RU2621862C1 - СЕМЕЙСТВО ПЕПТИДОВ - ИНГИБИТОРОВ АКТИВНОСТИ БЕЛКА RecA, БЛОКИРУЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ - Google Patents
СЕМЕЙСТВО ПЕПТИДОВ - ИНГИБИТОРОВ АКТИВНОСТИ БЕЛКА RecA, БЛОКИРУЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2621862C1 RU2621862C1 RU2016127595A RU2016127595A RU2621862C1 RU 2621862 C1 RU2621862 C1 RU 2621862C1 RU 2016127595 A RU2016127595 A RU 2016127595A RU 2016127595 A RU2016127595 A RU 2016127595A RU 2621862 C1 RU2621862 C1 RU 2621862C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reca
- peptide
- peptides
- bacteria
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 24
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 25
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title description 13
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 title description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 title description 2
- 101100355584 Mus musculus Rad51 gene Proteins 0.000 title 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 claims abstract description 80
- 230000027151 SOS response Effects 0.000 claims abstract description 40
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 20
- -1 aliphatic amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 33
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 9
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 5
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 4
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100150784 Escherichia coli (strain K12) sulA gene Proteins 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 101150068926 recX gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 2
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- XCUBVSAYUSFHNN-UHFFFAOYSA-N hydron;(2-nitrophenyl)hydrazine;chloride Chemical compound [Cl-].[NH3+]NC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O XCUBVSAYUSFHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 101150073502 sulA gene Proteins 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- BBVIDBNAYOIXOE-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-oxadiazole Chemical compound C=1N=CON=1 BBVIDBNAYOIXOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001637 1-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(*)=C([H])C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 1H-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC=NC2=C1 HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVRPFRMDMNDIDH-UHFFFAOYSA-N 1h-quinazolin-2-one Chemical compound C1=CC=CC2=NC(O)=NC=C21 AVRPFRMDMNDIDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical compound OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101100402795 Caenorhabditis elegans mtl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000192091 Deinococcus radiodurans Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710130905 Regulatory protein RecX Proteins 0.000 description 1
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241001455617 Sula Species 0.000 description 1
- 101100355952 Vibrio cholerae serotype O1 (strain ATCC 39315 / El Tor Inaba N16961) rcp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100223934 Yersinia pestis dkgA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000008876 conformational transition Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- DHZYXWMZLAKTQV-UHFFFAOYSA-N diazepin-3-one Chemical compound O=C1C=CC=CN=N1 DHZYXWMZLAKTQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Polymers 0.000 description 1
- 229930003811 natural phenol Natural products 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012576 optical tweezer Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K4/00—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
- C07K4/04—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к новым пептидным структурам, обладающим антибактериальными свойствами, и может быть использовано в медицине. Заявляется семейство пептидов, обладающих ингибирующей активностью против бактериальных белков RecA, а также свойством блокирования SOS-ответа у бактерий. В отличие от известных аналогов предложенные пептиды обладают большей конформационной стабильностью и способны ингибировать активность белка RecA с достаточно низким IC50. 4 пр., 1 табл., 5 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новым пептидным структурам, обладающим антибактериальными свойствами. В настоящее время одной из главных проблем фармакологии и медицины является способность бактерий адаптироваться к действию применяемых антибиотиков. В результате широкого применения антибиотиков для борьбы с различными инфекциями они постепенно теряют свою эффективность. При этом постоянно увеличивается количество бактериальных штаммов, устойчивых к применяемым антибиотикам (Cassell G.H. Emergent antibiotic resistance: health risks and economic impact // FEMS Immunol Med. Microbiology. 1997, Vol. 18, P. 271-274.). Известно, что такая адаптация бактерий к новым антибиотикам связана с активацией бактериального SOS-ответа (Wu N., et al. Ranking of persister genes in the same Escherichia coli genetic background demonstrates varying importance of individual persister genes in tolerance to different antibiotics // Frontiers in Microbiology. - 2015. - Vol. 6 - No 01003).
Основные классы современных антибиотиков воздействуют на весьма ограниченное количество белков, занятых в таких ключевых клеточных процессах, как биосинтез белков и компонентов клеточных мембран, репликации и репарации ДНК (Cirz R.T., et al Inhibition of mutation and combating the evolution of antibiotic resistance // PLoS Biol. - 2005. - Vol. 3. - P. e176). Известно, что бактериальные клетки адаптируются к воздействию этих антибиотиков с помощью активации клеточного механизма SOS-ответа и связанного с этим повышенного мутагенеза и перестройки бактериального генома (Smith Р.А., Romesberg F.E. Combating bacteria and drag resistance by inhibiting mechanisms of persistence and adaptation // Nat. Chem. Biol. 2007. Vol. 3. P. 549-556). В свою очередь, стратегии преодоления этого сопротивления обычно включают химические модификации существующих антибиотиков.
Одной из потенциальных возможностей выхода из этого тупика является разработка новых способов блокирования SOS-ответа у бактерий с помощью ингибиторов основного белка - инициатора бактериального SOS-ответа - белка RecA. Белок RecA является центральным ферментом гомологической рекомбинации и рекомбинационной репарации ДНК. Структура и функции RecA сохраняют высочайшую консервативность среди патогенных бактерий. Белок RecA необходим для осуществления рекомбинационной репарации ДНК бактерий, а также для восстановления синтеза ДНК в местах вынужденной остановки репликативной вилки. Поэтому белок RecA является хорошей мишенью для конструирования соединений, блокирующих бактериальный SOS-ответ.
В последние годы предпринято несколько попыток поиска ингибиторов белка RecA (Peterson E.J., Janzen W.P., Kireev D., Singleton S.F. High-throughput screening for RecA inhibitors using a transcreener adenosine 5'-O-diphosphate assay // Assay Drug Dev Technol. - 2012. - Vol. 10. - P. 260-268). В частности, были обнаружены несколько химических соединений, которые ингибируют АТФазную активность RecA in vitro, например, природный фенол (куркумин) ингибирует SOS-ответ, индуцируемый антибиотиком левофлоксацином (Bellio P., et al. Curcumin inhibits the SOS response induced by levofloxacin in Escherichia coli // Phytomedicine. - 2014. - Vol. 21. - P. 430-434). Кроме того, в числе таких соединений оказались некоторые аналоги нуклеотидов (Lee A.M., Ross С.Т., Zeng В.В., Singleton S.F. A molecular target for suppression of the evolution of antibiotic resistance: inhibition of the Escherichia coli RecA protein by N(6)-(1-naphthyl)-ADP // J Med Chem. - 2005. - Vol. 48. - P. 5408-5411), малые органические молекулы на основе 2-амино-4,6-диарилпиридина, 1,2,4-оксадиазол, хиназолинон, бензимидазола и диазепинона (Sexton J.Z., et al Novel Inhibitors of E. coli RecA ATPase Activity // Cur. Chem. Genomics 2010, Vol. 4, P. 34-42), полисульфатированные и полисульфанированные нафтил соединения (Nautiyal A., Patil K.N., Muniyappa K. Suramin is a potent and selective inhibitor of Mycobacterium tuberculosis RecA protein and the SOS response: RecA as a potential target for antibacterial drug discovery // J Antimicrob Chemother. - 2014. - Vol. 69. - P. 1834-1843). Однако, все эти соединения недостаточно специфичны, и имеют широкую область побочного действия, поскольку могут связываться не только с бактериальными белками RecA, но и со многими человеческими АТФазами, имеющими сходное с RecA строение центра связывания и гидролиза АТФ и поэтому потенциально токсичны.
В отличие от этих соединений, небольшие пептидные фрагменты, представляющие функциональные участки природных ингибиторов, являются одними из лучших кандидатов для достижения блокирования SOS-ответа у бактерий. Такие соединения содержат только природные аминокислоты, весьма специфичны для их белков мишеней и поэтому не обладают широкой областью побочного действия и нетоксичны для человека.
В качестве наиболее близкого аналога рассмотрена заявка на патент № US 20100292135 А1 от 18.11.2010 «Inhibitors of RecA activities for control of antibiotic-resistant bacterial pathogens» («Ингибиторы активности RecA для контроля анибиотикоустойчивых бактериальных патогенов»; МПК: A61K 31/095; A61K 31/12; A61K 31/538).
Кроме большого набора органических ингибиторов АТФазной активности белков RecA на основе производных АДФ, приведены две пептидные последовательности (INPEP-1 и INPEP-2), построенных по аналогии с аминокислотной последовательностью N-концевого домена RecA, участвующего в образовании межмолекулярного интерфейса белков RecA при образовании ими спирального филамента на онДНК.
К недостаткам этого аналога можно отнести следующее. В заявке US 20100292135 А1 не приведено никаких данных о степени блокирования SOS-ответа у бактерий in vivo, а пептид рассматривается как ингибитор активности белка RecA только in vitro. Используя данные, приведенные в описании к заявке, можно прийти к выводу, что степень блокирования SOS-ответа у бактерий крайне низка. Например, представленные сведения демонстрируют, что пептиды INPEP препятствуют сборке спирального филамента RecA на онДНК, но она все равно будет происходить, но с замедленной скоростью, и на ДНК будет какое-то количество RecA, что служит сигналом для других белков бактерий, участвующих в SOS-ответе, и поэтому он не будет полностью заблокирован. Из фиг. 11а заявки US 20100292135 А1 следует, что величина концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) заявленного пептида даже in vitro весьма высока и составляют 35-500 мкМ, а эффективное блокирования бактериального SOS-ответа с помощью этих пептидов является практически не реализуемой. А вариант пептида, где удалось понизить IC50 до ~3 мкМ, бесполезен с точки зрения практического использования, поскольку требуют образования дисульфидных связей, которое в бактериальных клетках, как известно, блокируется высокими концентрациями глутатиона. Это соединение обладает антиоксидантными свойствами, и не позволит окисляться тиоловым группам аминокислотных остатков цистеина в пептиде, образующих дисульфидную связь, и поэтому пептид потеряет необходимую конформационную стабильность и эффект блокирования бактериального SOS-ответа достигнут не будет. Кроме того, необходимо отметить, что для того, чтобы получить достаточно низкие значения IC50 ~3 мкМ, авторы примерно в три раза понизили концентрации белка RecA, по сравнению с их обычными значениями для такого рода измерений IC50. Поэтому реальные значения IC50 для лучшего их пептида INPEP-2, скорее всего ~9 мкМ.
Как и все природные аминокислотные последовательности глобулярных белков в случае их использования в виде мономерных пептидов, они не обладают достаточной конформационной стабильностью, что и объясняет их низкую эффективность в качестве ингибиторов тех или иных биохимических реакций. Это объясняется тем, что ингибиторы связываются и действует на свои мишени только в определенной биологически активной конформации. В данном случае в конформации при которой боковые группы пептида, взаимодействующих с RecA аминокислот, имеют правильное взаимное расположение в пространстве для связывания с RecA и препятствованию формирования его филамента. Чем выше стабильность биологически активной конформации пептида, тем выше концентрация готового к взаимодействию с RecA пептида и соответственно выше удельная эффективность блокирования SOS-ответа.
Таким образом, в заявке US 20100292135 А1 не удалось получить достаточно хорошие величины IC50 с использованием нескольких традиционных способов конформационной стабилизации пептидов, таких как: дополнительных солевых мостиков, взаимодействий заряженных групп с макродиполем альфа-спирали, использованием аминокислот с высокой склонностью к образованию альфа-спиралей и бета-структур, а также так называемых "кэпинг" взаимодействий. Именно поэтому для конформационной стабилизации пептидов INPEP авторам пришлось использовать искусственные дисульфидные мостики, которые, однако, совершенно бесполезны в условиях бактериальных клеток.
Задачей данного изобретения является создание семейства пептидов для практического применения, обладающих ингибирующей активностью против бактериальных белков RecA, обеспечивающих высокую эффективность блокировки SOS-ответа у бактерий и нетоксичных для организма человека.
Техническим результатом является повышение эффективности блокирования SOS-ответа у бактерий, за счет повышенной конформационной стабильности.
Сущность изобретения заключается в том, что предлагается семейство пептидов (см. таблицу 1), общей формулы Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Lys-AAA-Lys-Ile-HAA-Arg-Tyr-AAA-AAA-Tyr-Arg-HAA-HAA-HAA-NH2, где Ас - N-концевая ацетильная группа, AAA- одна из алифатических аминокислот из набора Leu, Ile, Val, НАА - одна из гидрофобных аминокислот из набора Leu, Ile, Val, Phe и Tyr, a NH2 - C-концевая амидная группа, обладающих ингибирующей активностью против бактериальных белков RecA, а также свойством блокирования SOS-ответа у бактерий.
В отличие от аналога, обладающего недостаточной эффективностью для практического применения, заявляемый нами пептиды имеют совершенно другую длину, аминокислотную последовательность, структуру и механизм действия. Пептиды заявляемого семейства обладают такой же способностью, как и природный белок RecX, быстро разбирать уже собранные фрагменты филаментов белков RecA на онДНК, что доказано в заявляемом изобретении экспериментально, и, таким образом, полностью исключать их появление в клетках в достаточном количестве для активации бактериального SOS-ответа и, соответственно, начала процесса адаптации бактерий к действию антибиотиков.
Изобретение относится к направлению создания препаратов на основе конформационно стабильных пептидов, состоящих только из 20 природных аминокислот, построенных на основе модифицированного фрагмента белка RecX, природного ингибитора белков RecA. Поскольку регуляторный белок RecX довольно нестабилен in vitro и в чистом состоянии он быстро теряет свою активность, его использование в качестве антибиотического лекарственного средства, к сожалению, практически невозможно. Кроме того его аминокислотная последовательность имеет длину 166 остатков и поэтому его твердофазный синтез в чистом виде, в отличие от коротких пептидов, слишком трудоемок и дорог. В заявляемом изобретении используется только короткий фрагмент на основе модифицированной последовательности белка RecX, который непосредственно вовлечен во взаимодействия с комплексом белка RecA и онДНК.
Короткие аминокислотные последовательности природных альфа-спиралей обычно не обладают достаточной конформационной стабильностью. Поэтому для конструирования пептидов с высокой конформационной стабильностью была использована программа SEQOPT (свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2013614525 от 14.05.2013) (Yakimov A., Rychkov G., Petukhov М. De novo design of stable alpha-helices // Methods. Mol. Biol. 2014. Vol. 1216. P. 1-14).
Для решения поставленной задачи за основу был взят участок белка RecX и его аминокислотная последовательность была оптимизирована. В результате получено семейство пептидов, которое не встречается в природе, и с достаточно низким значением IC50 ингибирует активность белка RecA, что в свою очередь приводит к блокированию SOS-ответа у бактерий.
На фиг. 1 приведены результаты глобальной оптимизации аминокислотной последовательности альфа-спирали из белка RecX. № aa/RecX - номера и имена остатков белка RecX из E. coli. 4Е1 - аминокислотная последовательность пептида 4Е1 (SeqNo 1), выбранного для экспериментальной проверки заявляемых свойств.
На фиг. 2 представлена сравнительная динамика гидролиза АТФ белком RecA в присутствии и отсутствии белка RecX и пептида 4Е1.
На фиг. 3 показана динамика изменения длины ДНК при формировании филаментов RecA и последующей разборке филаментов в результате добавления пептида 4Е1.
На фиг. 4 представлены данные по изучению зависимости выживаемости клеток E. coli K-12 от дозы УФ-излучения.
На фиг. 5 показана величина SOS-ответа при воздействии на бактериальные клетки E. coli GY6871 налидиксовой кислотой.
По результатам оптимизации аминокислотных последовательностей программой SEQOPT, для экспериментальной проверки был выбран пептид 4Е1 (Seq No 1), обладающий не менее чем 90% конформационной стабильностью и достаточно хорошей растворимостью в воде. Также для проведения экспериментов в реакции ингибирования АТФазной активности использовался пептид с аминокислотной последовательностью, соответствующий фрагменту белка RecX, без модификаций и оптимизации последовательности, с расчетной конформационной стабильностью составляющей 16%. Для немодифицированного фрагмента белка RecX не было обнаружено никакого влияния на белок RecA.
Экспериментальные результаты, представленные на фиг. 2-5, получены для пептида 4Е1. Общая структура этого пептида приведена на фиг. 1. Однако основываясь на хорошо экспериментально проверенной теоретической модели AGADIR (Munoz V., Serrano L. Elucidating the folding problem of helical peptides using empirical parameters // Nat. Struct. Biol. 1994, V. 1 (6), P. 399-409), описывающей конформационные переходы альфа-спираль - случайный клубок в мономерных пептидах, любой пептид из семейства высоко гомологичных пептидов, имеющих общую формулу Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Lys-AAA-Lys-Ile-HAA-Arg-Tyr-AAA-AAA-Tyr-Arg-HAA-HAA-HAA-NH2, где Ас - N-концевая ацетильная группа, AAA- - одна из алифатических аминокислот из набора Leu, Ile, Val, НАА - одна из гидрофобных аминокислот из набора Leu, Ile, Val, Phe и Tyr, a NH2 - C-концевая амидная группа, будет обладать похожей биологической активностью по ингибированию бактериальных белков RecA и блокированию бактериального SOS-ответа.
Пептиды синтезированы стандартными методами с помощью твердофазного синтезатора пептидов с использованием 5-кратного избытка L-аминокислот, имеющих защитные группы Fmoc ((9-фторенил)-метоксикарбонил) (фирма Novabiochem), и реагентов FastMoc (гексафторфосфат/гидроксибензотриазол 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония (ГБТУ/ГОБТ) (фирма Advanced Chemical Europe) в качестве агента для осуществления реакции образования пептидной связи. После отщепления от смолы и удаления защитных групп осуществляли обессоливание путем гель-фильтрации, с помощью системы для жидкостной хроматографии FPLC типа AktaPurifier 10 (фирма GE Healthcare, Великобритания), с использованием в качестве элюента 0,1%-ного водного раствора ТФК (трифторуксусная кислота). Окончательную очистку с помощью препаративной хроматографии с обращенной фазой осуществляли на колонке типа С18, присоединенной к системе для UFPLC типа Shimadzu LC-20. Пептиды элюировали с использованием линейного градиента ацетонитрила в 0,1%-ном водном растворе ТФК и наблюдение за процессом элюирования осуществляли при длине волны 220-230 нм. Массы молекул были подтверждены масс-спектрометрией ионно-циклотронного резонанса с Фурье преобразованием (Varian FT-ICR MS 9.4Т MALDI) с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией. Содержание основного вещества, по данным оптической плотности, не менее 95%. Аминокислотный состав пептидов соответствовал приведенным на фиг. 1.
Для in vivo экспериментов использованы следующие штаммы E. coli K-12: AB1157 (F-recA+ara14 galK2 his_4 proA2 argE3 thil tsx33 thr1 leu6lacY1 mtl1 xyl5 rpsl31 supE37), штамм GY6871 sfiA::lacZ из лаборатории P. Деворе. В экспериментах использованы плазмиды precXEc и pPeptid, несущие нормальные аллели генов recX Е. Coli, пептид 4Е1 соответственно. Плазмида precXEc (pEAW224) любезно предоставлена проф. М. Кокс (Университет Висконсин-Мэдисон, США). Для индукции экспрессии гена recX с промотора гена lac проводили инкубацию с изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом (IPTG) при концентрации 1 мМ в течение 2 ч перед УФ облучением. Для индукции использовали двуплазмидную систему, включающую плазмиду рТ7, которая несет ген Т7 РНК полимеразы. Ген, несущий аминокислотную последовательность пептида 4Е1, был синтезирован и клонирован в плазмиду pET21b.
Экспериментальная проверка и доказательство работоспособности изобретения проводилась при помощи двух in vitro (в пробирке) и двух in vitro (на живых бактериях) экспериментах, полностью подтвердивших заявляемые свойства. Эксперименты 1 и 2 показали влияние на биохимические реакции, проводимые белком RecA и ингибирование его активности. Эксперименты 3 и 4 показали что заявляемое изобретение оказывает влияние на бактерии E. coli и приводит к наблюдаемому снижению выживаемости при воздействии ультрафиолетового (УФ) излучения, и отсутствию активации SOS-ответа.
Эксперимент 1. Влияние пептида 4Е1 на реакцию АТФ-гидролиза белка RecA in vitro; (фиг. 2)
Известно, что белок RecA является ДНК зависимой АТФазой. Поэтому блокирование его АТФазной активности пептидом 4Е1 в присутствии онДНК было доказано экспериментально. Степень гидролиза АТФ, катализируемого белком RecA, измеряли с помощью спектрофотометрического теста, в котором уровень образования АДФ сопряжен с окислением NADH в NAD+ (Shan Q., Bork J.M., Webb B.L., Inman R.B., Cox M.M. RecA protein filaments: end-dependent dissociation from ssDNA and stabilization by RecO and RecR proteins // J Mol Biol. - 1997. - Vol. 265. - P. 519-540). Концентрацию NADH определяли по оптической плотности реакционной смеси при λ=380 нм с использованием коэффициента экстинкции 1.21 мМ-1 см-1. Реакцию проводили при 37°C в стандартном буфере TMD (25 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреитол), содержащем 2 мМ АТФ, АТФ-регенерирующую систему (4 мМ фосфоенолпирувата и 30 ед/мл пируваткиназы), а также NADH и 30 ед/мл лактатдегидрогеназы. Реакционная смесь содержала 5 мкМ поли(dT) и 3 мкМ RecA. Уровень гидролиза определяли с использованием спектрофотометра Cary 5000 и кюветы с длиной оптического пути 1 см. Концентрацию белков RecA дикого типа определяли по поглощению при 280 нм с использованием коэффициента экстинкции 2.23×104 М-1 см-1. Концентрацию белка RecX и пептида 4Е1 определяли при λ=280 нм с использованием коэффициентов молярной экстинкции 2.57×104 М-1 см-1.
Количество белка RecA, находящегося в состоянии филамента на онДНК, обычно оценивают по скорости гидролиза АТФ. Соответственно, изменение скорости гидролиза АТФ отражает не только количество RecA, которое перешло в свободное или, наоборот, связанное состояние, но и количество онДНК в филаменте. Использование поли(dT), лишенной сложной вторичной структуры, позволило нам вовлечь в реакцию RecA и RecX в отсутствии SSB.
Добавление RecX либо пептида 4Е1 в реакционную смесь, содержащую поли(dT), приводит к одномоментному резкому снижению скорости гидролиза до некоторого постоянного значения. Добавление RecX указано на фиг. 2 стрелкой, в точке 10 мин по оси времени. Эффективность ингибирования активности RecA пептидом 4Е1 примерно в 10-20 раз меньше, чем в случае с белком RecX, если считать по молекулярной концентрации. Вместе с тем, в отличие от белка RecX, который связывает сразу три мономера RecA, пептид 4Е1 взаимодействует лишь с одним мономером. Таким образом, различие в эффективности ингибирования активности белка RecA пептидом 4Е1 по сравнению с полнофункциональным белком RecX различается менее чем в 10 раз.
Таким образом, пептид 4Е1 ингибирует АТФазную активность белка RecA, что является необходимым для блокирования бактериального SOS-ответа.
Эксперимент 2. Влияние пептида 4Е1 на стабильность филамента белка RecA на днДНК in vitro; (фиг. 3)
Известно, что белок RecA инициирует бактериальный SOS-ответ только после образования им спирального филамента на онДНК. Поэтому блокирование пептидом 4Е1 этой реакции было доказано экспериментально. Исследование влияния пептида 4Е1 на стабильность филаментов RecA проводилось на уровне индивидуальных молекул ДНК при помощи метода оптического захвата. В ходе эксперимента молекула ДНК, биотинилированная по обоим концам, фиксировалась между двух полистироловых микросфер диаметром 2,13 мкм, покрытых стрептавидином. Манипуляция ДНК осуществлялась за счет оптического захвата микросфер при помощи двух оптических ловушек. Эксперименты проводились на уникальной установке «Лазерный пинцет» (СПбПУ), которая позволяет исследовать динамику изменения длины ДНК в реальном времени при поддержании постоянной силы натяжения ДНК (Pobegalov G., et al Deinococcus radiodurans RecA nucleoprotein filaments characterized at the single-molecule level with optical tweezers // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2015, V. 466(3), P. 426-430.).
На фиг. 3 представлена полученная экспериментальная зависимость изменения длины молекулы ДНК в присутствии RecA, до и после добавления пептида 4Е1. Так как связывание RecA приводит к увеличению длины ДНК на величину порядка 50% по сравнению с В-формой спирали, то в ходе построения филаментов RecA на ДНК происходит постепенное увеличение ее длины. Соответственно, диссоциация RecA приводит к сокращению длины ДНК до исходной. Таким образом, наблюдение за длиной молекулы ДНК при постоянной растягивающей силе позволяет отслеживать динамику построения и разборки филаментов RecA, которая свидетельствует о скорости ингибирования RecA пептидом 4Е1.
В эксперименте была использована ДНК бактериофага λ, длина которой составляет порядка 16 мкм (48502 пары оснований). ДНК помещали в раствор, содержащий Трис-HCl 10 мМ, MgCl2 1 мМ, RecA 1 мкМ и АТФ 1 мМ, в результате чего, при приложении силы растяжения в 20 пН, наблюдалось увеличение длины ДНК, что соответствует связыванию RecAc ДНК. На 490-й секунде в реакцию был добавлен пептид 4Е1 в концентрации 10 мкМ. В присутствии данного пептида рост филаментов RecA прекращался. При этом наблюдалось постепенное уменьшение длины ДНК до исходной, что свидетельствует о том, что исследуемый пептид 4Е1 препятствует связыванию RecA с ДНК и стимулирует разборку филамента RecA на ДНК. Данное наблюдение указывает на то, что пептид 4Е1 способен ингибировать активность RecA на стадии формирования пресинаптического комплекса.
Таким образом, пептид 4Е1 приводит к разборке филамента белка RecA на ДНК, что является необходимым для блокирования бактериального SOS-ответа.
Эксперимент 3. Влияние пептида 4Е1 на выживаемость клеток E. coli при УФ облучении in vivo; (Фиг. 4).
Известно, что блокирование активности белков RecA в клетках Е. coli резко снижает их способность выживать при действии высоких доз ультрафиолетового облучения. Способность пептида 4Е1 блокировать действие белков RecA in vivo доказано экспериментально. Клетки Е. coli, несущие плазмиды с геном recX и аминокислотной последовательности пептида 4Е1, выращивали в среде LB до OD600, равной 0.4-0.6, добавляли IPTG до конечной концентрации 0.3 мМ и растили в течение еще 1.5 ч для индукции синтеза белка RecX либо пептида 4Е1. Контрольные клетки Е. coli также выращивали в среде LB, но без индукции. Клетки, после достижения OD600, равной 0.7-0.9, осаждали центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендировали в исходном объеме солевой среды (NaCl 0.9%). УФ-облучение (λ=254) проводили в чашках Петри на приборе "Хроматоскоп" при мощности дозы 100 мДж/м /с, отбирая аликвоты культуры объемом 0.1 мл через равные временные интервалы (2 с). Облученные клетки разбавляли солевой средой, рассевали на LB-агар и через 24 ч подсчитывали число колоний. УФ облучение клеток, их разведение, рассев и выращивание проводили при освещении красным светом для избегания фотореактивации. С каждой культурой проводили по три независимых опыта. Для оценки погрешностей экспериментальных измерений средняя квадратичное отклонение результата серии измерений умножали на коэффициент Стьюдента для заданной надежности (0.9) и находили границы соответствующего доверительного интервала, т.е. погрешность измерений (Кассандрова О.Н., Лебедев В.В. Обработка результатов наблюдений: «Наука», Москва, 1979). Погрешность измерения во всех случаях не превышала 10%.
Экспрессия RecX приводит к падению выживаемости клеток E. coli. Данный результат был продемонстрирован ранее и свидетельствует о том, что белок RecX является ингибитором in vivo (Stohl Е.А., et al Escherichia coli RecX inhibits RecA recombinase and coprotease activities in vitro and in vivo // J Biol Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 2278-2285). Вместе с тем ингибирование не является максимальным в сравнении со штаммом, где отсутствует ген RecA (дельта RecA). Кривая падения выживаемости клеток, несущих ген пептида, подобна кривой падения выживаемости клеток с RecX. Представленные на фиг. 4 экспериментальные данные доказывают, что экспрессия пептида 4Е1 приводит к уменьшению выживаемости при УФ облучении столь же эффективно как при экспрессии RecX.
Таким образом, пептид 4Е1 приводит к снижению выживаемости бактерий, что показывает отсутствие активности белка RecA на ДНК, что является необходимым условием для блокирования SOS-ответа у бактерий.
Эксперимент 4. Влияние пептида 4Е1 на бактериальный SOS-ответ в клетках E. coli in vivo, (фиг. 5)
Поскольку в живых клетках в принципе могут быть и альтернативные RecA пути активации SOS-ответа, способность пептида 4Е1 блокировать бактериальный SOS-ответ in vivo доказана экспериментально с помощью стандартного метода Миллера. Известно, что единицы Миллера, в которых стандартно измеряется величина SOS-ответа, пропорциональны количеству увеличения О-нитрофенола в минуту на бактерию при воздействии на бактериальные клетки налидиксовой кислоты.
Ген бета-галактозидазы встроен под промотор sfiA таким образом, что о силе SOS-ответа можно судить по количеству выработанной бета-галактозидазы, при SOS-ответе вызванным налидиксовой кислотой. Промотор sfiA (sulA) гена является наиболее чувствительным промотором в ходе индуцируемого SOS-ответа. Экспрессия белков с помощью этого промотора в зависимости от дозы и времени воздействия может увеличиваться до 100 раз (McCool J.D., et al Measurement of SOS expression in individual Escherichia coli K-12 cells using fluorescence microscopy // Mol Microbiol. - 2004. - Vol. 53.
- P. 1343-1357; Cole S. Characterisation of the promoter for the LexA regulated sulA gene of Escherichia coli // Mol. Gen. Genet. 1983, Vol. 189, P. 400-404). В норме при выбранных нами условиях RecA вызывает SOS-ответ примерно до 2000 единиц Миллера, то есть увеличивает в 80-100 раз относительно его базовых значений (измерение №2, фиг. 5). Однако экспрессия белка RecX либо пептида 4Е1 подавляет активность RecA и приводит к ингибированию SOS-ответа почти до базовых значений (измерение №3, 4) Из этого следует, что пептид 4Е1 подавляет SOS-ответ, а вместе с ним и экспрессию всех генов SOS-ответа, включая полимеразу 5. Полимераза 5 является причиной множественного мутагенеза, то есть образует мутации, которые в свою очередь являются материалом для селективного отбора новых генов и последующей адаптации бактерии к антибиотикам.
Активность белка рассчитывалась в условных единицах в соответствии со стандартными рекомендациями (Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике: «Мир», Москва, 1976): β-gal=TOOO(OD420/OD600tν), где OD420 - оптическая плотность реакционной смеси при 420 нм, OD600 - оптическая плотность клеточной суспензии в Z-буфере при длине волны 600 нм, t - время инкубации, a ν - объем пробы в миллилитрах. Из ночной культуры, выращенной в LB с ампициллином 100 мкГ/мл и канамицином 40 мкГ/мл или без них (для контрольного штамма), 100 мкл вносили в 4 мл такой же среды. Выращивали 50-60 минут и добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и проводили индукцию в течение 90 минут. Затем пробы делили пополам и к одной из них добавляли налидиксовую кислоту до конечной концентрации 40 мкГ7/мл. Индуцировали 60 минут, 1 мл клеток смешивали с 1 мл Z-буфера и измеряли OD600. Z-буфер (pH 7.0) На 1 л: Na2HPO4 × 7H2O 16.1 г NaH2PO4 × H2O 5.5 г KCl 0.75 г MgSO4 × 7H2O 0.246 г 
-меркаптоэтанол 2.7 мл. В каждую пробирку добавляли 4 капли хлороформа и 2 капли 0.1% раствора додецилсульфата натрия. Затем пробирки интенсивно встряхивали в течение 15 секунд. Реакцию инициировали, добавив в каждую пробирку по 0.4 мл ОНФГ (4 мг/мл). ОНФГ - орто-нитрофенил--D-галактозид и тщательно перемешивали. Время реакции измерялось секундомером. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 1 М Na2CO3 (pH 12). Клеточные фрагменты удаляли центрифугированием 10 мин 5000 об/мин. Измеряли OD420 (желтая окраска) и рассчитывали активность -галактозидазы в условных единицах по выше приведенной формуле.
Таким образом, пептид 4Е1 приводит блокированию SOS-ответа у бактерий.
Таким образом, приведенные выше доказательства свидетельствуют о том, что подмножество заявляемого семейства пептидов - пептид 4Е1 отличается от известных пептидов новыми свойствами: ингибирующей активностью против бактериальных белков RecA, а также свойством блокирования SOS-ответа у бактерий. При этом обладает соизмеримыми с белком RecX активностями: 1) ингибировать АТФазную активность RecA; 2) инициировать разборку филамента белка RecA на онДНК; 3) понижать уровень выживаемости бактериальных клеток при облучении УФ излучением 4) блокировать систему SOS-ответа бактериальных клеток. Все это позволяет считать пептид 4Е1 и заявляемое семейство пептидов заявляемой структуры хорошими кандидатами для разработки лекарственных средств, предотвращающих адаптацию бактерий к новым антибиотикам.
Claims (8)
- Семейство пептидов, общей формулы
- Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Lys-AAA-Lys-Ile-HAA-Arg-Tyr-AAA-AAA-Tyr-Arg-HAA-HAA-HAA-NH2,
- где
- Ас - N-концевая ацетильная группа,
- AAA - одна из алифатических аминокислот из набора Leu, Ile, Val,
- НАА - одна из гидрофобных аминокислот из набора Leu, Ile, Val, Phe и Tyr,
- NH2 - С-концевая амидная группа,
- обладающих ингибирующей активностью против бактериальных белков RecA, а также свойством блокирования SOS-ответа у бактерий.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016127595A RU2621862C1 (ru) | 2016-07-08 | 2016-07-08 | СЕМЕЙСТВО ПЕПТИДОВ - ИНГИБИТОРОВ АКТИВНОСТИ БЕЛКА RecA, БЛОКИРУЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016127595A RU2621862C1 (ru) | 2016-07-08 | 2016-07-08 | СЕМЕЙСТВО ПЕПТИДОВ - ИНГИБИТОРОВ АКТИВНОСТИ БЕЛКА RecA, БЛОКИРУЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2621862C1 true RU2621862C1 (ru) | 2017-06-07 |
Family
ID=59032447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016127595A RU2621862C1 (ru) | 2016-07-08 | 2016-07-08 | СЕМЕЙСТВО ПЕПТИДОВ - ИНГИБИТОРОВ АКТИВНОСТИ БЕЛКА RecA, БЛОКИРУЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2621862C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2674581C1 (ru) * | 2018-02-02 | 2018-12-11 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ") | Тиазол-оксазол-модифицированные пептиды, обладающие способностью ингибировать бактериальную рибосому |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200601557A1 (ru) * | 2004-02-26 | 2006-12-29 | Миксис Франс С.А. | Уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетках |
| US20100292135A1 (en) * | 2005-03-07 | 2010-11-18 | Scott Fain Singleton | INHIBITORS OF RecA ACTIVITIES FOR CONTROL OF ANTIBIOTIC-RESISTANT BACTERIAL PATHOGENS |
-
2016
- 2016-07-08 RU RU2016127595A patent/RU2621862C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200601557A1 (ru) * | 2004-02-26 | 2006-12-29 | Миксис Франс С.А. | Уменьшение частоты спонтанных мутаций в клетках |
| US20100292135A1 (en) * | 2005-03-07 | 2010-11-18 | Scott Fain Singleton | INHIBITORS OF RecA ACTIVITIES FOR CONTROL OF ANTIBIOTIC-RESISTANT BACTERIAL PATHOGENS |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DREES J. et al., Inhibition of RecA Protein by the Escherichia coli RecX Protein, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2004, v. 279, p. 52991-52997. * |
| SEXTON J.Z. et al., Novel Inhibitors of E. coli RecA ATPase Activity, CURRENT CHEMICAL GENOMICS, 2010, v. 4, p. 34-42. * |
| SEXTON J.Z. et al., Novel Inhibitors of E. coli RecA ATPase Activity, CURRENT CHEMICAL GENOMICS, 2010, v. 4, p. 34-42. DREES J. et al., Inhibition of RecA Protein by the Escherichia coli RecX Protein, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2004, v. 279, p. 52991-52997. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2674581C1 (ru) * | 2018-02-02 | 2018-12-11 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ") | Тиазол-оксазол-модифицированные пептиды, обладающие способностью ингибировать бактериальную рибосому |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12037579B2 (en) | Synthetic RNA binding polypeptides | |
| JP3901726B2 (ja) | ウイルス複製の選択的不活性化のための方法 | |
| CN111225976A (zh) | 模块化结合蛋白 | |
| EP3506982A1 (en) | Mif inhibitors and methods of use thereof | |
| Hu et al. | Threonine phosphorylation fine-tunes the regulatory activity of histone-like nucleoid structuring protein in Salmonella transcription | |
| RU2621862C1 (ru) | СЕМЕЙСТВО ПЕПТИДОВ - ИНГИБИТОРОВ АКТИВНОСТИ БЕЛКА RecA, БЛОКИРУЮЩИХ SOS-ОТВЕТ У БАКТЕРИЙ | |
| Yang et al. | Aberrant expression of SLC7A11 impairs the antimicrobial activities of macrophages in Staphylococcus Aureus osteomyelitis in mice | |
| Tuteja et al. | Isolation and characterization of an eIF-4A homologue from Plasmodium cynomolgi | |
| US20170096717A1 (en) | Antibacterial and plasmid elimination agents | |
| WO2020249946A1 (en) | Assays and inhibitors of oxygen-dependent n-terminal oxidation | |
| US20110288008A1 (en) | Antibacterial and plasmid elimination agents | |
| BG112506A (bg) | Методи за създаване на антибактериални агенти, използвайки химерни антисенс олигонуклеотиди | |
| Von Dwingelo | The manipulation of host transcription by the ANKH effector of legionella. | |
| Meriesh | Elucidating the Function of the Histone H4 Basic Patch in Saga-Mediated Histone H2b Deubiquitination and Histone Acetylation | |
| García Beyaert | Molecular mechanisms of msl2 mRNA translational regulation | |
| Jardine | Characterising the function of the mitochondrial deubiquitylase USP30 in mitophagy | |
| Zukowski | Unraveling Novel Functions of SIR Complex in Heterochromatic Silencing | |
| WO2023200745A1 (en) | Chemogenetic regulation of peptide function | |
| Griffith | An investigation of the cellular functions of HNRNPUL1 | |
| Van Oss | Insights into the role of the Paf1 complex in promoting H2B monoubiquitylation | |
| Boateng | Determining the binding partners of PKA in the axoneme of Chlamydomonas reinhardtii flagella | |
| Steven | 2 The Ess1 prolyl isomerase: Traffic cop of the RNA polymerase II transcription cycle | |
| Thekkethil | Characterizing the role of ribosomal proteins in modulating Ty1 transposition and maintaining translational fidelity in Saccharomyces cerevisiae | |
| Cobb | Resolving the flexibility and intricacy of DNA repair protein-DNA interactions | |
| Mugo | The role of RBP10, a key post-transcriptional regulator in the development of Trypanosoma brucei |