CN87101797A - 与甲醇和葡萄糖相应答的酵母菌调节区 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的与甲醇和/或分解代谢产物抑制碳源的存在相应答的DNA片段及其调节蛋白质表达的方法。

Description

本发明涉及重组DNA技术。一方面，本发明涉及甲醇诱导的调节区，另一方面，本项发明涉及葡萄糖存在的条件下被阻遇了的调节区域。还有一方面，本发明涉及整合了本发明的调节区的新型表达载体，以及由此产生的新型转化体和受调节的多肽的表达。

近年来，由于重组DNA技术的发展，所以就使得控制由微生物产生的各种有用多肽成为可能。许多真核多肽如人生长激素、白细胞干扰素、人胰岛素、人胰岛素原等等已由多种微生物产生。人们期待将来重组DNA技术能有进一步的发展，以便得到更加有效的方法来利用微生物生产有用的多肽产品。一项吸引人的发展将是调节区域的分离和鉴定，该调节区域可以通过选择适当的培养基、生长条件或其它条件而很容易地打开和关闭。

例如，Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras就曾在1985年5月的《分子及细胞生物学》出版物（1111-1121页）上揭示了DNA序列的分离和特性鉴定，该序列与甲醇的存在相应答，并且在某些分解代谢抑制碳源如葡萄糖存在的条件下，该序列受到分解代谢产物阻遏。本发明是在对上述的参考资料进行进一步的研究后得出的结果。

因此，本发明的一个目的就是对Ellis等的甲醇应答DNA序列的功能性亚片段进行分离和特性鉴定。

本发明的这一目的及其它目的从这里所提供的说明书和权利要求书中明显可见。

本发明人已惊奇地发现由Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras（Molecular    and    Cellular    Biology，1985年5月，1111-1121页）等所公布的调节区的独特亚片段具有独特的调节性质;一个这样的调节区当作为染色体成分引进宿主体内时，在甲醇存在的条件下能够完全诱导;另一个这样的调节区当作为染色体外成分引进宿主体内时，甲醇能够对其进行完全诱导;还有另一个这样的调节区能够为定位在下游的异源启动子核苷酸序列提供这样一种能力，即在甲醇存在的条件下被诱导而在分解代谢产物抑制碳源存在的条件下被阻遏。

图1是毕赤酵母属的伯醇氧化酶基因（AOXI）的5′区的限制性酶切图谱。

图2是质粒pSAOH5的限制性酶切图谱。

图3是在pBR322基础之上构建的质粒pPG2.5的酵母插入子的限制性酶切图谱。

图4是质粒pBPf3I的限制性酶切图谱。

图5是实例中的讨论的构建载体的流程图。

下面的缩写是用在图中以代表所用的限制性内切酶。

缩写    限制酶

A    AvaⅡ

B    BamHⅠ

B₂BglⅡ

Bc    BclⅠ

H₂HincⅡ

H₃HindⅢ

K    KpnⅡ

Nd₁NdeⅠ

Nr    NruⅠ

Ps    PstⅠ

Pv₂PvuⅡ

R₁EcoRⅠ

R₅EcoRV

S    SalⅠ

Sm    SmaⅠ

Ss    SstⅠ

St    StuⅠ

附图中，用于DNA片段的操作的限制性酶切位点用圆括号将破坏位点的缩写圈起来表示，不过这些点在连接时被破坏。

本发明提供了一种新型DNA片段，它包括与培养基中的甲醇的存在相应答的调节区，该培养基是与该DNA片段的宿主体相联系的。当将本发明的一新型片段作为单拷贝整合进宿主体的基因组（即作为染色体成分而不是作为染色体外成分被携带）时，它能够在甲醇存在的条件下促进完全诱导。当作为宿主体的染色体外成分（即在宿主体内作为自主成分维持）或作为染色体成分时，本发明的另一新型片段在甲醇存在的情况下能够促进完全诱导。当本发明的DNA片段的调节区位于编码产生mRNA的DNA的5′末端时，它能够控制mRNA的转录。上述DNA片段的突变型和功能等价物也包括在本发明的范围之内。

“完全诱导”一词用在本发明书中是指所给DNA片段与甲醇的存在相应答的能力。该词涉及甲醇与调节区相应答以诱导产生蛋白质产物的水平的能力，该水平与使用同相调节区一结构基因构造物转化的宿主的野生型AOXI蛋白质编码序列上游的1Kb非编码序列新达到的水平相当。

本发明进一步提供了一种由上游激活剂序列组成的DNA片段，它赋予位于下游的异源启动子核苷酸序列这样一种能力，即在该DNA片段的宿主体所在的培养基中含有甲醇时，能够诱导其表达，而在含有分解代谢产物抑制碳源时，能够抑制表达。当将本发明的这一实施方案中的DNA片段的调节区与位于编码mRNA的5′末端的异源启动子相结合时，它能够控制mRNA的转录。上述DNA片段突变型和功能等价物也包括在本发明的范围之内。

按照本发明，还可进一步提供质粒和含有上述DNA片段的转化体，以及使用这种转化体生产多肽的工序。

在本发明的另一实例方案中，还提供了一种通过使用可变数量的可操作调节区的核苷酸来控制调节区对于甲醇的应答的方法。能够获得的甲醇应答范围从微小应答（只有“完全”诱导的百分之几）直至完全甲醇诱导均可达到。

本发明的调节区对于使用重组DNA修饰的宿主用以调节多肽的生产是非常有用的。例如，在本发明的一个实施方案中，从整合表达盒中甲醇诱导多肽产物的表达是可能的。在另一实施方案中，从自主表达盒中甲醇诱导多肽产物的表达也是可能的。

按照本发明的另一个实施例，多肽产物的表达受转化宿主控制，而该宿主带有一种多肽编码序列，这一序列在甲醇诱导和分解代谢产物抑制条件相应答的上游激活剂序列的控制之下;并且此后在甲醇或分解代谢产物抑制碳源存在或缺乏的条件下使转化宿主得以维持。这样，按照这一具体实施方案，如果需要某一特定水平的多肽产物，就可以对培养基的组成进行调整，直至达到所需水平的多肽产物，然后通过向培养基中加入一种分解代谢产物抑制碳源以阻止多肽编码序列的进一步表达。

按照这后一种实施方案，本发明的上游激活剂序列对于在正常的非调节启动子的控制条件下完成多肽产物的调节生产是有用的。例如，通过掺入本发明的上游激活剂序列，可以使得组成启动子对甲醇诱导和分解代谢产物抑制作出反应。按这种方式，任何能够作为RNA转录的一个启动子的功能序列的表达都可以通过有无甲醇或分解代谢产物抑制碳源而受到控制。

将从Ellis、rust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras所揭示的伯醇氧化酶基因（AOX;见图1）（Molecular    and    Cellalor    Biology，1985年5月，1111-1121页）的5′端得到的大约1kb的调节区分别从3′末端和5′末端进行BAL31消化，然后将产生的突变启动子片段与大肠杆菌LacZ基因融合，得到一系列载体。5′端的缺失产生了下列载体：

表1

载体    AO启动子    缺失区域

pSAOH5    -900→ATG    none

pBAZ3    -709→ATG    5′191bp

pBAZ4    -499→ATG    5′401bp

pBAZ6    -372→ATG    5′528bp

pBAZ7    -216→ATG    5′684bp

pBAZ8    -197→ATG    5′703bp

载体pSAOH5（见图2）代表完整的5′-乙醇氧化酶调节区，而载体pBAZ3，4，6，7和8则代表5′端缺失。将这些含有各种调节区一结构基因（lacZ）构建物的载体转化一种巴斯德毕赤酵母营养突变体，然后当其在作为碳源和能源的甲醇或葡萄糖上生长时，检测β-半乳糖苷酶的产生。而β-半乳糖苷酶表达结果的详细分析见实施例，其结果总结如下：

（a）在ATG起始密码子上游的709碱基对与499碱基对之间存在一个弱的甲醇应答区，该密码子是用于含有这些序列的自主载体的，而整合载体的完全甲醇应答不需要上游709至499碱基对的序列。因此，尽管对于整合和自主载体来说，具有0-709核苷酸序列得到了完全用醇诱导，而带有乙醇氧化酶ATG上游的0-499碱基对，则自主载体仅显示约为50%的甲醇诱导。由自主载体表达的完全诱导所需要的709个碱基对序列如下所示：

序列A

5′-GCTACTAACA    CCATGACTTT    ATTAGCCTGT    CTATCCTGGC

CCCCCTGGCG    AGGTCATGTT    TGTTTATTTC    CGAATGCAAC

AAGCTCCGCA    TTACACCCGA    ACATCACTCC    AGATGAGGGC

TTTCTGAGTG    TGGGGTCAAA    TAGTTTCATG    TTCCCAAATG

GCCCAAAACT    GACAGTTTAA    ACGCTGTCTT    GGAACCTAAT

ATGACAAAAG    CGTGATCTCA    TCCAAGATGA    ACTAAGTTTG

GTTCGTTGAA    ATGCTAACGG    CCAGTTGGTC    AAAAAGAAAC

TTCCAAAAGT    CGCCATACCG    TTTGTCTTGT    TTGGTATTGA

TTGACGAATG    CTCAAAAATA    ATCTCATTAA    TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA    TCGCTTCTGA    ACCCGGTGGC    ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT    GGGGAAACAA    CCCGCTTTTT    GGATGATTAT

GCATTGTCCT    CCACATTGTA    TGCTTCCAAG    ATTCTGGTGG

GAATACTGCT    GATAGCCTAA    CGTTCATGAT    CAAAATTTAA

CTGTTCTAAC    CCCTACTTGG    ACAGGCAATA    TATAAACAGA

AGGAAGCTGC    CCTGTCTTAA    ACCTTTTTTT    TTATCATCAT

TATTAGCTTA    CTTTCATAAT    TGCGACTGGT    TCCAATTGAC

AAGCTTTTGA    TTTTAACGAC    TTTTAACGAC    AACTTGAGAA

GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG^-3′.

带有象ATG上游的第一个197个这样少的核苷酸至少观察到微小的甲醇诱导。

（b）在起始密码子ATG上游的约372和197碱基对之间存在一个强的甲醇应答区。而在起始密码子ATG上游的372和216碱基对之间存在一个葡萄糖应答区。通过附加实验（其详性见实施例），已表明这一片段具有一上游激活剂序列（UAS）的性质，即它可赋予下游异源启动子序列具有通过甲醇的存在而被诱导和/或通过一种分解代谢产物抑制碳源如葡萄糖的存在而被抑制。这种UAS片段的序列如下：

序列B

5′-ATA    ATCTCATTAA    TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA    TCGCTTCTGA    ACCCGGTGGC    ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT    GGGGAAACAA    CCCGCTTTTT    GGATGATTAT

GCATTGTCCT    CCACATTGTA    TGCTTCCAAG    ATTCTGGTGG

GAATACTGCT    GATAGCCTAA    CGTTCATGAT    CAA-3′

从5′-AOXI启动子的3′末端制备一系列缺失，然后依次克隆进5′缺失载体pBAZ6和pBAZ8中，得到的载体序列列于表Ⅱ

表Ⅱ

载体    缺失

pBAZ801    -264→197

pBAZ802    -347→197

pBAZ803    -445→197

pBAZ805    -532→197

pBAZ804    -694→197

pBAZ604    -445→372

pBAZ601    -532→372

pBAZ603    -542→372

pBAZ602    -694→372

表Ⅱ中所列的一套载体在与AOXI的ATG起始密码子相关的694和197碱基位置之间含有可变的内部缺失。总结于表Ⅱ的载体所含有的启动子序列的5′部分是从乙醇氧化酶调节区的3′末端缺失得到的，而总结于表Ⅱ的载体所含有的调节区的3′部分是从乙醇氧化酶调节区、pBAZ6和pBAZ8的5′末端缺失得到的。如同前面一样，用这种调节区-β-半乳糖苷酶结构基因构建物集合转化一种巴斯德毕赤酵母营养突变株，然后，当其在甲醇或葡萄糖上生长时，以检测β-半乳糖苷酶的产生。检测结果的详细分析见实施例，其结果可概括如下：在ATG起始密码子上游的约260至370核苷酸之间的大约100个碱基对区域内存在一个非常强的甲醇可诱导成分。另外，在ATG起始密码子上游的约500至700核苷酸盐区域也发现了一个较弱的甲醇可调节DNA片段。而且，在乙醇氧化酶ATG起始密码子上游的从约350至375碱基对区域观察到了一个葡萄糖可抑制区。这一葡萄糖可抑制区正好在甲醇可诱导区上游，且可能与甲醇应答序列相重叠。

上述所鉴定的任一甲醇可诱导成分都可以单独或以重组形式插入表达载体之中，而使甲醇诱导的基因能够表达。

相反地，上面所鉴定的葡萄糖可抑制区可以从甲醇可诱导的启动子成分中删掉，这样，当将经修饰的启动子用于表达载体且产生的转化体在葡萄糖存在的条件下生长时，就使得非抑制基因能够表达。或者，可以将葡萄糖可抑制区特意包括在特殊设计的载体中，以便能够迅速地控制基因表达的“开-关”。

按照本发明的另一个实施方案，本发明提供了一种控制被整合了的调节区的应答的方法，它是在甲醇存在的条件下通过利用一种含有可变数目的碱基对的核苷酸序列作为调节区而完成的。这样，当使用最小值为下列197个碱基对时，得到了完全甲醇诱导的5%。

序列C

5′-AAATTTAA

CTGTTCTAAC    CCCTACTTGG    ACAGGCAATA    TATAAACAGA

AGGAAGCTGC    CCTGTCTTAA    ACCTTTTTTT    TTATCATCAT

TATTAGCTTA    CTTTCATAAT    TGCGACTGGT    TCCAATTGAC

AAGCTTTTGA    TTTTAACGAC    TTTTAACGAC    AACTTGAGAA

GATCAAAAAA    CAACTAATTA    TTCGAAACG-3′.

当所有下列增加序列都被使用时，对于被整合的表达载体观察到了基本上完全的甲醇诱导：

序列D

5′-ATA    ATCTCATTAA    TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA    TCGCTTCTGA    ACCCGGTGGC    ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT    GGGGAAACAA    CCCGCTTTTT    GGATGATTAT

GCATTGTCCT    CCACATTGTA    TGCTTCCAAG    ATTCTGGTGG

GAATACTGCT    GATAGCCTAA    CGTTCATGAT    CAA-3′

甲醇诱导的近似程度与在被整合表达载体中所使用的调节区的大小的关系列于表Ⅲ：

表Ⅲ

核苷酸序列    甲醇诱导（%）

0-197    5

0-197加347-372    5

0-197加264-372    25

0-372    100

与此相似，本发明也提供了一种控制自主调节区对于甲醇的存在进行应答的方法，它是通过使用至少含有上述序列C中所列的197个核苷酸的一段核苷酸序列作为调节区而完成的。如果要达到完全甲醇表达还需要下列补加序列：

序列E

5′-GCTACTAACA    CCATGACTTT    ATTAGCCTGT    CTATCCTGGC

CCCCCTGGCG    AGGTCATGTT    TGTTTATTTC    CGAATGCAAC

AAGCTCCGCA    TTACACCCGA    ACATCACTCC    AGATGAGGGC

TTTCTGAGTG    TGGGGTCAAA    TAGTTTCATG    TTCCCAAATG

GCCCAAAACT    GACAGTTTAA    ACGCTGTCTT    GGAACCTAAT

ATGACAAAAG    CGTGATCTCA    TCCAAGATGA    ACTAAGTTTG

GTTCGTTGAA    ATGCTAACGG    CCAGTTGGTC    AAAAAGAAAC

TTCCAAAAGT    CGCCATACCG    TTTGTCTTGT    TTGGTATTGA

TTGACGAATG    CTCAAAAATA    ATCTCATTAA    TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA    TCGCTTCTGA    ACCCGGTGGC    ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT    GGGGAAACAA    CCCGCTTTTT    GGATGATTAT

GCATTGTCCT    CCACATTGTA    TGCTTCCAAG    ATTCTGGTGG

GAATACTGCT    GATAGCCTAA    CGTTCATGAT    CAA-3′.

甲醇诱导的近似程度与调节区的大小的关系见表Ⅳ：

表Ⅳ

核苷酸序列    甲醇诱导（%）

0-197    4

0-216    13

0-372    50

0-499    50

0-709    100

按照本发明的一个实施方案，将序列B所示的上游激活剂序列（UAS）插入到通常对于葡萄糖和/或甲醇的存在不敏感的毕赤酵母序列的上游。当其生长在葡萄糖上时，含有UAS的转化体的基因产物（β-半乳糖苷酶）的表达被抑制要比不含UAS的构建物，pBPf3I大400倍以上。生长于甲醇上时这一抑制减弱;β-半乳糖苷酶的产生水平要比在葡萄糖上转化体的那些增加170倍以上。

表Ⅴ

pBPf-3Ⅰ中的插入子    生长于甲醇与葡萄糖上时产生

的β-半乳糖苷酶的比值

无    1.07

-197至-372    174

具体的转化株，结果等在实施例中有详细叙述。

根据以下非限定实例，现在对本发明进行更详细地叙述。

实例

下面的实例中所用的缓冲液和溶液的组成如下：

SD平皿    2%琼脂

6.7不含氨基酸的酵母含氮碱基（DIFCO）

重量百分比为2的葡萄糖

溶于1升水中

YNB肉汁培养基    6.7克不含氨基酸的酵母含氮碱基（DIFCO）

溶于1升水中

Z缓冲液    0.1M磷酸钠，pH7.0

0.01M    Kcl

0.001M Mg SO₄

0.039M    β-巯基乙醇

X-gal    指示剂平皿    2%琼脂

0.5%（体积）的甲醇

6.7克不含氨基酸的酵母含氮碱基（DIFCO）

0.4毫克生物素

40毫克X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半

乳糖苷）溶于1升水中，

用磷酸二氢钾（monobasic    potassium    phosphate

将pH调至7

-EGTA＝乙二醇-双-（β-氨基乙基醚）-N，N，N′，N′-四-乙酸（Sigma公司）

在下面的实施例中所用到的菌株可以从被承认的保藏单位得到，登记号如下：

-细菌菌株JM103，HB101和MC1061通常均可得到

-毕赤酵母GS115＝NRRL    Y-15851

-pSAOH5（转化到GS115＝NRRL    Y-15853;转化到大肠杆菌＝NRRL    B-15862）

-pBPf3Ⅰ是从质粒pBPf1得到的（登记号为NRRL    B-15892），它用到了下列各步序列：将从pYJ8（登记号NRRL    B-15889）得到的0.6kbp的EcoRⅠ-PvuⅡ片段（该片段含有毕赤酵母HIS4启动子序列）插进pBPf1的EcoRⅠ-SmaⅠ位点。所合成的质粒被称为pBPf3。用PstⅠ和NruⅠ降解质粒pBPf3以释放出含有lacZ序列的片段。将该片段与pYM4的PstⅠ-EcoRV片段连接，以产生质粒pBPf3Ⅰ，其中pYM4含有插入到pBP322的BamHⅠ位点的pYJ8的BglⅡ片段，而BglⅡ片段又含有HIS4，见图4所示。

-pPG2.5（可从等于NRRL    B-15868的pPG4.0得到，详情见下）

实例1

AOXI启动子的5′-末端缺失的构建

用EcoRⅠ将30毫克质粒pSAOH5（图2）完全降解，苯酚抽提，及乙醇沉淀。将得到的干DNA沉淀溶于水（最终反应体积＝100微升），然后于23℃用1.2单位的BAL31降解。每隔3分钟，取10微升到10微升40m    MEGTA中，然后用苯酚抽提及乙醇沉淀。

从每一部分得到的重新溶解的DNA沉淀用1单位的Klenow    DNA多聚酶进行处理以增强平末端，然后连接到EcoRⅠ连接子（5′-GGAATTCC-3′）上，再用PstⅠ和EcoRⅠ完全降解以释放大约9.0kbp的载体片段。然后将PstⅠ-EcoRⅠ所降解的DNA连接到来自pBR2的750bp的PstⅠ-EcoRⅠ片段上，以便再次生出β-内酰胺酶基因。将连接的DNA转化进JM103，筛选出氨苄青霉素抗性的转化株。挑选从每一BAL31降解的pSAOH5的等分试样得到的并且在x-gal指示剂平皿上检测对β-半乳糖苷酶阳性的单个转化株，用微量DNA制备方法检测在AOXI启动子中含有新的EcoRⅠ限制性位点的质粒的存在。用EcoRⅠ和EcoRV进行完全降解（见图2）就能够鉴定含有融合进大肠杆菌lac    Z基因中的各种长度的AOXI启动子的克隆。这些克隆的名称如下：

表1

载体    AO启动子    缺失区

pSAOH5    -900→ATG    none

pBAZ3    -709→ATG    5′191bp

pBAZ4    -499→ATG    5′401bp

pBAZ6    -372→ATG    5′528bp

pBAZ7    -216→ATG    5′684bp

pBAZ8    -197→ATG    5′703bp

然后按照公布过的方法（Cregg等，Molecular    and    Cellular    Biology    5，3376-3385（1985）），用含有这些缩短了的AOXI启动子序列的质粒转化巴斯毕赤酵母菌株GS115，筛选出Hi    S表型的转化株。使Hi    S转化株生长于各种碳源上，并且检测β-半乳糖苷酶的产生（见表Ⅵ）。

表Ⅵ

β-半乳糖苷酶，单位/OD600

自主载体

载体    缺失    生长于葡萄糖    生长于甲醇

pSAOH5    None    1    1000

pBAZ3    5′（191bp）    1    1000

pBAZ4    5′（401bp）    1    500

pBAZ6    5′（528bp）    1    500

pBAZ7    5′（684bp）    15    150

pBAZ8    5′（703bp）    15    40

基于该项说明，即pBAz6含有甲醇可诱导的-葡萄糖可抑制的序列的大部分，而pBAz8大都缺失了这些应答区，选择质粒pBAz6和pBAz8用于进一步的研究。

实例Ⅱ

AOXI启动子的3′-末端缺失的构建

用BamHⅠ将18毫克的质粒pPG2.5（在pBR322基础上构建的质粒，它含有pPG4.0的大约2.5kbp的EcoRⅠ-SalⅠ片段，如图3所示）完全降解苯酚抽提及乙醇沉淀。用1.2单位的BAL31在23℃下消化溶解的DNA沉淀（最终反应体积＝100μl），每隔3分钟取10微升的等分试样到10微升40mM    EGTA中，然后用苯酚抽提和乙醇沉淀。

用1个单位的Klenow    DNA多聚酶处理重新溶解的每一等分试样中的DNA沉淀，增强平末端，连接到EcoRⅠ连接子上，用来转化氨苄基青霉素抗性大肠杆菌HB101菌株，从每-BAL31降解的pPG2.5的等分试样挑选出单个转化株，用微DNA制备方法检测在AOXI启动子中含有新的EcoRⅠ限制性酶切位点的质粒的存在。

分离出在AOXI的启动子中的AOXIATG上游的264，347，445，532，542和694核苷酸位置含有新的EcoRⅠ限制性酶切位点的质粒，且分别定名为pPG2.5△4，△5，△7，△10，△12和△11，然后用EcoRⅠ降解。这些降解分别产生出大约1186，1103，1005，918，908和756个碱基对的新的EcoRⅠ片段。分离并乙醇沉淀所形成的EcoRⅠ片段，该片段含有后来插到BAL31诱变中并定位在EcoRⅠ连接子上游的AOXI启动子的部分。

实例Ⅲ

用lacz融合质粒转化的毕赤酵母的生长

挑选一个转化菌落，划线接种于SD平皿。将通过划线得到的一个单菌落接种于50毫升的摇瓶中，其中含有15毫升YNB肉汁培养基和2%甘油。于30℃以250rpm的速度摇动过夜。培养24小时后的OD600在2至3之间。

为了在YNB一甲醇中生长，从摇瓶中取出10D600的培养物，在IEC离心机上以2000×g的转速于室温下离心7分钟。沉淀了的细胞用无菌水洗一次，然后再悬浮在含有20毫升YNB肉汁培养基和0.5%甲醇的50毫升摇瓶中（OD600＝0.05）。将培养物于30℃以250rpm的转速培养16-20小时，在此期间OD600在0.3-0.5之间。

为了在YNB-葡萄糖中生长，从甘油摇瓶中取出0.2OD600的培养物，直接接种到含有20毫升YNB肉汁培养基和2%葡萄糖的50毫升摇瓶中（OD600＝0.01）。培养物于30℃以250rpm的转速培养16-20小时，在此期间OD600在0.3-0.5之间。

实例Ⅳ

生长于葡萄糖或甲醇培养基上的毕赤酵母的β-半乳糖苷酶的检测

为了检测在甲醇上生长的细胞，取出对应OD600＝0.1的-体积的培养物，在DYNAC临床离心机上以最高转速（3350rpm）于室温下离心5分钟。为了检测在葡萄糖上生长的细胞，取出对应OD600＝0.5的-体积的培养物，同上一样离心。

细胞沉淀用水洗涤一次，重新悬浮于1毫升的Z缓冲液中。得到的悬浮液与30微升CHCl和30微升0.1%的SDS混合，旋转搅拌，然后在30℃保温5分钟。

反应是通过加进200微升预热的0-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（4毫克/毫升）（SIGMA公司）而开始的，旋转搅拌混合。反应保温2-20分钟，直至出现可见的黄色。然后加入0.5毫升的1.0M    Na    Co溶液以终止反应，沉淀细胞，测定悬浮液的OD420。β-半乳糖苷酶的单位是按下列公式计算的：

1个单位＝ (（378）（A⁴²⁰）)/(保温时间)

实例Ⅴ

A、自主质粒pBAZ801-805和pBAZ601-604的构建

用EcoRⅠ将质粒pBAZ6和pBAZ8完全降解，然后连接到在上面的实例Ⅱ中分离到的EcoRⅠ片段上，用它来转化氨苄青霉素抗性大肠杆菌HB101菌株。用微量DNA制备方法对转化株进行新的EcoRⅠ片段的存在的分析，然后用PstⅠ降解，以确认片段在质粒中的定位，它与pPG2.5的相对应。在适当的位置含有EcoRⅠ片段的pBAZ8和pBAZ6的连接产物的质粒名称列于下表。

表Ⅶ

载体    EcoRⅠ片段大小    缺失

pBAZ    801    1186    -264→197

802    1103    -347→197

803    1005    -445→197

805    918    -532→197

804    756    -694→197

604    1005    -445→372

601    918    -532→372

603    908    -542→372

602    756    -694→372

将这些质粒转化进巴斯德毕赤酵母GS115菌株;HiS⁺转化株生长于YNB-葡萄糖或YNB-甲醇培养基上，测定β-半乳糖苷酶。测定结果见表Ⅷ。

表Ⅷ

β-半乳糖苷酶，单位/OD600

自主载体

载体    缺失    生长于葡萄糖    生长于甲醇

pSAOH5    无    1    1000

pBAZ801    197-264    3    500

pBAZ802    197-347    1    150

pBAZ803    197-445    1    140

pBAZ805    197-532    1    150

pBAZ804    197-694    10    100

pBAZ604    372-445    1    1000

pBAZ601    372-532    1    500

pBAZ603    372-542    1    800

pBAZ602    372-694    1    600

鉴于这样一个观察结果，即在pBAZ801中的缺失比野生型减少了50%的表达而在pBAZ802中的缺失比野生型只减少了15%的表达，我们得出如下结论：在-372至-197序列的-264至-197之间有一弱的甲醇应答区。而且，葡萄糖抑制序列的有效范围位于-347上游。

B.整合质粒pBAZ801    Ⅰ-805Ⅰ和pBAZ601    Ⅰ-604Ⅰ的构建

用BglⅡ降解质粒pBAZ6和pBAZ8，再用Klenow    DNA多聚酶处理以破坏BglⅡ位点，用连接酶环化后用其转化氨苄青酶素抗性大肠杆菌HB101菌株，所得质粒pBAZ6△BglⅡpBAZ8△BglⅡ用EcoRⅠ完全降解，然后连接到实例Ⅱ中分离到的EcoRⅠ片段上且转化氨苄青酶素抗性大肠杆菌HB101菌株，用微量DNA制备方法对转化株进行新的EcoRⅠ片段存在的分析，然后用PstⅠ消化以确认该片段在与pPG2.5的相对应的质粒中的定位。

在适当位置含有EcoRⅠ片段的pBAZ8△BglⅡ和pBAZ6△BglⅡ的连接产物的质粒命名列于表Ⅸ。

表Ⅸ

载体    EcoRⅠ片段大小    缺失

pBAZ    801Ⅰ    1186    -264→197

802Ⅰ    1103    -347→197

803Ⅰ    1005    -445→197

805Ⅰ    918    -532→197

804Ⅰ    756    -694→197

604Ⅰ    1005    -445→372

601Ⅰ    918    -532→372

603Ⅰ    908    -542→372

602Ⅰ    756    -694→372

用BglⅡ降解质粒以把它们对活性AOXI座位，且转化进毕赤酵母GS115菌株。分离出稳定的Hi S⁺转化株，它生长于YNB-葡萄糖或YNB-甲醇培养基中。然后检测β-半乳糖苷酶。表Ⅹ给出了检测结果。

表Ⅹ

β-半乳糖苷酶，单位/OD600

自主载体

载体    缺失    生长于葡萄糖    生长于甲醇

pSAOH5    无    1    320

pBAZ801Ⅰ    197-264    1    73

pBAZ802Ⅰ    197-347    1    19

pBAZ803Ⅰ    197-445    1    30

pBAZ805Ⅰ    197-532    1    20

pBAZ804Ⅰ    197-694    ND    ND

pBAZ604Ⅰ    372-445    1    290

pBAZ601Ⅰ    372-532    1    300

pBAZ603Ⅰ    372-542    0    250

pBAZ602Ⅰ    372-694    1    320

从整合行为的稳定性可以得出结论：-372上游的序列对于整合载体的甲醇诱导是不需要的，因为pBAZ602Ⅰ产生了野生型水平的β-半乳糖苷酶。另外，这一结果还证实了在-347至-264以及-264至-197之间分别有一强的和弱的甲醇应答区。

实例Ⅵ

为了便于比较，表Ⅺ一起给出了β-半乳糖苷酶与各种5′缺失和内部缺失表达盒以自主及整合的形式存在的表达结果。

表Ⅺ

β-半乳糖苷酶，单位/OD600

自主载体    整合载体

载体    缺失    生长于    生长于    生长于    生长于

葡萄糖    甲醇    葡萄糖    甲醇

pSAOH5    无    1    1000    1    320

pBAZ3    5′（191bp）    1    1000

pBAZ4    5′（401bp）    1    500

pBAZ6    5′（528bp）    1    500

pBAZ7    5′（684bp）    15    150

pBAZ8    5′（703bp）    15    40

pBAZ801，801Ⅰ    197-264    3    500    1    73

pBAZ802，802Ⅰ    197-347    1    150    1    19

pBAZ803，803Ⅰ    197-445    1    140    1    30

pBAZ805，805Ⅰ    197-532    1    150    1    20

pBAZ804，804Ⅰ    197-694    10    100    ND    ND

pBAZ604，604Ⅰ    372-445    1    1000    1    290

pBAZ601，601Ⅰ    372-532    1    500    1    300

pBAZ603，603Ⅰ    372-542    1    800    0    250

pBAZ602，602Ⅰ    372    694    1    600    1    320

这些载体的每一种衍生物在图5中以图解的形式进行了总结。

实例Ⅶ

pAHZ1的构建

质粒pBAZ6用EcoRⅠ进行降解，再连接到EcoRⅠ-BglⅡ人工合成接头上（5′-AATTAGATCT-3′），用BclⅡ和BglⅠ完全降解。分离出新得到的含有AOXⅠ    UAS的大约180bp的片段，将其它连接到pBBf3Ⅰ（图4）的唯一BglⅡ位点上，所得到的连接产物用于转化氨苄青霉素抗性大肠杆菌MC1061菌株上。通过用BamHⅠ降解而鉴定出含有带有单个UAS插入子的质粒的转化株;这种质粒命名为pAHZ1。

用StuⅠ降解质粒pAHZ1，然后用于转化毕赤酵母GS115菌株;分离出在YNB-葡萄糖和YNB-甲醇培养基上生长的稳定的HIS⁺转化株。这一分析的结果如下：

表Ⅶ

β-半乳糖苷酶，单位/OD600

质粒    生长于葡萄糖上    生长于甲醇上

pBPf3Ⅰ    49.8    53.5

pAHZ1    0.1    17.4

这些数据表明：在BglⅡ-Bcl    IDNA片段上的AOXI启动子的-372至-197之间所含的175个碱基对对于为毕赤酵母HIS4基因启动子序列提供甲醇诱导和葡萄糖阻遇不仅是必需的而且是足够的，因此把这一区段称为含上游激活剂序列的区段。

以上这些实施例仅仅是用来本发明的实施，而不应该把它看成是对本发明的范围或所附权项在任何方面的限制。在不离开本发明的本质的前提下的适当变化和改进都包括在本发明所要求的专利保护的范围之内。

Claims (33)

1、一种与培养基中的甲醇的存在相应答的DNA片段，这种培养基是用于带有该片段的宿主所生长的；其中所说的片段是作为一种自主成分存在于所述宿主中；且所说片段至少由下列核苷酸序列及其功能等价物组成：

5′-GCTACTAACA  CCATGACTTT  ATTAGCCTGT  CTATCCTGGC

CCCCCTGGCG      AGGTCATGTT  TGTTTATTTC  CGAATGCAAC

AAGCTCCGCA      TTACACCCGA  ACATCACTCC  AGATGAGGGC

TTTCTGAGTG      TGGGGTCAAA  TAGTTTCATG  TTCCCAAATG

GCCCAAAACT      GACAGTTTAA  ACGCTGTCTT  GGAACCTAAT

ATGACAAAAG      CGTGATCTCA  TCCAAGATGA  ACTAAGTTTG

GTTCGTTGAA      ATGCTAACGG  CCAGTTGGTC  AAAAAGAAAC

TTCCAAAAGT      CGCCATACCG  TTTGTCTTGT  TTGGTATTGA

TTGACGAATG      CTCAAAAATA  ATCTCATTAA  TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA      TCGCTTCTGA  ACCCGGTGGC  ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT      GGGGAAACAA  CCCGCTTTTT  GGATGATTAT

GCATTGTCCT      CCACATTGTA  TGCTTCCAAG  ATTCTGGTGG

GAATACTGCT      GATAGCCTAA  CGTTCATGAT  CAAAATTTAA

CTGTTCTAAC      CCCTACTTGG  ACAGGCAATA  TATAAACAGA

AGGAAGCTGC      CCTGTCTTAA  ACCTTTTTTT  TTATCATCAT

TATTAGCTTA      CTTTCATAAT  TGCGACTGGT  TCCAATTGAC

AAGCTTTTGA      TTTTAACGAC  TTTTAACGAC  AACTTGAGAA

GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG^-3¹

2、根据权利要求1所述的DNA片段，其进一步包括：

一个多肽编码区，其中上述的调节区位于该多肽编码区的5′末端。

3、根据权利要求2所述的DNA片段，它进一步包括多肽编码区DNA下游的3′序列;其中所说的DNA的3′序列能够控制所说多肽编码区所编码的mRNA的多聚腺苷酸化、转录终止和翻译终止。

4、根据权利要求2所述的DNA片段，其中所说的DNA片段进一步包括一个或多个附加DNA序列，这些DNA序列是从由细菌质粒DNA、噬菌体DNA、酵母质粒DNA和酵母染色体DNA组成的一组DNA中得到的。

5、依照权利要求4所述的DNA片段，其中所说的酵母染色体DNA包括一个自主复制DNA序列和一个标记基因。

6、依据权利要求5所述的DNA片段，其中所说的片段是以闭合环状杂种质粒的形式存在。

7、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求2所述的DNA片段的宿主。

8、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求3所述的DNA片段的宿主。

9、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求6所述的DNA片段的宿主。

10、一个与培养基中的甲醇的存在相应答的DNA片段，该培养基是用于带有该片段的宿主所生长的;其中所说的片段被整合进所说的宿主的基因组中，且其中所说的片段至少包括下列核苷酸序列及其功能等价物：

5′-ATA  ATCTCATTAA  TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA  TCGCTTCTGA  ACCCGGTGGC  ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT  GGGGAAACAA  CCCGCTTTTT  GGATGATTAT

GCATTGTCCT  CCACATTGTA  TGCTTCCAAG  ATTCTGGTGG

GAATACTGCT  GATAGCCTAA  CGTTCATGAT  CAAAATTTAA

CTGTTCTAAC  CCCTACTTGG  ACAGGCAATA  TATAAACAGA

AGGAAGCTGC  CCTGTCTTAA  ACCTTTTTTT  TTATCATCAT

TATTAGCTTA  CTTTCATAAT  TGCGACTGGT  TCCAATTGAC

AAGCTTTTGA  TTTTAACGAC  TTTTAACGAC  AACTTGAGAA

GATCAAAAAA  CAACTAATTA  TTCGAAACG-3′

11、根据权利要求10所述的DNA片段，它进一步包括：

一个多肽编码区;其中调节区位于该多肽编码区的5′末端。

12、根据权利要求11所述的DNA片段，它进一步包括多肽编码区的下游DNA的3′端序列;其中所说的DNA的3′序列能够控制由所说多肽编码区所编码的mRNA的多聚腺苷酸化、转录终止及翻译终止。

13、根据权利要求11所述的DNA片段，其中所说的DNA片段进一步包括一个或多个的附加DNA序列，这些DNA序列是从由细菌质粒DNA、噬菌体DNA、酵母质粒DNA和酵母染色体DNA组成的一组DNA中得到的。

14、根据权利要求13所述的DNA片段，其中所说的酵母染色体DNA包括一个标记基因。

15、根据权利要求13如述的DNA片段，其中所述的酵母染色体DNA包括一个自主复制的DNA序列。

16、依照权利要求13所述的DNA片段，其中所述片段在整合到宿主基因组上之前是以闭合环状杂种质粒的形式存在。

17、根据权利要求13所述的DNA片段，其中所述片段是一线型片段。

18、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求11的DNA片段的宿主。

19、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求12的DNA片段的宿主。

20、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求17的DNA片段的宿主。

21、一个具有上游激活剂序列性质的DNA片段，其中所述片段给位于下游的异源启动子核苷酸序列提供了这样一种能力，即在甲醇存在的条件下被诱导而在分解代谢抑制碳源存在的条件下被抑制，且其中所述片段至少包括下列核苷酸序列及其功能等价物：

5′-ATA  ATCTCATTAA  TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA  TCGCTTCTGA  ACCCGGTGGC  ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT  GGGGAAACAA  CCCGCTTTTT  GGATGATTAT

GCATTGTCCT  CCACATTGTA  TGCTTCCAAG  ATTCTGGTGG

GAATACTGCT  GATAGCCTAA  CGTTCATGAT  CAA-3′

22、根据权利要求21所述的DNA片段，它进一步包括：

一多肽编码区;其中所指的调节区位于该多肽编码区的5′末端。

23、根据权利要求22所述的DNA片段，进一步包括多肽编码区的下游的DNA3′序列;其中所说的DNA3′序列能够控制由所述多肽编码区所编码的mRNA的多聚腺苷酸代、转录终止及翻译终止。

24、根据权利要求22所述的DNA片段，其中所述的DNA片段进一步包括一个或多个附加DNA序列，该序列是从由细菌质粒DNA、噬菌体DNA，酵母质粒DNA和酵母染色体DNA组成的一组DNA中得到的。

25、根据权利要求24所述的DNA片段，其中所述的酵母染色体DNA包括一个标记基因。

26、根据权利要求24所述的DNA片段，其中所述的酵母染色体DNA包括一个自主复制的序列。

27、根据权利要求24所述的DNA片段，其中所述片段在被整合进宿主基因组之前是以闭合环状杂种质粒的形式存在。

28、根据权利要求24所述的DNA片段，其中所述的片段是一线型片段。

29、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求22的DNA片段的宿主。

30、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求23的DNA片段的宿主。

31、一个被转化了的酵母菌株，其中所说的酵母菌株是权利要求28的DNA片段的宿主。

32、一种控制被整合了的调节区对于甲醇的存在作出应答的方法，它包括使用至少下列核苷酸序列作为与甲醇相应答的调节区，该调节区位于被表达的编码序列的上游：

5′-AATTTAA

CTGTTCTAAC  CCCTACTTGG  ACAGGCAATA  TATAAACAGA

AGGAAGCTGC  CCTGTCTTAA  ACCTTTTTTT  TTATCATCAT

TATTAGCTTA  CTTTCATAAT  TGCGACTGGT  TCCAATTGAC

AAGCTTTTGA  TTTTAACGAC  TTTTAACGAC  AACTTGAGAA

GATCAAAAAA  CAACTAATTA  TTCGAAACG-3′

以便得到微小甲醇应答;且为了得到更高水平的甲醇应答，增加包括下列的上游核苷酸：

5′-ATA  ATCTCATTAA  TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA  TCGCTTCTGA  ACCCGGTGGC  ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT  GGGGAAACAA  CCCGCTTTTT  GGATGATTAT

GCATTGTCCT  CCACATTGTA  TGCTTCCAAG  ATTCTGGTGG

GAATACTGCT  GATAGCCTAA  CGTTCATGAT  CAA-3′

其中最大程度的甲醇应答是通过使用上面所列举的所有核苷酸而得到的，且按照下面的应答表得到了不同程度的甲醇应答，它使用的是得自后一序列的中间数目的核苷酸：

核苷酸序列  甲醇诱导

0-197  5

0-197加347-372  5

0-197加264-372  25

0-372  100

33、一种控制自主调节区对于甲醇的存在作出应答的方法，它包括使用至少下列核苷酸作为调节区以达到微小的甲醇应答：

5′-AATTTAA

CTGTTCTAAC  CCCTACTTGG  ACAGGCAATA  TATAAACAGA

AGGAAGCTGC  CCTGTCTTAA  ACCTTTTTTT  TTATCATCAT

TATTAGCTTA  CTTTCATAAT  TGCGACTGGT  TCCAATTGAC

AAGCTTTTGA  TTTTAACGAC  TTTTAACGAC  AACTTGAGAA

GATCAAAAAA  CAACTAATTA  TTCGAAACG-3′

为了获得更高水平的甲醇应答，增加包括下列上游核苷酸：

5′-AGATCTAA  CATCCAAAGA

CGAAAGGTTG  AATGAAACCT  TTTTGCCATC  CGACATCCAC

AGGTCCATTC  TCACACATAA  GTGCCAAACG  CAACAGGAGG

GGATACACTA  GCAGCAGACG  TTGCAAACGC  AGGACTCATC

CTCTTCTCTA  ACACCATTTT  GCATGAAAAC  AGCCAGTATT

GGGCTTGATG  GAGCTCGCTC  ATTCCAATTC  CTTCTATTAG

GCTACTAACA  CCATGACTTT  ATTAGCCTGT  CTATCCTGGC

CCCCCTGGCG  AGGTCATGTT  TGTTTATTTC  CGAATGCAAC

AAGCTCCGCA  TTACACCCGA  ACATCACTCC  AGATGAGGGC

TTTCTGAGTG  TGGGGTCAAA  TAGTTTCATG  TTCCCAAATG

GCCCAAAACT  GACAGTTTAA  ACGCTGTCTT  GGAACCTAAT

ATGACAAAAG  CGTGATCTCA  TCCAAGATGA  ACTAAGTTTG

GTTCGTTGAA  ATGCTAACGG  CCAGTTGGTC  AAAAAGAAAC

TTCCAAAAGT  CGCCATACCG  TTTGTCTTGT  TTGGTATTGA

TTGACGAATG  CTCAAAAATA  ATCTCATTAA  TGCTTAGCGC

AGTCTCTCTA  TCGCTTCTGA  ACCCGGTGGC  ACCTGTGCCG

AAACGCAAAT  GGGGAAACAA  CCCGCTTTTT  GGATGATTAT

GCATTGTCCT  CCACATTGTA  TGCTTCCAAG  ATTCTGGTGG

GAATACTGCT  GATAGCCTAA  CGTTCATGAT  CAA-3′

其中最大程度的甲醇应答是通过使用上述所有列举核苷酸而得到的，按照下列表格，通过使用得自后一序列的中间数目的核苷酸，得到了各种不同程度的甲醇应答：

核苷酸序列  甲醇诱导

0-197  4

0-216  13

0-372  50

0-499  50

0-709  100

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