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.
Unter Derivaten sind auch funktionelle Äquivalente zu verstehen, die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der verwendeten Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9,
SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 beinhalten, welche weiterhin die gewünschte Funktion, das heißt deren biologische Aktivität nicht wesentlich reduziert ist, zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modi- fikation der genannten Nukleotidsequenzen erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt (= nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist (= Enzym aktivität stärker als die Aktivität des Ausgangsenzym, das heißt Aktivität ist höher als 100 %, bevorzugt höher als 150 %, besonders bevorzugt höher als 180 %). Die Nukleinsäuresequenz kann dabei vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt (= Expressionskassette oder Nukleinsäurefragment) geeignete codierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für ein Protein mit den oben beschriebenen Sequenzen codieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion des Proteins und damit seiner biologischen Funktion verleihen. Diese Sequenzen können homologen oder heterologen Ursprungs sein.
Daher ist ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ein Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, z.B. ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 ,
SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz, oder
b) einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22,
SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Amino- säuresequenzen ableiten lässt,
c) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27,
SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60 % Homologie auf Nukleinsäureebene aufweisen; oder d) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26,
SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
e) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz codiert wird;
f) Nukleinsäuresequenz, die ein Fragment einer in a) dargestellten Nukleinsäure codiert und das eine eine "Translation Releasing Factor"-Aktivität, eine Kobala- min-Synthese-Aktivität, Arginyl-tRNA-Synthase-Aktivität, eine RNA-Helicase-
Aktivität, eine GTP-Bindeprotein-Aktivität, eine Pseudouridylat-Synthase- Aktivität, eine Adenylatkinase-Aktivität, eine Preprotein-Translocase secA Pre- cursorprotein-Aktivität, eine DCL-Protein-Aktivität, eine Arginin-tRNA-Ligase- Aktivität, eine plastidäre Gluthathion-Reduktase-Aktivität, eine Transkriptions- faktor Sigma-Aktivität, eine Calmudulin-Aktivität, eine INT6- Aktivität, eine Helikase YGL150c-Aktivität, eine RNA-bindende Aktivität, eine Hitzeschock- Transkriptionsfaktor-Aktivität, eine chloroplastidäre DNA-Nukleoid bindende Aktivität oder eine Met2-Typ Cytosin DNA Methyltransferase-Aktivität hat; und/oder
g) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20,
SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20 % Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt;
wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist. Die vorhergenannten Begriffe haben die oben genannte Bedeutung.
Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, z.B. die in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5,
SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 genannten Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funktioneilen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Regulation, insbesondere Erhöhung, der Genexpression funktioneil verknüpft wurden und welche die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene bzw. der Proteine ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es konstitutiv exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kann auch vorteilhaft nur aus der natürlichen gentechnologisch veränderten Regulationsregion am 5'- und/oder 3'-Ende bestehen. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Derivate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und/oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promotoren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform kann die Expression jedoch auch gezielt reduziert oder blockiert werden.
Als Promotoren in der Expressionskassette sind grundsätzlich alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organismen vorteilhaft in Pflanzen oder Pilzen steuern können. Vorzugsweise verwendet man insbesondere ein pflanz- liehe Promotoren oder Promotoren, die aus einem Pflanzenvirus entstammen. Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, Iaclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, tre-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise ingram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulations- Sequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFα, AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21(1980) 285-294], SSU, OCS, Iib4, STLS1 , B33, nos (= Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression der Nukleinsäure
Sequenzen im erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt in den Organismen vorteilhaft in den Pflanzen zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige vorteilhafte Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der PRP1 -Promotor [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22(1993), 361-366], ein durch Benzensulfonamid-induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon- induzierbarer (WO 93/21334) Promotor. Weitere Pflanzenpromotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phospho- ribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien-spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden.
In der Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäurekonstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um Biosynthesegene des Stoff- wechseis wie Gene die an den Stoffwechselwegen der durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codierten Proteine beteiligt sind. Es können aber auch Biosynthesegene anderer Stoffwechselwege sein wie der Fettsäure-, der Aminosäure- oder der Vitaminbiosynthese oder Regulationsgene um nur einige zu nennen.
Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungsgemäße Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie unten beschrieben, verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allge- meinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'- Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für die im erfindungs- gemäßen Verfahren verwendeten Proteine codiert und eine Region für die transkrip- tionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche können vorteilhaft gegeneinander ausgetauscht werden.
Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, -primerrepair-, Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, -chewing-back- oder Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u.a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus
Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHδ entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder entsprechende funktionelle Äquivalente.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten
Promotors mit einer geeigneten Nukleinsäuresequenz sowie einem Polyadenylierungs- signal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben werden.
Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen beinhalten alle Sequenzmerkmale, die notwendig sind, um eine für den Ort der biologischen Wirkung bzw. Aktivität korrekte Lokalisation zu erreichen. Daher sind keine weiteren Targetingsequenzen per se notwendig. Allerdings kann eine solche Lokalisation wünschenswert und vorteilhaft sein und daher künstlich verändert oder verstärkt werden, so dass auch solche Fusionskonstrukte eine bevorzugte vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sind.
Vorteilhaft sind dafür beispielsweise Sequenzen, die ein Targeting in Piastiden gewährleisten. Unter bestimmten Umständen kann auch ein Targeting in andere Kompartimente (referiert: Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285-423) z.B. in in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER), Peroxisomen, Lipidkörper oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen ein Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, wünschenswert sein.
Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische
Messung ermöglichen. Beispielhaft seien als Reportergene Antibiotika-oder Herbizidresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Biolumineszenzgene, Zuckeroder Nukleotidstoffwechselgene oder Biosynthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2- Gen, das Luciferasegen, das ß-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose- 6-phosphat-Phosphatasegen, das ß-Glucuronidase-Gen, ß-Lactamasegen, das
Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Weitere vorteilhafte Antibiotika- oder Herbizidresistenzen sind Resistenzen gegen z.B. Imidazolinon oder Sulfonylhamstoff; die Antibiotikaresistenzen gegen z.B. Bleomycin, Streptomycin, Kanamycin, Tetra- cyclin, Chlorampenicol, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin um nur einige zu nennen. Diese Gene ermöglichen eine leichte Messbarkeit und Quaritifizierbarkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Expressionskassette stromaufwärts, d.h. am 5'-Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteinen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation in Piastiden. Aber auch Targeting- Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (= ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten sind bei Bedarf einsetzbar sowie Transiationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).
Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor beispielsweise den 35S-, 34S- oder eine Ubiquitin-Promotor, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Die Expressionskassette wird zur Expression in einem prokaryontischen oder eukary- ontischen Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYCl84, pBR-Serie wie z.B. pBR322, pUC-Serie wie pUClδ oder pUC19, M113mp-Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-lll -B1 , λgtl 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, pl J702 oder plJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , pll_2 oder pBB116, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos, M.A. et al., [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] und von van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi] sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J.W. Bennet & LL Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi" [van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte Hefepromotoren sind beispielsweise 2 μM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L, 1988). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds.
Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S.71 -119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agrobacterium replizieren. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation. Umfasst sind funktionelle und nicht-funktionelle Vektoren.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die
Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit oder ohne einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der verwendeten Nukleinsäuresequenzen und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts.
Beispielhaft kann das Nukleinsäurekonstrukt in den Tabak-Transformationsvektor pBinAR eingebaut werden und unter der Kontrolle des 35S-, 34S- oder Ubiquitin- Promotor oder des USP-Promotor stehen.
Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor) auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. durch Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.
Weitere vorteilhafte Vektoren enthalten in Pflanzen oder Pflanzenkulturen nutzbare Resistenzen wie die Phosphinotricin- (= bar-Resistenz), die Methioninsulfoximin-, die Sulfonylhamstoff- (= ilv-Resistenz, ind S. cerevisiae ilv2), die Phenoxyphenoxyherbizid- (= ACCase-Resistenz), die Glyphosate- oder Clearfieldresistenz (AHAS-Resistenz) bzw. die Gene, die für diese Resistenzen codieren. Diese Resistenzen sind in ganzen Pflanzen zur Selektion von transgenen Pflanzen nutzbar. Nur Pflanzen, die über eine Transformation, diese Resistenzen erhalten haben, können in Gegenwart der selektierenden Substanz wachsen. In Zellkulturen auf Agarplatten können nach Trans- formation in planta - beispielsweise Infiltration der Samenvorläuferzellen - auch beispielsweise Kanamycin oder Hygromycin als selektierendes Agenz verwendet werden. Darüber hinaus können vorteilhafte Vektoren Sequenzen für die Integration in das Genom der Organismen bevorzugt der Pflanzen enthalten. Beispiele für derartige Sequenzen sind die sog. T-DNA-Borders. Außerdem können vorteilhafte Vektoren noch Promotoren und Terminatoren, wie beispielsweise die oben beschriebenen, enthalten. Auch sogenannte PolyA-Sequenzen können im Vektor enthalten sein. Vorteilhafte Vektoren sind beispielsweise Figur 1, 2 und 3 zu entnehmen. SEQ ID NO: 25 gibt die vorteilhafte Sequenz des Vektors pMTX 1a300 wieder. Dieser enthält eine Kanamycin-Resistenz (Nukleotid 4922-5713), eine Phosphinotricin-Resistenz (Nukleotid 6722-7288), das LaeZalpha-Fragment (Nukleotid 7630-7864), einen Teil von pVSIsta (Nukleotid 945-1945), einen Teil von pBR322bom (Nukleotid 3948-4208), eine T-Border-Sequenz (links, Nukleotid 6138-6163), eine T-Border-Sequenz (rechts, Nukleotid 7924-7949), ein PolyA-Teil (Nukleotid 7292 - 7503), den mas2'1 '-Promotor (Nukleotid 6241-6718) und zwei Replikations-Origins pVSIrep (Nukleotid 6241-6718) sowie pBR322ori (Nukleotid 43-4628).
In Prokaryoten verwendete Expressionsvektoren nutzen häufig induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteinen bzw Fusionsoligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C-terminal oder anderen nutzbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen in der Regel dazu: i.) die Expressionsrate der RNA zu erhöhen ii.) die erzielbare Proteinsytheserate zu erhöhen, iii.) die Löslichkeit des Proteins zu erhöhen, iv.) oder die Reinigung durch einen für die Affinitätschromatographie nutzbare Bindesequenz zu vereinfachen. Häufig werden auch proteolytische Spaltstellen über Fusionsproteine eingeführt, was die Abspaltung eines Teils des Fusionsproteins auch der Reinigung ermöglicht. Solche Erkennungssequenzen für Proteasen erkennen sind z.B. Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A.
Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] und pET Vektoren [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande].
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSed (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES-Derivate (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39).
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDMδ und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kauf man et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispielsweise in RIanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F.M. Ausubel et al. (1994) Current protoeols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D.M. Glover et al., DNA Cloning Vol.1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentrans- formation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobaeterium vermittelte Gentransfer vorteilhaft erfolgt der Gentransfer in der vorliegenden Erfindung mit beispielsweise dem Agrobaeterium tumefaeiens Stamm GV 3101 pMP90. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1 , Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205- 225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobaeterium tumefaeiens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpfianzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agro- bakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen mit Agrobaeterium tumefaeiens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Im folgenden ist eine vorteilhafte Ausführungsform wiedergegeben. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, wird die einzuführende Nukleinsäure bzw. DNA in spezielle Plasmide cloniert, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von
Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobaeterium tumefaeiens übertragen werden (Konju- gation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181 -187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir- Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EPA-0 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4: 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobaeterium tumefaeiens oder Agrobaeterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Rlanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzen- zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt (vergl. z.B. Willmitzer, L, 1993 Transgenic plants. In: Bioteehnology, A MultiVolume Comprehensive Treatise (H . Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).)
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobaeterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al, Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei et al, Plant J. 6 (1994) 271-282; Deng et al; Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11 ,(1992) 76-80; May et al; Bioteehnology 13 (1995) 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sei. 153 (1992) 550-555; Ritchie et al; Transgenic Res. (1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux; Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al; Bioteehnology 11 (1992), 667-674; Ritala et al, Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325; Spencer et al, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631) die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permea- bilisierten Zellen; die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z.B. WO 95/06128; EP 0513849 A1 ; EP 0465875 A1 ; EP 0292435 A1 ; Fromm et al, Bioteehnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al, Bioteehnology 11(1993) 194-200; Moroc et al, Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben z.B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al, s.o.; Weizen (Nehra et al, Plant J. 5(1994) 285-297).
Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspezies verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S.D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.
Unter Pflanzen im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke zu verstehen.
Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren zu exprimieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuss, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinetorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Cyanobakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Beispielsweise seien Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren wie Soja, Raps, Kokosnuss, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuss, Kakaobohne oder Sonnenblume genannt. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch nicht-humane transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.
Bevorzugt sind transgene Pflanzen, die ein erfindungsgemäßes funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt oder einen erfindungsgemäßen funktioneilen oder nicht funktionellen Vektor enthalten. Unter funktioneil ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder im Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor exprimiert werden und ein biologisch aktives Gen- produkt hergestellt wird. Unter nicht funktioneil ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren allein oder im Nukleinsäurekonstrukt oder im Vektor nicht transcribiert, nicht exprimiert werden und/oder ein biologisch inaktives Genprodukt hergestellt wird. In diesem Sinne handelt es sich bei den sogenannten Antisense-RNAs auch um nicht funktionelle Nukleinsäuren bzw. bei Insertion in das Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor um ein nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt oder nicht funktioneilen Vektor. Sowohl das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt als auch der erfindungsgemäße Vektor kann zur Herstellung von transgenen Organismen bevorzugt Pflanzen vorteilhaft verwendet werden.
Unter transgen im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom eines Organismus sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Tansgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegen- über der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor. Gleiches gilt für das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder den Vektor.
Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Verwendbare Expressionsstämme z.B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, z.B. der unter den SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargelegten Nukleotidsequenzen zur Erstellung von genetisch veränderten RIanzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie veränderte Proteine, der von den SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 codierten Proteine enthalten, die dadurch gekennzeichnet sind dass sie eine sehr viele geringere Interaktion mit dem Herbizid aufweisen bzw. in ihrer Aktivität nicht durch das Herbizid beeinträchtigt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesondere SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 , deren aufgrund des degenerierten genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen sowie deren Derivate wurden aus einer Populationen transgener Pflanzen identifiziert, die zum einen dadurch gekennzeichnet war, dass sie mittels des Agrobaeterium transformiert worden sind und im Rahmen dieses Prozesses neue DNA im Chromosomen an zufälliger Stelle integriert worden war. Durch Rückkreuzungen wurden schließlich Pflanzen isoliert, die die identifizierten Nukleinsäuren auf beiden homologen Chromosomen enthalten. Diese Pflanzen sind lethal, daher sterben sie entweder schon als Embryo oder aber als Keimling. Es konnten keine homozygoten Linien gewonnen werden. Darüber hinaus sind diese Pflanzen dadurch gekennzeichnet, dass sie im Verlauf des Screenings als für lethale Mutationen segregierende Linien identifiziert worden sind. Diese Pflanzen weisen als Ergebnis der homozygoten Situation der Integration der neuen DNA starke Behinderungen im Wachstum und oder Entwicklung auf. Es ist davon auszugehen, dass diese Wachstums- und Entwicklungs- behinderungen darauf zurückzuführen sind, dass die neu inserierte DNA in für
Wachstum und Entwicklung wichtige Gene integriert hat, wodurch in der homozygoten Situation deren biologische Funktion eingeschränkt oder blockiert wird. Dieses bedeutet, dass diese Gene sowie deren aufgrund des degenerierten genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen sowie deren Derivate für Proteine codieren, welche in analoger Weise wie für die in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 beschrieben, geeignete Zielproteine für neu zu entwickelnde Herbizide darstellen.
Zur Erzeugung veränderter Proteine werden in einer vorteilhaften Ausführungsform die genannten Nukleinsäuren überexprimiert und folgende Prozessschritte werden vorteilhaft durchlaufen:
a) Expression der von den SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5,
SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ,
SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 oder von einer Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rücküber- Setzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8,
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48,
SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt, oder von Derivaten oder Fragmenten der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27,
SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 dargestellten Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 %, 60 %, vorzugsweise 70 %, 80 %, 90 % oder mehr Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, codierten Proteine in einem heterologen System beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Bakterium der Gattung Escherichia wie E. coli XL1-Red oder in einem zellfreien System.
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion oder der biologischen Aktivität des veränderten Proteins mit dem Herbizid bzw. in Gegenwart des Herbizids,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion oder eine wenig beeinflusste biologische Aktivität aufweisen,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides.
Vorteilhaft erfolgt die Überführung des so erhaltenen veränderten Proteins bzw. der veränderten Nukleinsäure, z.B. der unter SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 aufgeführten Sequenzen sowie der weiteren oben beschriebenen erfindungsgemäßen Sequenzen, z.B. Derivate und Fragmente, z.B. von anderen Pflanzen, in einen Organismus vorteilhaft in eine Pflanze, bevorzugt pflanzliche Zellen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung ver- änderter Genprodukte, die von den hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Prozessschritte umfasst:
a) Expression der von den SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 codierten Proteine oder Derivate oder
Fragmente, z.B. von anderen Pflanzen, davon in einem heterologen System o- der in einem Zellfreiensystem
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid oder der biologischen Aktivität des veränderten Genprodukts in Gegenwart des Herbizids,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen oder in ihrer Aktivität weniger beeinflusst sind,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides,
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die oder deren Genprodukte eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid, vorzugsweise eine verringerte Hemmung durch das Herbizid oder geringere Interaktion mit dem Herbizid, aufweisen.
Die nach dem oben beschriebenen Verfahren nach ausgewählten Sequenzen können vorteilhaft in einen Organismus eingebracht werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein nach diesem Verfahren hergestellter Organismus, bevorzugt ist der Organismus eine Pflanze. Das Verfahren eignet sich auch für die Gen- expression der oben genannten biologisch aktiven Derivate und Fragmente.
Anschließend erfolgt die Regeneration ganzer Pflanzen und Überprüfung der Resistenz gegenüber dem Herbizid in intakten Pflanzen.
Veränderte Proteine und/oder Nukleinsäuren, die in Pflanzen Resistenz gegen Herbizide vermitteln können, können aus den hierin beschriebenen, erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere aus den Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 oder deren Derivaten aus anderen Pflanzen auch über die sogenannte "site directed mutagenesis" hergestellt werden. Durch diese Mutagenese kann beispielsweise die Stabilität und/oder enzymatische Aktivität von Enzymen oder die Eigenschaften wie Bindung von niedermolekularen Verbindungen mit kleiner 1000 Molekulargewicht gezielt verändert und vorteilhaft verringert werden. Vorteilhaft sollte das Molekulargewicht der Verbindungen kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton sein, vorteilhaft mit einem Ki-Wert von kleiner 10"7, vorteilhaft kleiner 10"8, bevorzugt kleiner 10"9 M, vorteilhaft sollte dabei diese Hemmwirkung auf ein spezifische Hemmung des biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine zurückzuführen sein, das heißt es sollte keine Hemmung durch diese niedermolekularen Substanzen weiterer nahe verwandter Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine erfolgen. Weiterhin sollten die niedermolekulare Substanzen vorteilhaft ein Molekulargewicht von größer 50 Dalton, bevorzugt größer 100 Dalton, besonders bevorzugt größer 150 Dalton, ganz besonders bevorzugt größer 200 Dalton haben. Vorteilhaft sollten die niedermolekularen Substanzen weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlenstoffatom-enthaltenden Ring haben. Weiterhin sollten auch keine freie(n) Säure- oder Lacton-Gruppe(n) sowie keine Phosphatgruppe und nicht mehr als eine Aminogruppe im Molekül enthalten sein. Auch Basen wie Adenosin im Molekül sind weniger bevorzugt. Auch die Stabilität und/oder enzymatische Aktivität von Enzymen oder die Eigenschaften wie Bindung von Proteinen oder Antisense-RNA kann so sehr gezielt verbessern bzw. verändert werden.
Weiterhin können Veränderungen über die von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21 , No. 3, 1993: 777-78) beschriebenen PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese erzielt werden oder durch die von Rellos et al. (Protein Expr. Purif ., 5, 1994: 270-277) weiter verbessert Methode.
Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung dieser veränderten Proteine und/oder von Nukleinsäuren ist eine von Stemmer et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 91 , 1994: 10747-10751) beschriebene "in vitro" Rekombinationstechnik für die molekulare Evolution oder die von Moore et al. (Nature Bioteehnology Vol. 14, 1996: 458-467) beschriebene Kombination der PCR- und Rekombinationsmethode.
Ein weiterer Weg zur Mutagenese von Nukleinsäuren bzw. Proteinen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (Vol. 57, 1996: 375-385) beschrieben. In EP-A-0909821 wird eine Methode zur Veränderung von Proteinen unter Ver- wendung des Mikroorganismus E. coli XL-1 Red beschrieben. Dieser Mikroorganismus erzeugt bei der Replikation Mutationen in den eingeführten Nukleinsäuren und führt so zu einer Veränderung der genetischen Information. Über Isolierung der veränderten Nukleinsäuren bzw. der veränderten Proteine und Testung auf Resistenz lassen sich leicht vorteilhafte Nukleinsäuren und die durch sie codierten Proteine und umgekehrt identifizieren. Diese können dann nach Einbringen in Pflanzen dort die Resistenz ausprägen und so zur Resistenz gegen die Herbizide führen.
Weitere Methoden der Mutagenese und Selektion sind beispielsweise Methoden wie die in vivo Mutagenese von Samen oder Pollen und Selektion resistenter Allele in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Inhibitoren, gefolgt von genetischer und molekularer Identifizierung des veränderten, resistenten Alieis. Weiterhin die Mutagenese und Selektion von Resistenzen in der Zellkultur durch Vermehrung der Kultur in Anwesenheit von sukzessiv steigenden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Dabei kann die Erhöhung der spontanen
Mutationsrate durch chemische/physikalische mutagene Behandlung ausgenutzt werden. Wie vorgehend beschrieben lassen sich auch mit Mikroorgansimen, die eine endogene oder rekombinante Aktivität der durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codierten Proteine haben, und die gegenüber den erfindungsgemäß identifizierten Inhibitoren sensitiv sind, veränderte Gene isolieren. Die Anzucht der Mikroorgansimen auf Medien mit steigenden Konzentrationen von erfindungsgemäßen Inhibitoren erlaubt die Selektion und Evolution von resistenten Varianten der erfindungsgemäßen Targets. Die Frequenz der Mutationen kann wiederum durch mutagenen Behandlungen erhöht werden. Daneben stehen Verfahren zur gezielten Veränderungen von Nukleinsäuren zur Verfügung (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 96, 8768-8773 und Beethem et al.", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol 96, 8774-8778). Diese Methoden ermöglichen es, in den Proteinen solche Aminosäuren, die für die Bindung von Inhibitoren von Bedeutung sind, durch funktionell äquivalente Aminosäuren zu ersetzen, die jedoch die Bindung des Inhibitors verhindern.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist weiterhin ein Verfahren zur Erstellung von Nukleotidsequenzen welche für Genprodukte codieren, die eine veränderte biologische Aktivität aufweisen, wobei die biologische Aktivität dahingegen verändert wurde, dass eine erhöhte Aktivität vorliegt. Unter erhöhter Aktivität ist eine gegenüber dem Ausgangsorganismus bzw. gegenüber dem Ausgangsgenprodukt um mindestens 10 %, bevorzugt um mindestens 30 %, besonders bevorzugt um mindestens 50 % oder 70 %, ganze besonders bevorzugt um mindestens 100 % höhere Aktivität zu verstehen. Weiterhin kann die biologische Aktivität dahingegen verändert worden sein, dass die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel nicht mehr oder nicht mehr richtig an die Nukleinsäuresequenzen und/oder die durch sie codierten Genprodukte binden. Unter nicht mehr oder nicht mehr richtig ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, dass die Substanzen um mindestens 30 %, bevorzugt mindestens 50 %, besonders bevorzugt um mindestens 70 %, ganz besonders bevorzugt um mindestens 80 % oder gar nicht mehr an die veränderten Nukleinsäuren und/oder Genprodukte im Vergleich zum Ausgangsgenprodukt oder den Ausgangsnukleinsäuren binden.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine nach dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren genetisch veränderte transgene Pflanze.
Genetisch veränderten transgene Pflanzen, die gegen die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen und/oder Mittel enthaltend diese Substanzen resistent sind, können auch durch Überexpression der in den erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Nukleinsäuren, insbesondere SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 erzeugt werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Erzeugung trans- gener Pflanzen, die gegen Substanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden wurden, resistent sind, dadurch gekennzeichnet, dass in diesen Pflanzen erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit einer der beschriebenen biologischen Aktivität, insbesondere mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 überexprimiert werden. Ein ähnliches Verfahren wird beispielhaft in Lermantova et al., Plant Physiol., 122, 2000: 75-83 beschrieben. Natürlich können auch die hierin genannten Derivate und Fragmente, z.B. aus anderen Pflanzen, verwendet werden, die die gewünschte Aktivität aufweisen.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung resistenter
Pflanzen ermöglichen die Entwicklung neuer Herbizide, die eine möglichst umfassende Pflanzenspezies unabhängige Wirkung aufweisen (sog. Totalherbizide), in Kombination mit der Entwicklung von gegenüber dem Totalherbizid resistenten Nutzpflanzen. Gegenüber Totalherbiziden resistente Nutzpflanzen sind bereits verschiedentlich beschrieben worden. Dabei können mehrere Prinzipien zur Erzielung einer Resistenz unterschieden werden:
a) Resistenzerzeugung in einer Pflanze über Mutationsverfahren oder gen- technische Verfahren, indem das als Zielort für das Herbizid dienende Protein deutlich überproduziert wird und indem auf Grund des großen Überschusses des als Zielort für das Herbizid dienende Protein, die von diesem Protein in der Zelle ausgeübte Funktion auch nach Applikation des Herbizides beibehalten wird.
b) Veränderung der Pflanze dahingehend, dass eine modifizierte Version des als Zielort des Herbizid fungierenden Proteins eingeführt wird und dass das neu eingeführte modifizierte Protein vom Herbizid nicht in seiner Funktion beeinträchtigt wird.
c) Veränderung der Pflanze dahingehend, dass ein neues Protein/ eine neue RNA eingeführt wird, welche(s) dadurch gekennzeichnet ist, dass die für die herbizide Wirkung der niedermolekularen Substanz verantwortliche chemische Struktur des Proteins oder der Nukleinsäure, wie der RNA oder der DNA, so verändert wird, dass durch die veränderte Struktur keine herbizide Wirkung mehr entfaltet werden kann, oder das Herbizid in der veränderten Pflanze inaktiviert oder modifiziert wird, z.B. abgebaut wird, nicht aufgenommen oder nicht transportiert wird oder in die Vakuole transportiert wird, etc., d.h. die Interaktion des Herbizids mit dem Zielort nicht mehr erfolgen kann.
d) dass die Funktion des Targets durch eine neue in die Rlanze eingebrachte Nukleinsäure, z.B. ein Gen ersetzt wird, wobei die Nukleinsäure für ein Genprodukt codiert, das geringer oder gar nicht von der herbiziden Substanz in seiner Funktion getrennt wird. So kann z.B. ein sogenannter "alternativer Pathway" geschaffen werden.
e) dass die Funktion des Targets durch ein anderes in der Pflanze vorhandenes oder in die Pflanze eingebrachtes Gen bzw. dessen Genprodukt übernommen wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher weiterhin die Verwendung von Pflanzen, die durch die T-DNA Insertion getroffene Gene mit den in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 oder die weiteren genannten Sequenzen, z.B. Fragmente und Derivate, z.B. aus anderen Pflanzen, enthalten, zur Entwicklung von neuen Herbiziden. Dem Fachmann sind alternative Verfahren zur Identifizierung von homologen Nukleinsäuren beispielsweise in anderen Pflanzen mit ähnlichen Sequenzen wie unter Verwendung von Trans- posons, bekannt. Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch die Verwendung von alternativen Insertionsmutageneseverfahren zur Insertion von fremder Nukleinsäure in die hierin beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 in von diesen Sequenzen aufgrund des genetischen Codes abgeleitete Sequenzen und/oder deren Derivate oder Fragmente z.B. aus anderen Pflanzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb wie oben beschrieben Sub- stanzen identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanz ein Verbindungen vorteilhaft eine niedermolekulare Verbindung ist mit kleiner 1000 Molekulargewicht, vorteilhaft kleiner 900 Dalton, bevorzugt kleiner 800, besonders bevorzugt kleiner 700, ganz besonders bevorzugt kleiner 600 Dalton, vorteilhaft mit einem Ki-Wert von kleiner 10"7, vorteilhaft kleiner 10"8, bevorzugt kleiner 10"9 M, vorteilhaft sollte dabei diese Hemmwirkung auf ein spezifische Hemmung des biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine zurückzuführen sein, das heißt es sollte keine Hemmung durch diese niedermolekularen Substanzen weiterer nahe verwandter Nukleinsäuren und/oder der durch diese Nukleinsäuren codierten Proteine erfolgen. Weiterhin sollten die niedermolekulare Substanzen vorteilhaft ein Molekulargewicht von größer 50 Dalton, bevorzugt größer 100 Dalton, besonders bevorzugt größer 150 Dalton, ganz besonders bevorzugt größer 200 Dalton haben. Vorteilhaft sollten die niedermolekularen Substanzen weniger als drei Hydroxylgruppen an einem Kohlen- stoffatom-enthaltenden Ring haben. Weiterhin sollten auch keine freie(n) Säure- oder Lacton-Gruppe(n) sowie keine Phosphatgruppe und nicht mehr als eine Aminogruppe im Molekül enthalten sein. Auch Basen wie Adenosin im Molekül sind weniger bevorzugt. Bei den Substanzen kann es sich auch vorteilhaft um eine proteinogene Substanz wie einem Antikörper oder um eine Antisense-RNA handelt. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind Substanzen, die nach den erfindungsgemäßen oben beschriebenen Verfahren identifiziert wurden und wobei es sich bei den Substanzen um einen Antikörper gegen das durch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 codierte Protein oder Derivate oder Fragmente davon handelt.
Die Antikörper können auch mehrere der genannten Sequenzen binden, solange die Bindung spezifisch ist, d.h. nach den oben genannten Verfahren identifiziert oder getestet werden können.
Diese Substanzen zeichnen sich vorteilhaft durch ihre herbizide Wirkung, die mit den oben beschriebenen Verfahren identifizierbar sind.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind Mittel, enthaltend eine herbizid wirksame Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren oder eines Antagonisten identifiziert nach einem erfindungsgemäßen
Verfahren und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
Eine weitere Ausführungsform sind Mittel, enthaltend eine das Wachstum regulierende Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren oder eines Antagonisten identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
Diese erfindungsgemäßen Substanzen oder Mittel mit ihrer herbiziden Wirkung können als Defoliants, Desiccants, Krautabtötungsmittel und insbesondere als Unkrautvernichtungsmittel verwendet werden. Unter Unkraut im weitesten Sinne sind alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind. Ob die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen bzw. Wirk- Stoffe als totale oder selektive Herbizide wirken, hängt unter anderem von der angewandten Menge, ihrer Selektivität und weiteren Faktoren ab. Die Substanzen können beispielsweise gegen folgende Unkräuter verwendet werden:
Dikotyle Unkräuter der Gattungen: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.
Monokotyle Unkräuter der Gattungen:
Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen bzw. sie enthaltende Mittel vorteilhaft noch in einer weiteren Zahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung unerwünschter
Pflanzen eingesetzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen:
Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctori- us, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberica), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineen- sis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hordeum vulgäre, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec, Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N. rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec, Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylestre, Ricinus communis, Saccharum offieinarum, Seeale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgäre), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Substanzen können vorteilhaft auch in Kulturen verwandt werden, die durch Züchtung einschließlich gentechnischer Methoden gegen die Wirkung von Herbiziden tolerant sind.
Die erfindungsgemäßen Substanzen bzw. die sie enthaltenden herbiziden Mittel können beispielsweise in Form von direkt versprühbaren wässrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wässrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen oder Dispersionen, Emulsionen, Oldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken; sie sollten in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe gewährleisten.
Als inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe kommen flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, eyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z.B. Amine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser in Frage.
Weitere vorteilhafte Anwendungsformen der erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel sind wässrige Anwendungsformen wie Emulsionskonzentrate, Suspensionen, Pasten, netzbaren Pulvern oder wasserdispergierbaren Granulaten, die beispielsweise durch Zusatz von Wasser bereitet werden können. Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder Oldispersionen können die Substanzen und/oder Mittel die sog. Substrate als solche oder in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst, mittels Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel in Wasser homogenisiert werden. Es können aber auch aus wirksamer Substanz, Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel und eventuell Lösungsmittel oder Öl bestehende Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind.
Als oberflächenaktive Stoffe kommen die Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z.B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaphthalin- sulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenol- ether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenyl- polyglykolether, Alkylarylpolyetheralkohole, Isotrideeylalkohol, Fettalkoholethylenoxid- Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylen- alkylether, Laurylalkoholpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfitablaugen oder Methylcellulose in Betracht. Pulver-, Streu- und Stäubemittel können als feste Trägerstoffe vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermählen der wirksamen Substanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden.
Granulate, z.B. Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der Wirkstoffe an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nussschalenmehl, Cellulosepul- ver oder andere feste Trägerstoffe.
Die Konzentrationen der erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel in den anwendungsfertigen Zubereitungen können in weiten Bereichen variiert werden. Die Formulierungen enthalten im allgemeinen 0,001 bis 98 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 95 Gew.-%, mindestens eines Wirkstoffs. Die Wirkstoffe werden dabei in einer Reinheit von 90 % bis 100 %, vorzugsweise 95 % bis 100 % (nach NMR-Spektrum) eingesetzt.
Die Applikation der herbiziden Mittel bzw. der Substanzen kann im Vorauflauf- oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind die Wirkstoffe für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Ausbringungstechniken angewandt werden, bei welchen die herbiziden Mittel oder Substanzen mit Hilfe der Spritzgeräte so gespritzt werden, dass die Blätter der empfindlichen Kulturpflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die Wirkstoffe auf die Blätter darunter wachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen (post-directed, lay-by).
Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums und zur Erzielung synergistischer Effekte können die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel mit zahlreichen Vertretern anderer herbizider oder wachstumsregulierender Wirkstoffgruppen gemischt und gemeinsam ausgebracht werden. Beispielsweise kommen als Mischungspartner 1 ,2,4-Thiadiazole, 1 ,3,4-Thiadiazole, Amide, Aminophosphorsäure und deren Derivate, Aminotriazole, Anilide, (Het)-Aryloxyalkansäure und deren Derivate, Benzoesäure und deren Derivate, Benzothiadiazinone, 2-Aroyl-1 ,3-cyclohexandione, Hetaryl-Aryl-Ketone, Benzylisoxazolidinone, Meta-CF3-phenylderivate, Carbamate, Chinolinsäure und deren Derivate, Chloracetanilide, Cyclohexan-1 ,3-dionderivate, Diazine, Dichlorpropionsäure und deren Derivate, Dihydrobenzofurane, Dihydrofuran-3-one, Dinitroaniline, Dinitro- phenole, Diphenylether, Dipyridyle, Halogencarbonsäuren und deren Derivate, Harnstoffe, 3-Phenyluracile, Imidazole, Imidazolinone, N-Phenyl-3,4,5,6-tetrahydrophthal- imide, Oxadiazole, Oxirane, Phenole, Aryloxy- oder Heteroaryloxyphenoxypropion- säureester, Phenylessigsäure und deren Derivate, Phenylpropionsäure und deren Derivate, Pyrazole, Phenylpyrazole, Pyridazine, Pyridincarbonsäure und deren Derivate, Pyrimidylether, Sulfonamide, Sulfonylharnstoffe, Triazine, Triazinone, Triazolinone, Triazolcarboxamide, Uracile in Betracht.
Außerdem kann es von Nutzen sein, die erfindungsgemäßen Substanzen und/oder Mittel allein oder in Kombination mit anderen Herbiziden auch noch mit weiteren Pflanzenschutzmitteln gemischt, gemeinsam auszubringen, beispielsweise mit Mitteln zur Bekämpfung von Schädlingen oder phytopathogenen Pilzen bzw. Bakterien. Von Interesse ist ferner die Mischbarkeit mit Mineralsalzlösungen, welche zur Behebung von Ernährungs- und Spurenelementmängeln eingesetzt werden. Es können auch nichtphytotoxische Öle und Ölkonzentrate zugesetzt werden.
Die Aufwandmengen an Wirkstoff (= Substanzen und/oder Mittel) betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0,001 bis 3,0, vorzugsweise 0,01 bis 1 ,0 kg/ha aktive Substanz.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist die Verwendung einer Substanz identifiziert nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren oder Mittel enthaltend diese Substanzen als Herbizid oder zur Wachstumsregulierung von Pflanzen.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Kit, umfassend das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt, der erfindungsgemäßen Substanzen, z.B. den erfindungsgemäßen Antikörper, das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül und/oder einen Antagonisten und/oder eine herbizide Substanz identifiziert gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren sowie die unten beschriebene Zusammensetzung.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist eine Zusammensetzung, enthaltend die erfindungsgemäße Substanz, den erfindungsgemäßen Antikörper, das erfindungs- gemäße Antisense-Nukleinsäurekonstrukt und/oder einen erfindungsgemäßen Antagonisten und/oder eine erfindungsgemäße Substanz identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten.
Beispiele
a) Molekularbiologische Methoden Molekularbiologische Methoden wie sie hier eingesetzt wurden entsprechen dem Stand der Technik und sind an verschiedenen Stellen, wie bspw. Sambrock et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Reiter et al., Methods in Arabidopsis Research, World Sientific Press (1992), Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer
Academic Publishers (1998) und Martinez-Zapater und Salinas, Methods in Molecular Biology, Vol. 82: Arabidopsis Protoeols eds., Humana Press Inc., Totowa, NJ. Diese Referenzen beschreiben die gängigen Standardmethoden für die Produktion, Identifizierung und Klonierung von durch T-DNA-Insertionen her- vorgerufenen Mutanten. Zusätzlich wurde für die Identifizierung von Insertions- stellen auf eine weitere gängige Methode, wie sie u.a. von Spertini et al., Biotechniques 27: 308-314 (1999) beschrieben wurde, zurückgegriffen. Die Sequenzierungen erfolgten durch die Firma DNA LandMarks Inc., Quebec, Kanada.
b) Material
Die verwendeten Chemikalien wurden, wenn im Text nicht gesondert angegeben, in p.A.-Qualität von den Firmen Fluka (Neu-UIm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deideshofen) bezogen.
Lösungen wurden unter Verwendung von reinem pyrogenfreiem Wasser, das mit einer lonenaustauschanlage der Firma (TKA, Niederelbert) hergestellt wurde. Restriktionsnukleasen, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits und Oligonukieotide wurden bezogen von den Firmen Amersham Pharmacia (Freiburg), Biometra (Göttingen), Dynal (Hamburg), Gibco-BRL (Gaithersburg,
MD., USA), Invitrogen (Groningen, Niederlande), MBI Fermentas (St. Leon Rot), New England Biolabs (Schwalbach, Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Qiagen (Hilden), Röche Diagnostics (Mannheim), Stratagene (Amsterdam, Niederlande), TIB-Molbiol (Berlin). Falls nicht anders beschrieben wurden die Produkte nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1 : Herstellung einer KO-Population und Identifizierung von Linien, die für lethale Mutation segregieren
Ausgehend von dem Grundgerüst der pPZP- Vektoren [Hajukiewicz, P. et al., (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobaeterium binary vectors for plant trans- formation. Plant Mol. Biol. 25, 989-994], wurde ein modifizierter binärer Vektor konstruiert, welcher das Kanamycin-Resistenzgen für die Selektion in Bakterien enthielt. Zwischen der linken und der rechten T-DNA-Border befand sich nur eine Selektions- kassette, bestehend aus dem Resistenz Gen für die Clearfieldresistenz (Imidazolinon- bzw. AHAS-Resistenz) unter der Kontrolle des konstitutiven Promotors masl (Veiten et al., 1984, EMBO J. 3, 2723-2730; Mengiste, Amedeo and Paszkowski, 1997, Plant J., 12, 945-948.). Alternativ können anderen Resistenzgene wie die Hebizidresistenzgene wie die Phosphinotricin- (= bar-Resistenz), die Methioninsulfoximin-, die Sulfonyl- harnstoff- (= ilv-Resistenz, ind S. cerevisiae iiv2) oder die Phenoxyphenoxyherbizid- resistenzgene (= ACCase-Resistenz) oder Antibiotikaresistenzgene verwendet werden. Auch sind dem Fachmann anderen konstitutive Promotoren bekannt, die anstelle des verwendeten masl '-Promotors verwendet werden können wie der 34S-, der 35S- oder der Ubiquitin-Promotor aus Petersilie. Dem Fachmann sind die verschiedenen für die Transformation von Arabidopsis mittels Agrobakterium verwendbaren Vektoren bekannt. Eine detaillierte Beschreibung der einsetzbaren Vektoren und Agrobakterien- stämme findet man in Hellens et al., (Trends in Plant Science, 2000, Vol 5, 446-451). Die Plasmide wurden mittels eines Hitze-Schock Protokolls in Agrobakterien hier in den Agrobaeterium tumefaeiens Stamms GV3101pMP90 (Koncz and Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204:383-396) transfomiert. Transformierte Kolonien der Baktierien wurden auf YEP-Medium, welche die entsprechenden Antibiotika enthielten, für 2 Tage bei 28°C angezogen. Diese Agrobakterien wurden dann für die Transformationen einer großen Zahl an Arabidopsis-Pflanzen des Ökotyps C24 (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK ; NASC Stock N906) eingesetzt, wobei nach einer modifizierten Version der "in-planta" Transformationsmethode (Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. 1993. In planta Agrobaeterium mediated gene transfer by infiltration of Arabidopsis thaliana plants, C.R. Acad. Sei. Paris. 316:1194-1199; Clough, JC and Bent, AF. 1998 Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J.. 16:735-743) verfahren wurde. Transformierte Pflanzen wurden mittels des Selektionsagenz, gegen welches das auf der T-DNA codierte Resistenzgen eine Resistenz vermittelt, selektiert.
Von diesen transformierten Pflanzen wurden ca. 100 bis 200 Samen (T2) auf Agar- platten mit Selektionsagenz ausgelegt. Diese Platten wurden für 2 Tage bei 4°C stratefiziert und für ca. 7 bis 10 Tage bei 20°C und Dauerlicht inkubiert. Anschließend wurde die Zahl an gegenüber dem Selektionsagenz resistenten und sensitiven Keimlingen bestimmt. Zudem wurden gegebenenfalls die Zahl an nicht pigmentierten Pflanzen (Albinos) bestimmt. Diese ließen sich auf Grund ihrer Farbe eindeutig von den sensitiven Keimlingen unterscheiden. Es wurden nur solche Linien weiter unter- sucht, die offensichtlich für einen Insertionsort segregierten, das heißt in denen ungefähr ein Drittel bis zu einem Viertel der Pflanzen eine Sensitivität gegenüber der Selektion zeigten und in denen eine sehr enge Kopplung, das heißt, dass eine Cosegregation zwischen der die Resistenz vermittelnde T-DNA und der den Phänotyp erzeugenden Mutation gefunden wurde. Eine solche sehr enge Kopplung zwischen der T-DNA und der Mutation lag vor, wenn ein Zahlenverhältnis von 2:1 zwischen resistenten und sensitiven Keimlingen gefunden wurde. Dieses von einer normalen 3:1 Spaltung für einen Insertionsort abweichende Zahlenverhältnis kommt nur vor, wenn die homozygot resistenten Pflanzen quantitativ fehlen, weil sie entweder schon als Embryo sterben bzw. sich nicht entwickeln oder aber weil sie einen Albinophänotyp ausprägen. Demnach ist es sehr wahrscheinlich, dass die Insertion der T-DNA an dem jeweiligen Ort im Genom die Ursache für die embryonallethale bzw. die Albinomutation darstellt. Entsprechend kann das essentielle Gen durch Bestimmung des Insertionsort und des dort vorhandenen Gens identifiziert werden.
Beispiel 2: Molekulare Analyse von Linien mit embryo- oder albinolethalem Phänotyp
Von den ausgewählten Linien, die für eine albinolethale oder embryolethale Mutation segregierten und für die eine Cosegregation zwischen T-DNA und Mutation bestimmt wurde, wurde aus ca. 50 mg Blattmaterial genomische DNA mittels Standardverfahren (entweder Säulen der Firma Qiagen, Hilden, Germany oder Phytopure Kit der Firma Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany) isoliert. Die Amplifikation der Insertions- stelle der T-DNA erfolgte durch eine modifizierte Version der Adaptor-PCR-Methode wie sie von Spertini D, Beliveau C. and Bellemare, 1999, Biotechniques, 27, 308-314 publiziert worden ist. Etwa jeweils 50 bis 100 ng der genomischen DNA wurden parallel mit den Restriktionsenzymen Muni, Bglll, Bspl (= Bspl 191), Pspl (= Psp1406l) und Spei verdaut und mit einem Adaptor ligiert, der aus den annealten Oligos 5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGGGCAGGT-3' und 5'NN(2- 4)ACCTGCCCAA-3' bestand, wobei 5'NN(2-4) den zum jeweiligen Enzym passenden Überhang repräsentierten. Ein μl dieser mit Adaptoren versehenen genomischen DNA wurde für eine Amplifikation der zu den T-DNAs flankierend liegenden Sequenzen unter Verwendung eines adaptorspezifischen
(5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3') und jeweils eines genspezifischen Primers für jede Border eingesetzt. Dem Fachmann ist bekannt, wie man genspezifische Primer für die T-DNA, welche zur Pflanzentransformation verwendet wurde, designt und synthetisiert. Die PCR wurde unter Standardbedingungen für 7 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 72°C und für 32 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 65°C in 25 μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Das erhaltene Amplifikat wurde 1 :50 in H20 verdünnt und ein μl dieser Verdünnung für eine zweite Amplifikations- runde (5 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 67°C und 28 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 60°C) eingesetzt. Hierzu wurden "eingerückte" daher auf dem PCR-Produkt weiter innenliegende Primer eingesetzt, wodurch die Spezifität und Selektivität der Amplifikation erhöht wurde. Von dem in 50 μl Reaktionsvolumen erhaltenen Amplifikaten wurde ein Aliquot einer gelelektrophoretischen Analyse unterzogen. Es wurden jeweils ein oder mehrere spezifische PCR-Produkte für die linke und/oder die rechte T-DNA erhalten. Die Produkte wurden mittels Standard- methoden (Firma Qiagen, Hilden) gereinigt und mit Hilfe weiterer T-DNA-spezifischer Primer sequenziert. Durch einen Blast- Vergleich (BLASTN, Altschul, et al., 1990, J Mol. Biol. 215:403-410) der isolierten Sequenz mit der publizierten Genomsequenzen von Arabidopsis (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000, Nature, 408:796-815) wurde jeweils die Insertionsstelle der T-DNA im Genom bestimmt. Da diese Sequenzen in annotierten Form in verschiedenen Datenbanken, die dem Fachmann bekannt sind, zur Verfügung stehen, konnten auch die jeweils inaktivierten ORFs bestimmt werden. Die erfolgreiche Identifizierung eines inaktivierten ORFS wurde durch eine PCR- Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierenden Sequenz und einem für die T-DNA spezifischen Primer verifiziert. Der Erhalt des PCR-Produkts der erwarteten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA.
Beispiel 3: Identifizierung und Analyse der Linie 303317 die für eine lethale Mutation segregiert
Die Linie 303317 wurde wie oben beschrieben (Beispiele 1 und 2) als Linie, die für eine keimlingslethale Mutation segregiert, identifiziert. Die genaue Auszählung der Spaltung ergab, dass 25 % der Nachkommen den Albinophänotyp, 25 % der Nachkommen Sensitivität gegenüber der Selektion und 50 % der Nachkommen Resistenz gegenüber der Selektion zeigten. Dieses Spaltungsverhältnis wird erwartet, wenn ausschließlich die homozygot resistenten Keimlinge den Phänotyp zeigen, daher die T-DNA-Insertion mit der lethalen Mutation sehr eng gekoppelt ist. Die Kopplung wurde weiterhin in einer Cosegregationsanalyse überprüft. Dazu wurden von 40 wildtypischen, resistenten Pflanzen der Linie 303317 die Nachkommen analysiert. In allen Fällen konnten wiederum Albinos in der Nachkommenschaft gefunden werden. Dieser Umstand lässt den Schluss zu, dass die Resistenz-vermittelnde T-DNA-Insertion und die Mutation immer zusammen vererbt werden und damit (mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit) übereinstimmen. Die molekularbiologische Analyse wurde wie für Beispiel 1 beschrie- ben durchgeführt. Für die Linie 303317 wurde für das Enzym Muni ein 1400 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Der Erhalt des PCR-Produkts der vorhergesagten Größe spezifisch für diese Linie bestätigte die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle der T-DNA. Die Blast-Analyse der isolierten Sequenz (BLASTN, Altschul et al., 1990) J Mol. Biol. 215:403-410) demonstrierte die Insertion der T-DNA in Position 6628 des BAC-Klons ATF2809 mit der Accession Number AL137080. Nach der Annotation dieses Bereichs ist die Integration in einen ORF (F2809.40, SEQ ID NO: 1) erfolgt, der Ähnlichkeit zum "Translation Releasing Factor" RF-2 aus Synechocystis sp. (PIR:S76448) hat. Weiterhin besitzt das Protein (SEQ ID NO: 2) eine araC-Familiensignatur. Die erfolgreiche Identifizierung der Insertionsstelle und des inaktivierten ORFs wurde durch eine PCR-Reaktion mit einem für die abgeleitete flankierende Sequenz und einem für die T-DNA-spezifischen Primer verifiziert.
Beispiel 4: Identifizierung und Analyse der Linien 304149, 120701 , 126548, 127023, 127235, 218031 , 171042, KO-T3-02-33338-3, KO-T3-02-33885-2 und
KO-T3-02-35172-2, die für eine lethale Mutation segregieren
Analog den vorgenannten Beispielen 1 bis 4 wurden die Klone 304149, 120701 , 126548, 127023, 127235, 218031, 171042, KO-T3-02-33338-3, KO-T3-02-33885-2 und KO-T3-02-35172-2, als Linien identifiziert, die für embryo- oder keimlingslethale Mutationen segregieren. Die Aufspaltung erfolgte bei allen Linien wie unter Beispiel 3 bzw. analog zu Beispiel 3 für embryolethale Mutationen beschrieben. Die embryoletha- le Mutation führt jedoch dazu, dass die für die Mutation homozygoten Pflanzen bereits im Embyrostadium ihre Entwicklung abbrechen, somit gar nicht keimen. Entsprechend verschiebt sich das Zahlenverhältnis nach einem Drittel sensitive und zwei Drittel resistente Pflanzen gegenüber der Selektion. Die molekularbiologischen Arbeiten bzw. Analysen wurden wie unter Beispiel 1 bis 3 beschrieben durchgeführt.
Die Linie 304149 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenz- marker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 304149 wurde für das Enzym Muni ein 750 bp-großes Fragment, für die Enzyme Psp1406l/Bsp1191 ein 300 bp- großes Fragment und für das Enzym Spei ein 950 bp großes Fragment jeweils für die linke T-DNA-Border identifiziert. Für die rechte T-DNA-Border wurde mit dem Enzym Spei ein 300 bp großes Fragment identifiziert. Die Sequenzierung dieser Fragmente offenbarte den gleichen Insertionsort. Die T-DNA ist auf Chromosom 5 in Position 35398 des P1 -Klons MSH12, Accession AB006704 inseriert. Durch die Insertion 110 bp stromaufwärts vom Startcodon des ORFs MSH12.9 wird höchstwahrscheinlich die Transkription unterbunden bzw. die Transkriptstabilität verringert und damit die Funktionalität des ORFs verringert oder vollständig zerstört. Dieser ORF MSH12.9 codiert für ein Kobalamin-Synthese-Protein.
Die Linie 120701 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenz- marker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 120701 wurde für das Enzym Bglll ein 500 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 4 in Position 55170 des Bac-Klons ATT25K17, Acession AL049171 inseriert. Durch die Insertion innerhalb des codierende Bereichs wir der ORF T25K17.110 unterbrochen und damit inaktiviert. Dieser ORF T25K17.110 codiert für eine Arginyl-tRNA-Synthetase Dieser ORF beinhaltet den EST: gb:AA404880, T76307. Die Linie 126548 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenz- marker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 126548 wurde für die Enzyme Psp1406l/Bsp119l ein 1000 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Für die rechte T-DNA-Border wurden mit den Enzymen Psp1406l/Bsp1191 ein 900 bp-großes Fragment und mit dem Enzym Bglll ein 300 bp-großes Fragment identifiziert. Die Sequenzierung aller PCR-Produkte demonstrierte die Insertion der T-DNA am gleichen genomischen Ort. Die T-DNA ist auf Chromsom 4 in Position 36872 des Bac-Klons ATF17A8, Acession AL049482 inseriert. Durch die Insertion innerhalb des codierende Bereichs wir der ORF F17A8.80 unterbrochen und damit inaktiviert. Dieser ORF F17A8.80 codiert für putatives Protein mit Ähnlichkeit zu einer RNA-Helicase aus Maus (Mus musculus), PIR2:I84741.
Die Linie 127023 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenz- marker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 127023 wurde für das Enzym Bglll ein 350 bp-großes Fragment und für die Enzyme Psp1406l/Bsp1191 ein 900 bp- großes Fragment jeweils für die linke T-DNA-Border identifiziert. Beide Fragmente identifizierten nach der Sequenzierung den identischen Insertionsort. Die T-DNA ist auf Chromsom 4 in Position 61403 des BAC-Klons ATT19P19, Acession AL022605 inseriert. Durch diese Insertion wird der ORF AT4g39780 unterbrochen und damit inaktiviert. Dieser ORF AT4g39780 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zum dem die AP2-Domäne enthaltenden Protein RAP 2.4 aus Arabidopsis thaliana. Zudem beinhaltet dieser ORF die ESTs gb:T46584 und AA394543.
Die Linie 127235 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenz- marker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 127235 wurde für das Enzym Muni ein 1600 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Für die rechte T-DNA-Border wurde mit dem Enzym Bglll eine 600 bp-großes Fragment identifiziert. Beide Fragmente identifizierten nach der Sequenzierung den identischen Insertionsort. Die T-DNA ist auf Chromsom 1 in Position 10776 des BAC-Klons F9K20, Accession AC005679 inseriert. Durch diese Insertion wird der ORF F9K20.4 unterbrochen und damit inaktiviert. Dieser ORF F9K20.4 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu dem gill 786244 hypothetischen 24.9 kD Protein in der surA-hepA intergenischen Region yabO des Escherichia coli Genoms gblAE000116, und zu dem hypothetischen Protein der YABO Familie PFI00849. Weiterhin besitzt das durch den ORF F9K20.4 codierte Protein eine konservierte Pseudouridylat-Synthase-Domäne, welche an der Modifizierung von Uracil in RNA-Molelkülen beteiligt ist. Demnach zeigt der ORF F9K20.4 im blastp-Vergleich unter Standardbedingungen signifikante Homologie zu verschiedenen Pseudouridylat-Synthasen. Die Linie 218031 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenz- marker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 218031 wurde für das Enzym Bglll ein 400 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert und dieses anschließend sequenziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 2 in Position 11909 des Klons F3G5 mit der Accession AC005896 inseriert. Durch die Insertion im codierenden Bereich wir der ORF At2g37250 inaktiviert. Dieser ORF codiert für eine putative Adenylatkinase.
Die Linie 171042 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmar- ker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 171042 wurde für die Enzyme Psp1406l/Bsp119l ein 1600 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert und dieses anschließend sequenziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 3 in Position 97005 des Bac-Klons T29H11 mit der Accession AL049659 inseriert. Durch die Insertion im codierenden Bereich wir der ORF T29H11_270 inaktiviert. Dieser ORF T29H11_270 codiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu dem pol Polyprotein des equine infectious anemia virus (PIR:GNLJEV).
Die Linie KO-T3-02-33338-3 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-33338-3 wurde für das Enzym Muni ein 624 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert und dieses anschließend sequenziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 5 in Position 39500 des P1 -Klons MJE7 mit der Accession AB020745 inseriert. Durch die Insertion 64 Basenpaare stromabwärts vom Stop-Codon des ORFs MEJ7.11 wird vermutlich das Transkript dieses ORFs verändert und damit die Transkriptstabilität reduziert. Demnach ist von einer reduzierten oder gänzlich blockierten Genfunktion für diesen ORF auszugehen. Der ORF MEF7.11 codiert für ein unbekanntes Protein.
Die Linie KO-T3-02-33885-2 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-33885-2 wurde für die Enzyme Pspl 406I/Bsp1191 ein 450 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Für die rechte T-DNA-Border wurde mit den Enzymen Psp1406l/Bsp119l ein 650 bp-großes Fragment identifiziert. Beide Fragmente iden- ti izierten nach der Sequenzierung den identischen Insertionsort. Die T-DNA ist auf Chromsom 1 in Position 76356 des Bac-Klons F14G9 mit der Accession AC069159 inseriert. Durch die Insertion im codierenden Bereich des ORFs F14G9.26 wird dieser ORF in dieser Linien inaktiviert. Der ORF F14G9.26 codiert für ein unbekanntes Protein.
Die Linie KO-T3-02-35172-2 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-35172-2 wurde für das Enzym Muni ein 700 bp-großes Fragment für die rechte T-DNA-Border identifiziert und dieses anschließend sequenziert. Die T-DNA ist auf Chromsom 5 in Position 24422 des P1 -Klons MAB16 mit der Accession AB018112 inseriert. Durch diese Insertion 87bp stromaufwärts des ORFs MAB16.6 wird die Transkription dieses ORFs höchstwahrscheinlich blockiert und damit das Gen ausgeschaltet. Der ORF MAB16.6 codiert für ein Protein, welches nur Homologie zu anderen unbekannten Proteinen zeigt.
Beispiel 5: Identifizierung und Analyse der Linien 305861 , 303814, KO-T3-02-132241 , KO-T3-02-15114-2, KO-T3-02- 18601-1 und 304143, die für albinolethale
Mutationen segregieren
Analog den vorgenannten Beispielen 1 bis 4 wurden die Klone 305861 , 303814, KO-T3-02-132241, KO-T3-02-15114-2, KO-T3-02-18601-1 und 304143 als Linien identifiziert, die für albinolethale Mutationen segregieren. Die Aufspaltung erfolgte bei allen Linien wie unter Beispiel 3 beschrieben. Die molekular-biologischen Arbeiten bzw. Analysen wurden wie unter Beispiel 1 bis 3 beschrieben durchgeführt.
Die Linie 305861 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenz- marker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 305861 wurde für die Enzymkombination Bgl II ein ca. 1300 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 16326 des BACs T7B11, Accession AC007138 auf Chromosom 4. Durch die Insertion in das offene Leseraster wird der ORF T7B11.6 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF kodiert für ein „preprotein translocase secA precursor" Protein, es ist daher ein chloroplastidäres SecA-Protein, das für die Proteintransport über die Thylakoidmemmbran verantwortlich ist. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie 303814] segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 303814 wurde für die Enzymkombination Mun I ein ca. 1300 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 2027 des BACs F2G19, Accession AC083835 auf Chromosom 1. Durch die Insertion in das offene Leseraster wird der ORF F2G19.1 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF kodiert für ein Protein mit signifikanter Homologie zum DCL Protein aus Tomate, PIR:S71749. Weiterhin besitzt das Protein eine sogenannte die HMG-Signatur, der high mobility group Proteine, welche an DNA binden können. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-13224-1 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-13224-1 wurde für die Enzym kombination Bgl II ein ca. 500 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 55170 des BACs T25K17, Accession AL049171 auf Chromosom 4. Durch die Insertion in das offene Leseraster wird der ORF T25K17.110 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF kodiert für eine Arginin-tRNA-Ligase. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-15114-2 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-15114-2 wurde für die Enzymkombination Mun I ein ca. 350 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 6984 des BACs T5N23, Accession AL138650 auf Chromosom 3. Durch die Insertion in das offene Leseraster wird der ORF T5N23.20 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF, kodiert für eine plastidäre GIuthathion-Reduktase. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-18601 -1 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-18601 -1 wurde für die Enzymkombination Bgl II ein ca. 600 bp-großes Fragment für die rechte T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 4026 des BACs F22O13, Accession AC003981 auf Chromosom 1. Durch die Insertion in das offene Leseraster wird der ORF F22O13.2 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF kodiert einen Transkriptionsinitationsfaktor Sigma Homolog, daher einem pflanzlichen Homologen zum Sigma-Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA- spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt. Die Linie 304143 segregiert für eine albinolethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie 304143 wurde für das Enzym Bgl II ein ca. 950 bp-großes Fragment für die rechte T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 79156 des BACs F9O13 map mi398, Accession AC006248 auf Chromosom 2. Durch die Insertion in den Promotor, daher ca. 450bp stromaufwärts vom Startcodon, wird vermutlich die Transkription des ORFs At2g15680 verhindert und damit die Genfunktion ausgeschaltet. Der ORF At2g15680 kodiert für ein putatives Calmudulin-ähnliches Protein. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF- spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Beispiel 6: Identifizierung und Analyse der Linien KO-T3-02-403222-2, KO-T3-02-40309-1, KO-T3-02-40309-2, KO-T4-02-00666-4, KO-T4-02-00666-5, KO-T3-02-41568-2, KO-T3-02-42903-1 ,
KO-T3-02-41395-1 und KO-T3-02-44634-4, die für embryoiethale Mutationen segregieren
Analog den vorgenannten Beispielen 1 bis 4 wurden die Klone KO-T3-02-403222-2, KO-T3-02-40309-1 , KO-T3-02-40309-2, KO-T4-02-00666-4, KO-T4-02-00666-5, KO-T3-02-41568-2, KO-T3-02-42903-1 , KO-T3-02-41395-1 und KO-T3-02-44634-4 als Linien identifiziert, die für embryoiethale Mutationen segregieren.
Diesen Linien spalten analog zu dem für keimlingslethale Linien beschriebenen Beispiel 3 auf. Die embrolethale Mutation führt jedoch dazu, dass die für die Mutation homozygoten Pflanzen bereits im Embyrostadium ihre Entwicklung abbrechen, somit gar nicht keimen. Entsprechend verschiebt sich das Zahlenverhältnis nach einem Drittel sensitive und zwei Drittel resistente Pflanzen gegenüber der Selektion. Die molekular-biologischen Arbeiten bzw. Analysen wurden wie unter Beispiel 1 bis 3 beschrieben durchgeführt.
Die Linie KO-T3-02-40322-2 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-40322-2 wurde für das Restriktionsenzym Mun I mittels Adapter-PCR ein ca. 620 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 5261 des BACs MPX5, Accession AP002048 auf Chromosom 3. Durch die Insertion im Promotorbereich, ca. 243 bp stromaufwärts des Leserasters, wird die Transkription des ORF MPX5.1 verhindert und dadurch die Genfunktion ausgeschaltet. Dieser ORF kodiert für ein Protein mit Ähnlichkeit zu einem unbekannten Protein. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-40309-1 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-40309-1 wurde mittels Adapter-PCR für das Enzym Mun I ein ca. 900 bp- großes Fragment für die rechte T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 38553 des BACs F28O9, Accession AL137080 auf Chromosom 3. Durch die Insertion im Promotorbereich, ca.24 bp stromaufwärts des Leserasters, wird die Transkription des ORF F28O9.140 verhindert und dadurch die Genfunktion ausgeschaltet. Dieser ORF kodiert für ein Protein mit großer Ähnlichkeit zu INT6, einem brustkrebsassoziierten Protein und mit Ähnlichkeit zu einem „initiation-factor 3" Protein. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-40309-1 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie
KO-T3-02-40309-1 wurde mittels Adapter-PCR für das Enzym Mun I ein ca. 900 bp- großes Fragment für die rechte T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 38553 des BACs F28O9, Accession AL137080 auf Chromosom 3. Durch die Insertion im Promotorbereich, ca. 515 bp stromaufwärts des Leserasters, wird die Transkription des ORF F28O9.150 verhindert und dadurch die Genfunktion ausgeschaltet. Dieser ORF kodiert für ein Protein mit großer Ähnlichkeit zur DNA Helikase YGL150c aus Saccharomyces. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T4-02-00666-4segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie
KO-T4-02-00666-4 wurde mittels Adapter-PCR für das Enzym Bgl II ein ca. 390 bp- großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 9358 des BACs MKN22, Accession AB019234 auf Chromosom 5. Durch die Insertion im 3'-UTR-Bereich, ca. 82 bp stromabwärts des Leserasters, wird höchstwahrscheinlich das Transkript des ORF MKN22.2 destabilisiert und dadurch die Genfunktion ausgeschaltet. Dieser ORF kodiert für ein Protein mit Ähnlichkeit zu einem RNA- bindenden Protein. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T4-02-00666-4 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T4-02-00666-4 wurde mittels Adapter-PCR für das Enzym Spe I ein ca. 650 bp- großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 48978 des BACs MEE6, Accession AB010072 auf Chromosom 5. Durch die Insertion in das offene Leseraster wird der ORF MEE6.19 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF kodiert für ein Protein mit großer Ähnlichkeit zu einem unbekannten Protein. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-41568-2 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-41568-2 wurde mittels Adapter-PCR für das Enzym Bgl II ein ca. 500 bp- großes Fragment für die rechte T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 6993 des BACs T19L18, Accession AC004747 auf Chromosom 2. Durch die Insertion im 3'-UTR-Bereich, ca. 285 bp stromabwärts des Leserasters, wird höchstwahrscheinlich das Transkript des ORF At2g26150 destabilisiert und dadurch die Genfunktion ausgeschaltet. Dieser ORF kodiert für einen putativen Hitzeschock-Transkriptionsfaktor. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll- PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-42903-1 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-42903-1 wurde mittels TAIL-PCR für den degenerierten Primer ADP3 (5'-WGTGNAGWANCANAGA-3') ein ca. 1300 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 25933 des BACs T1 E2, Accession AC006929 auf Chromosom 2. Durch die Insertion in das offene Leseraster wird der ORF At2g28030 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF kodiert für ein putatives, chloroplastidäres an das DNA-Nukleoid bindende Protein. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-41395-1 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie
KO-T3-02-41395-1 wurde mittels Adapter-PCR für das Enzym Mun I ein ca. 910 bp- großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 153501 des BACs ATCHRIV25, Accession AL161513 auf Chromosom 4. Durch die Insertion in das Gen wird der ORF AT4g08990 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF kodiert für ein Protein mit Ähnlichkeit zu einer putativen Met2-Typ Cytosin DNA- Methyltransferase, das starke Ähnlichkeit zu einer DNA-(cytosine-5-)-Methyltransferase aus Arabidopsis thaliana aufweist. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll-PCR, welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.
Die Linie KO-T3-02-44634-4 segregiert für eine embryoiethale Mutation, die mit dem Resistenzmarker und damit der T-DNA cosegregiert. Für die Linie KO-T3-02-44634-4 wurde mittels TAIL-PCR für den degenerierten Primer ADP8 (5'-NTGCGASWGANWAGAA-3') ein ca. 800 bp-großes Fragment für die linke T-DNA-Border identifiziert. Die Sequenzierung dieses Fragmentes offenbarte die Insertion der T-DNA in dieser Linie an Basenpaarposition 16225 des BACs F12B17, Accession AL353995 auf Chromosom 5. Durch die Insertion in das offene Leseraster wird der ORF F12B17_70 unterbrochen und inaktiviert. Dieser ORF kodiert für ein putatives Protein mit Ähnlichkeit zu einem postulierten Protein aus Arabidopsis thaliana. Die Insertion der T-DNA in den genannten ORF wurde mittels einer Kontroll- PCR; welche mit einem T-DNA-spezifischen und einem ORF-spezifischen Primer ein Fragment der erwarteten Größe lieferte, bestätigt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit herbizider Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass:
a) die Expression oder die Aktivität des Genprodukts einer Nukleinsäure oder eines Gens umfassend:
aa) Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ,
SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder
SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz;
bb) Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10,
SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen ableiten lässt;
cc) Nukleinsäuresequenz, die ein Derivat oder ein Fragment der in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7,
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO: 49 der SEQ ID NO: 51 dargestellten Nukleinsäuresequenzen ist, und mindestens 60 % Homologie auf Nukleinsäureebene aufweist;
Fig/Seq dd) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate oder Fragmente der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30,
SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen;
ee) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment oder ein Epitope eines Polypeptides codiert, das spezifisch an einem Antikörper bindet, wobei der Antikörper spezifisch an ein Polypeptid bindet, das von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7,
SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO: 49 der SEQ ID NO: 51 dargestellten Sequenz codiert wird;
ff) Nukleinsäuresequenz, die für ein Fragment einer in aa) dargestellten Nukleinsäure codiert und das eine 'Translation Releasing Factor"-
Aktivität, eine Kobalamin-Synthese-Aktivität, Arginyl-tRNA-Synthase- Aktivität, eine RNA-Helicase-Aktivität, eine GTP-Bindeprotein- Aktivität, eine Pseudouridylat-Synthase-Aktivität, eine Adenylatkinase-Aktivität, eine Preprotein-Translocase secA Precursorprotein- Aktivität, eine DCL-Protein-Aktivität, eine Arginin-tRNA-Ligase-
Aktivität, eine plastidäre Gluthathion-Reduktase-Aktivität, eine Transkriptionsfaktor Sigma-Aktivität, eine Calmudulin-Aktivität, eine INT6- Aktivität, eine Helikase YGL150c-Aktivität, eine RNA-bindende Aktivität, eine Hitzeschock-Transkriptionsfaktor-Aktivität, eine chloro- plastidäre DNA-Nukleoid bindende Aktivität oder eine Met2-Typ Cytosin DNA Methyltransferase-Aktivität hat; und/oder
gg) Nukleinsäuresequenz, die für Derivate der Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 oder SEQ ID NO: 52 dargestellten Aminosäuresequenzen codiert, die mindestens 20 % Homologie auf Aminosäureebene aufweist und eine äquivalente biologische Aktivität besitzt; oder
b) die Expression oder Aktivität einer Aminosäuresequenz, die von einer
Nukleinsäuresequenz nach aa) bis gg) codiert wird,
beeinflusst wird und solche Substanzen ausgewählt werden, die die Expression oder die Aktivität reduzieren oder blockieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Expression oder die Aktivität der Nukleinsäure oder des Proteins dadurch reduziert oder blockiert wird, dass die
a) Transcription, b) Translation, c) Prozessierung und/oder d) Modifikation
der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz in Anspruch 1 reduziert oder blockiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aktivität der Nukleinsäure oder des Proteins durch eine niedermolekulare Substanz reduziert oder blockiert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High-Throughput-Screening (HTS) durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die ausgewählten Substanzen auf eine Pflanze verbringt, um die herbizide
Aktivität der Substanzen zu testen und die Substanzen auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in einem Organismus durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Organismus Bakterien, Hefen, Pilze oder Pflanzen verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Organismus verwendet wird, der eine konditionale oder natürliche Mutante einer der in Anspruch 1 beschriebenen Sequenzen ist.
9. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, dargestellt in Anspruch 1 , wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
10. Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Substanz ein Molekulargewicht von kleiner 1000 Dalton und größer 50 Dalton und einen Ki-Wert kleiner 10-7 M hat.
11. Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei der Substanz um eine proteinogene Substanz oder um eine Antisense-RNA handelt.
12. Substanz nach Anspruch 11 , wobei es sich um einen Antikörper gegen das durch eine der in Anspruch 9 dargestellten Sequenz codiertes Protein handelt.
13. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, wobei im Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten sind.
14. Vektor enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 9 oder 13.
15. Organismus enthaltend mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 9 oder 13 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 14.
16. Organismus nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, einen Mikroorganismus oder ein nicht humanes Tier handelt.
17. Transgene Pflanze enthaltend ein funktionelles oder nicht funktionelles
Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 9 oder 13 oder einen Vektor gemäß Anspruch 14.
18. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 9 oder 13 oder eines Vektors gemäß Ansprüche 14 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.
19. Verfahren zur Identifikation eines Antagonisten von Proteinen, die durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 9 oder 13 codiert werden indem folgende Verfahrensschritte durchlaufen werden
i) Inkontaktbringen von Zellen, die das Protein exprimieren, oder des Proteins mit einem Kandidatenstoff;
ii) Testen der biologischen Aktivität des Protein;
iii) Vergleichen der biologischen Aktivität des Proteins mit einer Standardaktivität in Abwesenheit des Kandidatenstoffs, wobei eine Verringerung der biologischen Aktivität des Proteins anzeigt, dass der Kandidatenstoff ein Antagonist ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass man den nach Anspruch 19 Buchstabe iii) identifizierten Antagonisten auf eine Pflanze verbringt, um seine herbizide Aktivität zu testen und die Antagonisten auswählt, die eine herbizide Aktivität zeigen.
21. Verfahren zur Bekämpfung unerwünschten Pflanzenwuchses, dadurch gekennzeichnet, dass man eine herbizid wirksame Menge einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 8 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 auf Pflanzen oder deren Lebensraum oder auf Pflanzen und deren Lebensraum einwirken lässt.
22. Verwendung einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 als Herbizid oder zur Wachstumsregulierung von Pflanzen.
23. Verfahren zur Erzeugung veränderter Genprodukte, die von den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23,
SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 , deren Derivate oder Fragmente gemäß Anspruch 1 codiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Prozessschritte umfasst:
a) Expression der von den SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 oder SEQ ID NO: 51 , deren Derivate oder
Fragmente gemäß Anspruch 1 codierten Proteine in einem heterologen System oder in einem Zellfreien System
b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure,
c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid oder der biologischen Aktivität des veränderten Genproduktes in Gegenwart des Herbizids,
d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufweisen oder in ihrer Aktivität weniger beeinflusst sind,
e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides,
f) Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die oder deren Genprodukte eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die gemäß
Anspruch 23 f) ausgewählten Sequenzen in einen Organismus eingebracht werden.
25. Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen gefunden nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 resistent sind, dadurch gekennzeichnet, dass in diesen Pflanzen Nukleinsäuren mit den in Anspruch 1 beschriebenen Sequenzen überexprimiert werden.
26. Organismus hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24 oder einem Verfahren gemäß Anspruch 25.
27. Mittel, enthaltend eine herbizid wirksame Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines
Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
28. Mittel, enthaltend eine das Wachstum regulierende Menge mindestens einer Substanz identifiziert nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Antagonisten identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20 und mindestens einen inerten flüssigen und/oder festen Trägerstoff sowie gegebenenfalls mindestens einen oberflächenaktiven Stoff.
29. Zusammensetzung, enthaltend die Substanz nach einem der Ansprüche 10 bis 12 oder einen Antagonisten identifiziert gemäß Anspruch 19.
30. Kit, umfassend das Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9 oder 13, die Substanz nach einem der Ansprüche 10 bis 12, einen Antagonisten identifiziert gemäß Anspruch 19 oder 20 die Zusammensetzung nach Anspruch 29.
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