JP2002519067A

JP2002519067A - メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子

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Publication number: JP2002519067A
Application number: JP2000558219A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズエム．クレッグ、
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2002-07-02
Anticipated expiration: 2019-07-02
Also published as: DK1095150T3; EP1095150B1; WO2000001829A9; IL140553A0; DE69929885T2; DE69929885D1; ATE317902T1; AU762727B2; WO2000001829A3; CA2331765A1; IL140553A; AU4966699A; WO2000001829A2; CA2331765C; JP4511728B2; EP1095150A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ）を提供する。ＦＬＤ構造遺伝子は、ホルムアルデヒドに対する耐性を付与し、それ故、メチロトローフ酵母の選択マーカーとして有用である。ＦＬＤプロモーター配列は、唯一の炭素源としてのメタノール（窒素源としての硫酸アンモニウムと共に）または唯一の窒素源としてのメチルアミン（炭素源としてのグルコースと共に）により強力かつ独立的に誘導される。メタノール、メチルアミンまたは両方下での誘導は、一般的に使用されるアルコールオキシダーゼＩ遺伝子プロモーター（Ｐ _ＡＯＸ１）で得られるものと同等の異種遺伝子発現レベルを提供する。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ _ＦＬＤ１）のＦＬＤプロモーターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでの外来遺伝子発現用のＰ _ＡＯＸ１の魅力的な代替物であり、同発現株内での炭素（メタノール）または窒素（メチルアミン）源による調節を可能とする。ＦＬＤ遺伝子プロモーターおよび３’終結配列を含む、酵母株、発現カセット、発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）Ｐｉｃｈｉａは、工業的および学術的関心の高い異種タンパク質の産生に広く
使用されるメチロトローフ酵母である（Ｃｒｅｇｇ、１９９８；Ｈｉｇｇｉｎｓ
およびＣｒｅｇｇ、１９８８）。ＦＬＤは、炭素およびエネルギー源としてのメ
タノールの利用に重要な酵素である（Ｖｅｅｎｈｕｉｓら、１９８３）。メチロ
トローフ酵母では、メタノール代謝経路は、ほぼ同一であると考えられ、ペルオ
キシソームと呼ばれる細胞小器官に隔離された過酸化水素産生オキシダーゼのア
ルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）によるメタノールのホルムアルデヒドへの酸化
で開始される。次いで、過酸化水素は、古典的ペルオキシソームマーカー酵素の
カタラーゼにより、酸素および水に分解される。得られたホルムアルデヒドの一
部が、キシルロース−５’−１リン酸と、第三のペルオキシソームメタノール経
路酵素である、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＡＳ）により触媒される反
応で縮合する。この反応の生成物のグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）
およびジヒドロキシアセトンは、次いで、ペルオキシソームを出て、キシルロー
ス−５’−１リン酸を再生し、また３回のサイクル毎に正味１分子のＧＡＰも産
生する回路に入る。ＧＡＰは、細胞増殖のための炭素骨格の生合成に使用される
。別の部分のホルムアルデヒドはペルオキシソームを出て、ホルムアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼ（ＦＬＤ）により蟻酸に酸化され、次いで、蟻酸デヒドロゲナー
ゼ（ＦＤＨ）により二酸化炭素に酸化される。これらの両方の反応が、ＮＡＤＨ
形の還元力を産生する。ＦＬＤ機能の１つのモデルは、ＦＬＤおよびＦＤＨによ
り産生されたＮＡＤＨが、メタノール上での増殖中の基本的なエネルギー源とし
て作用する（Ｖｅｅｎｈｕｉｓら、１９８３）。第二モデルは、メタノール増殖
のためのほとんどのエネルギーは、ＴＣＡ回路の酵素による、１つ以上のキシル
ロース−５’−１リン酸サイクル中間体の酸化から生じること、およびＦＬＤの
基本的役割は、培地中の過剰のメタノールと共に蓄積する毒性ホルムアルデヒド
から細胞を保護することであることを提唱する（Ｓｉｂｉｒｎｙら、１９９０）
。

【０００２】メタノールに加えて、ＦＬＤはまた、唯一の窒素源としてのあるメチル化アミ
ン（例えばメチルアミンおよびコリン）の代謝にも関与している（Ｚｗａｒｔら
、１９８０）。この経路では、アミン基が、最初にペルオキシソームアミンオキ
シダーゼにより遊離され、ホルムアルデヒドを放出し、これはさらにＦＬＤおよ
びＦＤＨにより酸化される。唯一の窒素源としてのメチルアミン上で増殖させる
と、高レベルのＦＬＤが過剰のグルコースの存在下でさえ誘導される。従って、
メチルアミン代謝におけるＦＬＤの基本的な役割は、ホルムアルデヒドの毒性作
用から細胞を保護することであって、炭素またはエネルギーを産生することでは
ないようである。

【０００３】ＦＬＤ合成は、唯一の炭素源およびエネルギー源としてのメタノールまたは唯
一の窒素源としてのメチルアミンに対する応答において独立的に調節されている
。従って、例えば、グルコースおよびアンモニウムイオン含有培地上で増殖して
いる細胞でのみ低いレベルのＦＬＤが観察され、一方、メタノール−アンモニウ
ムイオンまたはグルコース−メチルアミン培地上では、ＦＬＤレベルは高い。

【０００４】Ｐｉｃｈｉａ系では、ほとんどの外来遺伝子が、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓアルコ
ールオキシダーゼ１遺伝子プロモーター（Ｐ _ＡＯＸ１）の転写調節下で発現され
、その調節特徴は、この目的によく適している。このプロモーターは、グルコー
ス、グリセロール、またはエタノールなどのほとんどの一般的な炭素源上での酵
母の増殖中には堅く抑制されているが、メタノール上での増殖中は高度に誘導さ
れている（Ｔｓｃｈｏｐｐら、１９８７；Ｓｔｒｏｍａｎ，Ｄ．Ｗ．らの米国特
許第４，８５５，２３１号）。外来タンパク質の産生のために、Ｐ _ＡＯＸ１制御
発現株を、最初に抑制炭素源上で増殖させてバイオマスを産生させ、次いで、唯
一の炭素およびエネルギー源としてのメタノールに切り替え、外来遺伝子の発現
を誘導する。Ｐ _ＡＯＸ１調節系の１つの利点は、遺伝子発現産物が細胞に毒性で
ある外来遺伝子で形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株を、抑制条件下で増殖さ
せることにより維持できることである。

【０００５】多くのタンパク質が、Ｐ _ＡＯＸ１を使用して成功裡に産生されてきたが、この
プロモーターは、全ての設定で適切または簡便であるわけではない。例えば、振
盪フラスコ培養物では、メタノールは急速に蒸発し、メタノール濃度を監視し、
化合物を繰返し培地に加えることは不便である。さらに、大量で高密度の発酵層
培養物中でのＰ _ＡＯＸ１制御発現株の増殖および誘導に必要な大量のメタノール
の貯蔵は、火事の危険性がある。それ故、転写的に効率的で、かつより揮発性お
よび可燃性の低い誘導物質により調節可能なＰ _ＡＯＸ１に替わるプロモーターが
必要である。本発明は、両方の特性を有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨａｎ
ｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子
（ＦＬＤ）プロモーターを提供する。

【０００６】さらに、抗生物質耐性遺伝子である選択マーカー以外の、メチロトローフ酵母
で機能する選択マーカーが必要である。現在、Ｚｅｏ ^Ｒ遺伝子のみを、その遺伝
子型に関係なくＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に形質転換するのに使用できる。さらに
、Ｚｅｏ ^Ｒは、複数のコピーの発現ベクターを受容するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株
を直接選択（選択培地中のゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）の濃度を増加させることに
より）するために使用できる唯一の遺伝子である。抗生物質Ｇ４１８に耐性を付
与する第二の遺伝子（Ｇ４１８ ^Ｒ）を使用して、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの複数コ
ピー発現株をスクリーニングできるが、その使用には、栄養要求性／生合成遺伝
子選択マーカーも形質転換体を選択するためにベクターに含めなければならない
ことが要求される。本発明のＦＬＤ構造遺伝子は、メチロトローフ酵母細胞で選
択マーカーとして使用し得、抗生物質に対する耐性は付与しない。

【０００７】（発明の概要）本発明は、メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝
子（ＦＬＤ）を含む単離核酸配列に関する。本発明の１つの実施形態において、
単離核酸は、低ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号５に示した
ヌクレオチド配列、または配列番号１または５に示した配列に相補的な配列の少
なくとも１つにハイブリッド化する配列を含む。

【０００８】図７に示した制限地図を有するＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＦＬＤ
遺伝子（ＦＬＤ１）および図１０の斜交平行線模様領域に示した制限地図を有す
るＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤ遺伝子も提供される
。

【０００９】本発明の１つの実施形態において、配列番号５に示したヌクレオチド配列と比
較すると、約７０％から約８５％の配列相同性をもつコード配列を有するメチロ
トローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸が提供される。本発明の別の実
施形態において、配列番号５に示したヌクレオチド配列と比較すると、約８５％
から約９５％の配列相同性もつコード配列を有するメチロトローフ酵母由来のＦ
ＬＤ遺伝子を含む単離核酸が提供される。さらに別の実施形態において、配列番
号５に示したヌクレオチド配列と比較すると、約９５％以上の配列相同性もつコ
ード配列を有するメチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸が提供
される。配列番号１または配列番号５に示した配列を含む単離核酸も提供される
。

【００１０】本発明はまた、ＦＬＤプロモーターを含むメチロトローフ酵母由来の単離核酸
も提供する。このプロモーターは、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌク
レオチド配列と比較すると、約７０％から約８５％の配列相同性をもつコード配
列を有するＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置する。別の実施形態にお
いて、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較すると、
約８５％から約９５％の配列相同性もつコード配列を有するＦＬＤ遺伝子由来のＦＬＤプロモーターを含むメチロトローフ酵母由来の単離核酸が提供される。好
ましい実施形態において、プロモーターは、配列番号５に示したＦＬＤコード配
列のヌクレオチド配列と比較すると、約９５％以上の配列相同性もつコード配列
を有するＦＬＤ遺伝子由来である。特に例示されるのは、配列番号３に示される
配列を含むＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１プロモーターである。

【００１１】また本発明により、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離
核酸が提供される。３’終結配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌ
クレオチド配列と比較すると、約７０％から約８５％の配列相同性をもつコード
配列を有するＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流に位置する。本発明の別の実
施形態において、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比
較すると、約８５％から約９５％の配列相同性もつコード配列を有する遺伝子由
来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸が提供される。本発明の好ましい実施形
態において、配列番号５に示した配列と比較すると、約９５％以上の配列相同性
もつコード配列を有する遺伝子由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸が提供
される。

【００１２】また、ＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸が提供され、ここでの該ＦＬＤ遺伝子は、
配列番号２に示したアミノ酸配列と比較すると、約３０％から約４９％、または
約５０％から約９０％、または約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する産物
をコードする。

【００１３】さらに、本発明はまた、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または
３’終結配列の少なくとも１つを含む単離核酸を提供し、ここでの該ＦＬＤ遺伝
子は、配列番号２に示したアミノ酸配列と比較すると約３０％から約４９％、ま
たは約５０％から約９０％、または約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する
産物をコードする。

【００１４】さらに、本発明は、主題の単離核酸を含む発現カセット、ベクターおよび宿主
細胞を提供する。

【００１５】また本発明により、メチロトローフ酵母において異種遺伝子の発現を指令する
方法が提供される。該方法は、メチロトローフ酵母細胞に、メチロトローフ酵母
から単離したＦＬＤプロモーターを含む単離核酸を導入することを含み、ここで
の該プロモーターは、その３’末端で、異種遺伝子の５’末端に作動可能に連結
し、該異種遺伝子は、その３’末端で、メチロトローフ酵母で機能する終結配列
の５’末端に作動可能に連結している。メチロトローフ酵母細胞は、グリセロー
ルまたはグルコースなどの適切な炭素源を有するおよびアンモニウム塩または水
酸化アンモニウムなどの適切な窒素源を有する培地で増殖させる。炭素または窒
素源が枯渇した後、該異種遺伝子の発現を、メタノールまたはメチルアミンまた
はメタノールおよびメチルアミンの両方の添加により誘導する。発現は、ホルム
アルデヒド、蟻酸、またはメチル化アミンの添加によっても誘導され得る。

【００１６】ホルムアルデヒド耐性宿主細胞を選択する方法も本発明により提供される。該
方法は、メチロトローフ酵母細胞を、ＦＬＤ遺伝子を含むベクターで形質転換さ
せることを含み、該ＦＬＤ遺伝子は、その５’末端で、該酵母細胞で機能するＦ
ＬＤプロモーターまたは異種プロモーターに作動可能に連結し、該ＦＬＤ遺伝子
は、その３’末端で、該酵母細胞で機能する３’終結配列に作動可能に連結して
いる。宿主細胞を、ホルムアルデヒドの存在下で増殖させ、ホルムアルデヒドの
存在下で増殖する酵母細胞を選択する。

【００１７】本発明はまた、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ２４１（ｆｌｄ１−１
）などのＦＬＤ遺伝子（ｆｌｄ）の欠損したメチロトローフ酵母株を提供する。
また、ＦＬＤ遺伝子が欠損し、別の生合成遺伝子について栄養要求性である、メ
チロトローフ酵母株も提供される。

【００１８】本発明により、メチロトローフ酵母で機能するＦＬＤプロモーターおよび３’
終結配列を含む発現カセットを含むキットが提供される。少なくとも１つの制限
部位が、ＦＬＤプロモーターと３’終結配列の間に位置し、よって異種遺伝子が
挿入され得、プロモーターおよび３’終結配列に作動可能に連結され得る。キッ
トには、メチロトローフ酵母中で複製するか、またはメチロトローフ酵母のゲノ
ムに組込まれるベクターも含まれ、このベクターは、マーカー遺伝子および該カ
セットの挿入のための１つ以上の制限部位を含む。

【００１９】さらに、本発明は、選択マーカーとしてのＦＬＤ遺伝子並びに発現カセットを
含む発現ベクターを含むキットを提供する。発現カセットは、メチロトローフ酵
母で機能するプロモーターおよび３’終結配列を含み、プロモーターと３’終結
配列の間に位置する少なくとも１つの制限部位を有し、よって異種遺伝子が挿入
され得、プロモーターおよび該３’終結配列に作動可能に連結され得る。

【００２０】（発明の詳細な説明）本発明は、メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝
子（ＦＬＤ）を含む単離核酸配列に関する。ＦＬＤ遺伝子の産物のホルムアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼは、ホルムアルデヒドに対する耐性を付与する。本発明の
１つの態様において、ＦＬＤコード配列を、メチロトローフ酵母細胞で選択マー
カーとして機能させるために、それ自体の５’および３’調節領域と共に、また
は異種５’および３’調節領域と共に使用し得る。それ故、主題のＦＬＤコード
配列は、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子の使用を回避したい場合に有
利である。

【００２１】本発明により、主題ＦＬＤ遺伝子は、選択マーカーとして使用でき、これは、Ｚｅｏ ^Ｒのように、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の遺伝子型とは独立的に選択でき、Ｚｅｏ ^ＲおよびＧ４１８ ^Ｒのように、複数のコピーの発現ベクターを受容する株
を直接選択するために使用できる。しかし、Ｚｅｏ ^ＲおよびＧ４１８ ^Ｒとは異な
り、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１遺伝子は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに天然で
あり、抗生物質に対する耐性を付与しない。

【００２２】本発明の１つの態様において、それぞれ図７に示した制限地図および図１０の
斜交平行線模様領域を有するＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨａｎｓｅ
ｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤ遺伝子が提供される。メタノール
およびメチルアミンに応答したＦＬＤ発現は、転写レベルで制御される。Ｐｉｃ
ｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（ＦＬＤ１）由来のＦＬＤ遺伝子は、そのヌクレオチ
ド配列に関してさらに記載でき、その配列（配列番号１）が図４に示されている
。ＦＬＤ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列は配列番号５に示す。

【００２３】本発明の別の態様において、メチロトローフ酵母から単離されたＦＬＤ遺伝子
由来の誘導性５’調節領域（本明細書では「ＦＬＤプロモーター」と同義語で使
用する）が提供され、その５’調節領域は、メチロトローフ酵母細胞での異種遺
伝子の効率的発現に有用である。対象であるＦＬＤ５’調節領域は、メタノール
、ホルムアルデヒド、および蟻酸などの異なる炭素および／またはエネルギー源
により強力かつ独立的に誘導される。ホルムアルデヒドも蟻酸も、真の意味で炭
素源ではない。なぜなら、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓは、該化合物から炭
素を利用せず、単にその酸化によってエネルギーを得るからである。対象であるＦＬＤ５’調節領域は、メチルアミン、コリン、および他のメチル化アミンなど
の異なる窒素源によっても強力かつ独立的に誘導される。従って、例えば、Ｐｉ
ｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１プロモーターは、唯一の炭素源としての
メタノールにより（窒素源としての水酸化アンモニウムまたはアンモニウム塩と
共に）、または唯一の窒素源としてのメチルアミンにより（炭素源としての炭素
糖と共に）強力かつ独立的に誘導される。非誘導窒素源の例は、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよび水酸化アンモニウムを含む。非
誘導炭素源の例は、グリセロールおよびグルコースを含む。

【００２４】従って、本発明は、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドン
の上流に位置する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を
提供する。特に、図８に示した制限地図を有するＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉ
ｓＦＬＤ遺伝子（ＦＬＤ１）由来のプロモーターが例示される。好ましい実施
形態において、ＦＬＤ１遺伝子プロモーターは、配列番号３に示したヌクレオチ
ド配列を有する。また、図１０の斜交平行線模様領域に示した制限部位を有するＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤプロモーターも例示さ
れる。

【００２５】本発明はまた、メチロトローフ酵母由来ＦＬＤ３’終結配列も提供する。従っ
て、本発明は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流に位置する約３００ヌクレ
オチド以上の配列を含む単離核酸を提供する。例えば、３’終結配列は、図４の
ヌクレオチド１２５５〜１５５５を含み得る（配列番号４）。本発明の別の実施
形態において、３’終結配列は、ＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ遺伝子由来であり、この遺伝子は、図１０に斜交平行線模様領域として示
す。

【００２６】配列番号３に示したＦＬＤ１プロモーターへの修飾は、メタノール、ホルムア
ルデヒド、または蟻酸誘導による、またはメチルアミン、コリンまたは他のメチ
ル化アミン誘導による発現促進の特徴的特性を維持しているが、これは本発明の
範囲内である。配列番号４に示した３’終結配列への修飾は、遺伝子のｍＲＮＡ
転写産物を安定化させる特徴的特性を維持しているが、これも本発明の範囲内で
ある。同様に、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１コード配列（図４、
配列番号５）への修飾は、生物学的に活性なホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ
をコードする特徴的特性を維持しているが、これも本発明の範囲内である。かか
る修飾は、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失および置換を含む。

【００２７】本発明はまた、ＦＬＤ遺伝子を欠損したメチロトローフ酵母株、すなわちｆｌ
ｄ変異体も提供する。かかる株は、メチロトローフ酵母細胞をニトロソグアニジ
ンなどの変異原に曝露させ、唯一の炭素源としてメタノールおよび唯一の窒素源
としてメチルアミンを利用できない株をスクリーニングすることにより作成し得
る。次いで、補完および他の遺伝子技法を使用して、メチロトローフ酵母株がｆ
ｌｄ変異体であることを確認し得る。本発明により、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
ｒｉｓｆｌｄ株が提供され、ＧＳ２４１（ｆｌｄ１−１）と称する。ｆｌｄ変
異体メチロトローフ酵母株は、生合成遺伝子について栄養要求性変異体であるか
、または異なる選択マーカーを有する別の株に交雑し得る。例えば、本発明は、
ＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１ｈｉｓ４）と称される、メタノール利用欠損（Ｍｕ
ｔ⁻）であり、ヒスチジンに栄養要求性である（Ｈｉｓ⁻）Ｐｉｃｈｉａｐａ
ｓｔｏｒｉｓ酵母株を提供する。

【００２８】ＦＬＤ遺伝子は、古典的な機能的補完技法を使用してメチロトローフ酵母から
単離し得る。簡潔に述べると、メチロトローフ酵母由来のＤＮＡのゲノムライブ
ラリーを、メチロトローフ酵母中で複製するベクターにクローン化する。ベクタ
ーを使用して、ｆｌｄ変異体であるメチロトローフ酵母を形質転換する。メタノ
ール（または任意の上記の誘導剤）の存在下で増殖する細胞を、ゲノムライブラ
リーから機能性ＦＬＤ遺伝子を有するものとして選択する。ベクターを、補完酵
母細胞から単離し、制限地図を作成する。ベクター挿入物の断片をサブクローニ
ングし、ｆｌｄ変異体および単離したｆｌｄ変異体に依然として補完するより小
さな断片を形質転換し得る。このベクターの挿入物をシークエンスし、ＦＬＤ遺
伝子オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定し得る。実施例２および３
に記載のように、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１遺伝子およびＨａ
ｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ遺伝子の両方を機能的補完によ
り単離した。

【００２９】メチロトローフ酵母のＦＬＤ遺伝子のコード配列、プロモーターまたは３’終
結配列に対応する核酸分子もまた、全ＦＬＤ１遺伝子、ＦＬＤ１遺伝子の全コー
ド配列、またはＦＬＤ１コード配列の一部（断片およびオリゴヌクレオチドを含
む）をプローブとして使用し、メチロトローフ酵母由来の核酸分子（群）とハイ
ブリッド化することにより得られ得る。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ全ＦＬ
Ｄ遺伝子（配列番号１）、またはＦＬＤコード配列（図４、配列番号５）、また
は配列番号５に示したヌクレオチド配列の一部にハイブリッド化する核酸分子を
、例えば、当業者に既知の技法によりゲノムライブラリーから単離できる。ゲノ
ムライブラリーをスクリーニングすることによる本発明のＰｉｃｈｉａｐａｓ
ｔｏｒｉｓＦＬＤ遺伝子に対応するゲノムＤＮＡ配列を得るに有用であると考
えられる方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、分子クローニング
：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、または汎用さ
れている組換えＤＮＡ工学に関する無数の実験マニュアルのいずれかに提供され
ている。

【００３０】対象ＦＬＤ遺伝子は、単離ＦＬＤゲノムクローンの制限エンドヌクレアーゼ消
化により得られ得る。従って、例えば、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬ
Ｄ１遺伝子の既知のヌクレオチドまたはアミノ酸配列（図４、配列番号１および
２）を、単離された推定ＦＬＤゲノムクローンの核酸または推論アミノ酸配列に
整列させ、単離ＦＬＤゲノムクローンの５’調節配列（すなわち、コード領域の
翻訳開始コドンの上流の配列）、コード配列、および３’調節配列（すなわち、
コード領域の翻訳終止コドンの下流の配列）を配置する。

【００３１】対象ＦＬＤプロモーター、３’終結配列またはコード配列は、例えばｉｎｖ
ｉｔｒｏ変異誘発により、過剰の５’フランキング配列、過剰のコード配列、ま
たは過剰の３’フランキング配列を有するゲノムクローンから作成し得る。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ変異誘発は、簡便な制限部位の導入に役立つ。Ｔ７−Ｇｅｎｉｎ
ｖｉｔｒｏ変異誘発キット（ＵＳＢ、クリーブランド、オハイオ）およびＱｕ
ｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（ストラタジーン、サンディエゴ、
カリフォルニア）などのこの適用に特に適切な様々な市販で入手可能なキットが
ある。別法として、ＰＣＲプライマーを、対象ＦＬＤプロモーター、コード配列
、および３’終結配列の直接的増幅を可能とするように規定できる。

【００３２】同方法を使用して、当分野の通常の熟練者は、配列番号３に示したＦＬＤ１プ
ロモーターの１つ以上の欠失断片を作成できる。配列番号３に示したヌクレオチ
ド配列の連続部分を含み、メタノール、ホルムアルデヒド、または蟻酸誘導によ
る発現促進能を保持するか、またはメチルアミン、コリンまたは他のメチル化ア
ミン誘導による発現促進能を保持する任意および全ての欠失断片が本発明により
考えられる。同様に、配列番号４および５に示した配列の連続部分を含み、それ
ぞれ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の安定化能を保持するか、または生物学的に活性
なＦＬＤをコードする能力を保持する任意および全ての欠失断片が本発明の範囲
内である。

【００３３】ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１プロモーター（そのヌクレオチド
配列は、図４のヌクレオチド−５３７から−１として示す（配列番号３））に加
えて、本発明は、他のメチロトローフ酵母のＦＬＤ遺伝子に対応する他のプロモ
ーター配列に関する。本明細書に定義したように、メタノール、ホルムアルデヒ
ド、または蟻酸誘導により発現を促進するか、またはメチルアミン、コリンまた
は他のメチル化アミン誘導により発現を促進する、かかる関連配列は、ＦＬＤコ
ード配列の翻訳開始コドンの上流でのその位置に関して記載され得、そのコード
配列は図４に示したヌクレオチドコード配列（配列番号５）に対するヌクレオチ
ドレベルでの相同性％に関して記載する。

【００３４】別に、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤコード配列は、低ストリンジェントな
ハイブリッド形成条件下で、例示したＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ
１遺伝子（配列番号１）またはＦＬＤ１コード配列（配列番号５）にハイブリッ
ド化するその能力に関して定義され得る。それ故、本発明は、ＦＬＤ遺伝子に対
応するプロモーター、コード領域または３’終結配列を含むメチロトローフ酵母
から単離した核酸配列に関し、かかるＦＬＤ遺伝子のコード領域は、低ストリン
ジェントな条件下で、配列番号１または５に示したＦＬＤ遺伝子核酸配列、また
は配列番号１または５に示した配列に相補的な配列にハイブリッド化する。ＦＬ
Ｄ遺伝子（そのコード領域は配列番号１または５に示した配列とハイブリッド化
する）のプロモーター、コード領域または３’終結配列は、ＦＬＤ遺伝子由来の
該コード配列が、生物学的に活性なＦＬＤをコードする限り、または該ＦＬＤプ
ロモーターが、エネルギー源としてのメタノール、ホルムアルデヒド、または蟻
酸により、または唯一の窒素源としてのメチルアミン、コリンまたは他のメチル
化アミンにより独立的に誘導される限り、配列番号１から５と比較して、１つ以
上のヌクレオチド位置が異なり得る。さらに、主題３’終結配列は、３’終結配
列がコード配列に作動可能に連結された場合にｍＲＮＡ転写物の安定化能を保持
する限り、配列番号４と比較して、１つ以上のヌクレオチド位置が異なり得る。

【００３５】「ハイブリッド形成」により、該核酸分子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（分
子クローニング；実験マニュアル、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニュ
ーヨーク（１９８９））により記載のように、慣用的なハイブリッド条件下でハ
イブリッド化することを意味する。

【００３６】メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子（ゲノム配列）、およびＦＬＤコード
配列は、慣用的なハイブリッド形成条件を使用して、ＦＬＤ１のコード領域また
はその一部（配列番号１および５、並びに配列番号１および５に相補的な配列）
へのハイブリッド形成により同定し得る。好ましくは、低ハイブリッド形成条件
、例えば、３７℃で３０％ホルムアミド、次いで、室温で１×ＳＳＣ中および６
０℃で１×ＳＳＣ中の洗浄などを使用する。低ストリンジェントな条件下で配列
番号１または５にハイブリッド化する、約２ｋｂから約３．５ｋｂまたは約２．
５ｋｂから約３．５ｋｂのサイズの範囲の推定ＦＬＤ遺伝子は、制限地図形成お
よびシークエンスによりさらに特徴づけ得る。プローブとしてプラスミドｐＹＧ
１のＦＬＤ１遺伝子を使用し、かかる低ストリンジェント条件下でハイブリッド
化させることにより、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ遺伝子を同定し得る。
実施例３参照。

【００３７】ＦＬＤプロモーターおよび３’終結配列もまた、ＦＬＤ遺伝子の対応するコー
ド配列（これからプロモーターまたは３’終結配列が得られる）の、低ストリン
ジェント条件下で、図４に示したコード配列（配列番号１および５）、並びに配
列番号１および５に対して相補的な配列にハイブリッド化する能力により規定さ
れ得る。

【００３８】本発明のＦＬＤ構造遺伝子、プロモーター断片および終結配列もまた、本明細
書に提供したヌクレオチド配列に対するヌクレオチドレベルでの相同性％に関し
て記載し得る。当業者が配列相同性を決定する目的で使用し得る核酸配列を比較
および整列させる多くのコンピュータープログラムが存在する。例えば、ＰＣ／
Ｇｅｎｅプログラム（リリース６．６、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎ
ｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、Ｃａ．）を、オープンギャップコスト１５お
よび単位ギャップコスト１０として使用し得る。

【００３９】本明細書に使用した配列相同性％値は、特に配列番号で示した一本鎖配列と比
較した場合の、単離核酸の相同性％を含むだけでなく、特に配列番号、例えば配
列番号５で示した一本鎖配列の相補的鎖と比較した場合の単離核酸の相同性％も
含む。

【００４０】従って、上記のようにパラメータを設定しＰＣ／Ｇｅｎｅプログラムなどのコ
ンピュータープログラムを使用して、主題単離核酸を下記の通りに記載し得る。
本発明の１つの実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一
の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるメチロトローフ酵母由
来のＦＬＤ遺伝子を含み、配列番号５に示したＦＬＤ遺伝子のヌクレオチド配列
と比較して約７０％から約８５％の配列相同性をもつコード配列を有する、単離
核酸が提供される。好ましい実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノー
ルまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺
伝子を含む単離核酸は、配列番号５に示したＦＬＤ遺伝子のコード配列と比較し
て約８５％から約９５％の配列相同性をもつコード配列を有する。

【００４１】最も好ましい実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一
の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子を含む単
離核酸は、配列番号５に示したＦＬＤコード領域の配列と比較して約９５％以上
の配列相同性をもつコード配列を有する。

【００４２】本発明の別の態様において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一の窒
素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子由来のプロモ
ーターを含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流（５’）に位置
する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番
号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約７０％から約８
５％の配列相同性を有する。好ましい実施形態において、唯一の炭素源としての
メタノールまたは唯一の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子由来のプロモーターを含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コ
ドンの上流（５’）に位置する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、
そのコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と
比較して約８５％から約９５％の配列相同性を有する。

【００４３】より好ましい実施形態において、唯一の炭素源としてのメタノールまたは唯一
の窒素源としてのメチルアミンにより独立的に誘導されるＦＬＤ遺伝子由来のプ
ロモーターを含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流（５’）に
位置する約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配
列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約９５％以上
の配列相同性を有する。任意の上記のプロモーターに関して、好ましくは、プロ
モーターは、ＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの直ぐ上流（５’）に位置する約６
００塩基対以上のヌクレオチド配列を含む。

【００４４】本発明の別の態様において、メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を
含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流（３’）に位置する約３
００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番号５に示
したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約７０％から約８５％の配
列相同性を有する。好ましい実施形態において、メチロトローフ酵母由来のＦＬ
Ｄ３’終結配列を含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流（３’
）に約３００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、そのコード配列は、配列番
号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較して約８５％から約９
５％の配列相同性を有する。最も好ましい実施形態において、メチロトローフ酵
母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドン
の下流（３’）に位置する約３００塩基対以上のヌクレオチド配列を含み、その
コード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列のヌクレオチド配列と比較
して約９５％以上の配列相同性を有する。任意の上記の３’終結配列に関して、
好ましくは、３’終結配列は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの直ぐ下流（３’
）に位置する約３００塩基対以上のヌクレオチド配列を含む。

【００４５】前記の核酸配列に加えて、本発明は、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コー
ド配列および３’終結配列を含む単離核酸に関し、その産物は、図４に示したア
ミノ酸配列（配列番号２）と比較して約３０％から約４９％のアミノ酸配列同一
性を有する。好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コ
ード配列または３’終結配列を含む単離核酸は、ＦＬＤ遺伝子由来であり、その
産物は、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）と比較して約５０％から約９
０％のアミノ酸配列同一性を有する。より好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺
伝子由来のプロモーター、コード配列および３’終結配列を含む単離核酸は、Ｆ
ＬＤ遺伝子由来であり、その産物は、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）
と比較して約９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。最も好ましい実施形態
において、ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または３’終結配列を
含む単離核酸はＦＬＤ遺伝子由来であり、その産物は、図４に示したアミノ酸配
列（配列番号２）を有する。

【００４６】本発明により、全ＦＬＤ遺伝子（すなわち、天然ＦＬＤプロモーターおよび天
然３’終結配列に作動可能に連結したＦＬＤコード配列を含むゲノム配列）もま
た、コード領域の産物の配列同一性により記載され得る。従って、本発明の１つ
の実施形態において、ＦＬＤ遺伝子の産物のアミノ酸配列が、図４に示したアミ
ノ酸配列（配列番号２）と比較して約３０％から約４９％の配列同一性を有するＦＬＤ遺伝子が提供される。好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子の産物の
アミノ酸配列が、図４に示したアミノ酸配列（配列番号２）と比較して約５０％
から約９０％の配列同一性を有するＦＬＤ遺伝子が提供される。より好ましい実
施形態において、ＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸は、図４に示したアミノ酸配列（
配列番号２）と比較して約９０％以上の配列同一性をもつアミノ酸配列を有する
産物をコードする。最も好ましい実施形態において、ＦＬＤ遺伝子は、図４に示
したアミノ酸配列（配列番号２）を有する産物をコードする。

【００４７】メチロトローフ酵母由来の推定ＦＬＤアミノ酸配列と、配列番号２として本明
細書に提供されるＦＬＤアミノ酸配列の間の配列同一度を決定する目的で、ＢＬ
ＡＳＴ２．０プログラム（Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ
ｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を、全てのパ
ラメータを初期パラメータに設定して使用し得る。

【００４８】単離ＦＬＤ核酸分子のヌクレオチド配列を決定するために、任意の様々な既知
の技法を使用し得る。例えば、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓまたは他のメチ
ロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む制限断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
（ストラタジーン）などのベクターのポリリンカー部位にサブクローニングでき
る。次いで、これらのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔサブクローンは、二本鎖ジデオキ
シ法（Ｃｈｅｎら、（１９８５）ＤＮＡ、４；１６５）によりシークエンスでき
る。

【００４９】ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ遺伝子配列に対応するメチロトロー
フ酵母ＦＬＤ遺伝子由来の５’調節配列、コード配列、および３’終結配列もま
た、配列番号１、３、４、および５に示した配列由来のプライマーオリゴヌクレ
オチドを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅技法を適用
することにより単離し得る。

【００５０】メチロトローフ酵母由来のＦＬＤプロモーター（その修飾または欠失断片も含
む）の独立的誘導性の確認を、異種遺伝子のコード配列との特異的配列の転写お
よび／または翻訳融合物の作成、キメラ遺伝子の適切な宿主への移行、および異
種遺伝子の発現の検出により達成できる。発現の検出に使用したアッセイは、異
種配列の性質に依存する。例えば、β−ラクタマーゼ（β−ｌａｃ）、β−ガラ
クトシダーゼ（β−ｇａｌ）、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）により例示されるリポーター遺伝子は、キ
メラ作成物の転写および翻訳適合性の評価によく使用される。標準的なアッセイ
は、形質転換宿主細胞のリポーター酵素を高い感度で検出するために利用できる
。

【００５１】ＦＬＤプロモーター、３’終結配列およびその単離断片は、メチロトローフ宿
主細胞での異種タンパク質の発現のための発現カセット（本明細書では「キメラ
遺伝子」とも呼ばれる）および発現ベクターの作成に有用である。本明細書に使
用した「異種タンパク質」または「異種ポリペプチド」は、ホルムアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼ以外の任意のタンパク質またはポリペプチドを意味する。本明細
書に使用した「異種遺伝子」は、ＦＬＤ以外の遺伝子を意味する。

【００５２】本明細書に使用した「カセット」なる語は、特定の遺伝子を、ヌクレオチド配
列に存在する１つ以上の調節配列に作動可能に連結するように挿入した場合に、
該遺伝子を発現できるヌクレオチド配列を意味する。従って、例えば、発現カセ
ットは、メタノールまたはメチルアミン誘導を通して発現されることが望ましい
異種遺伝子を含み得る。それ故、本発明の発現カセットおよび発現ベクターは、
メタノールまたはメチルアミン誘導時に任意の数の異種遺伝子の発現を促進する
に有用である。

【００５３】対象ＦＬＤプロモーターの制御下で外来タンパク質を発現させるための、およ
び本発明の発現カセットおよびベクターに使用するための異種遺伝子のいくつか
の例は、ヒト血清アルブミン、インベルターゼ、ウシリゾチーム、ヒトＥＧＦ、
マウスＥＧＦ、アプロチニン、クニッツプロテアーゼ阻害剤、Ｂ型肝炎表面抗原
、腫瘍壊死因子、破傷風毒素断片Ｃ、百日咳菌抗原Ｐ６９、ストレプトキナーゼ
、β−ガラクトシダーゼ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ属の種の結晶タンパク質毒素
を含む。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓで発現され得る他の有用なタンパク質
のリストについては、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．およびＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．１
９９８）分子生物学の方法：Ｐｉｃｈｉａプロトコール、ＨｕｍａｎａＰｒｅ
ｓｓ、トトワ、ニュージャージー、第１７章、ｐ．２４９−２６１参照。任意お
よび全てのコード配列が、本発明の発現カセットおよび発現ベクターに使用する
ための異種遺伝子として考えられる。

【００５４】本発明の発現カセットは、５’から３’の方向に、異種遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列に作動可能に連結したＦＬＤプロモーターを含む。好ましい実施
形態において、異種遺伝子のコード配列は、さらに、その３’末端で、３’終結
配列に作動可能に連結している。所望であれば、異種遺伝子によりコードされる
ポリペプチドの有効量を産生する発現を引き起こすに十分な、ＦＬＤ以外の遺伝
子由来の追加の調節エレメントまたは該エレメントの一部が、キメラ作成物に含
まれる。例えば、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を、異種遺伝子の
産物の分泌が所望である場合に使用し得る。該配列は、広く知られており、容易
に入手でき、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α交配因子
プレプロ（αｍｆ）、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼ（Ｐ
ＨＯ１）シグナル配列および異種遺伝子をコードするタンパク質由来の天然シグ
ナル配列を含む。

【００５５】発現カセットは、環状プラスミドまたは線形部位特異的組込みベクターなどの
ベクターを介して微生物宿主に挿入し得る。「作動可能に連結」なる語は、ＦＬ
Ｄプロモーター、構造遺伝子、および３’終結配列が、その正常な機能を実施す
るように連結および配置している近位を意味する。３’終結配列は、ポリアデニ
ル化を誘発する配列などの配列が作動可能に連結している遺伝子のｍＲＮＡ転写
産物を安定化させるように機能する構造遺伝子の終止コドンまでの３’配列であ
る。３’終結配列は、ＰｉｃｈｉａまたはＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈａまたは他のメチロトローフ酵母から得られ得る。本発明の実践に有用なＰ
ｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ３’終結配列の例は、ＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０
遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子およびＦＬＤ１遺伝子由来の終結配列を含む。

【００５６】本発明により、メチロトローフ酵母から単離されたＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
ｒｉｓＦＬＤ１遺伝子、ＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ
遺伝子および他のＦＬＤ遺伝子を、宿主細胞での選択マーカーとして使用し得る
。天然５’および３’調節配列を含む全ＦＬＤ遺伝子、またはＦＬＤ遺伝子以外
の５’および３’調節領域に作動可能に連結したＦＬＤコード領域を、使用し得
る。

【００５７】ＦＬＤプロモーター、ＦＬＤコード配列および／またはＦＬＤ３’終結配列を
含む単離核酸、該単離核酸を含む発現カセット、並びに、全ＦＬＤ遺伝子（ゲノ
ム配列）またはＦＬＤ遺伝子以外の５’および３’調節領域に作動可能に連結し
たＦＬＤコード配列を、プラスミドなどのベクターに挿入し得る。ベクターは、
好ましくは、メチロトローフ酵母で機能する選択マーカー遺伝子を含む。選択マ
ーカーは、メチロトローフ酵母に選択可能な表現型を付与し、該酵母の非形質転
換細胞からの同定および選択を可能とする任意の遺伝子であり得る。選択マーカ
ー系は、栄養要求性変異体Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ宿主株および宿主欠
損を補完する野生型遺伝子を含み得る。かかる系の例は、ｈｉｓ４Ｐｉｃｈｉ
ａ株の補完に使用され得るＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
またはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＨＩＳ４遺伝子、または、Ｐｉｃｈｉ
ａｐａｓｔｏｒｉｓａｒｇ変異体の補完に使用し得るＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅまたはＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＲＧ４遺伝子を含む。Ｐｉｃｈｉ
ａｐａｓｔｏｒｉｓで機能する他の選択マーカー遺伝子は、Ｚｅｏ ^Ｒ遺伝子、Ｇ４１８ ^Ｒ遺伝子、および勿論、本発明のＦＬＤ遺伝子を含む。

【００５８】本発明のベクターはまた、細菌中で機能する選択マーカー遺伝子も含み得る。
加えられた細菌選択マーカーにより、細菌宿主細胞中でのベクターの増幅が可能
となる。細菌選択マーカー遺伝子の例は、アンピシリン耐性（Ａｍｐ^ｒ）、テト
ラサイクリン耐性（Ｔｅｔ^ｒ）、ネオマイシン耐性、ヒグロマイシン耐性、およ
びゼオシン耐性（Ｚｅｏ ^Ｒ）を含む。

【００５９】さらに、本発明のベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌中での複製および染色
体外維持に関与する配列を含み得る。該配列の使用により、細菌中でのベクター
の増幅、および従って大量のベクターＤＮＡの産生が可能となる。細菌複製起源
の例は、コリシン、ｃｏｌＤ１、ｃｏｌＥ１、および当業者に既知の他の物
を含む。

【００６０】本発明のベクターはまた、ＪａｍｅｓＭ．Ｃｒｅｇｇの１９８９年６月６日
に発行された米国特許第４，８３７，１４８号に記載のような自己複製配列（Ａ
ＲＳ）を含み得る。米国特許第４，８３７，１４８号の開示は、完全に示したの
と同じように本明細書に組込む。Ｃｒｅｇｇにより開示された自己複製配列は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓでプラスミドを維持するに適切な手段を提供す
る。

【００６１】別法として、環状プラスミド以外の組込みベクターを使用してもよい。該組込
みベクターは、ＪａｍｅｓＭ．Ｃｒｅｇｇの１９８９年１１月２１日に発行さ
れた米国特許第４，８８２，２７９号に開示されている。’２７９号特許もまた
、完全に示したのと同じように本明細書に組込む。主題プロモーター、３’終結
配列、ＦＬＤ１マーカー遺伝子、および発現カセットと共に使用するに適切な組
込みベクターは、少なくとも第一の挿入可能なＤＮＡ断片、選択マーカー遺伝子
、および第二の挿入可能なＤＮＡ断片の連続的に並べられた配列を含む。異種構
造遺伝子を含む発現カセットは、このベクターに、第一および第二の挿入可能な
ＤＮＡ断片の間に、マーカー遺伝子の前または後に挿入する。別法として、発現
カセットは、ＦＬＤプロモーターが、構造遺伝子が作動可能に連結され得る挿入
可能な断片の１つの中に含まれる場合、ｉｎｓｉｔｕで形成できる。

【００６２】第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は、各々少なくとも約２００ヌクレオ
チド長であり、形質転換する種のゲノムＤＮＡの一部に相同的であるヌクレオチ
ド配列を有する。挿入可能な断片は、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓの二倍体
株を使用する場合、５０ヌクレオチド長という少ない長さであり得る。組込みベ
クターの様々な成分は、発現カセットおよび選択マーカー遺伝子が、第一の挿入
可能なＤＮＡ断片の３’末端と、第二の挿入可能なＤＮＡ断片の５’末端の間に
位置するように、連続的に並べられ線形ＤＮＡ断片を形成する。第一および第二
の挿入可能なＤＮＡ断片は互いに、親ゲノムの配向と同じように連続的に並べら
れた線形断片で配向している。

【００６３】第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片として有用なヌクレオチド配列は、ゲ
ノム修飾が起こる天然ゲノム位置の別々の部分と相同的であるヌクレオチド配列
である。例えば、ゲノム修飾がアルコールオキシダーゼ遺伝子の遺伝子座で起こ
る場合、使用される第一および第二の挿入可能なＤＮＡ断片は、アルコールオキ
シダーゼ遺伝子遺伝子座の別々の部分に相同的である。第一および第二の挿入可
能なＤＮＡ断片として使用できるヌクレオチド配列の例は、Ｐｉｃｈｉａｐａ
ｓｔｏｒｉｓアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）遺伝子、ジヒドロキシアセト
ンシンターゼ（ＤＡＳ１）遺伝子、ｐ４０遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子などのデ
オキシリボヌクレオチド配列である。ＡＯＸ１遺伝子、ＤＡＳ１遺伝子、ｐ４０
遺伝子、およびＨＩＳ４遺伝子が、米国特許第４，８５５，２３１号、および第
４，８８５，２４２号に開示され、その両方を参考として本明細書に組込む。呼
称ＤＡＳ１は、米国特許第４，８５５，２３１号および第４，８８５，２４２号
で最初に使用されたＤＡＳ呼称と等価である。第一の挿入可能なＤＮＡ断片は、ＦＬＤプロモーターを含み得、このＦＬＤプロモーターも発現カセットの一部で
ある。第二の挿入可能なＤＮＡ断片は、ＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流の
約３００塩基対で始まる３’フランキング配列を含み得る。

【００６４】本発明のベクターおよびキメラ遺伝子は、当業者には既知の標準的な技法によ
り作成でき、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、分子クローニング：
実験マニュアル、または汎用されている組換えＤＮＡ工学に関する無数の実験マ
ニュアルのいずれかに見出すことができる。様々な戦略が、ＤＮＡ断片のライゲ
ートに利用でき、その選択は、ＤＮＡ断片の末端の性質に依存し、当業者は容易
に決定できる。

【００６５】メチロトローフ酵母宿主細胞を、ＦＬＤプロモーターの制御下で、異種遺伝子
を含む線形ＤＮＡ断片を用いて形質転換する場合、発現カセットは、一段階遺伝
子置換などの当業者に既知の遺伝子置換法のいずれかにより宿主細胞ゲノムに組
込まれる。Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、１９８３ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．
１０１：２０２およびＣｒｅｇｇら、１９８７Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
５：４７９。ＤＮＡベクターが環状プラスミドである場合、該プラスミドは、
組込みを容易にするために線形にし得、次いで、付加によりメチロトローフ酵母
ゲノムの同一または異なる遺伝子座に組込み得る。Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６。

【００６６】本発明のベクターは、Ｃｒｅｇｇら１９８５により記載のスフェロプラスト技
法、または欧州特許第３１２，９３４号に記載のＰｉｃｈｉａでの使用のために
修飾されたＩｔｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４８：３４１の全細胞
塩化リチウム酵母形質転換系などの既知の方法を使用してメチロトローフ酵母細
胞に形質転換し得る。本発明のプラスミドまたは線形ベクターの形質転換に有用
な他の刊行された方法は、ＣｒｅｇｇおよびＢａｒｒｉｎｇｅｒの米国特許第４
，９２９，５５５号；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
５３：１６３；Ｄ．Ｗ．Ｓｔｒｏｍａｎらの米国特許第４，８７９，２３１号；
Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８７）Ｇｅｎｅ５９：１１５を含む。電気穿
孔およびＰＥＧ１０００全細胞形質転換手順も使用し得る。ＣｒｅｇｇおよびＲ
ｕｓｓｅｌ（１９８５）分子生物学の方法：Ｐｉｃｈｉａプロトコール、第３章
、Ｈｕｍａｎａｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー、ｐ．２７−３９。

【００６７】本発明により、主題発現カセットおよび発現ベクターを含む宿主細胞が提供さ
れる。形質転換用酵母宿主は、任意の適切なメチロトローフ酵母であり得る。適
切なメチロトローフ酵母は、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｔｏｒ
ｕｌｏｐｓｉｓ属、およびＰｉｃｈｉａ属の酵母などのメタノール上で増殖でき
る酵母を含むがこれに限定されない。このクラスの酵母を例示する種のリストは
、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ（１９８２）、メチロトローフの生化学、２６９に見出し
得る。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ
ａ、Ｐｉｃｈｉａａｎｏｍｏｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａおよびＣａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉは、本発明の実践に有用なメチロト
ローフ酵母の例である。好ましいメチロトローフ酵母はＰｉｃｈｉａ属である。
特に好ましいのは、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１）；米国特許第４，８１８，７００号に開示されたＧＳ１９０（
ＮＲＲＬＹ−１８０１４）；および米国特許第４，８１２，４０５号に開示さ
れたＰＰＦ１（ＮＲＲＬＹ−１８０１７）である。ＧＳ１１５、ＧＳ１９０お
よびＰＰＦ１などの栄養要求性Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株は、選択を容
易にするために本発明の実践に有利である。ＮＲＲＬＹ−１１４３０およびＮ
ＲＲＬＹ−１１４３１などの野生型Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株は、適
切な形質転換マーカー遺伝子を選択、例えば、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ
を、スクロース上での増殖を可能とする株に形質転換させるためのＳＵＣ２の使
用を選択する場合、または抗生物質耐性マーカーを使用、例えばＧ４１８および
ゼオシンに対する耐性を使用する場合、同程度成功裡に使用し得る。

【００６８】本発明のベクターを使用してＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓで異種タンパク
質を大量に産生するために、２段階の高細胞密度のバッチ発酵を使用し得る。第
一段階（増殖段階）中、Ｐｉｃｈｉａ宿主細胞を、グリセロールまたはグルコー
スなどの適切な炭素源、および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは他の
アンモニウム塩などの適切な窒素源を含む規定最小培地中で培養し得る。水酸化
アンモニウムも使用し得る。この第一段階で、異種遺伝子発現は抑制され、これ
により細胞塊の細胞増殖および産生が可能となる。一旦抑制炭素または窒素源が
枯渇すれば、メタノールまたはメチルアミン、または両方を加え、これは第二段
階（産生段階）の異種遺伝子の発現を開始する。本発明により、メタノールおよ
びメチルアミンの両方を使用した誘導により、相乗効果が得られる。すなわち、
遺伝子発現のレベルは、メタノールおよびメチルアミンの両方を誘導に使用する
と、メタノール単独またはメチルアミン単独を誘導に使用する場合に比べて高く
なる。

【００６９】別法として、遺伝子発現は、エネルギー源としてのホルムアルデヒドまたは蟻
酸または窒素源としてのコリンおよび他のメチル化アミンを使用して誘導され得
る。メタノールを誘導に使用する場合、１％またはそれ以下の濃度で使用される
。非常に少量から、ほとんど存在しない量が、発現の誘導に必要な全てである。
ホルムアルデヒドを誘導に使用する場合、約１０ｍＭからのほぼ存在しない量ま
でが使用され、ホルムアルデヒドは、１０ｍＭまたはそれ以上の量でＰ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓに対して非常に毒性であることを心に留めておく。蟻酸も、１００ｍ
Ｍ以上の量でＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに対して非常に毒性である。メチルアミン、
コリンまたは他のメチル化アミンを遺伝子発現の誘導に使用する場合、０．５％
からほぼ存在しない量までが使用される。

【００７０】宿主細胞は、摂氏（Ｃ）約３５℃から摂氏４℃までの範囲の温度で増殖し得る
。好ましい細胞増殖温度は、摂氏３０℃である。細胞増殖のｐＨ範囲は、２．８
から７．５であり、好ましい範囲は３．０から６．５である。メチロトローフ酵
母細胞の増殖の条件および方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＣｒｅｇｇ（１９８８
）分子生物学の方法：Ｐｉｃｈｉａプロトコール、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、
トトワ、ニュージャージーで徹底的に議論され、完全に示したのと同じように本
明細書に取込む。

【００７１】形質転換されたＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、形質転換後の前記の
栄養要求性細胞を、必要な生化学産物（細胞の栄養要求性のために）の非存在下
で培養し、新規表現型（「メタノール遅延」）を選択および検出するか、または
形質転換体に含まれる耐性遺伝子の非存在下で酵母に毒性な抗生物質の存在下で
培養することを含むがこれに限定されない適切な技法を使用して選択し得る。

【００７２】以前に議論したように、主題ＦＬＤ遺伝子は、選択マーカーとして使用して、
ホルムアルデヒド耐性を直接的に選択する目的でメチロトローフ酵母細胞を形質
転換し得る。さらに、本発明は、宿主細胞に、本明細書に定義したＦＬＤプロモ
ーターに作動可能に連結された、または異種プロモーターに作動可能に連結され
たＦＬＤコード配列を含むベクターを導入することを含む、形質転換宿主細胞の
直接的選択法を提供する。最適には、ＦＬＤコード配列もまた、その３’末端で
、３’終結配列に作動可能に連結している。形質転換宿主細胞は、ホルムアルデ
ヒドの存在下で増殖させ、耐性細胞を選択する。

【００７３】耐性細胞の選択に使用されるホルムアルデヒドのレベルは、宿主細胞として使
用した酵母株、およびＦＬＤ遺伝子の発現の駆動に使用したプロモーターに依存
する。例えば、野生型Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株および天然ＦＬＤプロ
モーターを使用する場合、約７ｍＭのホルムアルデヒドレベルが、直接的な選択
には十分である。ｆｌｄ変異体Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株を、天然ＦＬ
Ｄプロモーターまたは異種プロモーター（すなわち、ＦＬＤプロモーター以外の
プロモーター）と共に使用する場合、約２ｍＭのレベルが直接的な選択には十分
である。

【００７４】陽性形質転換体は、ＤＮＡ組込み部位の同定に特に有用であるサザンブロット
解析（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）により特徴づけられ得る。ノザン解析（
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用して、メタノール応答性およびメチルア
ミン応答性遺伝子発現を確認し得る。異種遺伝子産物はまた、既知の方法および
同定した適切なレベルで所望の遺伝子産物を産生する単離物を使用してアッセイ
し得る。異種遺伝子産物に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使
用したイムノブロットも使用し得る。

【００７５】本発明の別の態様は、メチロトローフ酵母細胞に、メチロトローフ酵母から単
離したＦＬＤプロモーター（このプロモーターは、その３’末端で、異種遺伝子
の５’末端に作動可能に連結している）を含む単離核酸を導入することを含む、
メチロトローフ酵母での異種遺伝子の発現を指令する方法を提供する。最適には
、異種遺伝子はまた、その３’末端で、メチロトローフ酵母で機能する３’終結
配列の５’末端に作動可能に連結している。かかる単離核酸は、好ましくは、メ
チロトローフ酵母内で複製するか、または前記したようにメチロトローフ酵母の
ゲノムに組込まれるベクター内に存在する。メチロトローフ酵母細胞は、発現カ
セットまたは発現ベクターで形質転換され、次いで、細胞を、炭素源としてグリ
セロールまたはグルコースなどの糖、および窒素源としての水酸化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、または他のアンモニウム塩を有する培
地中で増殖させる。抑制炭素または窒素源が枯渇した後、異種遺伝子の発現を、
メタノールまたはメチルアミンの添加により誘導する。別法として、遺伝子発現
は、エネルギー源としてのホルムアルデヒドまたは蟻酸で、または窒素源として
のコリンおよび他のメチル化アミンで誘導され得る。慣用的な方法を使用して、
培養培地（異種タンパク質が異種細胞から分泌される場合）またはメチロトロー
フ酵母細胞（異種タンパク質が分泌されていない場合）から異種タンパク質を単
離する。

【００７６】本発明はまた、本発明の発現カセットおよび発現ベクターを含むキットを提供
する。本発明のこの態様において、メチロトローフ酵母由来の主題ＦＬＤプロモ
ーターを含む発現カセット並びにＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、ＨＩＳ４遺伝
子またはＦＬＤ遺伝子由来の３’終結配列などの３’終結配列を含むキットが提
供される。少なくとも１つの制限部位および好ましくはマルチクローニングサイ
トが、ＦＬＤプロモーターと３’終結配列の間に簡便には位置し、よって異種遺
伝子が挿入され得、プロモーターおよび３’終結配列に作動可能に連結され得る
。キットはまた、メチロトローフ酵母中で複製するか、または前記したようにメ
チロトローフ酵母のゲノムに組込まれる、プラスミドなどのベクターを含み得る
。好ましくは、ベクターは、マーカー遺伝子並びに発現カセットの挿入のための
１つ以上の制限部位を含む。別に、キットは、ベクター内にすでに配置された発
現カセットを含んでもよい。別の実施形態において、キットはまた、発現ベクタ
ーで形質転換され得、形質転換細胞が直接選択され得る酵母株を含み得る。選択
マーカーおよび栄養要求酵母株の例は、前記している。本発明のこの態様のさら
に別の実施形態において、キットはまた、β−ラクタマーゼなどのリポーター遺
伝子に作動可能に連結したＦＬＤ１プロモーターなどの制御プラスミドを含み得
る。該プラスミドは、単独で、または形質転換酵母株内で供給され得る。

【００７７】本発明はまた、選択マーカーとしてのＦＬＤ遺伝子と共に発現ベクターを含む
キットを提供する。ベクターは、自己複製ベクターでも組込みベクターでもよい
。前記したように、ＦＬＤコード配列は、天然ＦＬＤ５’および／または３’調
節配列の制御下にあり得るか、または異種５’および／または３’調節配列に作
動可能に連結し得る。発現ベクターには、メチロトローフ酵母中で機能するプロ
モーター並びにメチロトローフ酵母中で機能する３’終結配列を含む発現カセッ
トも存在する。発現カセット内の、５’調節配列と３’調節配列の間には、１つ
以上の制限部位が存在し、よって異種遺伝子が挿入され得、調節配列の制御下に
配置され得る。好ましい実施形態において、プロモーターおよび３’終結配列は
、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＯＸ１遺伝子由来である。別の実施形態
において、キットはさらに、５’調節領域に作動可能に連結したシグナル配列と
共に、該発現カセットを有するベクターを含む。シグナル配列の末端と３’終結
配列の間には、異種遺伝子の挿入ための少なくとも１つの制限部位が位置する。
好ましくは、マルチクローニングサイトが、シグナル配列の末端と３’終結配列
の５’末端の間に位置する。適切なシグナル配列の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α交配因子プレプロ（αｍｆ）、およびＰｉｃ
ｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酸性ホスファターゼシグナル配列（ＰＨＯ１）を含む
。

【００７８】本発明は、以下の具体的な実施例によりさらに説明され、これは本発明の範囲
をいずれにしても限定するものではない。

【００７９】（実施例）以下の実施例で使用した株、プラスミド、および培地は、以下に示した組成を
有する。

【００８０】使用した野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、ＮＲＲＬＹ−１１４３０であっ
た。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｆｌｄ１変異体株を、ニトロソグアニジンを使用し
て作成し、Ｄｒ．ＧｅｏｒｇｅＳｐｅｒｌｏｆＰｈｉｌｌｉｐｓＰｅｔ
ｒｉｌｅｕｍＣｏｍｐａｎｙ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、オクラホマ、米国
）を通して得られた。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓｆｌｄ１株のＧＳ２４
１（ｆｌｄ１−１）は、米国農務省の北部領域リサーチセンター（ＮＲＲＬ）、
ピオリア、イリノイに＿＿で寄託され、寄託番号＿＿を割当てられた。ＭＳ１０
５、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｆｌｄ１ｈｉｓ４株は、ＧＳ２４１（ｆｌｄ１−
１）をＧＳ１１５（ｈｉｓ４）と交雑することにより作成した。ＭＳ１０５はま
た、ＮＲＲＬに＿＿で寄託され、寄託番号＿＿を割当てられた。プラスミドｐＹ
Ｇ１およびｐＹＧ２は、ＮＲＲＬに＿＿で寄託され、寄託番号＿＿および＿＿を
それぞれ割当てられた。使用したＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ株
は、ＣＢＳ４７３２であった。細菌組換えＤＮＡ操作は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ株ＭＳ１０６１またはＤＨ５αで実施した。酵母株は、富化ＹＰＤ
培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、０．４％グルコース）、または、硫酸ア
ンモニウムおよびアミノ酸を含まない０．１７％酵母窒素ベース、炭素源（０．
４％グルコースまたは０．５％メタノール）、および窒素源（０．５％硫酸アン
モニウムまたは０．２５％塩化メチルアミン）からなる最小培地中で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ株は、必要であれば１００μｇ／ｍｌアンピシリンまたは５０μｇ
／ｍｌゼオシン（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバ
ート、カリフォルニア、米国）を補充したルリアブロス培地中で培養した。

【００８１】（実施例１）［Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損変
異体の単離］Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＦＬＤ１）
のクローニングの第一段階として、ＦＬＤ活性の特異的に欠損した変異体を探し
た。以前のメチロトローフ酵母の生化学的研究により、ＦＬＤが、炭素源として
のメタノールおよび窒素源としてのメチルアミンの両方に関与していることが示
された（Ｚｗａｒｔ糖、１９８３）。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｆｌｄ１変異体を
探すために、ニトロソグアニジンで変異誘発した培養物を、炭素源としてメタノ
ールおよび窒素源としてメチルアミンを利用できない株についてスクリーニング
した。補完解析および他の古典的な遺伝子技法をＣｒｅｇｇおよびＲｕｓｓｅｌ
ｌ（１９９８）に記載の通りに実施した。単一の補完群に属する５つの変異体を
同定した。

【００８２】これらの５つの株をさらに、各株のメタノール誘導培養物から調製した抽出物
での鍵となるメタノール経路酵素活性レベルを測定することにより調べた。これ
らの酵素は、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）、カタラーゼ、ジヒドロキシア
セトン、シンターゼ、ジヒドロキシアセトンキナーゼ、ＦＬＤ、および蟻酸デヒ
ドロゲナーゼを含んだ。酵素アッセイ用に、酵母株を、振盪フラスコ中で３０℃
でＹＮＢ培地（アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない、ＤＩＦＣＯ）中で
炭素源として０．５％メタノールおよび窒素源として０．５％硫酸アンモニウム
を使用して増殖させた。培養物を、後期対数増殖期で収集し、細胞非含有抽出物
を、Ｗａｔｅｒｈａｍら（１９９６）に記載の通りにガラスビーズを使用して調
製した。細胞非含有抽出物のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）
の方法または標準物質としてウシ血清アルブミンを用いるピアスＢＣＡタンパク
質アッセイキット（ロックフォード、イリノイ）を使用して決定した。アルコー
ルオキシダーゼ（ｖａｎｄｅｒＫｌｅｉら、１９９０）、カタラーゼ（Ｌｕ
ｅｃｋ、１９６３）、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＷａｉｔｅｓおよびＱ
ｕａｙｌｅ、１９８１）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｖａｎＤｉｊｋｅ
ｎら、１９７８）、および蟻酸デヒドロゲナーゼ（ｖａｎＤｉｊｋｅｎら、１
９７６）活性を、発表された方法により決定した。ホルムアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ活性は、Ｓｃｈｕｔｔｅら（１９７６）に記載のように飽和量のホルムア
ルデヒド、グルタチオン、およびＮＡＤの存在下で３４０ｎｎｍでＮＡＤＨ形成
速度を追跡することにより分光光学的に測定した。反応混合物は、最終容量１．
０ｍｌ中に、３３ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９から８．０）、２ｍ
Ｍグルタチオン、１ｍＭＮＡＤ、１ｍＭホルムアルデヒド、および限定量の酵
素を含んだ。３４０ｎｍでの吸光度変化率を、少なくとも２分間追跡し、活性を
、ＮＡＤについて定数ε＝６．２２ｃｍ^２／ｎｍｏｌを使用することにより計算
した。アルコールオキシダーゼ活性は、μｍｏｌ／ｍｇ／分で表現し、ホルムア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、μｍｏｌ／ｍｇ／分で表現した。ｎｍｏｌ／
ｍｇ／分で表現したβ−ラクタマーゼ活性は、５６９ｎｍおよび３０℃で、２５
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中、１１．１ｍＭＰＡＤＡＣを基質として使
用して分光光学的にアッセイした（吸光係数４４．４０３ｃｍ^−１Ｍ^−１）。

【００８３】表１に示したように、唯一の炭素源としてのメタノールおよび唯一の窒素源と
しての硫酸アンモニウム上での野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの増殖は、特異的に
高レベルのＦＬＤ活性を誘導した（表１）。結果は、５つの変異体の各々につい
て本質的に同一であり、変異体株ＧＳ２４１の１つについて表１に示す。各変異
体は、検出不可能であったＦＬＤを除いてアッセイした全ての酵素について有意
な活性レベルを含んだ。対照として、メタノール増殖野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓは、通常レベルのＦＬＤ活性を示し、そのＡＯＸ遺伝子が欠失し、その結果と
してメタノール上で増殖できないＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのメタノール誘導細胞も
、かなりのレベルのＦＬＤ活性を含んだ。

【００８４】変異体の表現型および生化学的特徴は、それらがＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦＬ
Ｄ１遺伝子に特に欠損しているという知見と一致した。１つの推定ｆｌｄ１株の
ＧＳ２４１（ｆｌｄ１−１）を、全てのさらなる操作について選択した。

【００８５】（実施例２）［Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１遺伝子の単離および特徴づけ］機能的補完により推定ＦＬＤ１遺伝子をクローン化するために、Ｇ２４１株を
最初に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５（ｈｉｓ４）に交雑させて、メタノ
ール利用欠損（Ｍｕｔ⁻）およびヒスチジン栄養要求性（Ｈｉｓ⁻）の両方であ
る誘導体を得た。この交雑から生じた１つのＭｕｔ⁻Ｈｉｓ⁻株のＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１ｈｉｓ４）を、次いで、スフェロプラスト法を使用して、Ｐ．ｐ
ａｓｔｏｒｉｓ−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターｐＹＭ８に作成した５から１０
μｇのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡライブラリーを用いて形質転換した（
Ｃｒｅｇｇら、１９８５；Ｌｉｕら、１９９５）。プラスミドｐＹＭ８は、Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅヒスチジノールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ＳＨＩＳ４）およびＥ．ｃｏｌｉプラスミドｐＢＲ３２２に挿入され
たＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ−特異的自己複製配列（ＰＡＲＳ１）からなる。約５０
，０００のライブラリー形質転換体を、ＹＮＤ培地寒天上でＨｉｓ^＋プロトトロ
フについて選択し、得られた選択クローンはさらに、Ｍｕｔ^＋表現型についてＹ
ＮＭプレート上で選択した。全ＤＮＡを、数百個のＨｉｓ^＋Ｍｕｔ^＋コロニーの
プールから抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に使用した。このプロセスから回収
された１つのプラスミドのｐＹＧ１は、ＭＳ１０５株を、Ｈｉｓ^＋およびＭｕｔ ^＋の両方に再形質転換でき、さらに調べた。

【００８６】ｐＹＧ１上での推定ＦＬＤ１遺伝子の位置を決定するために、プラスミドの制
限地図を作成し、ベクターからの選択断片を、サブクローニングし、ＭＳ１０５
株を補完する能力について試験した。組換えＤＮＡ法を、本質的にＳａｍｂｒｏ
ｏｋら（１９８９）に記載の通りに実施した。オリゴヌクレオチドを合成し、Ｄ
ＮＡシークエンスを、ＯｒｅｇｏｎＲｅｇｉｏｎａｌＰｒｉｍａｔｅＲｅ
ｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＣｏｒｅ
Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、オレゴン、米国）で実施した。プラ
スミドは、サイズが１４．５ｋｂであり、６．８ｋｂの挿入断片を含むことが判
明した（図２）。２．７ｋｂのＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片は、ＭＳ１０５のＭｕ
ｔ⁻欠損を補完するに十分であることが判明し、シークエンスした。ＤＮＡ配列
は、長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定し、その推定産物は、
他のアルコールデヒドロゲナーゼと強い類似性を示した。またこの配列により、
遺伝子の５’末端近辺にイントロンの存在の可能性が示唆された。

【００８７】イントロンの存在を確認するために、ＯＲＦのこの領域を、ｍＲＮＡから、逆
転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅し、産物のサイ
ズおよび配列を、プラスミドｐＹＧ１上のゲノム断片のＰＣＲにより得られたも
のと比較した（図３）。ＰＣＲ反応は、ＫｒａｍｅｒおよびＣｏｅｎ（１９９５
）により記載の通りに実施した。全Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＲＮＡを、Ｓｃｈｍ
ｉｔｔら（１９９０）に従って単離した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は以前に記載された
通りに（Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８；Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９２）、以下の
オリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＣＡＣＡＡＴＧＴＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧ
ＴＣ−３’（５’プライマー）および５’−ＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＴＧＴＡＡＧ
ＣＡＴＣＡＧ−３’（３’プライマー）を使用して実施した。

【００８８】ゲノム産物は、２８４ｂｐ長であるが、ｃＤＮＡ産物は、１７０ｂｐよりも有
意に短かった。ｃＤＮＡおよびゲノム配列の整列により、ゲノムＤＮＡに存在し
た１１４ｂｐのセグメントは、ｃＤＮＡには存在しないことが実証された。さら
に、推定イントロン／エキソン接合部の調査により、典型的な酵母スプライス接
合部（５’接合部、５’−ＧＴＡＡＧＴ−３’；３’接合部、５’−ＹＡＧ−３
’）および分岐点（５’−ＴＡＣＴＡＡＣ−３’）（Ｄｏｍｄｅｙら、１９８４
；Ｓａｓｎａｕｓｋａｓら、１９９２）が判明した。１つのイントロンがそれ故
、ＯＲＦのこの位置に存在する。最後に、ハイブリッド形成プローブとしてＯＲ
Ｆ由来の断片を使用して、野生型ゲノムＤＮＡの選択制限消化物のサザンブロッ
トにより、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムは唯１つの遺伝子コピーを含むことが示
された。

【００８９】ＯＲＦのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を図４に示す。配列データは、ＥＭＢ
Ｌ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪから、アクセス番号ＡＦ０６６０５４で入手でき
る。ＯＲＦは、１，１３７ｂｐ長であり、計算分子量３９，８７０をもつ、３７
９アミノ酸のタンパク質をコードする。イントロンは、推定メチオニンイニシエ
ーターＡＴＧのＡの３’の１８ｂｐの位置（６アミノ酸）で開始し、１１４ｂｐ
長である。グルコースおよびメタノール増殖野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞か
ら、ＯＲＦ領域由来のＤＮＡ断片を使用して抽出された全ＲＮＡのノザンブロッ
トは、メタノール−増殖細胞には高いレベルで存在するが、グルコース増殖細胞
には存在しない約１．３ｋｂの１つのｍＲＮＡ種を示した（データは示していな
い）。全体的に、推定ＦＬＤ１遺伝子のコドン使用は、他の高度に発現されてい
るＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子に典型的であった（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ、１
９９３）。

【００９０】ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩデータベースを、ＯＲＦ産物に対するアミノ酸配列
類似性をもつ他のタンパク質についてスクリーニングした。推定ＦＬＤ１タンパ
ク質（Ｆｌｄ１ｐ）の配列により、酵母Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ由来の
グルタチオン依存性ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼのそれと最も高い同一性
（７１％）を示した（Ｓａｓｎａｕｓｋａｓら、１９９２）（図５）。Ｃ．ｍａ
ｌｔｏｓａは、ｎ−アルカン同化酵母であり、ＦＬＤは、ホルムアルデヒドの毒
性効果から酵母を保護するに重要であると信じられている（Ｓａｓｎａｕｓｋａ
ｓら、１９９２）。推定Ｃ．ｍａｌｔｏｓａＦＬＤ産物の、クローン化ＯＲＦ
のそれへの高度な類似性は、このＯＲＦが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦｌｄ１ｐ
をコードするさらなる支持を提供する。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦｌｄ１ｐ配列
はまた、高等真核生物のアルコールデヒドロゲナーゼＩＩＩ（ＡＤＨＩＩＩ）タ
ンパク質との高度な同一性（６５％ヒト；６３％、ウマ；６４％、ラット）、お
よび他の高等真核生物（ＡＤＨ）との低いが有意な同一性が示された（Ｈｏｌｍ
ｑｕｉｓｔおよびＶａｌｌｅｅ、１９９１；Ｋｏｉｖｕｓａｌｏら、１９９８；
Ｒａｔｈｎａｇｉｒｉら、１９９８）。最後に、Ｆｌｄ１ｐ配列は、Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅＡＤＨの推定アミノ酸配列とほとんど類似性を示さなかった。
最も近い、１９％同一性は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＤＨＩであった（Ｊ
ｏｒｎｖａｌｌら、１９８７）。

【００９１】（実施例３）［ＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ遺伝子の単離および特
徴づけ］推定Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ１遺伝子を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺
伝子について上記した同じ機能的補完戦略を使用して単離した。Ｈ．ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈａゲノムＤＮＡライブラリーは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓライブラリーと
同じ方法で、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターｐＹＭ８に作成した（Ｌｉｕら１９
９５）。簡潔には、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムＤＮＡを、Ｓａｕ３Ａで部
分消化し、５から２０ｋｂの断片についてサイズを選択した。これらの断片を、
ｐＹＭ８のＢａｍＨＩ部位にライゲートした。ライブラリーは、約１００，００
０の独立したＥ．ｃｏｌｉ形質転換体からなり、９０％以上が挿入断片を含む。
挿入断片ＤＮＡの平均サイズは、約１０ｋｂであった。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａゲノムのサイズが１０，０００ｋｂであると仮定して、ライブラリーは、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムＤＮＡの約１００ゲノム等価物を含んだ。プラスミ
ドを回収し、ＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１ｈｉｓ４）をＨｉｓ^＋およびＭｕｔ^＋表現型の両方に同時に再形質転換できるものについて解析した。これらの基準に
適合する１つのプラスミドｐＹＧ２（図９）を、これらの研究に使用するために
選択した。このプラスミドは、７．２ｋｂのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＤＮＡ
挿入断片を含み、Ｍｕｔ補完活性は、２．４ｋｂＳｐｈＩ断片内に存在するこ
とが判明した（図１０）。サザンブロット研究により、ベクターｐＹＧ１および
ｐＹＧ２は、相同ＦＬＤ遺伝子を含むことが示された。かかるブロットの例は、
図１１に示す。この実験で、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のゲノムＤＮＡを、
ＢｇｌＩＩ（Ｂ_２）（レーン１から３）またはＣｌａＩ（Ｃ）（レーン４から６
）で消化し、以下の標識プローブとハイブリッド化させた：ｐＹＧ２（レーン１
および４）、ｐＹＭ８（レーン２および５）、またはｐＹＧ１（レーン３および
６）。推定Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ１遺伝子を含むｐＹＧ２プローブ
は、高ストリンジェントでＢｇｌＩＩおよびＣｌａＩ消化Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａゲノムＤＮＡとそれぞれハイブリッド化させた場合に、から１５ｋｂおよび
から７ｋｂの主なバンドを生じた。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１遺伝子を含
むｐＹＧ１の、低ストリンジェント（３０％ホルムアミド、３７℃ハイブリッド
形成、１×ＳＳＣ、室温洗浄）でのハイブリッド形成により、同サイズの主なハ
イブリッド形成バンドが生じた。これらのバンドは、ｐＹＭ８由来のベクター配
列のハイブリッド形成に起因するものではない。なぜなら、ｐＹＭ８プローブは
、同じ低ストリンジェントな条件下でＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａゲノムＤＮＡと
のハイブリッド形成による主なバンドを全く示さなかったからである。

【００９２】（実施例４）［Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤ１ｐの
熱安定性の比較］クローン化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子が実際にＦＬＤをコードしているさら
なる証拠は、その産物を、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤに対して熱安
定性を比較することにより得られた。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、Ｐ．ｐａｓ
ｔｏｒｉｓよりも有意に高い（４２℃対３０℃）最適増殖温度を有する関連メチ
ロトローフ酵母である。Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＦＬＤは、それ故、Ｐ
．ｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤよりも有意に高い熱安定性を示すことが期待される
。２つの酵母由来の推定ＦＬＤの熱安定性特性の比較により、遺伝子産物の同一
性の強力な支持が提供される。この実験で、推定Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ
．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ１遺伝子は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｆｌｄ１
−１ｈｉｓ４ＭＳ１０５のメタノール増殖細胞中で発現され、各々のＦＬＤ
活性の熱安定性は、株から調製した抽出物を、６０℃で、選択した期間インキュ
ベートし、ＦＬＤ活性の減少速度を決定することにより評価した。遺伝子が実際
にＦｌｄ１ｐをコードする場合、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに発現されるＨ．ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａＦｌｄ１ｐのＦＬＤ失活速度は、野生型Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａＦｌｄ１ｐのそれと類似し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子産物の失活速度
は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦｌｄ１ｐのそれと類似するはずである。

【００９３】この比較を行うために、最初に、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈａＦＬＤの熱安定性が有意に異なることを確立し、推定Ｈ．ｐｏｌｙ
ｍｏｒｐｈａＦＬＤ１遺伝子をクローン化することが必要であった。熱安定性
は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのメタノール
増殖培養物から細胞非含有抽出物を調製し、それらを６０℃でインキュベートす
ることにより決定した。インキュベート中の選択した時間に、抽出物のサンプル
を取り出し、ＦＬＤ活性についてアッセイした。図６に示したように、Ｈ．ｐｏ
ｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ活性は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ活性よりも有意により
熱に安定であった。

【００９４】次いで、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａベクターｐＹＧ２から発現されたＦＬＤの
熱安定性を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓベクターｐＹＧ１由来のＦＬＤの熱安定性と
比較した。図６に示したように、ＭＳ１０５（ｐＹＧ２）のＦＬＤは、野生型Ｈ
．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのそれと類似した熱失活速度を示し、一方、ＭＳ１０５
（ｐＹＧ１）は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのそれと類似した速度を示した。これら
の結果は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ２４１株（およびＭＳ１０５）のＦＬＤ活
性の特異的非存在、およびクローン化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＯＲＦおよびＣ．ｍ
ａｌｔｏｓａＦＬＤの一次アミノ酸配列の高度な類似性を実証した結果と合わ
せて、クローン化ＯＲＦは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦｌｄ１ｐをコードするこ
とが示された。

【００９５】（実施例５）［Ｐ_ＦＬＤ１の解析およびＰ_ＡＯＸ１に対する比較］Ｐ _ＦＬＤ１の転写制御下での遺伝子発現を調べるために、２つのベクターを作
成した（図１）。両方のベクターが、β−ラクタマーゼ（β−ｌａｃ）をコード
している細菌ｂｌａ遺伝子に融合したＦＬＤ１のメチオニンイニシエーターＡＴ
Ｇコドンのちょうど５’から配列が始まっている０．６ｋｂＭｕｎＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片、次いで、ＡＯＸ１転写ターミネーターを含む断片からなる同一の発現
カセットを含んだ。ＭｕｎＩは人工的であり、ＦＬＤ１のメチオニンイニシエー
ターＡＴＧのちょうど５’からの配列と共に、ＭｕｎＩ部位を含んだオリゴヌク
レオチドを使用して、ＰＣＲにより設置された。この位置での制限部位は、β−
ラクタマーゼリポーター遺伝子の５’へのプロモーターの挿入を補助するのに必
要であった。ＭｕｎＩ部位を選択した。なぜなら、ＭｕｎＩで作成したＤＮＡ末
端は、ＥｃｏＲＩと適合性であり、試験ベクターのβ−ラクタマーゼリポーター
のちょうど５’にすでにＥｃｏＲＩが存在していたからである。ＥｃｏＲＩ部位
は、ＦＬＤ１遺伝子の３’末端には配置できなかった。なぜなら、ＦＬＤ１プロ
モーター領域は天然ＥｃｏＲＩ部位を有するからである。

【００９６】１つのベクターのｐＳＳ０４０は、Ｐ _ＦＬＤ１断片内に独特なＮｓｉＩ制限部
位を含んだ。この部位で切断し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換すると、ベク
ターは、Ｐ _ＦＬＤ１遺伝子座で効率的に組込まれた。この組込み事象の結果は、Ｐ _ＦＬＤ１ −ｂｌａ発現カセットであり、これはまたＰ _ＦＬＤ１断片の上流に天
然ＦＬＤ１配列も含んだ（ＷＴ−Ｐ _ＦＬＤ１−ｂｌａ）。ＦＬＤ１の転写制御に
必要な全ての配列がＦＬＤ１ＯＲＦの５’に位置すると仮定すると、この株で
のｂｌａおよびＦＬＤ１発現の調節は、ほぼ同一であるべきである。表２に示す
ように、これは、株でのβ−ｌａｃおよびＦＬＤ活性の相対レベルが、４つの発
現試験培地中で増殖した細胞で類似していた点で真実のようであった。これらの
４つの培地は、炭素および窒素源としてそれぞれ：（１）グルコースおよび硫酸
アンモニウム（Ｇ／ＮＨ_４ ^＋）、（２）グルコースおよびメチルアミン（Ｇ／Ｍ
Ａ）、（３）メタノールおよび硫酸アンモニウム（Ｍ／ＮＨ_４ ^＋）、および（４
）メタノールおよびメチルアミン（Ｍ／ＭＡ）を含んだ。期待される通り、β−
ｌａｃおよびＦＬＤ活性は、Ｇ／ＮＨ_４ ^＋培地上で増殖した細胞で高度に抑制さ
れていた。Ｇ／ＭＡまたはＭ／ＮＨ_４ ^＋培地上で増殖した細胞は、少なくとも１
０倍以上のβ−ｌａｃおよびＦＬＤを含み、両酵素の最も高いレベルがＭ／ＭＡ
培地で増殖させた細胞で観察された。

【００９７】第二ベクターのｐＳＳ０５０は、選択マーカーとしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＨＩＳ４遺伝子を含んだ。ＨＩＳ４内の独特なＳａｌＩ部位で切断し、Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓで形質転換すると、このベクターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＨＩ
Ｓ４遺伝子座で効率的に取込まれた。この組込み事象の結果は、０．６−ｋｂＰ _ＦＬＤ１ −断片のちょうど５’のｐＢＲ３２２由来の配列をもつＰ _ＦＬＤ１−ｂ
ｌａ発現カセットであった（ｐＢ−Ｐ _ＦＬＤ１−ｂｌａ）。この株のβ−ｌａｃ
活性レベルと、ＷＴ−Ｐ _ＦＬＤ１−ｂｌａ株で観察された活性レベルの比較によ
り、０．６ｋｂ断片は正常な調節に必要な全ての上流調節配列を含むかの評価が
可能となった。表２は、各４つの発現試験培地中で増殖させた場合、ｐＢ−Ｐ_Ｆ _ＬＤ１ −ｂｌａ株のβ−ｌａｃ活性レベルが、ＷＴ−Ｐ _ＦＬＤ１−ｂｌａ株で観
察されたレベルの約２倍高かったことを示す。これらの結果は、正常な調節に必
要なほとんどの配列が、Ｐ _ＦＬＤ１断片内に存在するが、Ｐ _ＦＬＤ１を約２倍の
率で構成的に抑制するその配列は、Ｐ _ＦＬＤ１断片のいずれかの５’に存在し、
０．６ｋｂ断片にはないことを示した。

【００９８】最後に、Ｐ _ＦＬＤ１制御下で産生されたβ−ｌａｃ活性レベルを、ｂｌａ発現
がＰ _ＡＯＸ１の転写制御下にある株のものと比較した（Ｗａｔｅｒｈａｍら、１
９９７）。以前に報告されたように、Ｐ _ＡＯＸ１発現は、グルコース含有培地で
強力に抑制され、メタノール含有培地で高度かつ特異的に誘導される（Ｔｓｃｈ
ｏｐｐら、１９８７；Ｗａｔｅｒｈａｍら、１９９７）（表２）。同等なレベル
のβ−ｌａｃが、Ｍ／ＮＨ_４ ^＋またはＭ／ＭＡ培地中で増殖させたＷＴ−Ｐ_ＦＬ _Ｄ１ −ｂｌａ株の細胞に存在し、一方、ｐＢ−Ｐ_ＦＬＤ１ −ｂｌａ株の細胞は、Ｐ _ＡＯＸ１ −ｂｌａ株のレベルよりも有意に高いβ−ｌａｃレベルを含んだ。特
に注目されるのは、Ｍ／ＮＨ_４ ^＋およびＭ／ＭＡ培地上のｐＢ−Ｐ _ＦＬＤ１−ｂ
ｌａ株のβ−ｌａｃであり、これは一貫して、同培地上のＰ _ＡＯＸ１−ｂｌａ株
で観察されたものの約２倍であった。

【００９９】（実施例６）ＦＬＤ１遺伝子は、ホルムアルデヒドに対する耐性を付与するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１遺伝子を、Ｚｅｏ ^Ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、カールスバート、カリフォルニア）を含むｐＰＩＣＺベクターに取込んだ。２
つの該ｐＰＩＣＺ−ＦＬＤ１ベクターを作成した。１つに、ＦＬＤ１プロモータ
ーを含む全ＦＬＤ１遺伝子、構造遺伝子および転写ターミネーターを挿入した（
ｐＰ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１）。他方には、ＦＬＤ１構造遺伝子（および転写ターミ
ネーター）を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子（ＧＡＰ）プロモーター（ｐＰ_ＧＡＰ−ＦＬＤ１）の制御下に配
置した。これらの２つのプラスミドを、そのそれぞれのプロモーター断片（Ｐ_Ｆ _ＬＤ１、Ｐ_ＧＡＰ）内で線形化し、電気穿孔法により野生型およびＭＳ１０５（ｆｌｄ１−１ｈｉｓ４）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株に形質転換し、１００μｇ／
ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌでゼオシンに対する耐性についての選択した。低い方の
ゼオシン濃度は、１つの組込みＺｅｏ ^Ｒベクターコピーを有するＰ．ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ形質転換体を選択し、一方、高い方のゼオシン濃度は、複数の組込みＺｅ
ｏ ^Ｒベクターコピーを有する形質転換体を選択する。各々の型の選択された形質
転換体を、１００ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含むＹＰＤ培地プ
レート上および０から３０ｍＭの範囲の濃度のホルムアルデヒドを含むＹＰＤプ
レートのセットに画線した。対照として、ｐＰＩＣＺベクターのみで形質転換し
た（すなわちＦＬＤ１遺伝子を含まない）野生型およびＧＳ２４１株もまたプレ
ート上に画線した。

【０１００】ｐＰＩＣＺのみで形質転換したＭＳ１０５株は、１ｍＭホルムアルデヒドに対
して耐性であった。１コピーのｐＰ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰ_ＧＡＰ−ＦＬ
Ｄ１を含むＭＳ１０５由来株は、１０ｍＭおよび５ｍＭホルムアルデヒドにそれ
ぞれ耐性であり、一方、複数コピーのｐＰ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰ_ＧＡＰ −ＦＬＤ１を含むＭＳ１０５由来株は、３０ｍＭおよび１０ｍＭホルムアルデヒ
ドに対してそれぞれ耐性であった。従って、Ｐ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰ_Ｇ _ＡＰ −ＦＬＤ１ベクターは、ホルムアルデヒドに対する耐性の増加を付与した。
さらに、追加の効果が明らかとなり、各々のベクターのコピー数の増加により、
各ベクターの１コピーにより付与される耐性レベル以上に、ホルムアルデヒドに
対する耐性レベルは増加した。

【０１０１】ｐＰＩＣＺのみで形質転換した野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株は、５ｍＭホル
ムアルデヒドに対して耐性であった。野生型株は、ＦＬＤ１遺伝子の１つの天然
コピーを含むので、この株に対するホルムアルデヒドの濃度は、期待されるより
も有意に高かった。１コピーのｐＰ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰ_ＧＡＰ−ＦＬ
Ｄ１を含む野生型由来株は、１０および５ｍＭホルムアルデヒドにそれぞれ耐性
であり、一方、複数コピーのｐＰ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰ_ＧＡＰ−ＦＬＤ
１を含む野生型由来株は、３０ｍＭホルムアルデヒドにそれぞれ耐性であった。
従って、ｐＰ_ＧＡＰ−ＦＬＤ１ではなくｐＰ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１ベクターは、ホ
ルムアルデヒドに対する耐性の増加を付与した。さらなる効果も明らかとなり、
各々のベクターのコピー数の増加は、各ベクターの１コピー以上に、ホルムアル
デヒドに対する耐性レベルの増加を付与した。

【０１０２】これらの形質転換実験は、ｐＰ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１およびｐＰ_ＧＡＰ−ＦＬＤ
１ベクター並びにホルムアルデヒドに対する耐性を直接選択する野生型およびＭ
Ｓ１０５Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株（対照としてゼオシン耐性の選択と共に）を用
いて繰返した。ＭＳ１０５株では、２ｍＭホルムアルデヒドが形質転換体の選択
に最適であった。この濃度のホルムアルデヒドは、１００μｇ／ｍｌゼオシン選
択対照を用いて観察したのとほぼ同数の形質転換体を産生した。野生型Ｐ．ｐａ
ｓｔｏｒｉｓには、７ｍＭホルムアルデヒドが、ｐＰ_ＦＬＤ１−ＦＬＤ１ベクタ
ーをもつ形質転換体の選択に最適であった。この濃度は、１００μｇ／ｍｌのゼ
オシン選択対照を用いて観察したのとほぼ同数の形質転換体を産生した。形質転
換体は、ｐＰ_ＧＡＰ−ＦＬＤ１ベクターでは観察されなかった。

【０１０３】これらの陽性結果に基づいて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターを作成した
。ベクターは、異種遺伝子を挿入できるマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に
より分離されているＡＯＸ１プロモーターおよび転写ターミネーターを含むＤＮ
Ａ断片からなる異種遺伝子発現カセットを含む。発現カセットの次に、Ｐ _ＧＡＰ −ＦＬＤ１遺伝子作成物を含むＤＮＡセグメントが続き、このセグメントの次に
、ＡＯＸ１遺伝子の３’配列由来のＤＮＡ断片が続く。このセットのＤＮＡ断片
を、細菌プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン、サンディエゴ、
カリフォルニア）に挿入し、よってベクターはＥ．ｃｏｌｉで増殖させることが
できる。

【０１０４】異種遺伝子をＭＣＳに挿入した後、得られたベクターを、制限酵素ＮｏｔＩで
切断し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓを形質転換できるＤＮＡ断片を細菌プラスミドか
ら放出させる。断片を、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの野生型またはＭＳ１０５（ｆｌ
ｄ１−１）株に、電気穿孔法により形質転換し、形質転換体を、野生型株につい
ては７ｍＭホルムアルデヒドまたはＭＳ１０５ｆｌｄ１株については２ｍＭを
含むＹＰＤ培地プレート上で選択した。ベクター断片は、２つの方法の１つで、
それ自体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに挿入する。第一は、ＡＯＸ１遺伝子を
置換する遺伝子置換事象による。ホルムアルデヒドに対する耐性の増加に加えて
、該遺伝子置換形質転換体は、ＡＯＸ１遺伝子の非存在に起因するメタノール上
での非常に遅い増殖速度から、容易に表現型により同定できる。

【０１０５】ベクターのそれ自体をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムに挿入する別の方法は、組
込み前の同じ点での形質転換断片の線形化を含む。線形化後、形質転換ＤＮＡは
、ベクターに示されるＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノム遺伝子座のいずれかで１回の
交差事象により組込むことができる。これらのゲノム領域は、ＦＬＤ１、ＡＯＸ
１プロモーターおよびＡＯＸ１３’フランキング遺伝子座を含む。これらの部
位のいずれかでの組込みにより、ホルムアルデヒドに対する耐性の増加以外は株
表現型に変化は生じなかった。任意の方法でのこの断片の組込みにより、そのタ
ンパク質産物を所望する異種遺伝子の例外を除く、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓに外来
性の抗生物質耐性遺伝子または任意の他の遺伝子の取り込みが生じないように注
意することは重要である。

【０１０６】（参照文献）Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．（１９７６）タンパク質−染料結合という原則を利用し
た、タンパク質のマイクログラム量定量化の急速で鋭敏な方法。Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４．Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．メチルトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓでの
発現（１９９８）Ｊ．ＦｅｒｎａｎｄｅｚとＪ．Ｈｏｅｆｆｌｅｒ（編），Ｎａ
ｔｕｒｅ：発現技術のパレット、第１０章．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，サ
ンディエゴ，印刷中．よりＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．，Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｈａｓｓｅｌｅｒ
，Ａ．Ｙ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｋ．Ｒ．（１９８５）形質転換のホスト機構とし
てのＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，３３
７６．Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．とＲｕｓｓｅｌｌ，Ｋ．Ａ．形質転換（１９９８）Ｄ．Ｒ
．ＨｉｇｇｉｎｓとＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ（編）分子生物学の方法：Ｐｉｃｈｉａ
プロトコール、第３章、Ｈｕｍａｎａｐｒｅｓｓ，トトワ，ニュージャージー
，ｐｐ．２７−３９．よりＤｏｍｄｙ，Ｈ．，Ａｐｏｓｔｏｌ，Ｂ．，Ｌｉｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｎｅｗｍ
ａｎ．Ａ．，Ｂｒｏｄｙ，Ｅ．及びＡｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．（１９８４）投げな
わ構造がイーストｐｒｅ−ｍＲＮＡスプライシング時のｉｎｖｉｖｏ中間体に
ある．Ｃｅｌｌ３９，６１１−６２１．Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｄｕｓｈ，Ｍ．Ｋ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒ．（
１９８８）稀少な転写物からのｃＤＮＡ完全長の急速な産出：一本鎖の遺伝子
特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使っての増幅：Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５，８９９８−９００２．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．とＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．（１９８８）分子生物学の方
法：Ｐｉｃｈｉａプロトコール、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，トトワ，ニュージ
ャージー，ｐｐ．１−１５．Ｈｏｌｍｑｕｉｓｔ，Ｂ．とＶａｌｌｅｅ，Ｂ．Ｌ．（１９９１）ヒト肝臓クラ
スＩＩＩアルコール・グルタチオン依存ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼは同
一酵素である．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７
８，１３７１−１３７７．Ｊｏｒｎｖａｌｌ，Ｈ．，Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．及びＪｅｆｆｅｒｙ，Ｊ．（
１９８７）アルコール／ポリオールデヒドロゲナーゼの特性：亜鉛含有長鎖アル
コールデヒドロゲナーゼ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６７，１９５−２０
１．Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ，Ｍ．，Ｂａｒｍａｎｎ，Ｍ．及びＵｏｔｉｌａ，Ｌ．（
１９８９）グルタチオン依存ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼとクラスＩＩＩ
アルコールデヒドロゲナーゼの同一性の証拠．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２５７，１
０５−１０９．Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｆ．とＣｏｅｎ，Ｄ．Ｍ．ポリメラーゼ連鎖反応．（１９９
５）Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，
Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ及び
Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（編）分子生物学の最新プロトコール、第２巻、第１５章．Ｊ
ｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ニューヨーク，ｐｐ．１５．１．１−
１５．１．９．よりＬｉｕ，Ｈ．，Ｔａｎ，Ｘ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｋ．Ａ．，Ｖｅｅｎｈｕｉ
ｓ，Ｍ．及びＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．（１９９５）ＰＥＲ３，Ｐｉｃｈｉａｐａ
ｓｔｏｒｉｓでペルオキシソーム生体発生のために必要な、タンパク移入に関与
するペルオキシソーム膜タンパクをコードする遺伝子．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７０，１０９４０−１０９５１．Ｌｕｅｃｋ，Ｈ．カタラーゼ（１９６３）Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ（編），
酵素的分析手法，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，サンディエゴ，ｐｐ．８８５
−８９４．よりＲａｔｈｎａｇｉｒｉ，Ｐ．，Ｋｒｕｇ，Ｊ．Ｆ．，Ｋｏｚａｋ，Ｃ．，
Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｔ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｅｕａｎｅｚ，Ｈ．
Ｎ．及びＧｏｌｄｍａｎ，Ｄ．（１９８９）ヒトのクラスＩＩＩアルコールデヒ
ドロゲナーゼｃＤＮＡのクローニングと比較的マッピング．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６４，４５３−４６０．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．（１９８９）分子クローニング：実験マニュアル，第２版．ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，コールドスプリ
ングハーバー，ＮＹ．Ｓａｓｎａｕｋａｓ，Ｋ．，Ｊｏｍａｎｔｉｅｎｅ，Ｒ．，Ｊａｎｕｓｋａ
，Ａ．，Ｌｅｂｅｄｉｅｎｅ，Ｅ．，Ｌｅｂｅｄｙｓ，Ｊ．及びＪａｎｕｌ
ａｉｔｉｓ，Ａ．（１９９２）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｕｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅにホルムアルデヒド耐性を与えるＣａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ遺伝子の
クローニングとシークエンシング分析．Ｇｅｎｅ１２２，２０７−２１１．
Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．Ａ．及びＴｒｕｍｐｏｗｅｒ，Ｂ．
Ｌ．（１９９０）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＲ
ＮＡの調製のための迅速で簡便な手法．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１８，３０９１−３０９２．Ｓｃｈｕｔｔｅ，Ｈ．，Ｆｌｏｓｓｄｏｒｆ，Ｊ．，Ｓａｈｍ，Ｈ．及びＫ
ｕｌａ，Ｍ．Ｒ．（１９７６）Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ由来のホルム
アルデヒドデヒドロゲナーゼと蟻酸デヒドロゲナーゼの精製と特質．Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２，１５１−１６０．Ｓｉｂｉｒｎｙ，Ａ．Ａ．，Ｕｂｉｙｖｏｖｋ，Ｖ．Ｍ．，Ｇｏｎｃｈａｒ
，Ｍ．Ｖ．，Ｔｉｔｏｒｅｎｋｏ，Ｖ．Ｉ．，Ｖｏｒｏｎｏｖｓｋｙ，Ａ．Ｙ
．，Ｋａｐｕｌｔｓｅｖｉｃｈ，Ｙ．Ｇ．及びＢｌｉｚｎｉｋ，Ｋ．Ｍ．（１
９９０）ＣＯ_２への直接的なホルムアルデヒド酸化反応は酵母のメチルトローフ
成長のエネルギー供給に非必須である．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１５４
，５６６−５７５．Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．メチルトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
ｒｉｓにおけるタンパク質発現と分泌の最適化のための戦略．（１９９３）Ｒ．
Ｈ．Ｂａｌｔｓ，Ｇ．Ｄ．Ｈｅｇｍａｎ，及びＰ．Ｌ．Ｓｋａｔｒｕｄ（編）
，産業的微生物：基礎及び応用分子遺伝学．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ワシントン，ＤＣ，ｐｐ．１１９−１２
６．よりＳｔｅｗａｒｔ，Ｐ．，Ｋｅｒｓｔｅｎ，Ｐ．，Ｗｙｍｅｌｅｎｂｅｒｇ，
Ａ．Ｖ．，Ｇａｓｋｅｌｌ，Ｊ．及びＣｕｌｌｅｎ，Ｄ．（１９９２）Ｐｈａ
ｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍのリグニンペルオキシソー
ム遺伝子ファミリー：炭素・窒素限定による複合体制御、及び二形性染色体の同
定．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４、５０３６−５０４２．Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｒｕｓｔ，Ｐ．Ｆ．，Ｃｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．
，Ｓｔｉｌｌｍａｎ，Ｃ．Ａ．及びＧｉｎｇｅｒａｓ，Ｔ．Ｒ．（１９８７）Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおける２つのメタノール調節性プロモーター
由来のｌａｃｚ遺伝子の発現．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１５，３８
５９−３８７６．ｖａｎＤｉｊｋｅｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｈａｒｄｅｒ，Ｗ．，Ｂｅａｒｄｓｍｏ
ｒｅ，Ａ．Ｊ．及びＱｕａｙｌｅ，Ｊ．Ｒ．（１９７８）ジヒドロキシアセトン
：酵母によるメタノール同化作用における中間体か？ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４，９７−１０２．ｖａｎＤｉｊｋｅｎ，Ｊ．Ｐ．（１９７６）Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍ
ｏｒｐｈａによるメタノールの酸化：メタノールオキシダーゼの精製と動態学的
特性．学位論文，フローニンゲン大学，ｐｐ．３０−４３ｖａｎｄｅｒＫｌｅｉ，Ｉ．Ｊ．，Ｂｙｓｔｒｙｋｈ，Ｌ．Ｖ．及びＨａ
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の重要性．Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４，１−８２．Ｗａｉｔｅｓ，Ｍ．Ｊ．とＱｕａｙｌｅ，Ｊ．Ｒ．（１９８１）メチルトローフ
酵母Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉにおけるトランスケトラーゼとジヒドロ
キシアセトンシンターゼの活性の間の相互関係．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．１２４，３０９−３１６．Ｗａｔｅｒｈａｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｋｅｉｚｅｒ−Ｇｕｎｎｉｎｋ，Ｉ．，Ｇｏ
ｏｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｈａｒｄｅｒ，Ｗ．及びＶｅｅｎｈｕｉｓ，Ｍ．（１
９９２）Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉのオレイン酸−メタノール限定連続
培養における多目的ペルオキシソームの発生．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１７４
，４０５７−４０６３．Ｗａｔｅｒｈａｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｄｉｇａｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｋｏｕｔｓ，Ｐ．Ｊ
．，Ｌａｉｒ，Ｓ．Ｖ．及びＣｒｅｇｇ，Ｊ．Ｍ．（１９７７）Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の単離
とそのプロモーターの使用．Ｇｅｎｅ１８６，３７−４４．Ｚｗａｒｔ，Ｋ．，Ｖｅｅｎｈｕｉｓ，Ｍ．，ｖａｎＤｉｊｋｅｎ，Ｊ．
Ｐ．及びＨａｒｄｅｒ，Ｗ．（１９８０）唯一の窒素源としてメチルアミン存在
下、グルコースで育成中の酵母におけるアミンオキシダーゼ含有ペルオキシソー
ムの発生．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２６，１１７−１２６．

【０１０７】（表１）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのメタノール利用欠損変異体の相対酵素活性レベル

【表１】 ^ａ各酵素の活性は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのメタノール増殖培養物から調
製した抽出物で観察される活性の％として表現する。略称は：ＡＯＸ、アルコー
ルオキシダーゼ；ＣＡＴ、カタラーゼ；ＦＬＤ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ；ＦＤＨ、蟻酸デヒドロゲナーゼ；ＤＡＳ、ジヒドロキシアセトンシンター
ゼ；ＤＡＫ、ジヒドロキシアセトンキナーゼである。

【０１０８】^ｂ決定せず。

【０１０９】（表２）Ｐ _ＦＬＤおよびＰ _ＡＯＸ１の制御下でｂｌａを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株
の抽出物でのβ−ラクタマーゼ活性の比較

【表２】 ^ａ各株は、炭素源としてグルコース（Ｇ）またはメタノール（Ｍ）および窒素源
として硫酸アンモニウム（ＮＨ_４ ^＋）またはメチルアミン（ＭＡ）を含む培地中
で増殖させた。

【０１１０】^ｂ β−ラクタマーゼ活性は、ｎｍｏｌ／ｍｇ／分として、および括弧内には、メ
タノールおよびメチルアミン上で増殖させた野生型Ｐ _ＦＬＤ１−ｂｌａ株で見ら
れる活性の％として表現する。活性は、２つの独立的に形質転換した株を使用し
た３つの実験の平均を示す。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、選択したプラスミドｐＨＷ０１８、ｐＳＳ０５０、ｐＫ３２１、およ
びｐＳＳ０４０の物理地図を提供する。

【図２】図２は、ＦＬＤ１遺伝子含有ベクターｐＹＧ１の制限酵素地図である。

【図３】図３Ａは、ＦＬＤ１遺伝子のエキソン解析を示す。非スプライス（ゲノム）お
よびスプライス（ｃＤＮＡ）ＤＮＡのＰＣＲから期待される産物の図が示される
。ＰＣＲ反応に使用したハイブリッド化プライマーの位置は収束矢印として示す
。図３Ｂは、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ反応産物の電気泳動図である。ＰＣＲ反
応は、以下を用いて実施した：レーン１、ゲノムＤＮＡ鋳型と両方のプライマー
；レーン２、ｃＤＮＡ鋳型と両方のプライマー；レーン３、ｃＤＮＡ鋳型と５’
プライマーのみ；レーン４、ｃＤＮＡ鋳型と３’プライマーのみ；レーン５、両
方のプライマーでＤＮＡ鋳型はなし。側方のマーカーバンドは塩基対で示す。

【図４】図４は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１遺伝子およびその産物のヌクレオチ
ドおよび推論アミノ酸配列である。

【図５】図５は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａＦＬＤタンパク質
の予測アミノ酸配列の比較である。配列をＰＣ遺伝子ソフトウェアを使用して整
列させた。配列間の文字「＊」は、同一の残基を示す。文字「．」は、類似残基
を示す。類似残基は、Ａ、Ｓ、Ｔ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｒ、Ｋ；Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ；
Ｆ、Ｙ、Ｗとして規定する。

【図６】図６は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来の推定Ｆ
ＬＤ１遺伝子で形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株のホルムアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ活性の熱安定性をグラフで示す。株は、野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
（■）；野生型Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（●）；Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＭＳ
１０５（ｐＹＧ１）（□）；およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＭＳ１０５（ｐＹＧ
２）（○）である。

【図７】図７Ａは、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＦＬＤ１遺伝子の制限地図であ
る。

【図８】図８は、Ｐ _ＦＬＤ１の制限地図である。

【図９】図９は、ＨａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＦＬＤ遺伝子含有ベク
ターｐＹＧ２の制限酵素地図である。

【図１０】図１０は、ＦＬＤ遺伝子を含むＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａＤＮＡ断片の制限
地図である。

【図１１】図１１は、ＢｇｌＩＩ（Ｂ_２）（レーン１から３）またはＣｌａＩ（Ｃ）（レ
ーン４から６）で消化し、以下のプローブ：ｐＹＧ２（レーン１および４）、ｐ
ＹＭ８（レーン２および５）、またはｐＹＧ１（レーン３および６）とハイブリ
ッド化させたＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のゲノムＤＮＡを示すサザンブロッ
トである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クレッグ、ジェイムズエム．アメリカ合衆国 97229 オレゴン州ポートランドエヌ．ダブリュー．ワンハンドレッドトゥエンティサードプレイス 3080 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA17 BA08 CA01 FA02 GA11 GA16 4B050 CC03 DD04 LL02 LL05 4B063 QA01 QA18 QQ07 QQ24 QR69 QS24 QX01 4B065 AA72X AA73X AA77Y AA82X AB01 AC14 AC20 BA02 BB12 CA28 CA41 CA56

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ＦＬＤ）を含む単離核酸。
【請求項２】メチロトローフ酵母由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ＦＬＤ）を含む単離核酸であって、上記単離核酸は、低ストリンジェ
ントな条件下で、配列番号１に示したヌクレオチド配列、配列番号５に示したヌ
クレオチド配列、または配列番号１または５に示したヌクレオチド配列に相補的
なヌクレオチド配列の少なくとも１つにハイブリッド化する上記単離核酸。
【請求項３】約２Ｋｂから約３．５ｋｂの長さを有する、請求項２の単離
核酸。
【請求項４】約２．５ｋｂから約３．５ｋｂの長さを有する、請求項２の
単離核酸。
【請求項５】図７に示す制限地図を有する、または図１０の斜交平行線模
様領域に示した制限地図を有するＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸。
【請求項６】メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸であ
って、上記単離核酸は、配列番号５に示したヌクレオチド配列と比較すると、約
７０％から約８５％の配列相同性をもつコード配列を有する、上記単離核酸。
【請求項７】メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸であ
って、上記単離核酸は、配列番号５に示したヌクレオチド配列と比較すると、約
８５％から約９５％の配列相同性もつコード配列を有する、上記単離核酸。
【請求項８】メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸であ
って、上記単離核酸は、配列番号５に示したヌクレオチド配列と比較すると、約
９５％以上の配列相同性もつコード配列を有する、上記単離核酸。
【請求項９】配列番号１または配列番号５に示した配列を含む単離核酸。
【請求項１０】ＦＬＤプロモーターを含むメチロトローフ酵母由来の単離
核酸であって、上記プロモーターはＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置
し、上記ＦＬＤ遺伝子のコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列の
ヌクレオチド配列と比較すると約７０％から約８５％の配列相同性を有する、上
記単離核酸。
【請求項１１】ＦＬＤプロモーターを含むメチロトローフ酵母由来の単離
核酸であって、上記プロモーターはＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置
し、上記ＦＬＤ遺伝子のコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列の
ヌクレオチド配列と比較すると約８５％から約９５％の配列相同性を有する、上
記単離核酸。
【請求項１２】ＦＬＤプロモーターを含むメチロトローフ酵母由来の単離
核酸であって、上記プロモーターはＦＬＤ遺伝子の翻訳開始コドンの上流に位置
し、上記ＦＬＤ遺伝子のコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列の
ヌクレオチド配列と比較すると約９５％以上の配列相同性を有する、上記単離核
酸。
【請求項１３】約６００塩基対以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１
０〜１２のいずれか１つの単離核酸。
【請求項１４】配列番号３に示した配列を含む単離核酸。
【請求項１５】図８に示した制限地図を有するＦＬＤプロモーターを含む
単離核酸。
【請求項１６】メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離
核酸であって、上記３’終結配列はＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流に位置
し、上記ＦＬＤ遺伝子のコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列の
ヌクレオチド配列と比較すると約７０％から約８５％の配列相同性を有する、上
記単離核酸。
【請求項１７】メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離
核酸であって、上記３’終結配列はＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流に位置
し、上記ＦＬＤ遺伝子のコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列の
ヌクレオチド配列と比較すると約８５％から約９５％の配列相同性を有する、上
記単離核酸。
【請求項１８】メチロトローフ酵母由来のＦＬＤ３’終結配列を含む単離
核酸であって、上記３’終結配列はＦＬＤ遺伝子の翻訳終止コドンの下流に位置
し、上記ＦＬＤ遺伝子のコード配列は、配列番号５に示したＦＬＤコード配列の
ヌクレオチド配列と比較すると約９５％以上の配列相同性を有する、上記単離核
酸。
【請求項１９】３’終結は、約３００塩基対以上のヌクレオチド配列を含
む、請求項１６〜１８のいずれか１つの単離核酸。
【請求項２０】配列番号４に示した配列を含む単離核酸。
【請求項２１】ＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸であって、上記ＦＬＤ遺伝子
は、配列番号２に示したアミノ酸配列と比較すると約３０％から約４９％のアミ
ノ酸配列同一性を有する産物をコードする、上記単離核酸。
【請求項２２】ＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸であって、上記ＦＬＤ遺伝子
は、配列番号２に示したアミノ酸配列と比較すると約５０％から約９０％のアミ
ノ酸配列同一性を有する産物をコードする、上記単離核酸。
【請求項２３】ＦＬＤ遺伝子を含む単離核酸であって、上記ＦＬＤ遺伝子
は、配列番号２に示したアミノ酸配列と比較すると約９０％以上のアミノ酸配列
同一性を有する産物をコードする、上記単離核酸。
【請求項２４】ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または３’
終結配列の少なくとも１つを含む単離核酸であって、上記ＦＬＤ遺伝子は、配列
番号２に示したアミノ酸配列と比較すると約３０％から約４９％のアミノ酸配列
同一性を有する産物をコードする、上記単離核酸。
【請求項２５】ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または３’
終結配列の少なくとも１つを含む単離核酸であって、上記ＦＬＤ遺伝子は、配列
番号２に示したアミノ酸配列と比較すると約５０％から約９０％のアミノ酸配列
同一性を有する産物をコードする、上記単離核酸。
【請求項２６】ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または３’
終結配列の少なくとも１つを含む単離核酸であって、上記ＦＬＤ遺伝子は、配列
番号２に示したアミノ酸配列と比較すると約９０％以上のアミノ酸配列同一性を
有する産物をコードする、上記単離核酸。
【請求項２７】ＦＬＤ遺伝子由来のプロモーター、コード配列または３’
終結配列の少なくとも１つを含む単離核酸であって、上記ＦＬＤ遺伝子は、配列
番号２に示したアミノ酸配列を有する産物をコードする、上記単離核酸。
【請求項２８】請求項１〜１２、１４〜１８、または２０〜２７のいずれ
か１つの単離核酸を含むベクター。
【請求項２９】請求項１〜１２、１４〜１８、または２０〜２７のいずれ
か１つの単離核酸を含む宿主細胞。
【請求項３０】請求項２８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１】宿主細胞は細菌細胞または酵母細胞である、請求項２９の
宿主細胞。
【請求項３２】宿主細胞は細菌細胞または酵母細胞である、請求項３０の
宿主細胞。
【請求項３３】請求項１０〜１２または２４〜２６のいずれか１つのプロ
モーターを含む発現カセットであって、上記プロモーターは、異種遺伝子をコー
ドする核酸に作動可能に連結されている、上記発現カセット。
【請求項３４】異種遺伝子は、ヒト血清アルブミン、インベルターゼ、ウ
シリゾチーム、ヒトＥＧＦ、マウスＥＧＦ、アプロチニン、クニッツプロテアー
ゼ阻害剤、Ｂ型肝炎表面抗原、腫瘍壊死因子、破傷風毒素断片Ｃ、百日咳抗原Ｐ
６９、ストレプトキナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ属
の種の結晶タンパク質毒素である、請求項３３の発現カセット。
【請求項３５】３’終結配列をさらに含む、請求項３３の発現カセット。
【請求項３６】請求項１０〜１２または２４〜２６のいずれか１つのプロ
モーターを含む発現カセットであって、上記プロモーターは、異種遺伝子をコー
ドする核酸に作動可能に連結され、異種遺伝子をコードする核酸は、その３’末
端で、請求項１６〜１８または２４〜２６の３’終結配列のいずれか１つに作動
可能に連結されている、上記発現カセット。
【請求項３７】３’終結配列は、ＡＯＸ１遺伝子、ｐ４０遺伝子、またはＨＩＳ４遺伝子の配列である、請求項３５の発現カセット。
【請求項３８】請求項３３に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項３９】請求項３５に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項４０】請求項３６に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項４１】請求項３７に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項４２】請求項３３に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項４３】請求項３５に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項４４】請求項３６に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項４５】請求項３７に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項４６】請求項３８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４７】請求項３９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４８】請求項４０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４９】請求項４１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５０】上記宿主細胞はメチロトローフ酵母細胞である、請求項４
６の宿主細胞。
【請求項５１】上記宿主細胞はメチロトローフ酵母細胞である、請求項４
７の宿主細胞。
【請求項５２】上記宿主細胞はメチロトローフ酵母細胞である、請求項４
８の宿主細胞。
【請求項５３】上記宿主細胞はメチロトローフ酵母細胞である、請求項４
９の宿主細胞。
【請求項５４】メチロトローフ酵母細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉ
ｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属由来である、請
求項４６の宿主細胞。
【請求項５５】メチロトローフ酵母細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉ
ｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属由来である、請
求項４７の宿主細胞。
【請求項５６】メチロトローフ酵母細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉ
ｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属由来である、請
求項４８の宿主細胞。
【請求項５７】メチロトローフ酵母細胞は、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉ
ｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属由来である、請
求項４９の宿主細胞。
【請求項５８】メチロトローフ酵母で異種遺伝子の発現を指令する方法で
あって、ａ）メチロトローフ酵母細胞に、メチロトローフ酵母から単離したＦＬＤプロ
モーターを含む単離核酸を導入すること、ここでの上記プロモーターは、その３
’末端で、異種遺伝子の５’末端に作動可能に連結し、上記異種遺伝子は、その
３’末端で、メチロトローフ酵母で機能する終結配列の５’末端に作動可能に連
結しており；ｂ）上記メチロトローフ酵母細胞を、グリセロールまたはグルコースなどの適
切な炭素源を有し、およびアンモニウム塩または水酸化アンモニウムなどの適切
な窒素源を有する培地で増殖させること、および炭素または窒素源が枯渇した後
；ｃ）上記異種遺伝子の発現を、メタノール或いはメチルアミンまたはメタノー
ルおよびメチルアミンの両方の添加により誘導することを含む、上記方法。
【請求項５９】メチロトローフ酵母で異種遺伝子の発現を指令する方法で
あって、ａ）メチロトローフ酵母細胞に、メチロトローフ酵母から単離したＦＬＤプロ
モーターを含む単離核酸を導入すること、ここでの上記プロモーターは、その３
’末端で、異種遺伝子の５’末端に作動可能に連結し、上記異種遺伝子は、その
３’末端で、メチロトローフ酵母で機能する終結配列の５’末端に作動可能に連
結しており；ｂ）上記メチロトローフ酵母細胞を、グリセロールまたはグルコースなどの適
切な炭素源を有し、アンモニウム塩または水酸化アンモニウムなどの適切な窒素
源を有する培地で増殖させること、および炭素または窒素源が枯渇した後；ｃ）上記異種遺伝子の発現を、ホルムアルデヒド、蟻酸、またはメチル化アミ
ンの添加により誘導することを含む、上記方法。
【請求項６０】メチル化アミンはコリンである、請求項５９の方法。
【請求項６１】ホルムアルデヒド耐性宿主細胞を選択する方法であって、ａ）メチロトローフ酵母細胞を、ＦＬＤ遺伝子を含むベクターで形質転換する
こと、ここでの上記ＦＬＤ遺伝子は、その５’末端上で、上記酵母細胞で機能す
るＦＬＤプロモーターまたは異種プロモーターに作動可能に連結し、上記ＦＬＤ
遺伝子は、その３’末端で、上記酵母細胞で機能する３’終結配列に作動可能に
連結しており；ｂ）ホルムアルデヒドの存在下で上記宿主細胞を増殖させ；およびｃ）ホルムアルデヒドの存在下で増殖する形質転換酵母細胞を選択することを
含む、上記方法。
【請求項６２】ＦＬＤ遺伝子（ｆｌｄ）の欠損したメチロトローフ酵母株
。
【請求項６３】上記株は、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ２４１
（ｆｌｄ１−１）である、請求項６２に記載のメチロトローフ酵母株。
【請求項６４】ＦＬＤ遺伝子が欠損し、別の生合成遺伝子について栄養要
求性である、メチロトローフ酵母株。
【請求項６５】上記株はヒスチジンについて栄養要求性である（ＨＩＳ⁻ ）、請求項６４に記載のメチロトローフ酵母株。
【請求項６６】上記株は、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＭＳ１０５
（ｆｌｄ１−１ｈｉｓ４）である、請求項６５に記載のメチロトローフ酵母株
。
【請求項６７】キットであって、ａ）少なくとも１つの制限部位が、ＦＬＤプロモーターと３’終結配列の間に
位置し、よって異種遺伝子が挿入され得、上記プロモーターおよび上記３’終結
配列に作動可能に連結され得る、メチロトローフ酵母で機能するＦＬＤプロモー
ターおよび３’終結配列を含む発現カセットであり、ｂ）ベクターは、マーカー遺伝子および上記カセットの挿入のための１つ以上
の制限部位を含む、メチロトローフ酵母中で複製するか、またはメチロトローフ
酵母のゲノムに組込まれる上記ベクターを含むキット。
【請求項６８】マーカー遺伝子としてのメチロトローフ酵母由来のＦＬＤ
遺伝子を含む発現ベクターおよび発現カセットを含むキットであって、上記発現
カセットは、メチロトローフ酵母で機能するプロモーターおよび３’終結配列を
含み、少なくとも１つの制限部位が、プロモーターと３’終結配列の間に位置し
、よって異種遺伝子が挿入され得、上記プロモーターおよび上記３’終結配列に
作動可能に連結され得る、上記キット。
【請求項６９】プロモーターは、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＯ
Ｘ１プロモーターである、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】３’終結配列は、ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＡＯ
Ｘ１３’終結配列である、請求項６８に記載のキット。