NO871038L - Dna-fragment. - Google Patents
Dna-fragment.Info
- Publication number
- NO871038L NO871038L NO871038A NO871038A NO871038L NO 871038 L NO871038 L NO 871038L NO 871038 A NO871038 A NO 871038A NO 871038 A NO871038 A NO 871038A NO 871038 L NO871038 L NO 871038L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- methanol
- dna
- fragment
- sequence
- host
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 105
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 205
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 81
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 46
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 41
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 39
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 23
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 9
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 5
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår rekombinant DNA-teknologi. En side ved oppfinnelsen angår metanolinduserbare regulerende områder. En annen side ved oppfinnelsen angår regulerende områder som undertrykkes i nærvær av glukose. Nok en side ved oppfinnelsen angår nye ekspresjonsvektorer som innbefatter de regulerende områder ifølge oppfinnelsen, samt nye organismer som er transformert med disse, og styrt polypeptidekspresjon ved disse.
Etter hvert som rekombinant DNA-teknologi har utviklet seg i de senere år, er den styrte produksjon ved hjelp av mikroorganismer av en enorm mengde forskjellige polypeptider blitt mulig. Mange eukaryote polypeptider som f.eks. humant veksthormon, leukocytt-interferoner, humant insulin, humant proinsulin og lignende er allerede blitt produsert ved forskjellige mikroorganismer. Den fortsatte utvikling av området rekombinant DNA-teknologi ventes i fremtiden å gi enda mer effektive midler til produksjon av nyttige polypeptidprodukter ved bruk av mikroorganismer. En ønskelig utvikling ville være isolasjonen og karakteriseringen av regulerende områder som lett slås av og på ved passende valg av medier, vekstbetingelser eller lignende.
F.eks., publikasjonen Molecular and Cellular Biology i mai 1985 (pp. 1111-1121) av Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold og Gingeras, angir isoleringen og karakteriseringen av DNA-sekvenser som reagerer på (are responsive to) nærværet av metanol og som dessuten er underlagt katabolittundertrykkelse i nærvær av slike katabolittundertrykkende karbonkilder som glykose. Den foreliggende oppfinnelse er resultatet av videre undersøkelser utført på de regulerende områder ifølge den ovenfor angitte henvisning.
En hensikt med oppfinnelsen er derfor isoleringen og karakteriseringen av funksjonelle underfragmenter ifølge de på metanol reagerende DNA-sekvenser i henhold til Ellis et al.
Denne og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå fra beskrivelsen og kravene.
Det er overraskende funnet at distinkte underfragmenter av de regulerende områder beskrevet av Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold og Gingeras (Molecular and Cellular Biology, mai 1985, pp. 1111-1121) har unike regulerende egenskaper; ett slikt regulerende område er istand til full induksjon i nærvær av metanol når det bæres i vertsorganismen som et kromosomalt element derav; et annet slikt regulerende område er istand til full induksjon i nærvær av metanol når det bæres i vertsorganismen som et ekstrakromosomalt element derav, og nok et slikt regulerende område er istand til å meddele heterologe promotor-nukleotidsekvenser anordnet på nedsiden derav, evnen til å induseres i nærvær av metanol og undertrykkes i nærvær av katabolittundertrykkende karbonkilder.
Kort beskrivelse av figurene
Fig. 1 er et restriksjonskart av området 5' av det primære alkoholoksidasegen fra Pichia ( A0X1).
Fig. 2 er et restriksjonskart av plasmid pSA0H5.
Fig. 3 er et restriksjonskart av gjærinnskuddet av plasmid pPG2.5, som er et pBR322-basert plasmid.
Fig. 4 er et restriksjonskart av plasmid pBPf3l.
Fig. 5 er et prosessdiagram for vektorkonstruksjonene angitt i eksemplene.
De følgende forkortelser er benyttet på figurene for å represen-tere de restriksjonsenzymer som anvendes.
På de ledsagende figurer er de restriksjonsseter som anvendes til manipulering av DNA-fragmenter, men som ødelegges ved ligasjon, vist ved at forkortelsen for det ødelagte sete er angitt i parentes.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet nye DNA-fragmenter omfattende regulerende områder som reagerer på nærværet av metanol i dyrkningsmediet som en vertsorganisme for DNA-fragmentene er i berøring med. Et av de nye fragmenter ifølge oppfinnelsen kan fremme full induksjon i nærvær av metanol når det innlemmes som en enkelt kopi i vertsorganismens genom, dvs. når det bæres som et kromosomalt element derav, men ikke når det bæres som et ekstrakromosomalt element. Et annet av de nye fragmenter ifølge oppfinnelsen kan fremme full induksjon i nærvær av metanol når det bæres som enten et ekstrakromosomalt element av vertsorganismen, dvs. når det opprettholdes som et autonomt element i verten, eller som et kromosomalt element derav. De regulerende områder av DNA-fragmentene ifølge oppfinnelsen kan styre transkripsjonen av budbringer-RNA når de er anordnet ved 5<1->enden av det DNA som koder for produksjonen av budbringer-RNA. Også innenfor oppfinnelsens ramme er mutanter og funksjonelle ekvivalenter av de ovenfor beskrevne DNA-fragmenter .
Uttrykket "full induksjon" anvendes i den foreliggende beskrivelse til å betegne evnen til et gitt DNA-fragment til å reagere på nærværet av metanol. Uttrykket angår den evne de på metanol reagerende regulerende områder har til å indusere produksjons-nivåer for proteinprodukt som er ekvivalente med de nivåer som fås ved bruk av de 1-kilobase ikke-kodende sekvenser på oversiden av vill type A0X1 proteinkodende sekvenser i verter transformert med i-fase konstruerte stykker av regulerende område/strukturelt gen.
Videre i henhold til oppfinnelsen er der skaffet et DNA-fragment som omfatter en overside-aktivatorsekvens som meddeler de heterologe promotor-nukleotidsekvenser anordnet på nedsiden derav, evnen til å indusere ekspresjon i nærvær av metanol og til å undertrykke ekspresjon i nærvær av en katabolittundertrykkende karbonkilde i det dyrkningsmedium som en vertsorganisme for DNA-fragmentet er i berøring med. Det regulerende område av DNA i denne utførelsesform av oppfinnelsen kan styre transkripsjonen av budbringer-RNA når det er assosiert med en heterolog promotor anordnet ved 5'-enden av det DNA som koder for produksjonen av budbringer-RNA. Mutanter og funksjonelle ekvivalenter av det ovenfor beskrevne DNA-fragment ligger også innenfor oppfinnelsens område.
Også i henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet plasmider og transformerte organismer inneholdende de ovenfor beskrevne DNA-fragmenter, samt en fremgangsmåte til fremstilling av polypeptider ved anvendelse av slike transformerte organismer .
I henhold til nok en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er der skaffet en fremgangsmåte til styring av graden av de regulerende områders evne til å reagere på metanol ved anvendelse av et varierende antall nukleotider i det operable regulerende område. Et område for metanolrespons kan oppnås som varierer fra nominell respons (bare noen få prosent av "full" induksjon), helt opp til full metanolinduksjon.
De regulerende områder ifølge oppfinnelsen er usedvanlig nyttige for den styrte produksjon av polypeptider ved bruk av rekombi-nante DNA-modifiserte verter. F.eks., i en utførelsesform av oppfinnelsen er metanolindusert ekspresjon av polypeptidprodukter fra integrerte ekspresjonskassetter mulig. I en annen utførelsesform er den metanolinduserte ekspresjon av polypeptidprodukter fra autonome ekspresjonskassetter mulig.
I henhold til nok en utførelsesform blir ekspresjonen av polypeptidprodukter styrt ved transformasjon av verten med en polypeptidkodende sekvens under styring av aktivatorsekvensen på oppsiden (upstream) som reagerer på betingelsene for både metanolinduksjon og katabolittundertrykkelse og deretter opprettholdelse av den transformerte vert i nærvær eller fravær av metanol eller katabolittundertrykkende karbonkilder. Således, i henhold til denne spesielle utførelsesform, dersom et spesielt nivå av polypeptidprodukter ønskes, kan sammensetningen av dyrkningsmediet justeres inntil det ønskede nivå av polypeptid-produkt nås, og deretter kan ytterligere ekspresjon av den polypeptidkodende sekvens forhindres ved tilsetningen av en katabolittundertrykkende karbonkilde til dyrkningsmediet.
I henhold til denne sistnevnte utførelsesform er oppside-aktivatorsekvensen ifølge oppfinnelsen nyttig for oppnåelse av den regulerte produksjon av polypeptidprodukter under styring av normalt uregulerte promotorer. F.eks. kan grunnleggende promotorer bringes til å reagere på metanolinduksjon og katabolittundertrykkelse ved innlemmelse deri av oppside-aktivatorsekven-sene ifølge oppfinnelsen. På denne måte kan ekspresjonen av hvilke som helst sekvenser som kan fungere som en promotor for RNA-transkripsjon styres ved nærværet eller fraværet av metanol eller katabolittundertrykkende karbonkilder.
Det tilnærmet ett kilobasepar-store (kbp) regulerende område som fås fra området 5<1>av det primære alkoholoksidasegen ( A0X1; se fig. 1) slik det er beskrevet av Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold og Gingeras (Molecular and Cellular Biology, mai 1985, pp. 1111-1121) ble underkastet BAL31-digestion fra både 3'- og 5'-enden, deretter ble de resulterende mutageniserte promotor-fragmenter sammensmeltet med E. coli lacZ-genet, hvilket ga en rekke vektorer. 5'-utslettelsene ga de følgende vektorer: Vektor pSA0H5 (se fig. 2) representerer det intakte 5'-alkoholoksidase regulerende område, mens hver av vektorene pBAZ3, 4, 6, 7 og 8 representerer utslettelser fra 5'-enden derav. Disse vektorer, som inneholder forskjellige konstruerte stykker av regulerende område/strukturelt gen (lacZ), ble brukt til å transformere en Pichia pastoris auxotrof mutant og deretter analysert for Q-galaktosidaseproduksjon når den ble dyrket på metanol eller glukose som karbon- og energikilde. Skjønt detaljerte analyser av resultatene for B-galaktosidaseekspresjon er vist i eksemplene, kan resultatene oppsummeres her som følger:
(a) et område med svak metanolrespons eksisterer mellom 709 basepar og 499 basepar på oppsiden av ATG-initieringskodonet for autonome vektorer som inneholder disse sekvenser, mens full metanolrespons for integrerte vektorer ikke krever sekvensen fra 709 til 499 basepar på oppsiden. Således, skjønt full metanolinduksjon fås med sekvensen 0-709 nukleotider for både integrerte og autonome vektorer, oppviser de autonome vektorer bare ca. 50 prosent metanolinduksjon med sekvensen 0-499 basepar på oppsiden av alkoholoksidase-ATG. Den sekvens på 709 basepar som er nødvendig for full induksjon av ekspresjon med autonome vektorer er som følger:
I det minste nominal metanolinduksjon observeres med så lite som de første 197 nukleotider på oversiden av ATG.
(b) et område med sterk metanolrespons ligger mellom ca. 372 og 197 basepar på oversiden av ATG-initieringskodonet, mens et på glukose reagerende område ligger mellom 372 og 216 basepar på oversiden av ATG-initieringskodonet. Dette fragment er ved ytterligere eksperimenter, som er vist i nærmere detalj i eksemplene, påvist å ha egenskapene til en oppside-aktivatorsekvens (UAS), dvs. det kan meddele heterologe promotorsekvenser på nedsiden evnen til å induseres ved nærværet av metanol og/eller undertrykkes ved nærværet av en katabolittundertrykkende karbonkilde såsom glukose. Dette UAS-fragment har sekvensen:
En serie utslettelser fra 3<1->enden av 5<1->A0X1-promotoren ble fremstilt, deretter subklonet inn i 5'-utslettelsesvektorene pBAZ6 og pBAZ8, hvilket ga den vektorsekvens som er angitt i tabell II.
Vektorsettet angitt i tabell II inneholder variable interne utslettelser mellom baseposisjoner 694 og 197 i forhold til ATG-initieringskodonet av A0X1. 5'-partiet av promotorsekvensene som inneholdes i de vektorer som er angitt i tabell II fås fra 3'-endeutslettelsene av alkoholoksidase-reguleringsområdet, mens 3'-delen av reguleringsområdene som inneholdes i de vektorer som er angitt i tabell II fås fra 5<1->endeutslettelsene fra alkoholoksidase-reguleringsområdet, pBAZ6 og pBAZ8. På samme måte som tidligere ble de konstruerte genmaterialer av regulerende område/S-galaktosidase brukt til å transformere en Pichia pastoris auxotrof mutant, deretter analysert for 6-galaktosidase-produksjon når den ble dyrket på metanol eller glukose. Skjønt detaljerte analyser av disse resultater er vist i eksemplene, kan resultatene kort oppsummeres ved at et meget sterkt metanolinduserbart element ligger i et område på ca. 100 basepar mellom ca. 260 og 370 nukleotider på oversiden av ATG-initieringskodonet. Dessuten er et svakere metanolregulerbart DNA-fragment også funnet i området fra ca. 500 inntil 710 nukleotider på oversiden av ATG-initieringskodonet. Dessuten er et glukoseundertrykkende område observert i området fra ca. 350 til 375 basepar på oversiden av alkoholoksidase-ATG-initieringskodonet. Dette glukoseundertrykkende område ligger like på oversiden av det metanolinduserbare område og kan overlappe med de på metanol reagerende sekvenser.
Hvilke som helst av de metanolinduserbare elementer som er angitt ovenfor kan innsettes alene eller i kombinasjon i ekspresjonsvektorer for å tillate metanolindusert genekspresjon.
Omvendt kan det glukoseundertrykkende område som er identifisert ovenfor slettes fra metanolinduserbare promotorelementer, hvilket tillater ikke-undertrykket genekspresjon når en modifi-sert promotor anvendes i ekspresjonsvektorer og de resulterende transformerte organismer dyrkes i nærvær av glukose. Alternativt kan de glukoseundertrykkbare områder med hensikt være innlemmet i spesielt konstruerte vektorer for å tillate hurtig "på-av"-styring av genekspresjon.
I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen er der skaffet en fremgangsmåte til å styre et integrert regulerende områdes evne til å reagere i nærvær av metanol ved at man som det regulerende område anvender en nukleotidsekvens som har et varierende antall basepar. Således, med et minimum av de følgende 197 basepar, oppnås ca. 5 prosent av full metanolinduksjon:
Stort sett full metanolinduksjon observeres med integrerte ekspresjonsvektorer når hele den følgende ytterligere sekvens anvendes:
Den tilnærmede grad av metanolinduksjon som en funksjon av størrelsen på det regulerende område som anvendes i integrerte ekspresjonsvektorer er angitt i tabell III:
På samme måte er der også skaffet en fremgangsmåte til å styre et autonomt regulerende områdes evne til å reagere på nærværet av metanol ved at der som det regulerende område anvendes en nukleotidsekvens som har minst de 197 nukleotider som er angitt i sekvens C ovenfor, idet den følgende ytterligere sekvens er nødvendig for oppnåelse av full metanolinduksjon:
Den tilnærmede grad av metanolinduksjon som en funksjon av størrelsen på det regulerende område som anvendes er angitt i tabell IV:
I henhold til en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse ble oppside-aktivatorsekvensen (UAS) som angitt i sekvens B innføyet på oversiden av Pichia-sekvensene som normalt er ufølsomme for nærværet av glukose og/eller metanol. Når det ble dyrket på glukose, ble ekspresjonen av genproduktet (B-galaktosidase) av den UAS-holdige transformant undertrykket med en faktor på mer enn 400 med hensyn til det ikke-UAS-holdige konstruerte materiale pBFf3l. Denne undertrykkelse ble mildnet ved dyrking på metanol, idet nivået av B-galaktosidase-produksjon ble øket mer enn 170 ganger i forhold til nivået med den glukose-dyrkede transformant:
De spesielle transformanter, resultater etc. er beskrevet i detalj i eksemplene.
Oppfinnelsen skal nå beskrives i nærmere detalj med henvisning til de følgende ikke-begrensende eksempler.
Eksempler
Buffrene og oppløsningene som ble anvendt i de følgende eksempler har de sammensetninger som er gitt nedenunder:
De stammer som ble anvendt i de følgende eksempler er tilgjenge-lige fra anerkjente deponeringssteder under de aksjesjonsnummer som er gitt nedenunder: — bakteriestammer JM103, HB101, og MC1061 er vanlig tilgjenge-lige.
-- Pichia GS115 = NRRL Y-15851.
—pSAOH5 (transformert inn i GS115 = NRRL Y-15853; transformert inn i E. coli tilgjengelig som NRRL B-15862) — pBPf3l fås fra plasmid pBPfl (aksesjonsnummer NRRL B-15892) ved de følgende trinn i rekkefølge: 0,6 kbp EcoRI- PvuII-fragmentet fra pYJ8 (aksesjonsnummer NRRL B-15889), hvilket fragment inneholder Pichia HIS-4-promotorsekvensene, ble innsatt i EcoRI-Smal-setene hos pBPf1. Det resulterende plasmid ble betegnet pBPf3. Plasmid pBPf3 ble digestert med Pstl og Nrul for å frigjøre det fragment som inneholder lacZ-sekvensene. Dette fragment ble ligatisert med Pstl-EcoRV-fragmentet av pYM4 (som inneholder det HIS4-holdige BglII-fragment av pYJ8 innskutt i BamHI-setet av pBR322) for å gi plasmid pBPf3l, vist på fig. 4.
— pPG2.5 (som fås fra pPG4.0 = NRRL B-15863 som beskrevet i detalj nedenunder.)
Eksempel I
Konstruksjon av 5'-endeutslettelser av A0X1-promotor
Tretti mikrogram plasmid pSA0H5 (fig. 2) ble digestert fullstendig med EcoRI, fenolekstrahert, og etanolutfelt. Den tørkede DNA-pellet ble oppløst i vann (endelig reaksjonsvolum = 100 ul) og digestert ved 23°C med 1,2 enheter BAL31. Porsjoner på 10 ul ble fjernet ved intervaller på 3 minutter til 10 jai av 40 mM EGTA, fenolekstrahert og etanolutfelt.
Den gjenoppløste DNA-pellet fra hver porsjon ble behandlet med 1 enhet Klenow-DNA-polymerase for å fremme butte ender, ligatisert til EcoRI-linkere (5<1->GGAATTCC-3') og digestert fullstendig med Pstl og EcoRI for å frigjøre'ca. 9 kbp vektorfragment. Det Pstl-EcoRI-digesterte DNA ble deretter ligatisert til det 750 bp PstI- EcoRI-fragment fra pBR322 for å regenerere B-lactamase-genet. Det ligatiserte DNA ble transformert inn i JM103 og transformanter valgt for ampicillinresistens. Individuelle transformanter, som fås fra hver av de BAL31-digesterte porsjoner av pSAOH5 og som testet positivt for S-galaktosidase på X-gal-indikatorplater, ble plukket ut og undersøkt ved mini-DNA-fremstillingsmåten for nærværet av et plasmid inneholdende et nytt EcoRI-restriksjonssete i A0X1-promotoren. Fullstendig digestion med en blanding av EcoRI og EcoRV (se fig. 2) tillot identifikasjon av kloner inneholdende forskjellige lengder av AOX1-promotoren sammensmeltet med E. coli-lacZ-genet. Betegnel-sen av disse kloner er vist nedenunder:
Plasmider inneholdende disse forkortede A0X1-promotorsekvenser ble deretter brukt til å transformere P. pastoris-stammen GS115 ved anvendelse av publiserte fremgangsmåter (Cregg el al., Molecular and Cellular Biology 5, 3376-3385 (1985)), og trans-formantene ble utvalgt for His<+->fenotype. His<+->transformanter ble dyrket på forskjellige karbonkilder og undersøkt for 6-galaktosidaseproduksjon (se tabell VI).
Plasmider pBAZ6 og pBAZ8 ble valgt for videre undersøkelse basert på den indikasjon at pBAZ6 inneholdt mesteparten av de metanolinduserbare-glukoseundertrykkbare sekvenser, og pBAZ8 var for det meste slettet for disse reagerende områder.
Eksempel II
Konstruksjon av 3<1->endeutslettelser av A0X1-promotor
18 mikrogram plasmid pPG2.5 (et pBR322-basert plasmid inneholdende det EcoRI- Sall-fragment på 2,5 kbp av pPG4.0 vist på fig. 3) ble fullstendig digestert med BamHI, fenolekstrahert, og etanolutfelt. Den oppløste DNA-pellet (endelig reaksjonsvolum = 100 ul) ble digestert ved 23°C med 1,2 enheter BAL31, og 10 ul porsjoner ble fjernet ved intervaller på 3 minutter til 10 ul 40 mM EGTA, fenolekstrahert, og etanolutfelt.
Den gjenoppløste DNA-pellet fra hver porsjon ble behandlet med 1 enhet Klenow-DNA-polymerase for å fremme butte ender, ligatisert til Eco-RI-linkere og brukt til å transformere E. coli-stammen HB101 til ampicillinresistens. Individuelle transformanter som fås fra hver av de BAL31-digesterte porsjoner av pPG2.5 ble plukket ut og undersøkt ved mini-DNA-fremstillingsmåten for nærværet av et plasmid inneholdende et nytt EcoRI-restriksjonssete i AOX1-promotoren.
Plasmider inneholdende et nytt EcoRI-restriksjonssete anordnet i en stilling i AOX1-promotoren svarende til 264, 347, 445, 532, 542 og 694 nukleotider ovenfor AOX1 ATG ble isolert og betegnet henholdsvis pPG2.5 A4, A 5, A 7, £10, A12 og A11 og digestert med EcoRI. Disse digestioner ga nye EcoRI-fragmenter med tilnærmet henholdsvis 1186, 1103, 1105, 918, 908 og 756 basepar. De resulterende EcoRI-fragmenter som inneholdt den del av AOX1-promotoren som var anordnet på oversiden av EcoRI-linkeren innsatt etter BAL31-mutagenese, ble isolert og etanolutfelt.
Eksempel III
Dyrking av Pichia-gjær transformert med lacZ-fusjonsplasmider
En transformert koloni ble plukket ut og strøket ut på en SD-plate. En enkelt koloni fra utstryket ble inokulert i 15 ml YNB-næringsvæske + 2 prosent glycerol i en 50 ml risteflaske og ristet ved 30°C og 250 omdreininger pr. min. over natten. OD500av kulturen 24 timer senere var mellom 2 og 3.
For YNB-metanol-dyrking ble 1 OD500av kulturen tatt ut av risteflasken og sentrifugert i en IEC-sentrifuge i 7 minutter ved 2000x g ved værelsestemperatur. De pelleterte celler ble vasket én gang med sterilt vann og resuspendert i 20 ml YNB-næringsvæske + 0,5 prosent metanol i en 50 ml risteflaske (OD500= 0,05). Kulturen ble inkubert ved 30°C ved 250 omdreininger pr. min. i 16-20 timer, på hvilket tidspunkt OD500var mellom 0,3 og 0,5.
For YNB-glukose-dyrking ble 0,2 ODqqo av kulturen tatt ut fra glycerol-risteflasken og podet direkte inn i 20 ml YNB-nærings-væske + 2 prosent glukose i en 50 ml risteflaske (OD500= 0,01). Kulturen ble inkubert ved 30°C ved 250 omdreininger pr. min. i 16-20 timer, på hvilket tidspunkt OD500var mellom 0,3 og 0,5.
Eksempel IV
S-galaktosidase-måling av Pichia-gjær dyrket på glukose- eller metanolmedium
For måling av metanoldyrkede celler ble et dyrkningsvolum svarende til en ODggo = 0,1 tatt ut og sentrifugert i en DYNAC klinisk sentrifuge ved maksimal hastighet (3350 omdreininger pr. min.) i 5 minutter ved værelsestemperatur. For måling av glukosedyrkede celler ble et dyrkningsvolum svarende til en ODgoo =0,5 tatt ut og sentrifugert som angitt ovenfor.
Cellepelletene ble vasket én gang med vann og resuspendert i 1 ml Z-buffer. Den resulterende suspensjon ble blandet med 30 jil CHCI3og 30 ul 0,1 prosent SDS, blandet ved å svirre det hele rundt (vortexing) og inkubert ved 30°C i 5 minutter.
Reaksjonen ble initiert ved tilsetning av 200 ul forvarmet 0-nitrofenyl-B-D-galaktopyranosid (4 mg/ml) (SIGMA Co.) og blandet ved svirring. Reaksjonen ble inkubert i 2-20 minutter til en synlig gul farge fremkom. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 0,5 ml 1,0 M oppløsning av Na2CC>3, cellene ble pelletert og OD420av den ovenpåflytende væske bestemt. Enheter av 0-galaktosidase ble beregnet som:
Eksempel V
A. Konstruksjon av autonome plasmider pBAZ801-805 og pBAZ601-604
Plasmider pBAZ6 og pBAZ8 ble digestert fullstendig med EcoRI, ligatisert til EcoRI-fragmentene isolert som angitt i eksempel II ovenfor, og brukt til å transformere E. coli-stammen HB101 til ampicillinresistens. Transformanter ble analysert ved mini-DNA-fremstillingsmåten for nærværet av det nye EcoRI-fragment, deretter digestert med Pstl for å sikre at fragmentorienteringen i plasmidet svarte til den for pPG2.5. Plasmidbetegnelser for ligasjonsproduktene av pBAZ8 og pBAZ6 inneholdende EcoRI-fragmenter i den riktige orientering er angitt i tabell VII.
Plasmidene ble transformert inn i P. pastoris-stammen GS115; His<+->transformanter ble dyrket på YNB-glukose- eller YNB-metanolmedia og analysert for S-galaktosidase. Analyseresulta-tene er vist i tabell VIII.
Basert på den observasjon at utslettelsen i pBAZ801 reduserte ekspresjonen 50 prosent fra vill type, mens den i pBAZ802 reduserte ekspresjonen til bare 15 prosent av vill type, trakk man den slutning at frekvensene mellom -372 og -197 inneholder et svakt metanolreagerende område mellom -264 og -197, og et sterkt metanolreagerende område mellom -347 og -264. Videre ligger en betydelig del av de glukoseundertrykkende sekvenser på oversiden av -347.
B. Konstruksjon av integrerte plasmider pBAZ801I og 8051 og
pBAZ601I og 6041
Plasmider pBAZ6 og pBAZ8 ble digestert fullstendig med Blgll, behandlet med Klenow-DNA-polymerase for å ødelegge Bglll-setet, resirkulærisert med ligase og brukt til å transformere E. coli-stammen HB101 til ampicillinresistens. De resulterende plasmider pBAZ6A BglII og pBAZSA Bglll ble digestert fullstendig med EcoRI, ligatisert til EcoRI-fragmenter isolert som angitt i eksempel II og brukt til å transformere E. coli-stammen HB101 til ampicillinresistens .
Transformanter ble analysert ved mini-DNA-fremstillingsmåten for nærværet av det nye EcoRI-fragment, deretter digestert med Pstl for å sikre at fragmentorienteringen i plasmidet svarte til den for pPG2.5.
Plasmidbetegnelser for ligasjonsprodukter av pBAZ8A BglII og pBAZ6 fl Bglll inneholdende EcoRI-fragmenter i den riktige orientering er angitt i tabell IX.
Plasmidene ble digestert med Bglll for å dirigere dem til A0X1-lokuset og transformert inn i P. pastoris-stammen GS115. Stabile HIS<+->transformanter ble isolert, dyrket på YNB-glukose- eller YNB-metanolmedier og analysert for S-galaktosidase. Analyse-resultatene er vist i tabell X.
Stabiliteten av integrasjonen førte til den konklusjon at sekvensene på oversiden av -372 ikke er nødvendige for metanolinduksjon for integrerte vektorer, da pBAZ602I produserte vill type nivåer av B-galaktosidase. Dessuten bekrefter resultatene at sterke og svake metanolreagerende områder ligger mellom henholdsvis -347 og -264, og -264 og -197.
Eksempel VI
B-galaktosidase-ekspresjonsresultatene med de forskjellige 5'-utslettelser og interne utslettelse-ekspresjonskassetter i både den autonome og integrert form er vist sammen i tabell XI for å lette sammenligningen.
Fremgangsmåten til fremstilling av hver av disse vektorer er vist skjematisk på fig. 5.
Eksempel VII
Konstruksjon av pAHZ1
Plasmid pBAZ6 ble digestert med EcoRI, ligatisert til EcoRI-Bglll syntetiske adaptorer (5<1->AATTAGATCT-3') og digestert fullstendig med Bqlll og Bell. Det resulterende tilnærmet 180 bp store fragment inneholdende AOX1 UAS ble isolert og ligatisert inn i det unike Bglll-sete hos pBPf3l (fig. 4), og de resulterende ligasjonsprodukter ble brukt til å transformere E. coli-stammen MC1061 til ampicillinresistens. En transformant inneholdende et plasmid med et enkelt UAS-innskudd ble identifisert ved
digestion med BamHI; dette plasmid ble betegnet pAHZ1.
Plasmid pAHZ1 ble digestert med Stul og brukt til å transformere P. pastoris-GS115; stabile HIS<+->transformanter ble isolert, dyrket på YNB-glukose- og YNB-metanolmedia og analysert for 6-galaktosidaseproduksjon. Resultatene av denne analyse er vist nedenunder:
Disse data viser at de 175 basepar som inneholdes mellom -372 og -197 av A0X1-promotoren på et BglII- BelI-DNA-fragment ikke bare er nødvendige, men også tilstrekkelige for å meddele metanol-induks jon og glukoseundertrykkelse av Pichia HIS4-genpromotor-sekvensene og avgrenser dette område som inneholdende en oppside-aktivatorsekvens (Upstream Activator Sequence).
Eksemplene er bare gitt for å vise utførelsen av oppfinnelsen og skal ikke anses å begrense omfanget av oppfinnelsen eller de tilhørende krav på noen som helst måte. Rimelige variasjoner og modifikasjoner som ikke avviker fra oppfinnelsens ånd anses å ligge innenfor omfanget av den patentbeskyttelse som ønskes og søkes.
De følgende deler av beskrivelsen er foretrukne utførelsesformer 1-33 avfattet i samme form som krav.
1. DNA-fragment som reagerer på nærværet av metanol i det dyrkningsmedium hvor verten som bærer det nevnte fragment dyrkes, idet det nevnte fragment opprettholdes som et autonomt element i den nevnte vert og fragmentet omfatter minst den følgende nukleotidsekvens:
og funksjonelle ekvivalenter derav.
2. DNA-fragment som angitt i punkt 1, som ytterligere omfatter: et polypeptidkodende område hvor det nevnte regulerende område er anordnet ved 5'-enden av det polypeptidkodende område. 3. DNA-fragment som angitt i punkt 2, ytterligere omfattende en 3'-sekvens av DNA på nedsiden av det polypeptidkodende område, idet 3'-sekvensen av DNA kan styre polyadynaleringen, avslutningen av transkripsjonen og avslutningen av translasjonen av budbringer-RNA som er kodet for av det nevnte polypeptidkodende område. 4. DNA-fragment som angitt i punkt 2, hvor det nevnte DNA-fragment videre omfatter én eller flere ytterligere DNA-sekvenser som fås fra gruppen bestående av bakterielt plasmid DNA, bakteriofag DNA, gjærplasmid DNA og gjærkromosomalt DNA. 5. DNA-fragment som angitt i punkt 4, hvor det gjærkromosomale DNA omfatter en autonomt replikerende DNA-sekvens og et markør-gen. 6. DNA-fragment som angitt i punkt 5, hvor fragmentet foreligger i form av et lukket sirkelformet hybrid plasmid. 7. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 2. 8. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 3. 9. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 6. 10. DNA-fragment som reagerer på nærværet av metanol i det dyrkningsmedium hvor verten som bærer det nevnte fragment dyrkes, idet fragmentet er innlemmet i vertens genom og fragmentet omfatter i det minste nukleotidsekvensen:
og funksjonelle ekvivalenter derav.
11. DNA-fragment som angitt i punkt 10, ytterligere omfattende: et polypeptidkodende område, hvor det nevnte regulerende område er anordnet ved 5'-enden av det nevnte polypeptidkodende område. 12. DNA-fragment som angitt i punkt 11, videre omfattende en 3'-sekvens av DNA på nedsiden av det polypeptidkodende område, idet 3'-sekvensen av DNA kan styre polyadenyleringen, avslutningen av transkripsjonen og avslutningen av translasjonen av det budbringer-RNA som er kodet for av det nevnte polypeptidkodende
område.
13. DNA-fragment som angitt i punkt 11, hvor DNA-fragmentet videre omfatter én eller flere ytterligere DNA-sekvenser som fås fra gruppen bestående av bakterielt plasmid DNA, bakteriofag DNA, gjærplasmid DNA og gjærkromosomalt DNA. 14. DNA-fragment som angitt i punkt 13, hvor det nevnte gjærkromosomale DNA omfatter et markørgen. 15. DNA-fragment som angitt i puntk 13, hvor det nevnte gjærkromosomale DNA omfatter en autonomt replikerende DNA-sekvens. 16. DNA-fragment som angitt i punkt 13, hvor fragmentet foreligger i form av et lukket sirkelformet hybrid plasmid før integrering i vertens genom. 17. DNA-fragment som angitt i punkt 13, hvor fragmentet er et lineært fragment. 18. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 11. 19. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 12. 20. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 17. 21. DNA-fragment som har egenskapene til en oppside-aktivatorsekvens, hvor det nevnte fragment meddeler heterologe promotor-nukleotidsekvenser anordnet på nedsiden derav, evnen til å induseres i nærvær av metanol og undertrykkes i nærvær av katabolittundertrykkende karbonkilder, og hvor det nevnte fragment omfatter i det minste nukleotidsekvensen:
og funksjonelle ekvivalenter derav.
22. DNA-fragment som angitt i punkt 21, ytterligere omfattende: et polypeptidkodende område, hvor det nevnte regulerende område er anordnet ved 5<1->enden av det polypeptidkodende område. 23. DNA-fragment som angitt i punkt 22, videre omfattende en 3'-sekvens av DNA på nedsiden av det polypeptidkodende område, idet den nevnte 3'-sekvens av DNA kan styre polyadenyleringen, avslutningen av transkripsjonen og avslutningen av translasjonen av budbringer-RNA som kodes for av det nevnte polypeptidkodende område. 24. DNA-fragment som angitt i punkt 22, hvor DNA-fragmentet videre omfatter én eller flere ytterligere DNA-sekvenser som fås fra gruppen bestående av bakterielt plasmid DNA, bakteriofag DNA, gjærplasmid DNA og gjærkromosomalt DNA. 25. DNA-fragment som angitt i punkt 24, hvor det gjærkromosomale DNA omfatter et markørgen. 26. DNA-fragment som angitt i punkt 24, hvor det gjærkromosomale DNA omfatter en autonomt replikerende sekvens. 27. DNA-fragment som angitt i punkt 24, hvor fragmentet foreligger i form av et lukket, sirkelformet hybrid plasmid før integrering i vertens genom. 28. DNA-fragment som angitt i punkt 24, hvor fragmentet er et lineært fragment. 29. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 22. 30. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 23. 31. Transformert gjærstamme, hvor gjærstammen er en vert for DNA-fragmentet som angitt i punkt 28. 32. Fremgangsmåte til å styre et integrert regulerende områdes evne til å reagere på nærværet av metanol, idet der som det på metanol reagerende område anordnet på oversiden av den kodende sekvens som skal uttrykkes, anvendes i det minste de følgende nukleotider:
for oppnåelse av nominell evne til å reagere på metanol og trinnvis innlemmelse av de følgende nukleotider på oversiden derav for oppnåelse av en høyere grad av evne til å reagere på metanol:
idet den maksimale grad av evne til å reagere på metanol fås ved anvendelse av alle de ovenfor angitte nukleotider, og hvor forskjellige grader av evne til å reagere på metanol fås i henhold til den nedenstående tabell ved anvendelse av et mellomliggende antall nukleotider som fås fra den sistnevnte sekvens:
Claims (1)
1. DNA-fragment som reagerer på nærværet av metanol i det dyrkningsmedium hvor verten som bærer det nevnte fragment dyrkes,
karakterisert ved at fragmentet opprettholdes som et autonomt element i den nevnte vert, idet fragmentet omfatter i det minste nukleotidsekvensen:
og funksjonelle ekvivalenter derav.
2. DNA-fragment som reagerer på nærværet av metanol i det dyrkningsmedium hvor verten som bærer det nevnte fragment dyrkes,
karakterisert ved at fragmentet er innlemmet i den nevnte verts genom og at fragmentet omfatter i det minste nukleotidsekvensen:
av budbringer-RNA som er kodet for av det nevnte polypeptidkodende område.
6. DNA-fragment som angitt i krav 4, karakterisert ved at det nevnte DNA-fragment videre omfatter en eller flere ytterligere DNA-sekvenser som fås fra gruppen bestående av
bakterielt plasmid DNA
bakteriofag DNA
gjærplasmid DNA, og
gjærkromosomalt DNA.
7. DNA-fragment som angitt i krav 1 og 6, karakterisert ved at det gjærkromosomale DNA omfatter en autonomt replikerende DNA-sekvens og et markørgen, særlig hvor det nevnte fragment foreligger i form av et lukket sirkelformet hybrid plasmid.
8. DNA-fragment som angitt i krav 2 og 6 eller krav 3 og 6, karakterisert ved at det nevnte gjærkromosomale DNA omfatter et markørgen, særlig hvor det nevnte gjærkromosomale DNA omfatter en autonomt replikerende DNA-sekvens, særlig hvor det nevnte fragment foreligger i form av et lukket sirkelformet hybrid plasmid før integrering inn i vertens genom, særlig hvor det nevnte fragment er et lineært fragment.
9. Transformert gjærstamme,
karakterisert ved at den nevnte gjærstamme er en vert for DNA-fragmentet som angitt i et av kravene 4, 5, 7 eller 8.
10. Fremgangsmåte til å styre et integrert regulerende områdes evne til å reagere på nærværet av metanol, idet der som det på metanol reagerende regulerende område, anordnet på oversiden av den kodende sekvens som skal uttrykkes, anvendes i det minste de følgende nukleotider:
for oppnåelse av nominell evne til å reagere på metanol og trinnvis innlemmelse av de følgende nukleotider på oversiden derav for oppnåelse av en høyere grad av evne til å reagere på metanol:
idet den maksimale grad av evne til å reagere på metanol fås ved anvendelse av alle de ovenfor angitte nukleotider, og hvor forskjellige grader av evne til å reagere på metanol fås i henhold til den nedenstående tabell ved anvendelse av et mellomliggende antall nukleotider som fås fra den sistnevnte sekvens:
11. Fremgangsmåte til styring av et autonomt reguleringsområdes evne til å reagere på nærværet av metanol omfattende å anvende som det regulerende område i det minste de følgende nukleotider:
for oppnåelse av nominell evne til å reagere på metanol og trinnvis innlemmelse av de følgende nukleotider på oversiden derav for oppnåelse av en høyere grad av evne til å reagere på metanol:
idet den maksimale grad av evne til å reagere på metanol fås ved anvendelse av alle de ovenfor angitte nukleotider og forskjellige grader av evne til å reagere på metanol fås ved anvendelse av et mellomliggende antall nukleotider fra den sistnevnte sekvens:
SAMMENDRAG:
Nye DNA-fragmenter som reagerer på nærværet av metanol og/eller katabolittundertrykkende karbonkilder er angitt, samt fremgangsmåter til regulering av proteinekspresjon med disse.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83984586A | 1986-03-14 | 1986-03-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO871038D0 NO871038D0 (no) | 1987-03-13 |
| NO871038L true NO871038L (no) | 1987-09-15 |
Family
ID=25280770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO871038A NO871038L (no) | 1986-03-14 | 1987-03-13 | Dna-fragment. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0244598A1 (no) |
| JP (1) | JPS6339584A (no) |
| CN (1) | CN87101797A (no) |
| AU (1) | AU608214B2 (no) |
| DK (1) | DK130987A (no) |
| IL (1) | IL81817A0 (no) |
| NO (1) | NO871038L (no) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5989870A (en) * | 1986-04-30 | 1999-11-23 | Rohm Enzyme Finland Oy | Method for cloning active promoters |
| US5789214A (en) * | 1988-03-08 | 1998-08-04 | Novartis Finance Corporation | Method of inducing gene transcription in a plant |
| US5614395A (en) * | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
| CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
| JPH06209763A (ja) * | 1993-01-13 | 1994-08-02 | Green Cross Corp:The | 変異株 |
| US5851766A (en) * | 1995-05-31 | 1998-12-22 | Novartis Finance Corporation | Process for isolating chemically regulatable DNA sequences |
| AU762727B2 (en) * | 1998-07-03 | 2003-07-03 | Research Corporation Technologies, Inc. | Formaldehyde dehydrogenase genes from methylotrophic yeasts |
| WO2001077351A1 (en) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Vectors and methods for dual protein expression in pichia pastoris and escherichia coli |
| MXPA03009059A (es) * | 2001-04-05 | 2004-10-15 | Univ Nebraska | Secuencias de nucleotidos reguladoras de alcohol oxidasa 1 para expresion de genes heterologos en levadura. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
-
1987
- 1987-03-08 IL IL81817A patent/IL81817A0/xx unknown
- 1987-03-10 AU AU69851/87A patent/AU608214B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-10 CN CN198787101797A patent/CN87101797A/zh active Pending
- 1987-03-10 JP JP62055114A patent/JPS6339584A/ja active Pending
- 1987-03-12 EP EP87103603A patent/EP0244598A1/en not_active Withdrawn
- 1987-03-13 DK DK130987A patent/DK130987A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-03-13 NO NO871038A patent/NO871038L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK130987D0 (da) | 1987-03-13 |
| NO871038D0 (no) | 1987-03-13 |
| DK130987A (da) | 1987-09-15 |
| AU608214B2 (en) | 1991-03-28 |
| JPS6339584A (ja) | 1988-02-20 |
| CN87101797A (zh) | 1987-10-21 |
| AU6985187A (en) | 1987-09-17 |
| IL81817A0 (en) | 1987-10-20 |
| EP0244598A1 (en) | 1987-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU593436B2 (en) | Dna fragment | |
| Drysdale et al. | The transcriptional activator GCN4 contains multiple activation domains that are critically dependent on hydrophobic amino acids | |
| FI121013B (fi) | Transformoitu Gandida utilis -hiiva ja vieraiden geenien ilmentäminen sen avulla | |
| Wieland et al. | A promoter-screening plasmid and xylose-inducible, glucose-repressible expression vectors for Staphylococcus carnosus | |
| Miyamoto et al. | Nucleotide sequence of the CLS4 (CDC24) gene of Saccharomyces cerevisiae | |
| Iino et al. | S. pombe pac1+, whose overexpression inhibits sexual development, encodes a ribonuclease III‐like RNase. | |
| NO314151B1 (no) | Pichia pastoris sur fosfatasegen | |
| EP0126206A2 (en) | Glucoamylase cDNA | |
| NO308667B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av fusjonsproteiner | |
| Gatignol et al. | Cloning of Saccharomyces cerevisiae promoters using a probe vector based on phleomycin resistance | |
| AU1818395A (en) | Yeast strains and modified albumins | |
| Kitada et al. | Isolation of a Candida glabrata centromere and its use in construction of plasmid vectors | |
| NO871038L (no) | Dna-fragment. | |
| US5135868A (en) | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification | |
| US8710205B2 (en) | Transcription factor | |
| DE3855633T2 (de) | Rekombinante DNS-Expressionsvektoren und DNS-Zusammensetzungen, die für Deacetoxycephalosporin C-Synthetase und Deacetylcephalosporin C-Synthetase kodieren | |
| JPS62151188A (ja) | 菌類の形質転換のための複合発現カセツト | |
| CA2295190C (en) | Improved protein expression strains | |
| US5616474A (en) | K. lactis transaldolase gene promoter and use thereof | |
| JP3689920B2 (ja) | マルチクローニングベクター、発現ベクター、および異種蛋白質の生産 | |
| Johnston et al. | Cloning and characterization of the Schizosaccharomyces pombe DNA ligase gene CDC17 | |
| AU604925B2 (en) | A hirudin derivative | |
| NZ241683A (en) | "two micron" plasmid varients and vectors for yeasts | |
| Burmester | Transformation of the mycoparasite Parasitella simplex to neomycin resistance | |
| WO1994016085A2 (en) | Hybrid proteins having cross-linking and tissue-binding activities |