JPS6339584A - メタノ−ルおよびグルコ−ス応答性ｄｎａフラグメント - Google Patents
メタノ−ルおよびグルコ−ス応答性ｄｎａフラグメントInfo
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- JPS6339584A JPS6339584A JP62055114A JP5511487A JPS6339584A JP S6339584 A JPS6339584 A JP S6339584A JP 62055114 A JP62055114 A JP 62055114A JP 5511487 A JP5511487 A JP 5511487A JP S6339584 A JPS6339584 A JP S6339584A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組臭えＤＮＡ技術に関する。その１つの面にお
いて、本発明はメタノール誘発性調節領域に関する。別
の面において、本発明はグルコースの存在下で抑制され
る調節領域に関する０さらに別の面において、本発明は
本発明の調節領域を組み込んだ新規発現ベクター、その
ベクターにより形質転換された新規生物、およびその生
物による調節されたポリペプチドの発現に関するＱ（従
来技術） 近年、組換えＤＮＡ技術が開発されたので、多種多様の
有用なポリペプチドの微生物による制御された生産が可
能となった。多くの真核生物のポリペプチド、例えばヒ
ト成長ホルモン、白血球インターフェロン、ヒトインシ
ュリン、ヒトプロインシュリンなどはすでに種々の微生
物によって生産されている。組換えＤＮＡ技術の分野の
開発を継続することにより、微生物を使用する有用なポ
リペプチド産物のさらに有効な生産手段が出現すると将
来期待される。１つの望ましい開発は、培地や生Ｈ条件
などを適当に選択することにより容易に作動したり休止
したりする調節領域を単離して同定することであるだろ
う。
いて、本発明はメタノール誘発性調節領域に関する。別
の面において、本発明はグルコースの存在下で抑制され
る調節領域に関する０さらに別の面において、本発明は
本発明の調節領域を組み込んだ新規発現ベクター、その
ベクターにより形質転換された新規生物、およびその生
物による調節されたポリペプチドの発現に関するＱ（従
来技術） 近年、組換えＤＮＡ技術が開発されたので、多種多様の
有用なポリペプチドの微生物による制御された生産が可
能となった。多くの真核生物のポリペプチド、例えばヒ
ト成長ホルモン、白血球インターフェロン、ヒトインシ
ュリン、ヒトプロインシュリンなどはすでに種々の微生
物によって生産されている。組換えＤＮＡ技術の分野の
開発を継続することにより、微生物を使用する有用なポ
リペプチド産物のさらに有効な生産手段が出現すると将
来期待される。１つの望ましい開発は、培地や生Ｈ条件
などを適当に選択することにより容易に作動したり休止
したりする調節領域を単離して同定することであるだろ
う。
例えばエリス（Ｅｌｌｉｓ）、フリスト（Ｂｒｗｓｔ）
、コーラ（Ｋｏｕｔｚ）、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ
）、バーボルド（Ｈａｒｐｏｌｄ）およびジンジャーズ
（Ｇｉｎｇ−ｅｒａｓ ） のモレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｔｒｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｅｉｏ −１ｏｙｙ）、１９
８５年５月、１１１１〜１１２１頁はメタノールの存在
に応答し、さらにグルコースのようなカタボライト（異
化代謝産物）抑制炭素源の存在下でカタボライト抑制を
受けるＤＮＡ配列の単離および同定を開示している。本
発明は上記文献に発表された調節領域に関して実施した
その後の研究の結果である。
、コーラ（Ｋｏｕｔｚ）、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ
）、バーボルド（Ｈａｒｐｏｌｄ）およびジンジャーズ
（Ｇｉｎｇ−ｅｒａｓ ） のモレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｔｒｃｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｅｉｏ −１ｏｙｙ）、１９
８５年５月、１１１１〜１１２１頁はメタノールの存在
に応答し、さらにグルコースのようなカタボライト（異
化代謝産物）抑制炭素源の存在下でカタボライト抑制を
受けるＤＮＡ配列の単離および同定を開示している。本
発明は上記文献に発表された調節領域に関して実施した
その後の研究の結果である。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明はエリスらのメタノール応答性ＤＮＡ配列の機能
的サブフラグメントの単離および同定に関する。
的サブフラグメントの単離および同定に関する。
驚くべきことに、エリス、プラスト、コーラ、ウォータ
ーズ、バーボルド訃よびジンジャース（モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー、１９８５年５月、１
１１１〜１１２１頁）によって開示された調節領域の別
個のサブフラグメントは特異な調節性質をもつことが見
出され、１つのこのような調節領域は宿主生物内に染色
体要素として保有されたときにメタノールの存在下で完
全誘発が可能であり、別のこのような調節領域は宿主生
物内に染色体外要素として保有されたときにメタノール
の存在下で完全誘発が可能であり、さらに別のこのよう
な調節領域はその下流に配置された異種プロモーターヌ
クレオチド配列に、メタノールの存在下で誘発さｈる能
力とカタボライト抑制炭素源の存在下で抑制される能力
全付与することが可能である。
ーズ、バーボルド訃よびジンジャース（モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー、１９８５年５月、１
１１１〜１１２１頁）によって開示された調節領域の別
個のサブフラグメントは特異な調節性質をもつことが見
出され、１つのこのような調節領域は宿主生物内に染色
体要素として保有されたときにメタノールの存在下で完
全誘発が可能であり、別のこのような調節領域は宿主生
物内に染色体外要素として保有されたときにメタノール
の存在下で完全誘発が可能であり、さらに別のこのよう
な調節領域はその下流に配置された異種プロモーターヌ
クレオチド配列に、メタノールの存在下で誘発さｈる能
力とカタボライト抑制炭素源の存在下で抑制される能力
全付与することが可能である。
以下の略語は使用する制限酵素を表すために図面におい
て使用する。
て使用する。
Ａ Ａνα■
Ｂ ＢａｍＨＩ２ＢＱＩＵ
Ｅｃ ＥａｒｌＨ２Ｈｉｎｃ［
Ｈ３Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩＩ
Ｋ Ｋｐｎ■Ｎｄ、
Ｎｄ５ｌＮｒ
ＮｒｕｌＰｓ
Ｐｓ ｔ ＩＰｖ２
ＰｖｕＵ７？ ｓ
Ｅ ｃ ｏ ＲＩＲ５ＥｃｏＲＶ Ｓ ＳａｌｌＳｍ
Ｓｍα■Ｓｓ
Ｓｅ ｔ ＩＳｔ
５ｊｕｌ添付の図面に
卦いて、ＤＮＡフラグメントの操作に使用する制限部位
のうち、連結の際に破壊される部位はその破壊部位の略
語をかっこ内に記入することにより表示する。
Ｎｄ５ｌＮｒ
ＮｒｕｌＰｓ
Ｐｓ ｔ ＩＰｖ２
ＰｖｕＵ７？ ｓ
Ｅ ｃ ｏ ＲＩＲ５ＥｃｏＲＶ Ｓ ＳａｌｌＳｍ
Ｓｍα■Ｓｓ
Ｓｅ ｔ ＩＳｔ
５ｊｕｌ添付の図面に
卦いて、ＤＮＡフラグメントの操作に使用する制限部位
のうち、連結の際に破壊される部位はその破壊部位の略
語をかっこ内に記入することにより表示する。
本発明によれば、宿主生物（本発明のＤＮＡフラグメン
トを含む）が接触する培地中のメタノールの存在に対し
て応答する調節領域から成る新規ＤＮＡフラグメントが
提供される。本発明の新規フラグメントの１つは、宿主
生物のゲノム内に単一コピーとして組み込まれたとき（
すなわち、その染色体外要素としてではなく、染色体要
素として保有されたとき）、メタノールの存在下で完全
誘発を促進することができる。本発明の別の新規フラグ
メントは、宿主生物の染色体外要素として保有されたと
き（すなわち、宿主内に自律的要素として保持されたと
き）、またはその染色体要素として保有されたとき、メ
タノールの存在下で完全誘発を促進することができる。
トを含む）が接触する培地中のメタノールの存在に対し
て応答する調節領域から成る新規ＤＮＡフラグメントが
提供される。本発明の新規フラグメントの１つは、宿主
生物のゲノム内に単一コピーとして組み込まれたとき（
すなわち、その染色体外要素としてではなく、染色体要
素として保有されたとき）、メタノールの存在下で完全
誘発を促進することができる。本発明の別の新規フラグ
メントは、宿主生物の染色体外要素として保有されたと
き（すなわち、宿主内に自律的要素として保持されたと
き）、またはその染色体要素として保有されたとき、メ
タノールの存在下で完全誘発を促進することができる。
本発明のＤ ＮＡフラグメントの調節領域は、メツセン
ジャーＲＮＡの生産をコードするＤＮＡの５′末端に位
置づけたとき、メツセンジャーＲＮＡの転写を制御でき
る。また、上記ＤＮＡフラグメントの突然変異体および
機能的均等物も本発明の範囲内に含まれる。
ジャーＲＮＡの生産をコードするＤＮＡの５′末端に位
置づけたとき、メツセンジャーＲＮＡの転写を制御でき
る。また、上記ＤＮＡフラグメントの突然変異体および
機能的均等物も本発明の範囲内に含まれる。
本明細書中で用いる”完全誘発”なる用語は、メタノー
ルの存在に対して応答する所定のＤＮＡフラグメントの
能力を意味する。この用語は調節領域−構造遺伝子構築
物により形質転換さｈた宿生において、野生型ＡＯＸｌ
タンパク質コード配列の上流の１キロ塩基の非コード配
列を使用して得られるタンパク質産物のレベルに等しい
レベルのタンパク質産物の生産を誘発するメタノール応
答性調節領域の能力に関する。
ルの存在に対して応答する所定のＤＮＡフラグメントの
能力を意味する。この用語は調節領域−構造遺伝子構築
物により形質転換さｈた宿生において、野生型ＡＯＸｌ
タンパク質コード配列の上流の１キロ塩基の非コード配
列を使用して得られるタンパク質産物のレベルに等しい
レベルのタンパク質産物の生産を誘発するメタノール応
答性調節領域の能力に関する。
さらに、本発明によれば、下流に配置された異種プロモ
ーターヌクレオチド配列に、宿主生物が接触する培地中
のメタノールの存在下で発現を誘発する能力を、そして
カタボライト抑制炭素源の存在下で発現を抑制する能力
を付与する上流アクチペーダー配列から成るＤＮＡフラ
グメントが提供される。本発明のこの実施態様のＤＮＡ
の調節領域は、メツセンジャーＲＮＡの生産をコードす
るＤＮＡの５′末端に配置された異種プロモーターと関
連づけたとき、メツセンジャーＲＮＡの転写を制御する
ことができる。また、上記ＤＮＡフラグメントの突然変
異体およ−び機能的均等物も本発明の範囲内に含まれる
。
ーターヌクレオチド配列に、宿主生物が接触する培地中
のメタノールの存在下で発現を誘発する能力を、そして
カタボライト抑制炭素源の存在下で発現を抑制する能力
を付与する上流アクチペーダー配列から成るＤＮＡフラ
グメントが提供される。本発明のこの実施態様のＤＮＡ
の調節領域は、メツセンジャーＲＮＡの生産をコードす
るＤＮＡの５′末端に配置された異種プロモーターと関
連づけたとき、メツセンジャーＲＮＡの転写を制御する
ことができる。また、上記ＤＮＡフラグメントの突然変
異体およ−び機能的均等物も本発明の範囲内に含まれる
。
さらに、本発明によれば、上記ＤＮＡフラグメントヲ含
むプラスミドおよび形質転換生物、並びにこの−の形質
転換生物を使用するポリペプチドの生産方法が提供され
る。
むプラスミドおよび形質転換生物、並びにこの−の形質
転換生物を使用するポリペプチドの生産方法が提供され
る。
本発明のさらに別の実施態様によれば、操作しうる調節
領域のヌクレオチド数をいろいろに変えることによって
メタノール応答性調節領域の応答性を制御する方法が提
供される。メタノール応答の範囲はわずかな応答（″′
完全”誘発のほんの数パーセント）から完全メタノール
誘発までの広い範囲で変化し５る〇 本発明の調節領域は組換えＤＮＡ修飾宿主を用いること
によるポリペプチドの調節された生産にきわめて有用で
ある。例えば、本発明の１つの実施態様では、組み込ま
れた発現カセットからのポリペプチド産物のメタノール
誘発発現が可能である。仙の実施態様では、自律的発現
カセットからのポリペプチド産物のメタノール誘発発現
が可能である。
領域のヌクレオチド数をいろいろに変えることによって
メタノール応答性調節領域の応答性を制御する方法が提
供される。メタノール応答の範囲はわずかな応答（″′
完全”誘発のほんの数パーセント）から完全メタノール
誘発までの広い範囲で変化し５る〇 本発明の調節領域は組換えＤＮＡ修飾宿主を用いること
によるポリペプチドの調節された生産にきわめて有用で
ある。例えば、本発明の１つの実施態様では、組み込ま
れた発現カセットからのポリペプチド産物のメタノール
誘発発現が可能である。仙の実施態様では、自律的発現
カセットからのポリペプチド産物のメタノール誘発発現
が可能である。
さらに別の実施態様によれば、ポリペプチド産物の発現
は、メタノール誘発およびカタボライト抑制の両方の状
況に応答する上流アクチペーター配列の制御下にあるポ
リペプチドコード配列により宿主を形質転換し、その後
その形質転換宿主をメタノールまたはカタボライト抑制
炭素源の存在下もしくは不在下に保持することにより制
御される。従って、この時定実旋態様によれば、一定レ
ベルのポリペプチド産物が望まれる巻合、所望レベルの
ポリペプチド産物が得られるまで培地の組成を調節し、
次いで培地にカタボライト抑制炭素源を加えてポリペプ
チドコード配列のその後の発現を抑制することができる
。
は、メタノール誘発およびカタボライト抑制の両方の状
況に応答する上流アクチペーター配列の制御下にあるポ
リペプチドコード配列により宿主を形質転換し、その後
その形質転換宿主をメタノールまたはカタボライト抑制
炭素源の存在下もしくは不在下に保持することにより制
御される。従って、この時定実旋態様によれば、一定レ
ベルのポリペプチド産物が望まれる巻合、所望レベルの
ポリペプチド産物が得られるまで培地の組成を調節し、
次いで培地にカタボライト抑制炭素源を加えてポリペプ
チドコード配列のその後の発現を抑制することができる
。
後者の実施態様において、本発明の上流アクチベーター
配列は、通常は調節さ瓦な℃・プロモーターの支配下に
あるポリペプチド産物の生産を調節するのに有用である
。例えば、構成プロモーターは本発明の上流アクチベー
ター配列をその中に組み入れることによりメタノール誘
発およびカタボライト抑制に応答するようになる。この
方法により、ＲＮＡ Ｐ、に写のプロモーターとして機
能するすべての配列の発現は、メタノールまたはカタボ
ライト抑制炭素源の存在または不在により制御されるＯ （問題点を解決するための手段および作用）エリス、プ
ラスト、コーラ、ウォーターズ、バーボルドおよびジン
ジャース（モレキュラー アンド・セルラー・バイオロ
ジー、１９８５年５月、１１１１〜１１２１頁）によっ
て開示さり、たような第１アルコールオキシダーゼ遺伝
子（ＡＯＸ １ ；第１図参照）の５′領域から得られ
た約１キロ塩基対（Ｋｂｐ）の調節領域を３′末端およ
び５′末端の両方からＢＡＬ３１で消化し、その後得ら
れた突然変異誘発プロモーターフラグメントを大腸菌（
Ｅ、 ｃｏｌｉ） ｌａｃ Ｚ遺伝子と融合させて一連
のベクターを得た。５′欠失は次のベクターをもたらし
た： 表 １ ベクター ＡＯプロモーター 欠失領域ｐｓＡＯＨ
５−９００→ＡＴＧ なしｐＢＡＺ３ −７
０９→ＡＴＧ ５’ １９１ ｂｐｐＢＡＺ４
−４９９→ＡＴＧ ５’４０１ ｂｐｐＢＡＺ６
−３７２→ＡＴＧ ５’ ５２８ ｂｐｐＢ
ＡＺ７ −２１６→ＡＴＧ ５’６８４ ｂｐ
ｐＢＡＺ８ −１９７→ＡＴＧ ５’ ７０３
ｂｐベクターｐｓＡＯＨ５（第２図参照）は完全な５
′−アルコールオキシダーゼ調節領域を表し、一方ベク
ターｐＢＡＺ３．４．６．７および８はその５′末端か
らの欠失物を表す。種々の調節領域−構造遺伝子（ｌａ
ｃＺ）構築物を含むこれらのベクターを用いてピチア・
パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａ−ｓｔｏｒｉｓ ）栄
養要求株を形質転換し、その後炭素およびエネルギー源
としてのメタノールまたはグルコース上で増殖させたと
きのβ−ガラクトシダーゼ生産について検定した。β−
ガラクトシダーゼ発現結果の詳細な分析は実施例におい
て説明するが、その結果を要約すると次のようになる＝
（α） 弱いメタノール応答性領域は、こハらの配列を
含む自律的ベクターにおいて、ＡＴＧ開始コドンの上流
の７０９塩基対と４９９塩基対の間に存在し、一方組み
込まれたベクターにおいて、完全メタノール応答は上流
の７０９〜４９９塩基対の配列を必要としない。従って
、組込みベクターおよび自律的ベクターの双方において
完全メタノール誘発は配列０−７０９ヌクレオチドから
得られるが、自律的ベクターはアルコールオキシダーゼ
ＡＴＧの上流の配列０−４９９塩基対を用いた場合に約
５０％のメタノール誘発を示すのみである。自律的ベク
ターによる発現の完全誘発に必要とされる７０９塩基対
配列は次の通りである：配位Ａ ＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡ ＣＡＡＣＴＡＡＴＴＡ ＴｒＣ
ＧＡＡＡＣＧ−３’少なくともわずかなメタノール誘発
がＡＴＧの上流の最初の１９７ヌクレオチドに観察され
る。
配列は、通常は調節さ瓦な℃・プロモーターの支配下に
あるポリペプチド産物の生産を調節するのに有用である
。例えば、構成プロモーターは本発明の上流アクチベー
ター配列をその中に組み入れることによりメタノール誘
発およびカタボライト抑制に応答するようになる。この
方法により、ＲＮＡ Ｐ、に写のプロモーターとして機
能するすべての配列の発現は、メタノールまたはカタボ
ライト抑制炭素源の存在または不在により制御されるＯ （問題点を解決するための手段および作用）エリス、プ
ラスト、コーラ、ウォーターズ、バーボルドおよびジン
ジャース（モレキュラー アンド・セルラー・バイオロ
ジー、１９８５年５月、１１１１〜１１２１頁）によっ
て開示さり、たような第１アルコールオキシダーゼ遺伝
子（ＡＯＸ １ ；第１図参照）の５′領域から得られ
た約１キロ塩基対（Ｋｂｐ）の調節領域を３′末端およ
び５′末端の両方からＢＡＬ３１で消化し、その後得ら
れた突然変異誘発プロモーターフラグメントを大腸菌（
Ｅ、 ｃｏｌｉ） ｌａｃ Ｚ遺伝子と融合させて一連
のベクターを得た。５′欠失は次のベクターをもたらし
た： 表 １ ベクター ＡＯプロモーター 欠失領域ｐｓＡＯＨ
５−９００→ＡＴＧ なしｐＢＡＺ３ −７
０９→ＡＴＧ ５’ １９１ ｂｐｐＢＡＺ４
−４９９→ＡＴＧ ５’４０１ ｂｐｐＢＡＺ６
−３７２→ＡＴＧ ５’ ５２８ ｂｐｐＢ
ＡＺ７ −２１６→ＡＴＧ ５’６８４ ｂｐ
ｐＢＡＺ８ −１９７→ＡＴＧ ５’ ７０３
ｂｐベクターｐｓＡＯＨ５（第２図参照）は完全な５
′−アルコールオキシダーゼ調節領域を表し、一方ベク
ターｐＢＡＺ３．４．６．７および８はその５′末端か
らの欠失物を表す。種々の調節領域−構造遺伝子（ｌａ
ｃＺ）構築物を含むこれらのベクターを用いてピチア・
パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａ−ｓｔｏｒｉｓ ）栄
養要求株を形質転換し、その後炭素およびエネルギー源
としてのメタノールまたはグルコース上で増殖させたと
きのβ−ガラクトシダーゼ生産について検定した。β−
ガラクトシダーゼ発現結果の詳細な分析は実施例におい
て説明するが、その結果を要約すると次のようになる＝
（α） 弱いメタノール応答性領域は、こハらの配列を
含む自律的ベクターにおいて、ＡＴＧ開始コドンの上流
の７０９塩基対と４９９塩基対の間に存在し、一方組み
込まれたベクターにおいて、完全メタノール応答は上流
の７０９〜４９９塩基対の配列を必要としない。従って
、組込みベクターおよび自律的ベクターの双方において
完全メタノール誘発は配列０−７０９ヌクレオチドから
得られるが、自律的ベクターはアルコールオキシダーゼ
ＡＴＧの上流の配列０−４９９塩基対を用いた場合に約
５０％のメタノール誘発を示すのみである。自律的ベク
ターによる発現の完全誘発に必要とされる７０９塩基対
配列は次の通りである：配位Ａ ＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡ ＣＡＡＣＴＡＡＴＴＡ ＴｒＣ
ＧＡＡＡＣＧ−３’少なくともわずかなメタノール誘発
がＡＴＧの上流の最初の１９７ヌクレオチドに観察され
る。
（６） 強いメタノール応答性領域はＡＴＧ開始コド
ンの上流の約３７２〜１９７塩基対に存在し、一方グル
コース応答性領域はＡＴＧ開始コドンから上流の３７２
〜２１６塩基対に存在する。このフラグメントは、実施
例でさらに詳しく示す追加実験により、上流アクチベー
ター配列（ＵＡＳ）の性質をもつことがわかった。すな
わち、このフラグメントは下流の異種プロモーター配列
にメタノールの存在により誘発される能力および／また
はカタボライト抑制炭素源（例えばグルコース）の存在
により抑制される能力を付与することができる。このＵ
ＡＳフラグメントは次の配列を有する：配列Ｂ ＧＡＡＴＡＣＴＧＣＴ ＧＡＴＡＧＣＣＴＡＡ ｃＧＴ
ｒＣＡＴＧＡＴ ＣＡＡ−３’５’−Ａ□Ｙｌプロモー
ターの３′末端からの一連の欠失物をつくり、５′欠失
ベクターｐＥＡＺ６およびｐＢＡＺ８にサブクローニン
グして表■に示す一連のベクターを得た。
ンの上流の約３７２〜１９７塩基対に存在し、一方グル
コース応答性領域はＡＴＧ開始コドンから上流の３７２
〜２１６塩基対に存在する。このフラグメントは、実施
例でさらに詳しく示す追加実験により、上流アクチベー
ター配列（ＵＡＳ）の性質をもつことがわかった。すな
わち、このフラグメントは下流の異種プロモーター配列
にメタノールの存在により誘発される能力および／また
はカタボライト抑制炭素源（例えばグルコース）の存在
により抑制される能力を付与することができる。このＵ
ＡＳフラグメントは次の配列を有する：配列Ｂ ＧＡＡＴＡＣＴＧＣＴ ＧＡＴＡＧＣＣＴＡＡ ｃＧＴ
ｒＣＡＴＧＡＴ ＣＡＡ−３’５’−Ａ□Ｙｌプロモー
ターの３′末端からの一連の欠失物をつくり、５′欠失
ベクターｐＥＡＺ６およびｐＢＡＺ８にサブクローニン
グして表■に示す一連のベクターを得た。
表 ■
ｐＢＡＺ８０１−２６４→１９７
ｐＢＡＺ８０２ −３４７→１９７
ｐＢＡＺ８０３ −４４５→１９７
ｐＥＡＺ８０５ −５３２→１９７
ｐＢＡＺ８０４ −６９４→１９７
ｐＢＡＺ６０４ −４４５→３７２
ｐＢＡＺ６０１−５３２→３７２
ｐＢＡＺ６０３ −５４２→３７２
ｐＢＡＺ６０２ −６９４→３７２
表■に示したベクター類は、ＡＯＸｌのＡＴＧ開始コド
ンに対して塩基位置６９４と１９７の間でいろいろ異な
る内部欠失を含む０表■に示したベクターに含まれるプ
ロモーター配列の５′部分はアルコールオキシダーゼ調
節領域の３′末端欠失物から誘導され、一方表■に示し
たベクターに含まれる調節領域の３′部分はアルコール
オキシダーゼ調節領域からの５′末端欠失物ｐＢＡＺ６
およびｐＢＡＺ８から誘導される。前のように、この調
節領域−β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子構築物を使用
してピチア・パストリス栄養要求株を形質転換し、その
後メタノールまたはグルコースのもとで増殖させたとき
のβ−ガラクトシダーゼ生産について検定した０この検
定結果の詳細な分析は実施例において示すが、この結果
を要約すると、非常に強いメタノール誘発性要素がＡＴ
Ｇ開始コドンから上流の約２６０ヌクレオチドと３７０
ヌクレオチドの間の約１００塩基対領域に存在すること
が判明した。さらに、比較的弱いメタノール調節性ＤＮ
ＡフラグメントがＡＴＧ開始コドンから上流の約５０６
ヌクレオチドから７１０ヌクレオチドまでの領域に見出
された０さらに、グルコース抑制性値域がアルコールオ
キシダーゼＡＴＧ開始コドンから上流の約３５０塩基対
から３７５塩基対までの領域に観察された０このグルコ
ース抑制性領域はメタノール誘発性領域の直接上流に存
在し、メタノール応答性配列と重複するかも知れない。
ンに対して塩基位置６９４と１９７の間でいろいろ異な
る内部欠失を含む０表■に示したベクターに含まれるプ
ロモーター配列の５′部分はアルコールオキシダーゼ調
節領域の３′末端欠失物から誘導され、一方表■に示し
たベクターに含まれる調節領域の３′部分はアルコール
オキシダーゼ調節領域からの５′末端欠失物ｐＢＡＺ６
およびｐＢＡＺ８から誘導される。前のように、この調
節領域−β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子構築物を使用
してピチア・パストリス栄養要求株を形質転換し、その
後メタノールまたはグルコースのもとで増殖させたとき
のβ−ガラクトシダーゼ生産について検定した０この検
定結果の詳細な分析は実施例において示すが、この結果
を要約すると、非常に強いメタノール誘発性要素がＡＴ
Ｇ開始コドンから上流の約２６０ヌクレオチドと３７０
ヌクレオチドの間の約１００塩基対領域に存在すること
が判明した。さらに、比較的弱いメタノール調節性ＤＮ
ＡフラグメントがＡＴＧ開始コドンから上流の約５０６
ヌクレオチドから７１０ヌクレオチドまでの領域に見出
された０さらに、グルコース抑制性値域がアルコールオ
キシダーゼＡＴＧ開始コドンから上流の約３５０塩基対
から３７５塩基対までの領域に観察された０このグルコ
ース抑制性領域はメタノール誘発性領域の直接上流に存
在し、メタノール応答性配列と重複するかも知れない。
先に同定したメタノール誘発性要素のいずれかを、単独
でまたは組合せで、発現ベクター内に挿入することによ
り、メタノール誘発される遺伝子発現が可能である。
でまたは組合せで、発現ベクター内に挿入することによ
り、メタノール誘発される遺伝子発現が可能である。
反対に、先に同定したグルコース抑制性領域をメタノー
ル誘発性プロモーター要素から欠失することにより、発
現ベクター内に修飾プロモーターを挿入し且つ得られた
形質転換生物をグルコースの存在下で増殖させるとき、
抑制されない遺伝子発現が可能である。また、グルコー
ス抑制性領域を特別な意図をもって特別に考案されたベ
クター内に挿入することにより、遺伝子発現の速やかな
１オンオフ（ｏｓ−ｏｆｆ ）” 制御が可能となる。
ル誘発性プロモーター要素から欠失することにより、発
現ベクター内に修飾プロモーターを挿入し且つ得られた
形質転換生物をグルコースの存在下で増殖させるとき、
抑制されない遺伝子発現が可能である。また、グルコー
ス抑制性領域を特別な意図をもって特別に考案されたベ
クター内に挿入することにより、遺伝子発現の速やかな
１オンオフ（ｏｓ−ｏｆｆ ）” 制御が可能となる。
本発明の別の実施態様によれば、調節領域として塩基対
の数がいろいろに異なるヌクレオチド配列を使用するこ
とにより、メタノールの存在下で組み込まれた調節領域
の応答性を制御する方法が提供される。こうして、最小
限１９７塩基対の次の配列を用いたとき、完全メタノー
ル誘発の約５％が得られる： 配列Ｃ ５’−ＡＡＡＴＴＩ’ＡＡ 本質的に完全なメタノール誘発は、次の配列のすべてを
付加したとき、組込み発現ベクターを用いることにより
観察される： 配列り 組込み発現ベクター内に挿入される調節領域の大きさの
関数としてのメタノール誘発のおおよその程度を表■に
示す： 表 ■ ０−１９７プラス３４７−３７２ ５０−１
９７プラス２６４−３７２ ２５０−３７２
Ｚｏ。
の数がいろいろに異なるヌクレオチド配列を使用するこ
とにより、メタノールの存在下で組み込まれた調節領域
の応答性を制御する方法が提供される。こうして、最小
限１９７塩基対の次の配列を用いたとき、完全メタノー
ル誘発の約５％が得られる： 配列Ｃ ５’−ＡＡＡＴＴＩ’ＡＡ 本質的に完全なメタノール誘発は、次の配列のすべてを
付加したとき、組込み発現ベクターを用いることにより
観察される： 配列り 組込み発現ベクター内に挿入される調節領域の大きさの
関数としてのメタノール誘発のおおよその程度を表■に
示す： 表 ■ ０−１９７プラス３４７−３７２ ５０−１
９７プラス２６４−３７２ ２５０−３７２
Ｚｏ。
同様に、調節領域として、完全メタノール誘発を達成す
るのに要する以下の付加配列（配列Ｅ）と共に、上記配
列Ｃに示した少なくとも１９７ヌクレオチドを有するヌ
クレオチド配列を使用することにより、自律的調節領域
のメタノールの存在に対する応答性を制御する方法が提
供される：配列Ｅ 使用する調節領域の大きさの関数としてのメタノール誘
発のおおよその程度を表■に示す：聚 ■ ０−．１９９ ５０ 本発明の１つの実施態様によれば、配列Ｂに示した上流
アクチベーター配列（ＵＡＳ）がグルコースおよび／ま
たはメタノールの存在に通常不感受性であるピチア配列
の上流に挿入された。グルコースの存在下で増殖させた
とき、ＵＡＳ含有形質転換体による遺伝子産物（β−ガ
ラクトシダーゼ）の発現はＵＡＳ不含構築物ｐＢＰｆ３
■に比べて４００倍以上抑制された。この抑制はメタノ
ールの存在下での増殖により軽減され、β−ガラクトシ
ダーゼの生産レベルはグルコース増殖形質転換体のそれ
の１７０倍以上に増加した。
るのに要する以下の付加配列（配列Ｅ）と共に、上記配
列Ｃに示した少なくとも１９７ヌクレオチドを有するヌ
クレオチド配列を使用することにより、自律的調節領域
のメタノールの存在に対する応答性を制御する方法が提
供される：配列Ｅ 使用する調節領域の大きさの関数としてのメタノール誘
発のおおよその程度を表■に示す：聚 ■ ０−．１９９ ５０ 本発明の１つの実施態様によれば、配列Ｂに示した上流
アクチベーター配列（ＵＡＳ）がグルコースおよび／ま
たはメタノールの存在に通常不感受性であるピチア配列
の上流に挿入された。グルコースの存在下で増殖させた
とき、ＵＡＳ含有形質転換体による遺伝子産物（β−ガ
ラクトシダーゼ）の発現はＵＡＳ不含構築物ｐＢＰｆ３
■に比べて４００倍以上抑制された。この抑制はメタノ
ールの存在下での増殖により軽減され、β−ガラクトシ
ダーゼの生産レベルはグルコース増殖形質転換体のそれ
の１７０倍以上に増加した。
表 Ｖ
なし １．０７
−１９７〜−３７２ １７４特定の形質転換
体、結果などは実施例において詳細に述べる。
体、結果などは実施例において詳細に述べる。
本発明は今や以下の非限定的実施例に関してさらに詳し
く説明するであろう。
く説明するであろう。
（実施例）
次の実施例で使用する緩衝液および溶液は以下に示す組
成を有する： ＳＤ平板−水１を中の２％寒天 アミノ酸不含の酵母窒素塩基（ジフコ）６．７ ７ ２重量％デキストロース Ｚ緩衝液−０，１Ｍリン酸ナトリウム、 ｐＨ７，００
、ＯＩＭＫＣｌ Ｏ，００１Ａｆ ＭｇＳＯ４ ０，０３９Ｍ β−メルカプトエタノール Ｘ−ｇａｇ指示薬乎板−水１を中の ２％寒天 ０．５容量％メタノール アミノ酸不含酵母窒素塩基（ジフコ） ６．７１ ビオチン０．４■ 整 一−ＥＧＴＡ＝エチレングリコール−ビス−（β−アミ
ノエチルエーテル）−＃、＃、＃’、＃’−テトラ酢酸
（シグマ社） 次の実施例で使用する菌株は以下に示す寄託番号により
認可された寄託機関より入手しうる。
成を有する： ＳＤ平板−水１を中の２％寒天 アミノ酸不含の酵母窒素塩基（ジフコ）６．７ ７ ２重量％デキストロース Ｚ緩衝液−０，１Ｍリン酸ナトリウム、 ｐＨ７，００
、ＯＩＭＫＣｌ Ｏ，００１Ａｆ ＭｇＳＯ４ ０，０３９Ｍ β−メルカプトエタノール Ｘ−ｇａｇ指示薬乎板−水１を中の ２％寒天 ０．５容量％メタノール アミノ酸不含酵母窒素塩基（ジフコ） ６．７１ ビオチン０．４■ 整 一−ＥＧＴＡ＝エチレングリコール−ビス−（β−アミ
ノエチルエーテル）−＃、＃、＃’、＃’−テトラ酢酸
（シグマ社） 次の実施例で使用する菌株は以下に示す寄託番号により
認可された寄託機関より入手しうる。
−一細菌株ＪＭ１０３、ＨＢ １０１およびＭＣ１０６
１、は一般的に入手可能。
１、は一般的に入手可能。
−−ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＧＳ １１５＝ＮＲＲＬ
Ｙ −−−ｐｓＡＯＨ５（ＧＳ１１５を形質転換した
もの＝ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５３；大腸菌を形質転換
したものはＮＲＲＬ Ｂ−１５８６２として入手可能
） −−ｐＢＰｆ３Ｉは次の工程：ｐＹＪ８（寄託番号ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１５８８９）由来の０．６ＫｂｐのＥａｏ
ＲＩ−Ｐνｕｎ フラグメント（このフラグメントは
ピチアＨＩＳ４プロモーター配列を含む）をｐＢＰｆｌ
（寄託番号ＮＲＲＬＢ−１５８９２）のＥｃｏＲＩ−８
ｍａ１部位へ挿入し、得られたプラスミドｐＢＰｆ３を
ＰｓｔＩおよびＮｒｒｂＩで消化してｌａｃ Ｚ 配列
を含むフラグメントを分離し、このフラグメントｆｔ７
）ＹＭ４（ｐＢＲ３２２のＥａｒｎＨ１部位へ挿入され
たｐＹＪ８のＨＩＳ４含有ＢＱＩ■フラグメンＩｆ含む
）のＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＶ フラグメントと連結させて
第４図に示すプラスミドｐＢＰｆ３Ｉを作製することに
よりプラスミドｐＢＰｆ１から誘導される。
Ｙ −−−ｐｓＡＯＨ５（ＧＳ１１５を形質転換した
もの＝ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５３；大腸菌を形質転換
したものはＮＲＲＬ Ｂ−１５８６２として入手可能
） −−ｐＢＰｆ３Ｉは次の工程：ｐＹＪ８（寄託番号ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１５８８９）由来の０．６ＫｂｐのＥａｏ
ＲＩ−Ｐνｕｎ フラグメント（このフラグメントは
ピチアＨＩＳ４プロモーター配列を含む）をｐＢＰｆｌ
（寄託番号ＮＲＲＬＢ−１５８９２）のＥｃｏＲＩ−８
ｍａ１部位へ挿入し、得られたプラスミドｐＢＰｆ３を
ＰｓｔＩおよびＮｒｒｂＩで消化してｌａｃ Ｚ 配列
を含むフラグメントを分離し、このフラグメントｆｔ７
）ＹＭ４（ｐＢＲ３２２のＥａｒｎＨ１部位へ挿入され
たｐＹＪ８のＨＩＳ４含有ＢＱＩ■フラグメンＩｆ含む
）のＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＶ フラグメントと連結させて
第４図に示すプラスミドｐＢＰｆ３Ｉを作製することに
よりプラスミドｐＢＰｆ１から誘導される。
−−ｐＰＧ２．５（ｐＰＧ４．０から誘導可能＝ＮＲＲ
ＬＢ−１５８６８、以下で詳述する） 実施例！ ＡＯＸ１プロモーターの５′末端欠失物の作製プラスミ
ドｐＳＡＯＨ（第２図参照）３０μ２をＥｃｏＲｌで完
全消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。
ＬＢ−１５８６８、以下で詳述する） 実施例！ ＡＯＸ１プロモーターの５′末端欠失物の作製プラスミ
ドｐＳＡＯＨ（第２図参照）３０μ２をＥｃｏＲｌで完
全消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。
乾燥したＤＮＡ沈殿物を水（最終反応容量＝１００μｔ
）に溶解し、１．２単位のＢＡＬ３１を用いて２３℃で
消化した０１０μｔのアリコートを３分おきに４０ ｍ
ｕ ＥＧＴＡ１０μｔへ取り出し、フェノール抽出し、
エタノール沈殿させた。
）に溶解し、１．２単位のＢＡＬ３１を用いて２３℃で
消化した０１０μｔのアリコートを３分おきに４０ ｍ
ｕ ＥＧＴＡ１０μｔへ取り出し、フェノール抽出し、
エタノール沈殿させた。
各アリコートからの再溶解ＤＮＡ沈殿物を１単位のフレ
ノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼで処理して平
滑末端となし、Ｅ ｃ ｏ ＲＩリンカ−（５′−ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣ−３’） へ連結させ、Ｐｓｔｌおよび
ＥｃｏＲＩで完全消化して約９．０Ｋｂｐのベクターフ
ラグメントを得た。次いでこのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ消
化ＤＮＡをｐＢＲ３２２由来の７５０ｂｐＰｓｔ１−Ｅ
ｃｏＲ１フラグメントに連結させて、β−ラクタマーゼ
遺伝子を再生した。この連結ＤＮＡｆ用いて、７Ａ／１
０３を形質転換し、形質転換細胞はアンピシリン耐性に
ついて選択した。ｐｓＡＯＨ５のＢＡＬ３１消化アリコ
ートのそれぞれから誘導された個々の形質転換細胞のう
ち、Ｘ−ｇａｌ 指示薬平板上でβ−ガラクトシター
ゼについて試験したとき陽性を示すものを取り出し、微
量ＤＮＡ調裂法を用いてＡＯＸ１プロモーター中に新規
なりｃ。
ノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼで処理して平
滑末端となし、Ｅ ｃ ｏ ＲＩリンカ−（５′−ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣ−３’） へ連結させ、Ｐｓｔｌおよび
ＥｃｏＲＩで完全消化して約９．０Ｋｂｐのベクターフ
ラグメントを得た。次いでこのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ消
化ＤＮＡをｐＢＲ３２２由来の７５０ｂｐＰｓｔ１−Ｅ
ｃｏＲ１フラグメントに連結させて、β−ラクタマーゼ
遺伝子を再生した。この連結ＤＮＡｆ用いて、７Ａ／１
０３を形質転換し、形質転換細胞はアンピシリン耐性に
ついて選択した。ｐｓＡＯＨ５のＢＡＬ３１消化アリコ
ートのそれぞれから誘導された個々の形質転換細胞のう
ち、Ｘ−ｇａｌ 指示薬平板上でβ−ガラクトシター
ゼについて試験したとき陽性を示すものを取り出し、微
量ＤＮＡ調裂法を用いてＡＯＸ１プロモーター中に新規
なりｃ。
ＲＩ制限部位を含むプラスミドの存在について試、験し
た。ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶの混合物で完全消化するこ
とにより（第２図参照）、大腸菌１ａｃ Ｚ遺伝子に融
合したＡＯＸ１プロモーターの種々の長さを含むクロー
ンを同定した○これらのクローンの名称を以下に示す； 表 Ｉ ｐｓＡＯＨ５−９００→ＡＴＧ なしｐＢＡＺ３
−７０９→ＡＴＧ ５’ １９１ ｂｐｐＢＡＺ４
−４９９→ＡＴＧ ５’ ４０１ ｂｐｐＢＡＺ６ −
３７２→ＡＴＧ ５’ ５２８ ｈｐｐＢＡＺ７ −２
１６→ＡＴＧ ５’ ６８４ ｈｐｐＢＡＺ８ −１９
７→ＡＴＧ ５’ ７０３ ｂｐその後、これらの短縮
されたＡＯＸ１プロモーター配列を含むプラスミドを使
用して、既知方法〔フレラグ（ｃｒｅｙｃｔ） らの
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ
ｌｇｃｒｂｌａｒ ａｎｄ Ｃｓ−１Ｌｕ１ａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ） ５．３３７６−３３８５（１９８５）
を参照〕によりＰ、パストリス菌株Ｇ、Ｓ’ｌ１５を形
質転換し、形質転換細胞はＨｉｓ十表現型について選択
した。Ｈｉｓ＋形質転換細胞を種々の炭素源により増殖
させて、β−ガラクトシダーゼ産生について険定した（
表■参照）。
た。ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶの混合物で完全消化するこ
とにより（第２図参照）、大腸菌１ａｃ Ｚ遺伝子に融
合したＡＯＸ１プロモーターの種々の長さを含むクロー
ンを同定した○これらのクローンの名称を以下に示す； 表 Ｉ ｐｓＡＯＨ５−９００→ＡＴＧ なしｐＢＡＺ３
−７０９→ＡＴＧ ５’ １９１ ｂｐｐＢＡＺ４
−４９９→ＡＴＧ ５’ ４０１ ｂｐｐＢＡＺ６ −
３７２→ＡＴＧ ５’ ５２８ ｈｐｐＢＡＺ７ −２
１６→ＡＴＧ ５’ ６８４ ｈｐｐＢＡＺ８ −１９
７→ＡＴＧ ５’ ７０３ ｂｐその後、これらの短縮
されたＡＯＸ１プロモーター配列を含むプラスミドを使
用して、既知方法〔フレラグ（ｃｒｅｙｃｔ） らの
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ
ｌｇｃｒｂｌａｒ ａｎｄ Ｃｓ−１Ｌｕ１ａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ） ５．３３７６−３３８５（１９８５）
を参照〕によりＰ、パストリス菌株Ｇ、Ｓ’ｌ１５を形
質転換し、形質転換細胞はＨｉｓ十表現型について選択
した。Ｈｉｓ＋形質転換細胞を種々の炭素源により増殖
させて、β−ガラクトシダーゼ産生について険定した（
表■参照）。
辰 ■
ベクター 欠失 増 殖 増 殖ｐｓＡＯＨ５
なし １ １０００ｐＢＡイ３ ５’（１９
１ｂｐ） １ １０００ｐＢＡＺ４ ５’
（４０１ｂｐ） １ ５００ｐＢＡＺ６ ５
’ （５２８ｂｐ） １ ５００ｐＢＡＺ７
５’ （６８４ｂｐ） １５ １５０ｐＢ
ＡＺ８ ５’ （７０３６ｐ） １５ ４
０プラスミドｐＢＡＺ６およびｐＢＡＺ８は、ｐＥＡＺ
６がメタノール誘発−グルコース抑制配列の大部分を含
み、またｐＢＡＺ８がこれらの応答領域をほとんど欠失
しているといつ指示に基づいて、その後の研究のために
選択した。
なし １ １０００ｐＢＡイ３ ５’（１９
１ｂｐ） １ １０００ｐＢＡＺ４ ５’
（４０１ｂｐ） １ ５００ｐＢＡＺ６ ５
’ （５２８ｂｐ） １ ５００ｐＢＡＺ７
５’ （６８４ｂｐ） １５ １５０ｐＢ
ＡＺ８ ５’ （７０３６ｐ） １５ ４
０プラスミドｐＢＡＺ６およびｐＢＡＺ８は、ｐＥＡＺ
６がメタノール誘発−グルコース抑制配列の大部分を含
み、またｐＢＡＺ８がこれらの応答領域をほとんど欠失
しているといつ指示に基づいて、その後の研究のために
選択した。
実施例■
ＡＯＸ１プロモーターの３′末端欠失物の炸裂プラスミ
ドｐＰＧ２．５（第３図に示すｐＰＧ４．０の約２．５
Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ−ｇａｌｌフラグメントを含むｐＢ
Ｒ３２２由来のプラスミド）１８μグｆ Ｂ ａ ｍＨ
Ｉで完全消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿さ
せた。溶解したＤＮＡ沈殿物（最終反応容量＝１００μ
ｔ）は１．２単位のＢＡＬ３１を用いて２３℃で消化し
、１０μｔのアリコートを１０ Ａｔの４０ｍＭ Ｅ
ＧＴＡに３分おきに取り出し、フェノール抽出し、エタ
ノール沈殿させた。
ドｐＰＧ２．５（第３図に示すｐＰＧ４．０の約２．５
Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ−ｇａｌｌフラグメントを含むｐＢ
Ｒ３２２由来のプラスミド）１８μグｆ Ｂ ａ ｍＨ
Ｉで完全消化し、フェノール抽出し、エタノール沈殿さ
せた。溶解したＤＮＡ沈殿物（最終反応容量＝１００μ
ｔ）は１．２単位のＢＡＬ３１を用いて２３℃で消化し
、１０μｔのアリコートを１０ Ａｔの４０ｍＭ Ｅ
ＧＴＡに３分おきに取り出し、フェノール抽出し、エタ
ノール沈殿させた。
各アリコートからの再溶解したＤＮＡ沈殿物を１単位の
フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端となし
、ＥｃｏＲＩリンカ−に連結し、そして大腸菌株ＨＢ１
０１’ｔアンピシリン耐性へ形質転換するために使用し
た。ｐＰＧ２．５のＢＡＬ３１消化アリコートのそれぞ
れから誘導された個々の形質転換細胞を取り出し、微量
ＤＮＡ調製法を用いてＡＯＸ１プロモーター中に新規の
Ｅｃ。
フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端となし
、ＥｃｏＲＩリンカ−に連結し、そして大腸菌株ＨＢ１
０１’ｔアンピシリン耐性へ形質転換するために使用し
た。ｐＰＧ２．５のＢＡＬ３１消化アリコートのそれぞ
れから誘導された個々の形質転換細胞を取り出し、微量
ＤＮＡ調製法を用いてＡＯＸ１プロモーター中に新規の
Ｅｃ。
ＲＩ制限部位を含むプラスミドの存在について試験した
。
。
ＡＯＸＩ ＡＴＧの上流の２６４．３４７．４４５．５
３２．５４２および６９４ヌクレオチドに対応するＡＯ
Ｘ１プロモーター内の位置に新規ＥｃｏＲＩ制限部位が
存在するプラスミドを単離し、それぞれｐＰＧ２．５ム
４、Δ５、△７、Δ１０、Δ１２およびΔ１１と命名し
、その後ＥｃｏＲＩで消化した。
３２．５４２および６９４ヌクレオチドに対応するＡＯ
Ｘ１プロモーター内の位置に新規ＥｃｏＲＩ制限部位が
存在するプラスミドを単離し、それぞれｐＰＧ２．５ム
４、Δ５、△７、Δ１０、Δ１２およびΔ１１と命名し
、その後ＥｃｏＲＩで消化した。
これらの消化はそれぞれ約１１８６．１１０３．１００
５．９１８．９０８および７５６塩基対の新規ＥｃｏＲ
Ｉフラグメントをもたらした。これらのＥｃｏＲＩフラ
グメン）（ＢＡＺ、３１突然変異誘発後に挿入されたＥ
ｃｏＲＩ’）ンカーの上流にＡＯＸ１プロモーターの部
分が存在する）を単離してエタノール沈殿させた。
５．９１８．９０８および７５６塩基対の新規ＥｃｏＲ
Ｉフラグメントをもたらした。これらのＥｃｏＲＩフラ
グメン）（ＢＡＺ、３１突然変異誘発後に挿入されたＥ
ｃｏＲＩ’）ンカーの上流にＡＯＸ１プロモーターの部
分が存在する）を単離してエタノール沈殿させた。
ｌαｃＺ融合プラスミドを用いて形質転換したピチア酵
母の増殖 形質転換コロニーヲ採取して、ＳＤ平板上で画線培養を
行った。画線培養からの単一コロニーを５〇−振と５フ
ラスコ中のＹＮＢ培地１５ｍ＋２％グリセロールに接種
し、２５′Ｏｒｐｍ、３０℃で一晩振とうした。２４時
間後の培養物の０Ｄ６ｏＯは２〜３であった。
母の増殖 形質転換コロニーヲ採取して、ＳＤ平板上で画線培養を
行った。画線培養からの単一コロニーを５〇−振と５フ
ラスコ中のＹＮＢ培地１５ｍ＋２％グリセロールに接種
し、２５′Ｏｒｐｍ、３０℃で一晩振とうした。２４時
間後の培養物の０Ｄ６ｏＯは２〜３であった。
Ｙ Ｎ Ｂ−メタノール増殖については、１０Ｄ、ｏ。
の培養物を振と５フラスコから抜き取り、ＩＥＣ遠心分
離機を用いて２０００ Ｘｆ 、室温で７分間遠心した
。この沈殿細胞を滅菌水で１回洗浄し、５０づ振と５フ
ラスコ中のＹＮＥ培地＋０．５％メタノールに再懸濁し
た（ ０Ｄａａｏ＝ ０．０５ ）。この培養物を２５
Ｏｒｐｍ、３０℃で１６〜２０時間イ・ンキユベートし
、その時点の０Ｄ６ｏＯは０．３〜０．５であった。
離機を用いて２０００ Ｘｆ 、室温で７分間遠心した
。この沈殿細胞を滅菌水で１回洗浄し、５０づ振と５フ
ラスコ中のＹＮＥ培地＋０．５％メタノールに再懸濁し
た（ ０Ｄａａｏ＝ ０．０５ ）。この培養物を２５
Ｏｒｐｍ、３０℃で１６〜２０時間イ・ンキユベートし
、その時点の０Ｄ６ｏＯは０．３〜０．５であった。
ＹＮＢ−グルコース増殖については、０．２０ Ｄ６Ｇ
。
。
の培養物をグリ七ロール振と５フラスコから抜き取り、
５〇−振と５フラスコ中のＹＮＥ培地２〇−＋２％グル
コースに直接に接種した（□Ｄａｏｏ＝０．０１）。こ
の培養物を２５０デｐ惧、３０℃で１６〜２０時間イン
キュベートし、その時点の０Ｄ６ｏＯは０．３〜０．５
であった。
５〇−振と５フラスコ中のＹＮＥ培地２〇−＋２％グル
コースに直接に接種した（□Ｄａｏｏ＝０．０１）。こ
の培養物を２５０デｐ惧、３０℃で１６〜２０時間イン
キュベートし、その時点の０Ｄ６ｏＯは０．３〜０．５
であった。
グルコースまたはメタノール培地上で増殖したピチア酵
母のβ−ガラクトシダーゼ検定 メタノール増殖細胞の検定については、０Ｄ６００＝０
．１に相当する容量の培養物を抜き取り、ＤＹＮＡＣ臨
床遠心分離機を用いて最高速度（３３５０ｒｐｍ）で室
温において５分間遠心した。
母のβ−ガラクトシダーゼ検定 メタノール増殖細胞の検定については、０Ｄ６００＝０
．１に相当する容量の培養物を抜き取り、ＤＹＮＡＣ臨
床遠心分離機を用いて最高速度（３３５０ｒｐｍ）で室
温において５分間遠心した。
グルコース増殖細胞の検定の場合は、０Ｄ６００＝０．
５に相当する容量の培養物を抜き取って、上記のように
遠心した。
５に相当する容量の培養物を抜き取って、上記のように
遠心した。
細胞沈殿物を水で１回洗い、Ｚ緩衝液１−中に再懸濁し
た。得られた懸濁液にＣｕＯ２３０μｔおよび０．１％
５ＤＳ３０μｔを加えてポルテックス混合し、３０℃で
５分間インキュベートした。
た。得られた懸濁液にＣｕＯ２３０μｔおよび０．１％
５ＤＳ３０μｔを加えてポルテックス混合し、３０℃で
５分間インキュベートした。
この反応は２００μｔの予め温めておいた０−二トロフ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４ｍ９／ｙ）（
シグマ社）を添加して開始させ、ポルテックス混合し、
反応液が黄色を呈するまで２〜２０分間インキュベート
した。１、ＯＭＮα、ＣＯ。
ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４ｍ９／ｙ）（
シグマ社）を添加して開始させ、ポルテックス混合し、
反応液が黄色を呈するまで２〜２０分間インキュベート
した。１、ＯＭＮα、ＣＯ。
溶液０．５−を添加して反応を停止させ、細胞を沈殿さ
せ、そして上清のＯＤ、２０を測定した。β−ガラクト
シダーゼの単位は次式： により計算した。
せ、そして上清のＯＤ、２０を測定した。β−ガラクト
シダーゼの単位は次式： により計算した。
Ａ、自律的プラスミドｐＢＡＺ８０１−８０５およびｐ
ＢＡＺ６０１−６０４の作製 プラスミドｐＥＡＺ６およびｐＢＪＶ１８をＥｃ。
ＢＡＺ６０１−６０４の作製 プラスミドｐＥＡＺ６およびｐＢＪＶ１８をＥｃ。
ＲＩで完全消化し、上記実施例■で単離したＥＣ。
ＲＩフラグメントに連結し、そして大腸菌株ＨＢ１０１
をアンピシリン耐性へ形質転換するために使用した。形
質転換細胞を微量ＤＮＡ調裂決裂法り新規ＥｃｏＲＩフ
ラグメントの存在について分析し、その後Ｐｓｔｌで消
化してそのプラスミド中でのｇ６ｏＲ１フラグメントの
向きがｐＰＧ２．５のそれに一致することを確かめた０
適当な向きでＥｃ。
をアンピシリン耐性へ形質転換するために使用した。形
質転換細胞を微量ＤＮＡ調裂決裂法り新規ＥｃｏＲＩフ
ラグメントの存在について分析し、その後Ｐｓｔｌで消
化してそのプラスミド中でのｇ６ｏＲ１フラグメントの
向きがｐＰＧ２．５のそれに一致することを確かめた０
適当な向きでＥｃ。
Ｒ１フラグメントを含むｐＥＡＺ８およびｐＥＡＺ６の
連結生成物のプラスミドの名称を下記の表■に示す。
連結生成物のプラスミドの名称を下記の表■に示す。
表 ■
ｐＥＡＺ ８０１ １１８６ −２６４−）１９７８０
２ １１０３ −３４７−＞１９７８０３ １００５
−４４５−＞１９７８０５ ９１８ −５３２−＞１９
７ ６０４ １００５ −４４５−＞３７２６０１ ９１８
−５３２−＞３７２ これらのプラスミドを用いてＰ、パストリス菌株Ｇ５１
１５を形質転換し、Ｈｉｓ＋形質転換細胞をＹＮＢ−グ
ルコース９はＹＮＢ−メタノール培地で増殖させ、β−
ガラクトシダーゼについて検定した。検定結果を表■に
示す。
２ １１０３ −３４７−＞１９７８０３ １００５
−４４５−＞１９７８０５ ９１８ −５３２−＞１９
７ ６０４ １００５ −４４５−＞３７２６０１ ９１８
−５３２−＞３７２ これらのプラスミドを用いてＰ、パストリス菌株Ｇ５１
１５を形質転換し、Ｈｉｓ＋形質転換細胞をＹＮＢ−グ
ルコース９はＹＮＢ−メタノール培地で増殖させ、β−
ガラクトシダーゼについて検定した。検定結果を表■に
示す。
表 ｌＮ
ｐ５ＡＯＨ５なし ｌ １０００ｐＢＡＺ８
０１ １９７−２６４ ３ ５００ｐ
ＥＡＺ８０２ １９７−３４７ １
１５０ｐＢＡＺ８０３ １９７−４４５
１ １４０ｐＢＡｚ８ｏ５ １９７−５３
２ １ １５０ｐＥＡＺ８０４ １
９７−６９４ １０ １００ｐＢＡＺ６
０４ ３７２−４４５ １ １０００
ｐＢＡＺ６０１ ３７２−５３２ １
５００ｐＢＡＺ６０３ ３７２−５４２
１ ８００ｐＢＡＺ６０２ ３７２−
６９４ １ ６００ｐＢＡＺ８０
１における欠失は発現を野生型の５０％に低下させ、一
方ｐＢＡＺ８０２における欠失は発現を野生型のたった
１５％に低下させたという観察に基づくと、−３７２と
−１９７の間の配列バー ２６４と−１９７の間に弱い
メタノール応答性領域を含み、−３４７と−２６４の間
に強いメタノール応答性領域を含むと結論づけることが
できた０さらに、有意な程度のグア・レコース抑制配列
が−３４７の上流に存在する。
０１ １９７−２６４ ３ ５００ｐ
ＥＡＺ８０２ １９７−３４７ １
１５０ｐＢＡＺ８０３ １９７−４４５
１ １４０ｐＢＡｚ８ｏ５ １９７−５３
２ １ １５０ｐＥＡＺ８０４ １
９７−６９４ １０ １００ｐＢＡＺ６
０４ ３７２−４４５ １ １０００
ｐＢＡＺ６０１ ３７２−５３２ １
５００ｐＢＡＺ６０３ ３７２−５４２
１ ８００ｐＢＡＺ６０２ ３７２−
６９４ １ ６００ｐＢＡＺ８０
１における欠失は発現を野生型の５０％に低下させ、一
方ｐＢＡＺ８０２における欠失は発現を野生型のたった
１５％に低下させたという観察に基づくと、−３７２と
−１９７の間の配列バー ２６４と−１９７の間に弱い
メタノール応答性領域を含み、−３４７と−２６４の間
に強いメタノール応答性領域を含むと結論づけることが
できた０さらに、有意な程度のグア・レコース抑制配列
が−３４７の上流に存在する。
８３組込みプラスミドｐＥＡＺ８０１１−８０５１およ
びｐＢＡＺ６０１１−６０４１の作製プラスミドｐＢＡ
Ｚ６およびｐＢＡＺ８をＢｇｌ’Ｊで完全消化し、フレ
ノウＤＮＡポリメラーゼで処理してＢＱｌ■部位を破壊
踵 リガーゼを用℃・て再環化し、そして大腸菌株ＨＢ
１０１ｅアンピシリン耐性へ形質転換するために使用し
た。得られたプラスミドｐＢＡＺ６△ＢｇｌＵおよびｐ
ＢＡＺ８△ＢＱｔ’ＪはＥｃ ｏ Ｒ１で完全消化し、
実施例■で単離したＥｃｏＲＩフラグメントに連結し、
そして大腸菌株ＨＢ１０１をアンピシリン耐性へ形質転
換するために使用した０
びｐＢＡＺ６０１１−６０４１の作製プラスミドｐＢＡ
Ｚ６およびｐＢＡＺ８をＢｇｌ’Ｊで完全消化し、フレ
ノウＤＮＡポリメラーゼで処理してＢＱｌ■部位を破壊
踵 リガーゼを用℃・て再環化し、そして大腸菌株ＨＢ
１０１ｅアンピシリン耐性へ形質転換するために使用し
た。得られたプラスミドｐＢＡＺ６△ＢｇｌＵおよびｐ
ＢＡＺ８△ＢＱｔ’ＪはＥｃ ｏ Ｒ１で完全消化し、
実施例■で単離したＥｃｏＲＩフラグメントに連結し、
そして大腸菌株ＨＢ１０１をアンピシリン耐性へ形質転
換するために使用した０
第１図はピチア由来の第１アルコールオキシダーゼ遺伝
子（ＡＱｌ’ｌ）の５′領域の制限地図であり； 第２図はプラスミドｐｓＡＯＨ５の制限地図であり； 第３図はｐＢＲ３２２由来のプラスミドであるｐＰＧ２
．５の酩母挿入物の制限地図であり；第４図はプラスミ
ドｐＢＰｆ３Ｉの制限地図であり；そして 第５図は実施例で論じたベクター作製の工程ｊ１頁序を
示す図である。 （外５名） ５・
３′ＦＩＱ、 Ｉ ＦＩＧ、 ３ 手続補正占（オ残） ２０発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 フィリップス・ペトロリウム・カンパニー新
大手町ピル ２０６＠室
子（ＡＱｌ’ｌ）の５′領域の制限地図であり； 第２図はプラスミドｐｓＡＯＨ５の制限地図であり； 第３図はｐＢＲ３２２由来のプラスミドであるｐＰＧ２
．５の酩母挿入物の制限地図であり；第４図はプラスミ
ドｐＢＰｆ３Ｉの制限地図であり；そして 第５図は実施例で論じたベクター作製の工程ｊ１頁序を
示す図である。 （外５名） ５・
３′ＦＩＱ、 Ｉ ＦＩＧ、 ３ 手続補正占（オ残） ２０発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 フィリップス・ペトロリウム・カンパニー新
大手町ピル ２０６＠室
Claims (27)
- （１）少なくとも次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 またはその機能的均等物から成るＤＮＡフラグメントで
あり、宿主内に自律的要素として保持され、該ＤＮＡフ
ラグメントを保有する宿主が生育する培地中のメタノー
ルの存在に応答するＤＮＡフラグメント。 - （２）ポリペプチドコード領域をさらに含み、前記ＤＮ
Ａフラグメントはポリペプチドコード領域の５′末端に
位置づけられる、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡフ
ラグメント。 - （３）ポリペプチドコード領域の下流にＤＮＡの３′配
列をさらに含み、該ＤＮＡの３′配列はポリペプチドコ
ード領域によつてコードされるメッセンジャーＲＮＡの
ポリＡ化、転写終止および翻訳終止を制御することがで
きる、特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡフラグメント
。 - （４）細菌プラスミドＤＮＡ）バクテリオファージＤＮ
Ａ、酵母プラスミドＤＮＡおよび酵母染色体ＤＮＡより
成る群から誘導される１つまたはそれ以上の追加のＤＮ
Ａ配列をさらに含む、特許請求の範囲第１〜３項のいず
れか１項に記載のＤＮＡフラグメント。 - （５）酵母染色体ＤＮＡは自律的に複製するＤＮＡ配列
およびマーカー遺伝子を含む、特許請求の範囲第４項記
載のＤＮＡフラグメント。 - （６）閉環状ハイブリッドプラスミドの形である、特許
請求の範囲第５項記載のＤＮＡフラグメント。 - （７）特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載のＤ
ＮＡフラグメントのための宿主が酵母菌株である形質転
換酵母菌株。 - （８）少なくとも次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 またはその機能的均等物から成るＤＮＡフラグメントで
あり、宿主のゲノム内に組み込まれて、該ＤＮＡフラグ
メントを保有する宿主が生育する培地中のメタノールの
存在に応答するＤＮＡフラグメント。 - （９）ポリペプチドコード領域をさらに含み、前記ＤＮ
Ａフラグメントはポリペプチドコード領域の５′末端に
位置づけられる、特許請求の範囲第８項記載のＤＮＡフ
ラグメント。 - （１０）ポリペプチドコード領域の下流にＤＮＡの３′
配列をさらに含み、該ＤＮＡの３′配列はポリペプチド
コード領域によつてコードされるメッセンジャーＲＮＡ
のポリＡ化、転写終止および翻訳終止を制御することが
できる、特許請求の範囲第９項記載のＤＮＡフラグメン
ト。 - （１１）細菌プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤ
ＮＡ、酵母プラスミドＤＮＡおよび酵母染色体ＤＮＡよ
り成る群から誘導される１つまたはそれ以上の追加のＤ
ＮＡ配列をさらに含む、特許請求の範囲第８〜１０項の
いずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。 - （１２）酵母染色体ＤＮＡはマーカー遺伝子を含む、特
許請求の範囲第１１項記載のＤＮＡフラグメント。 - （１３）酵母染色体ＤＮＡは自律的に複製するＤＮＡ配
列を含む、特許請求の範囲第１１項記載のＤＮＡフラグ
メント。 - （１４）宿主ゲノム内に組み込まれる以前は閉環状ハイ
ブリッドプラスミドの形をしている、特許請求の範囲第
８〜１３項のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント
。 - （１５）線状フラグメントである、特許請求の範囲第８
〜１３項のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント。 - （１６）特許請求の範囲第１１〜１５項のいずれかに記
載のＤＮＡフラグメントのための宿主が酵母菌株である
形質転換酵母菌株。 - （１７）少なくとも次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 またはその機能的均等物から成るＤＮＡフラグメントで
あり、該ＤＮＡフラグメントは上流アクチベーター配列
の性質を有し、その下流に配置された異種プロモーター
ヌクレオチド配列に、メタノールの存在により誘発され
る能力とカタボライト抑制炭素源の存在により抑制され
る能力を付与することができる上記ＤＮＡフラグメント
。 - （１８）ポリペプチドコード領域をさらに含み、上記Ｄ
ＮＡフラグメントは該ポリペプチドコード領域の５′末
端に位置づけられる、特許請求の範囲第１７項記載のＤ
ＮＡフラグメント。 - （１９）ポリペプチドコード領域の下流にＤＮＡの３′
配列をさらに含み、該ＤＮＡの３′配列はポリペプチド
コード領域によつてコードされるメッセンジャーＲＮＡ
のポリＡ化、転写終止および翻訳終止を制御することが
できる、特許請求の範囲第１８項記載のＤＮＡフラグメ
ント。 - （２０）細菌プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤ
ＮＡ、酵母プラスミドＤＮＡおよび酵母染色体ＤＮＡよ
り成る群から誘導される１つまたはそれ以上の追加のＤ
ＮＡ配列をさらに含む、特許請求の範囲第１８または１
９項に記載のＤＮＡフラグメント。 - （２１）酵母染色体ＤＮＡはマーカー遺伝子を含む、特
許請求の範囲第２０項記載のＤＮＡフラグメント。 - （２２）酵母染色体ＤＮＡは自律的に複製する配列を含
む、特許請求の範囲第２０項記載のＤＮＡフラグメント
。 - （２３）宿主ゲノム内に組み込まれる以前は閉環状ハイ
ブリットプラスミドの形をしている、特許請求の範囲第
１９〜２２項のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメン
ト。 - （２４）線状フラグメントである、特許請求の範囲第１
９〜２２項のいずれか１項に記載のＤＮＡフラグメント
。 - （２５）特許請求の範囲第１９〜２４項のいずれかに記
載のＤＮＡフラグメントのための宿主が酵母菌株である
形質転換酵母菌株。 - （２６）組み込まれた調節領域のメタノールの存在に対
する応答性を制御する方法であつて、少なくとも次のヌ
クレオチド： 【遺伝子配列があります】 を、発現すべきコード領域の上流に位置づけられるメタ
ノール応答性調節領域として使用してわずかなメタノー
ル応答性を得、その上流に次のヌクレオチド： 【遺伝子配列があります】 を次第に増してより高度のメタノール応答性を得ること
からなり、その際最高のメタノール応答は上記ヌクレオ
チドをすべて使用するとき得られ、そして異なる程度の
メタノール応答は下記の応答表： ￥ヌクレオチド配列￥ ￥メタノール誘発％￥ ０−１９７ ５ ０−１９７プラス３４７−３７２ ５ ０−１９７プラス２６４−３７２ ２５ ０−３７２ １００ に従つて後者のヌクレオチド配列から誘導される中間数
のヌクレオチドを使用するときに得られることを特徴と
する上記のメタノール応答性の制御方法。 - （２７）自律的調節領域のメタノールの存在に対する応
答性を制御する方法であつて、少なくとも次のヌクレオ
チド： 【遺伝子配列があります】 を調節領域として使用してわずかなメタノール応答性を
得、その上流に次のヌクレオチド： 【遺伝子配列があります】 を次第に増してより高度のメタノール応答性を得ること
からなり、その際最高のメタノール応答は上記ヌクレオ
チドのすべてを使用するときに得られ、そして異なる程
度のメタノール応答は下記の表： ￥ヌクレオチド配列￥ ￥メタノール誘発％￥ ０−１９７ ４ ０−２１６ １３ ０−３７２ ５０ ０−４９９ ５０ ０−７０９ １００ に従つて後者のヌクレオチド配列から誘導される中間数
のヌクレオチドを使用するときに得られることを特徴と
する上記のメタノール応答性の制御方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US83984586A | 1986-03-14 | 1986-03-14 | |
| US839845 | 1986-03-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6339584A true JPS6339584A (ja) | 1988-02-20 |
Family
ID=25280770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62055114A Pending JPS6339584A (ja) | 1986-03-14 | 1987-03-10 | メタノ−ルおよびグルコ−ス応答性ｄｎａフラグメント |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0244598A1 (ja) |
| JP (1) | JPS6339584A (ja) |
| CN (1) | CN87101797A (ja) |
| AU (1) | AU608214B2 (ja) |
| DK (1) | DK130987A (ja) |
| IL (1) | IL81817A0 (ja) |
| NO (1) | NO871038L (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002519067A (ja) * | 1998-07-03 | 2002-07-02 | リサーチ コーポレイション テクノロジーズ，インコーポレイテッド | メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5989870A (en) * | 1986-04-30 | 1999-11-23 | Rohm Enzyme Finland Oy | Method for cloning active promoters |
| US5614395A (en) * | 1988-03-08 | 1997-03-25 | Ciba-Geigy Corporation | Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof |
| US5789214A (en) * | 1988-03-08 | 1998-08-04 | Novartis Finance Corporation | Method of inducing gene transcription in a plant |
| CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
| JPH06209763A (ja) * | 1993-01-13 | 1994-08-02 | Green Cross Corp:The | 変異株 |
| US5851766A (en) * | 1995-05-31 | 1998-12-22 | Novartis Finance Corporation | Process for isolating chemically regulatable DNA sequences |
| WO2001077351A1 (en) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Vectors and methods for dual protein expression in pichia pastoris and escherichia coli |
| MXPA03009059A (es) * | 2001-04-05 | 2004-10-15 | Univ Nebraska | Secuencias de nucleotidos reguladoras de alcohol oxidasa 1 para expresion de genes heterologos en levadura. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
-
1987
- 1987-03-08 IL IL81817A patent/IL81817A0/xx unknown
- 1987-03-10 JP JP62055114A patent/JPS6339584A/ja active Pending
- 1987-03-10 CN CN198787101797A patent/CN87101797A/zh active Pending
- 1987-03-10 AU AU69851/87A patent/AU608214B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-03-12 EP EP87103603A patent/EP0244598A1/en not_active Withdrawn
- 1987-03-13 NO NO871038A patent/NO871038L/no unknown
- 1987-03-13 DK DK130987A patent/DK130987A/da not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002519067A (ja) * | 1998-07-03 | 2002-07-02 | リサーチ コーポレイション テクノロジーズ，インコーポレイテッド | メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL81817A0 (en) | 1987-10-20 |
| AU608214B2 (en) | 1991-03-28 |
| NO871038L (no) | 1987-09-15 |
| NO871038D0 (no) | 1987-03-13 |
| DK130987D0 (da) | 1987-03-13 |
| DK130987A (da) | 1987-09-15 |
| CN87101797A (zh) | 1987-10-21 |
| AU6985187A (en) | 1987-09-17 |
| EP0244598A1 (en) | 1987-11-11 |
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