BG112506A - Методи за създаване на антибактериални агенти, използвайки химерни антисенс олигонуклеотиди - Google Patents

Методи за създаване на антибактериални агенти, използвайки химерни антисенс олигонуклеотиди Download PDF

Info

Publication number
BG112506A
BG112506A BG112506A BG11250617A BG112506A BG 112506 A BG112506 A BG 112506A BG 112506 A BG112506 A BG 112506A BG 11250617 A BG11250617 A BG 11250617A BG 112506 A BG112506 A BG 112506A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
bacterial growth
line
aco
eden
iden
Prior art date
Application number
BG112506A
Other languages
English (en)
Other versions
BG67019B1 (bg
Inventor
Роберт Пенчовски
Димитров Пенчовски Роберт
Original Assignee
Роберт Пенчовски
Димитров Пенчовски Роберт
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Роберт Пенчовски, Димитров Пенчовски Роберт filed Critical Роберт Пенчовски
Publication of BG112506A publication Critical patent/BG112506A/bg
Publication of BG67019B1 publication Critical patent/BG67019B1/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A61K47/6455—Polycationic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. for complexing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3181—Peptide nucleic acid, PNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Описано е използването на различни антисенс олигонуклеотиди, прикрепени към проникващи в клетката пептиди, които се прицелват в специфични бактериални мРНК и инхибират бактериалния растеж на много патогенни бактериални видове. Създадените от нас химерни антисенс олигонуклеотидни-олигопептидни молекули може да се използват за тяхното антибактериално действие.

Description

ОПИСАНИЕ
НАИМЕНОВАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Методи за създаване на антибактериални агенти, използвайки химерни антисенс олигонуклеотиди
ИМЕНА НА СЪЗДАТЕЛЯ
Роберт Димитров Пенчовски
ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА: Развитие на антибактериални агенти чрез употребата на химерни антисенс олигонуклеотиди, свързани с пептиди, проникващи в клетката, които се свързват със специфични бактериални РНК и инхибират техните функции.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Последните години инфекциите, причинени от бактериални патогенни щамове, които са устойчиви на много лекарства, са станали голям проблем за здравните системи като причиняват често сепсис и загуба на живота на множество хора по света (описано в следната статия: Penchovsky, R. et al., Expert Opin Drug Discov. (2015) 10, 631-650 6; Penchovsky, R. et al Expert Opin Drug Discov. (2013) 8, 65-82 7; Penchovsky, R., Biomacromolecules, (2013) 14, 12401249.8)
Всъщност, злоупотребата c антибиотици е довела до появяването на голям брой резистентни бактериални щамове през последните 30 години, включително Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis и много други. За съжаление, усилията да се произвеждат антибиотици не са достатъчни за справяне с тези появили се нови устойчиви на антибиотик щамове. Обикновено се смята, че бактериите могат да развият резистентност срещу всеки антибиотик. Затова е много важно за благоденствието * · ·· ·· * · · · · на човечеството да се измислят нови методи, които да могат бързо и ефективно да създават нови антибиотици срещу резистентните бактериални патогени.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ
В тази патентна заявка ние описваме методи за създаване на антибиотици на базата на различни типове антисенс олигонуклеотиди (АСО), които са прикрепени към пептиди, проникващи в клетката (КПП). В патентната заявка се правят четири вида претенции, които са пряко свързани с методите за създаване на антибактериални агенти, базирани на химерни антисенс олигонуклеотиди. Първият тип претенции (от претенции 1 до 18) се отнася до АСО последователности, свързани с КПП (Таблица 1). Всички АСО последователности са оригинални. Вторият тип претенции, от 19 до 24, включват няколко мРНК-и в различни патогенни бактерии, които ние сме избрали за мишена на АСО (виж раздел Примери). Последователностите на мРНК в претенции 23 и 24 се претендират за първи път тук като антибактериални лекарствени мишени. Трябва да се отбележи, че части от 5'-края на мРНК в претенции от 19 до 22 вече са заявени като антибактериални мишени само с малки модули и пептидни лекарства (патентни заявки: ЕР2471925Д US20080269258,2 US20100041742,3 US20100286082,4 US201003241235). За разлика от тези претенции, ние претендираме, че целите последователности на тези матрична(м)РНК като антибактериални мишени само с АСО, с изключение на малки молекули и пептиди. Третата група от претенции, от 25 до 35, са за използването на няколко КПП (Таблица 2) като носители на АСО за прохикване в клетката, които са ковалентно свързани с тях. Ние сме първите, които правят специфични претенции за прилагането на тези КПП като носители на АСО в живите клетки. Обърнете внимание, че при ниската концентрация на молекулите на КПП-ACO, които ние използвахме в нятпите експерименти, никоя от КПП не притежава антибактериални свойства. Последният вид претенции, от 36 до 37, включва прилагането на две химични процедури за свързване на КПП към АСО. Ние също така сме първите, които правят конкретни твърдения за приложението на тези химични процедури за ковалетно свързване на КПП към АСО. Всички претенции са последователни стъпки в процеса на създаване на антибактериални агенти въз основа на АСОи. Всички претенции имат приложения за създаване на антибактериални агенти при използване на химерни антисенс олигонуклеотиди и представляват завършена технология.
Преимуществата на описаните методи за създаване на нови антибиотици са в по-бързото и по-ефективно създаване на антибактериал агенти чрез антисенс олигонуклеотиди, използвайки описаните РНК-мишени по правилата за комплементарност на Уотсън и Крийк, спрямо използваните до момента стандартни методи за създаване на нови антибиотици, базирани на малки молекули. Това би довело до възможността бързо и ефективно да се създават антибактериални агенти, базирани на този метод срещу резистентни патогенни бактерии при човека и домашни животни. За първи път се предлага патент за създаване на антибактериални агенти с използването на антисенс олигонуклеотиди, които при това са свързани с навлизащи в клетката пептиди.
Материали и методи
Таблица 1: Антисенс химерни олигонуклеотидни-олигопептидни молекули: Пептидите започват с техните N-крайща. Пептидна нуклеинова киселина (PNA); тиол-модифицирана ДНК (PS-DNA); и „заключена“ нуклеинова киселина (LNA). Всични нуклеинови киселини започват с техния 5'-край. С долен индекс “ι” се означава “2'-О-СНз” на ДНК олигомерите, а с долен индекс “2” - PS-модификация на ДНК олигомерите. Означението “ааг” значи аминокиселинни остатъци , a “nt” - нуклеотиди. Всяка последователност притежава съответен идентификационен номер (представен в таблицата по-долу), който занапред в текста ще бъде споменаван за по-кратко със съкращението „Иден. №“.
Иден. № Секвенции: КПП олигопептиден pVEC, прикрепен към множество олигонуклеотиди mPHK мишена Тип олигомери и дължина в ааг. nt.
Иден. №: 1 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu T1T1C1T2C2C2C2A2T2C2C2A2G2A1C1T1 FMN mPHK pVEC: 18 ааг PS- DNA:
16 nt
Иден. №: 2 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu C i Τι T i T 2 Аг A2C2T 2G2T 2 A2C2T2G1C1C1 glmS mPHK pVEC: 18 aar PS-DNA: 16 nt
Иден. №: 3 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg lie Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu T1C1C1C2T2C2C2A2C2C2A2C1T1C1 SAM mPHK pVEC: 18 aar PS-DNA: 14 nt
Иден. №: 4 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg lie Arg Arg Arg Leu He lie Leu Leu C1A1A2T2C2C2C2T2A2C1G1T1 TPP mPHK pVEC: 18 aar PS-DNA: 12 nt
Иден. №: 5 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg lie Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu TTCTCCCATCCAGACT FMN mPHK pVEC: 18 aar PNA:16nt
Иден. №: 6 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He lie Leu Leu TCCCTCCACCACTC SAM mPHK pVEC: 18 aar PNA:14nt
Иден. №: 7 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg lie Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu CTTTAACTGTACTGCC glmS mPHK pVEC: 18 aar PNA:16nt
Иден. №: 8 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg lie Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu CAATCCCTACGT TPP mPHK pVEC: 18 aar PNA:12nt
Иден. №: 9 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu TTCTCCCATCCAGACT FMN mPHK pVEC: 18 aar LNA:16nt
Иден. №: 10 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He lie Leu Leu TCCCTCCACCACTC SAM mPHK pVEC: 18 aar LNA:14nt
Иден. №: 11 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He lie Leu Leu CTTTAACTGTACTGCC glmS mPHK pVEC: 18 aar LNA:16nt
Иден. №: 12 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu CAATCCCTACGT TPP mPHK pVEC: 18 aar LNA:12nt
Иден. №: 13 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He lie Leu Leu G1A1T1T2T2T2G2C2T2T2C2T2T2T2A2C2C2T2A2A1T1T1 ADK mPHK pVEC: 18 aar PS-DNA: 22 nt
Иден. №: 14 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu GATTTTGCTTCTTTACCTAATT ADK mPHK pVEC: 18 aar PNA:22nt
Иден. №: 15 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He lie Leu Leu GATTTTGCTTCTTTACCTAATT ADK mPHK pVEC: 18aar LNA:22nt
Иден. №: 16 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He lie Leu Leu C1A1A1C2T2T2C2T2T2T2T2C2T2T2G2C2T2T2C2A1T1T1 GMK mPHK pVEC: 18 aar, PS DNA:22nt
Иден. №: 17 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu GMK mPHK pVEC: 18 aar
CAACTTCTTTTCTTGCTTCATT PNA:22nt
Иден. №: 18 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg lie Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu CAACTTCTTTTCTTGCTTCATT GMK mPHK pVEC: 18 aar LNA:22nt
Таблица 2: Списък на проникващите в клетката пептиди (КПП) като преносители на АСО. Пептидите започват с техния N-край.
Иден. №: КПП секвенция Име на КПП и произход Специфичност за бактерия или еукариоти, дължина в ааг
Иден. №: 19 Gly Pro Arg Pro Phe Pro Leu Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Leu Arg Pro Pro Arg Pro Arg He Arg Arg Вас7, биволски неурофили Селективни при бактериите, 24 ааг
Иден. №: 20 Asn Arg Asn Tyr He Pro Arg Pro Pro Thr Pro Arg Pro Leu Tyr Ser Gly Lys Asp Vai Pyrrhocoricin 9 Pyrrhocoris apterus Селективни при бактериите, 20 ааг
Иден. №: 21 Gin Gin Arg Lys Arg Lys He Trp Ser He Leu Ala Pro Leu Gly Thr Thr Leu Vai Lys Leu Vai Ala Gly He Gly Melittin, пчелна отрова Неселективни, 26 ааг
Иден. №: 22 Cys Ser Glu Thr Arg Pro Vai Leu Asn Arg Leu Phe Asp Lys lie Arg Gin Vai He Arg Lys Phe Glu Lys Gly He Lys Glu Lys Ser Lys Arg Phe Phe Asp Gly Leu Leu LL-37, Пептид за защита на човешки гостоприемн ИК Селективни при бактериите, 38 ааг
Иден. №: 23 Arg Gly Thr Ser Thr Ser Phe Arg Arg Arg Ser Tyr Ser Leu Arg Gly Gly Arg —1-w--rr·-------· - - SynBl, Вирусен Неселективни, 18aar
Иден. №: 24 Gly Ser Gly Lys Lys Gly Gly Lys Lys His Cys Gin Lys Tyr Crotamine, Crotalus durissus terrificus Селективни при бактериите, 14 aar
Иден. №: 25 Vai Lys Arg Lys Lys Lys Pro Ala Lys Leu Vai Lys Lys Leu Leu Thr Lys Trp Leu Ala S413-PVrev, Вирусен Неселективни, 20 aar
Иден. №: 26 Arg Arg Arg Gin Arg Arg Lys Lys Arg Tat, Вирусен Неселективни, 9 aar
Иден. №: 27 Lys Ser His Ala His Ala Gin Lys Arg He Arg Arg Arg Leu He He Leu Leu pVEC, Вирусен Неселективни, 18 aar
Иден. №: 28 Vai Lys Arg Lys Lys Lys Pro Gin Ser Trp Lys Thr Trp Trp Thr Lys Trp Trp Thr Lys Lys pep-l-k, Синтетичен Бактерии, 21 aar
Иден. №: 29 Arg Vai Arg Arg Arg Asn Arg Arg Thr Arg Asn Arg Arg Arg Arg FHV coat, Вирусен Еукариоти,15 aar
Обърнете внимание, че всички КПП, представени в Таблица 2, са обект на настоящата патентна заявка само по отношение на техните свойства да доставят АСО, които са прикрепени към тях в бактериални и/или в еукариотни клетки. Механизмите на инхибиране на транслацията на мРНК с АСО са изобразени на фигура 1. Може да се използват три типа АСО: PS-DNA, LNA и PNA. PS-DNA работи чрез РНаза Н, която разпознава PS-DNA/ мРНК хибрида и реже частта с мРНК (фигура 102). PNA и LNA просто блокират транслацията на тРНК чрез хибридизиране с областта, която включва иницииращия кодон (фигура 103).
Спектрофотометър измерва оптическата плътност на бактериалната култура (оптическа плътност ОП 600 nm 0.5 - 0.9). Ако плътността на клетките е по-голяма от 0,9, се прави разреждане (1: 1000), за да се постигне необходимата плътност на бактериалните клетки.
След разреждане се използват предварително стерилизирани кювети за измерване на клетъчната плътност. Кюветите съдържат разредени бактериални клетки, MgCh и стерилна вода, които се използват за контрола, докато други проби съдържат и АСО. Оптичната плътност се измерва на всеки половин час в продължение на осем часа. АСО се определя като функция на времето и оптичната плътност на бактериалните клетки. Бактериалните клетки се инокулират в LB среда и се инкубират при оптимални температури, като Staphylococcus aureus (S. aureus) и Escherichia coli (E. coli) се инкубират при 37°C, a Bacillus subtilis (B. subtilis) при 30°C. След растежа се прави подходящо разреждане и растежа на бактериалните клетки се измерва при присъствието на различни концентрации АСО.
Начин на производство
Антисенс олигонуклеотидът и пептидът се свързват ковалентно чрез химическите процедури, описани във фигури 14 и 15. Създаването на самите модифицирани олигонуклеотиди и олигопептиди ще се осъществява по 2 начина. Първият е чрез химическа синтеза, съответно на олигопептиди и олигонуклеотиди. Вторият начин за получаване на КПП е чрез тяхната експресия в Е. coli и Saccharomyces cerevisiae и съответно тяхното прочистване чрез хроматографични методи (size-exclusion chromatography). Алтернативният метод за получаване на нуклеотидите е чрез PCR модификация с нормални или тиол-модифицирани нуклеотиди.
Химична процедура за свързване на SH-модифицирани АСО със свободната карбоксилна група в С-края на КПП, използвайки ЕМСН (Ν-ε-maleimidocaproic acid hydrazide) е представена във фигура 15. ЕМСН реагира със сулфид-модифицирания АСО, за да се получи АСО-хидразид (Фигура 1501). В следващата стъпка, свободната карбоксилна група на С-края на КПП се активира от 1-етил- 3- (3- диметиламинопропил) карбодиимид. В резултат, се образува пептид-ацилсоуреа реактивен естер (1502). Аминно групата на АСО-хидразида реагира с карбоксилната група на пептида, като измества пептид-ацилсоуреа реактивния естер, получава се конюгация на пептида със тиол-модифицирания АСО и се освобождава исоуреа (фигура 1503).
Употребата на химична процедура за свързване на свободна карбоксилна група при С-края на КПП с 5'-края на тиол-модифицирани синтетични ДНК олигомери се извършва чрез двустепенна реакция (фигура 14). При първата реакция 3-(2-пиридилдитио) пропионил хидразид (PDPH) се използва при присъствието на 1-етил-З-(3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC), за да прикрепи пропионил хидразида при карбоксилната група в С-края на КПП като формира пептидна връзка (Фигури 1401 и 1402). Втората реакция е, когато тиолната група на 5‘- края на антисенс олигонуклеотида (АСО) реагира с пиридилдитио групата от пептида, за да формира дисулфидна връзка между АСО и КПП (фигура 1403).
ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ
Фигура 1. Обща схема на инхибиране на базата на антисенс олигонуклеотид в бактериите. Приложения на АСО, които са насочени към специфични мРНК и инхибират растежа на бактериите. Фигурата представя инхибирането на специфични мРНК, които са мишени за три различни типа химерни антисенс олигонуклеотиди. Всички антисенс олигонуклеотиди се свързват с клетъчно- проникващи пептиди, които навлизат в бактериалните клетки. След транскрипцията на мРНК (101), инхибирането на транслацията на специфична протеинова експресия може да бъде постигнато чрез разпадане на мРНК чрез РНаза Н (102) или чрез предотвратяване на транслацията на мРНК (103). Тези подходи водят до инхибиране на растежа на определени патогенни
Q бактерии, както е описано в тази патентна заявка (102 и 103).
Фигура 2. Специфично насочване на FMN аптамерната част в ribD полицистронна мРНК от химерен антисенс олигонуклеотид (Иден. №: 1 (АСО -1)). (201) Химерният антисенс η пигонук пеотид се свързва с комплементарната последователност на FMN аптамерната част. (202) След свързване на химерен антисенс олигонуклеотид с FMN аптамерната последователност се образува двойно-верижна молекула. (203) Двойно-верижната молекула се разпознава от РНаза Н, която я свързва и задейства ензимната хидролиза на мРНК. (204) Ензимната хидролиза на мРНК води до липса на генна експресия на ribD оперона.
О Фигура 3. Инхибиране на бактериалния растеж чрез антисенс олигонуклеотид, който се прицелва към мРНК на FMN рибопревключвател. (301) Иден. №: 1 (АСО -1) в концентрация 2000 пМ, се свързва с мРНК за FMN рибопревключвателя и инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълници), Е. coli (линия с кръгове) и S. aureus (линия с триъгълници). В сравнение с Иден. №: 1 (АСО -1), АСО -2 (фиг.2) не инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с ромбчета) и Е. coli (линия с обърнати надолу триъгълници). (302) Иден. №: 1 (АСО -1) в концентрация 1000 пМ, се свързва с мРНК за FMN рибопревключвателя и инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълници), Е. coli (линия с кръгове) и S. aureus (линия с триъгълници). В сравнение с Иден. №: 1 (АСО -1), АСО -2 (фиг.2) не инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с ромбчета) и Е. coli (линия с обърнати надолу триъгълници). (303) Иден. №: 1 (АСО -1) в концентрация 700 пМ, се свързва с мРНК за FMN рибопревключвател и инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълници), Е. coli (линия с кръгове) и 5. aureus (линия с триъгълници). В сравнение с Иден. №: 1 (АСО -1), АСО -2 (фиг.2) не инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с ромбчета) и Е. coli (линия с обърнати надолу триъгълници). (304) Иден. №: 1 (АСО -1) в концентрация от 350 пМ няма ефект върху инхибирането на бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълници), Е. coli (линия с кръгове) и S. aureus (линия с триъгълници). (305) Иден. №: 1 (АСО -1) в концентрация 150 пМ няма ефект върху инхибирането на бактериалния растеж в В. subtilis (линия с правоъгълници), Е. coli (линия с кръгове) и S. aureus (линия с триъгълници). (306) Бактериален растеж на В. subtilis (линия с правоъгълници), Е. coli (линия с кръгове) и S. aureus (линия с триъгълници) без АСО.
Фигура 4. Сравняване на последователностите в патогенни бактерии, съдържащи последователността на FMN рибопревключвател. Патогенните бактерии S. aureus, S. sapropyticus, S. epidermidis, L. monocytogenes, B. anthracis, S. agalactiae, S. pneumoniae, E. coli и непатогенната бактерия B. subtilis съдържат последователността за FMN рибопревключвателя.
Фигура 5. Специфично прицелване в glmS аптамерната част на иРНК чрез химерен антисенс олигонуклеотид (Иден. №: 2 (АСО-1)). (501) Химерният антисенс олигонуклеотид се свързва с комплементарната последователност на glmS рибозима. (502) След свързване на химерния антисенс олигонуклеотид с ghnS последователността се образува двойно-верижна молекула. (503) Двойно-верижната молекула се разпознава от РНаза Н, която я свързва и задейства ензимната хидролиза на мРНК. (504) Ензимната хидролиза на мРНК води до липса на генна експресия на glmS.
Фигура 6. Инхибиране на бактериалния растеж от антисенс олигонуклеотид, който се цели в тРНК за glmS рибопревключвателя. (601) Иден. №: 2 (АСО-1) в концентрация
2000 пМ инхибира бактериалния растеж на S', aureus (линия с триъгълник), но не инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълник) и E.coli (линия с кръгче). (602) Иден. №: 2 (АСО-1) в концентрация от 1000 пМ инхибира бактериалния растеж на S. aureus (линия с триъгълник), но не инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълник) и E.coli (линия с кръгче). (603) Иден. №: 2 (АСО-1) в концентрация 700 пМ инхибира бактериалния растеж на S. aureus (линия с триъгълник), но не инхибира бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълник) и E.coli (линия с кръгче). (604) Иден. №: 2 (АСО-1) в концентрация 350 пМ не инхибира бактериалния растеж на S', aureus (линия с триъгълник), както при бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълник) и E.coli (линия с кръгче). (605) Иден. №: 2 (АСО-1) в концентрация 150 пМ няма ефект върху инхибирането на бактериалния растеж на S. aureus (линия с триъгълник), както и при бактериалния растеж на В. subtilis (линия с правоъгълник) и E.coli (линия с кръгче). (606) Бактериален растеж на S. aureus, В. subtilis и Е. coli без Иден. №: 2 (АСО-1).
Фигура 7. Сравняване на последователностите в патогенни бактерии, съдържащи последователността за glmS рибопревключвател. Само S. aureus има пълно съвпадение с последователността на glmS рибопревключвателя, докато последователностите на другите патогенни бактерии имат някои несъответствия.
Фигура 8. Специфично насочване към SAM-Ι аптамерната част в полицистронната мРНК на S-box от химерен антисенс олигонуклеотид (Иден. №: 3 (АСО-1)). (801) Химерният антисенс олигонуклеотид се свързва към комплементарната последователност на S AM-I аптамерната част. (802) След свързване на химерен антисенс олигонуклеотид със SAM-I аптамерната последователност се образува двойно-верижна молекула. (803) Двойноверижната молекула се разпознава от РНаза Н, която я свързва и предизвиква ензимната хидролиза на РНК. (804) Ензимната хидролиза на РНК води до липса на генна експресия на оперона на S-box.
Фигура 9. Инхибиране на бактериален растеж с антисенс олигонуклеотид, който е насочен към SAM-Ι рибопревключвател мРНК. (901) Иден. №: 3 (АСО-1) в концентрация
2000 пМ, се свързва с мРНК на SAM-Ι рибопревключвателя и инхибира бактериалния растеж на S. aureus (линия с кръг) и L. monocytogenes (линия с обърнат надолу триъгълник), в сравнение с бактериалния растеж без Иден. №: 3 (АСО-1) (линия с правоъгълник за 5. aureus и линия с триъгълник за L. monocytogenes'). (902) Иден. №: 3 (АСО-1) в концентрация 1000 пМ се свързва с мРНК за рибопревключвателя SAM-Ι и инхибира бактериалния растеж на S'. aureus (линия с кръг) и L. monocytogenes (линия с обърнат надолу триъгълник). В сравнение с бактериалния растеж без Иден. №: 3 (АСО-1) (линия с правоъгълник за S', aureus и линия с триъгълник за L. monocytogenes). (903) Иден. №: 3 (АСО-1) в концентрация 700 пМ се свързва с мРНК за SAM-I рибопревключвателя и инхибира бактериалния растеж на S. aureus (линия с кръг) и L. monocytogenes (линия с обърнат надолу триъгълник). Растежът на бактериите без Иден. №: 3 (АСО-1) (линия с правоъгълник за S', aureus и линия с триъгълник за L. monocytogenes). (904) Иден. №: 3 (АСО-1) в концентрация от 350 пМ няма ефект при инхибиране на бактериалния растеж на S. aureus и L. monocytogenes. (905) Иден. №: 3 (АСО-1) в концентрация 150 пМ, няма ефект при инхибиране на бактериалния растеж на S. aureus и L. monocytogenes. (906) Бактериален растеж на Е. coli (линия с обърнат надолу триъгълник) и S. aureus (линия с кръг) при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1) в концентрация от 2000 пМ. Иден. №: 3 (АСО-1) няма ефект върху бактериалния растеж на Е. coli, тъй като не съдържа SAM-Ι рибопревключвател и не може да се свърже специфично.
Фигура 10. Сравняване на аптамерните последователности на експериментално тестваните бактерии, съдържащи рибопревключвателя SAM-Ι. Тестваните бактерии са Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.
Фигура 11. Специфично насочване към TPP аптамерната част в полицистронната мРНК чрез химерен антисенс олигонуклеотид (Иден. №: 4 (АСО -1)). (1101) Химерният антисенс олигонуклеотид се свързва с комплементарната последователност на ТРР аптамерната част. (1102) След свързване на химерния антисенс олигонуклеотид с ТРР аптамерната последователност, се образува двойноверижна молекула. (1103)
Двойноверижната молекула се разпознава от РНаза Н, която я свързва и задейства разрязване на РНК. (1104) Разрязването на РНК води до липса на генна експресия.
Фигура 12. Инхибиране на бактериален растеж е антисенс олигонуклеотид, който е насочен към мРНК на ТРР рибопревключвател. (1201) Иден. №: 4 (АСО-1) в концентрация 2000 пМ, се свързва с мРНК за ТРР рибопревключвател и инхибира бактериалния растеж на L. monocytogenes (линия с кръг) и В. subtilis (линия с обърнат надолу триъгълник). Бактериалният растеж на L. monocytogenes (линия с правоъгълник) и В. subtilis (линия с триъгълник) в отсъствие на Иден. №: 4 (АСО-1) не се инхибира. (1202) Иден. №: 4 (АСО-1) в концентрация 1000 пМ се свързва с тРНК за ТРР рибопревключвател и инхибира бактериалния растеж на L. monocytogenes (линия е кръг) и В. subtilis (линия с обърнат надолу триъгълник). Бактериалният растеж на L. monocytogenes (линия с правоъгълник) и В. subtilis (линия с триъгълник) в отсъствие на Иден. №: 4 (АСО-1) не се инхибира. (1203) Иден. №: 4 (АСО-1) в концентрация 700 пМ, се свързва с мРНК за ТРР рибопревключвателя и инхибира бактериалния растеж на L. monocytogenes (линия с кръг) и В. subtilis/PacTewbr на L monocytogenes (линия с правоъгълник) и В. subtilis (линия с триъгълник) в отсъствие на Иден. №: 4 (АСО-1) не се инхибира. (1204) Иден. №: 4 (АСО-1) в концентрация от 350 пМ няма ефект при инхибиране на бактериалния растеж на L. monocytogenes (линия с кръг) и В. subtilis (ттиния с триъгълник). (1205) Иден. №: 4 (АСО -1) в концентрация 150 пМ няма ефект при инхибирането на бактериалния растеж на L. monocytogenes (линия с кръг) и В. subtilis (пиния с обърнат надолу триъгълник). (1206) Бактериалният растеж на Е. coli (линия с кръг) при присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1) в концентрация от 2000 пМ не оказва влияние върху растежа на бактериите, тъй като не съдържа ТРР рибопревключвател и Иден. №: 4 (АСО-1) не може да се свърже конкретно.
Фигура 13. Сравняване на последователностите от патогенни бактерии, съдържащи последователността на ТРР рибопревключвател. Патогенните бактерии Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumonae, Streptococcus agalactiae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Brucella meltensis, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diphtherias и Salmonella enterica съдържат последователността на TPP рибопревключвателя.
Фигура 14. Имобилизиране на тиол-модифициран АСО до КПП чрез използване на хетеробифункционален свързващ (cross-linking) реагент, наречен 3- (2-пиридилдитио) пропионил хидразид (PDPH) и 1-етил-З- (3-диметиламинопропил) карбодиимид. Първо, хидразидната група на PDHP реагира с карбоксилната група на КПП, образувайки връзка (1401 и 1402). На второ място, тиоловата група в 5'-края на ДНК олигомера реагира с пиридилдитио групата, въведена върху КПП (1403).
Фигура 15. Химична процедура за свързване на SH-модифицирани АСО и свободна карбоксилна група в С-края на КПП като се използва N-е-малеимидокапронова киселина хидразид (ЕМСН). ЕМСН реагира със сулфидно модифициран АСО, за да се получи АСО-хидразид (1501). В следващия етап свободната карбоксилна група в С-края на КПП се активира от 1-етил-З- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC). В резултат на това се образува реактивен естер на пептид-ацил-сулфонамид (1502). При присъствието на АСО-хидразид реактивният естер на пептид-ацилисоурея образува пептидна връзка на тиол-модифицирания АСО със КПП и се отделя исоуреа(1503).
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ
Пример 1: Инхибиторно действие на антисенс олигонуклеотид за FMN рибопревключвател
Инхибиторният ефект на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2), създаден, за да се свърже към комплементарната последователност на аптамерната част на FMN рибопревключвателя, е тестван в клетки на условните патогенни за човека бактерии S. aureus и Е. coli и непатогенната за човек бактерия В. subtilis. В пробите, съдържащи най-високата концентрация (2000 пМ) от Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2), се наблюдава максимално инхибиране на бактериалния растеж на В. subtilis, Е. coli и най-вече на 5. aureus (фигура 301). Пинията с правоъгълниците показва бактериалния растеж на В. subtilis при присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2), който достига максимум около 0.3 оптични единици след инкубационно време от четири часа. Линията с кръговете показва бактериалния растеж при Е. coli при присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2), който достига максимум около 0.3 оптични единици след инкубационно време от четири часа. Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) инхибира най-вече бактериалния растеж на S. aureus, както е показано от линията с триъгълниците на фигура 301. Бактериалният растеж достига максимум около 0.2 оптични единици след инкубационно време от три часа и половина. Използва се и АСО-2, но не се свързва специфично с РНК в В. subtilis (линията с ромбове, фигура 301) и Е1, coli (линията с обърнати триъгълници, фигура 301) и следователно не инхибира растежа на тези бактерии. Те достигат максимум 1,3 оптични единици след инкубационно време от четири часа. АСО-2 (фигура 2) служи като отрицателна контрола за демонстриране на специфичното действие на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2). Липсата на инхибиране на бактериалния растеж на В. subtilis и Е. coli при присъствието на АСО-2 (фигура 2) е показател, че ДНК частта от химерния олигомер не хибридизира неспецифично с РНК-и, експресирани в тези бактерии.
Бактериалният растеж на трите бактерии, 5. aureus (линията с триъгълници, фигура 301), Е. coli (линията с кръгове, фигура 301) и Е. subtilis (линията с правоъгълниците, фигура 301) при наличието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) достига минимум по-малко от 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем часа. Същевременно бактериалният растеж на Е. coli (линията с обърнати надолу триъгълници, фигура 301) и В. subtilis (линията с ромбове, фигура 301) при присъствието на АСО-2 (фигура 2) достига минимум по-малко от 0.3 оптични единици след инкубационно време от седем часа.
Следващите проби са с 1000 пМ концентрация на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2). Тази концентрация на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) инхибира бактериалния растеж на В. subtilis, Е. coli и Е. aureus (фигура 302) на същото ниво като по-високата концентрация на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2), показано на фигура 302. При присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) бактериалният растеж на В. subtilis (линията с правоъгълници, фигура 302) и E.coli (линията с кръгове, фигура 302) достига максимум по-малко от 0,4 оптични единици след инкубационно време от четири часа. Същевременно бактериалният растеж на S. aureus достига максимум по-малко от 0.3 оптични единици след инкубационно време от три и половина часа (линията с триъгълници, фигура 302). АСО-2 (фигура 2) не възпрепятства бактериалния растеж на Е. coli (линията с обърнатите триъгълници, фигура 302) и В. subtilis (линията с ромбовете, фигура 302), тъй като те достигат максимум 1,3 оптични единици след инкубационно време от четири часа. При присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) бактериалният растеж на трите бактерии, S. aureus (линията с триъгълници, фигура 302), Е. coli (линията с кръговете, 302) и В. subtilis (линията с правоъгълниците, фигура 302) достига минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем часа. Същевременно при присъствието на АСО-2 (фиг. 2) бактериалният растеж на Е. coli (линията с обърнатите надолу триъгълници, фигура 302) и В. subtilis (линията с ромбовете, фигура 302) достига минимум около 0.3 оптични единици след инкубационно време от седем часа.
При следващата концентрация на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) от 700 пМ се наблюдава също така инхибиране на бактериалния растеж на В. subtilis, Е. coli и S. aureus на същото ниво като в предишните две по-високи концентрации (фигура 303). Линията с правоъгълници показва бактериален растеж на В. subtilis при присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2), който достига максимум около 0.4 оптични единици след инкубационно време от четири часа. Същевременно линията с кръговете показва бактериален растеж на Е. coli и достига същия максимум като В. subtilis при присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2). Линията с триъгълниците показва бактериален растеж на S aureus при присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2), който достига максимум по-малко от 0.3 оптични единици след инкубационно време от три часа и половина . При присъствието на АСО-2 (фигура 2) бактериалният растеж на Е. coli (линията с обърнатите надолу триъгълници, фигура 303) и В. subtilis (линията с ромбове, фигура 303) достига максимум 1,3 оптични единици след инкубационно време от четири часа. При присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) бактериалният растеж на трите бактерии, S. aureus (линията с триъгълници, фигура 303), Е. coli (линията с кръговете, 303) и В. subtilis (линията с правоъгълниците, фигура 303) достига минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем часа. Същевременно при присъствието на АСО-2 (фигура 2), бактериалният растеж на Е. coli (линията с обърнати триъгълници, фигура 303) и В. subtilis (линията с ромбове, фигура 303) достига минимум около 0.3 оптични единици след инкубационно време от седем часа.
При концентрация от Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) от 350 пМ няма инхибиране на бактериалния растеж на В. subtilis и Е. coli. Само при S. aureus се наблюдава слабо инхибиране (фигура 304). При присъствието на Иден. №: 1 (АСО-1, фигура 2) В. subtilis (линията с правоъгълници, фигура 304) и Е. coli (линията с кръговете, фигура 304) достигат максимум 1.3 оптични единици след инкубационно време от четири часа и половина, докато S. aureus достига максимум около 1,1 оптични единици след инкубационно време от четири часа. Минималната инхибираща концентрация (МИК) е най-ниската концентрация, при която се наблюдава инхибиране на растежа на бактериите. МИК80 е стандарт, използван за изчисляване на минималната концентрация на съответната антибиотична молекула за 80% инхибиране на бактериалния растеж. За АСО, който хибридизира с комплементарната последователност на аптамерната част на FMN рибопревключвателя и контролира генната експресия на ribD оперона, МИК80 е 700 пМ, 4.5 pg/ml. Тази концентрация включва АСО и pVEC, който е пептид, проникващ в клетките (КПП). При тази концентрация се наблюдава максимално инхибиране на бактериалния растеж и максимална преживяемост на човешката клетъчна линия А549 на недребноклетъчен белодробен рак. Ефектът е бактериостатичен. FMN рибопревключвателят е един от най-често срещаните рибопревключватели в бактериите. В базата данни на Rfam FMN рибопревключвателят е открит в 3098 вида бактерии. От тях 30 са патогенни за човека бактерии: Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Vibrio cholera, Echerichia coli, Shigella sonnei, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Yersinia pestis, Brucella canis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Haemophilus influenzae, Stretococcus pneumoniae, Stretococcus pyogenes, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Francisella tularensis, Salmonella typhi, Acinetobacter baumannii и Klebsiella pneumoniae.
Пример 2: Инхибиторно действие на антисенс олигонуклеотид за glmS рибопревключвателя
Инхибиторният ефект на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5), създаден, за да се свързва към комплементарна последователност на аптамерната част на glmS рибопревключвателя, е тестван в клетки на човешките условни патогенни бактерии S. aureus и Е. coli и непатогенната за човека бактерия В. subtilis. Последователността на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) е проектирана да бъде напълно комплементарна само с последователността на S. aureus, докато последователностите на Е. coli и В. subtilis имат някои несъответствия и Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) не могат да се свържат специфично. АСО-2 (фигура 5) се използва като отрицателна контрола и няма никакво влияние върху растежа на бактериите.
В пробите, съдържащи най-високата концентрация на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5), 2000 пМ, се наблюдава максимално инхибиране на бактериалния растеж на S. aureus, докато в Е. coli и В. subtilis няма инхибиране (фигура 601). Линията с триъгълници показва бактериален растеж на 5. aureus при присъствието на Иден. №: 2 (АСО -1, фигура 5), който достига максимум около 0.3 оптични единици след инкубационно време от три часа. Линията с кръговете показва бактериалния растеж на Е. coli, докато линията с правоъгълниците показва бактериален растеж на В. subtilis. При присъствието на Иден. №: 2 (АСО -1, фигура 5) те достигат максимум около 1.3 оптични единици след инкубационно време от пет часа (фигура 601). Липсата на инхибиране на бактериалния растеж на B.subtilis и Е. coli при присъствието на Иден. №: 2 (АСО -1, фигура 5) е индикатор, че pVEC от химерния олигомер не инхибира бактериалния растеж сам по себе си. Бактериалният растеж на Е. coli (линията с кръгове, фигура 601) и В. subtilis (линията с правоъгълниците, фигура 601) достига минимум 0.3 оптични единици при присъствието на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) след инкубационно време от седем и половина часа. Същевременно бактериалният растеж на S. aureus (линията с триъгълниците, фигура 601) достига минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем и половина часа.
Следващите проби са с 1000 пМ концентрация на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5). Тази концентрация на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) инхибира бактериалния растеж на S. aureus (фигура 602) на същото ниво като по-високата концентрация на Иден. №: 2 (АСО-1, както е показано на фигура 601). Същевременно тази концентрация на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5), показана на фигура 602, няма ефект върху бактериалния растеж на Е. coli и В. subtilis, които са същите като при по-високата концентрация на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5), показано на фигура 601. При присъствието на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) бактериалният растеж на S aureus (пинията с триъгълници, фигура 602) достига максимум 0.3 оптични единици след инкубационно време от три часа и половина. Същевременно бактериалният растеж на Е. coli (линията с кръгове, фигура 602) и В. subtilis (линията с правоъгълници, фигура 602) достига максимум 1,3 оптични единици след инкубационно време от пет часа. Бактериалният растеж на двете бактерии, Е. coli (линията с кръговете, фигура 602) и В. subtilis (линията с правоъгълници, фигура 602) достига минимум 0.3 оптични единици при присъствието на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) след инкубационно време от седем часа и половина.
Същевременно бактериалният растеж на S. aureus (линията с триъгълниците, фигура 602) достига минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем часа и половина.
При следващата концентрация на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) от 700 пМ също се наблюдава инхибиране на бактериалния растеж на S. aureus, тъй като достига максимум около 0.4 оптични единици след инкубационно време от четири часа (линията с триъгълниците, фигура 603). Същевременно бактериалният растеж на Е. coli (линията с кръговете, фигура 603) и В. subtilis (линията с правоъгълници, фигура 603) при присъствието на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) достига същата максимална и минимална стойност, както при предишните две концентрации, показани на фигура 601 и фигура 602. Бактериалният растеж на S. aureus достига минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем и половина часа (линията с триъгълници , фигура 603).
При концентрация на Иден. №: 2 (АСО -1, фигура 5) от 350 пМ няма инхибиране на бактериалния растеж при В. subtilis, Е. coli и S. aureus. При присъствието на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5), бактериалният растеж на S. aureus достига максимум около 1.1 оптични единици след инкубационно време от четири часа и половина (линията с триъгълници, фигура 604). Бактериалният растеж на Е. coli (линията с кръгове, фигура 604) и В. subtilis (пинията с правоъгълниците, фигура 604) достига същия максимум, както при предишните три концентрации, показани на фигури 601, 602 и 603. При най-ниската концентрация на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) от 150 пМ, инхибиране на бактериалния растеж на В. subtilis, Е. coli и S. aureus напълно липсва. Последните две концентрации на Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 5) не могат да инхибират бактериалния растеж на тестваните бактерии. Кинетиката на растежа на тези бактерии е идентична с кинетиката на растежа на бактериите в пробите без Иден. №: 2 (АСО-1, фигура 606). АСО хибридизира с комплементарната последователност на аптамерната част на glmS рибопревключвателя и контролира генната експресия на гена, който кодира glmS ензима. Неговият МИК 86% е *700 пМ, 5 pg/ml. Тази концентрация включва АСО и pVEC КПП. Рибопревключвателят glmS се среща в 800 бактериални вида, от които следните 11 са патогенни за човека: Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium.
Пример 3: Инхибиращо действие на антисенс олигонуклеотид за SAM-Ι върху бактериалния растеж
Инхибиращият ефект на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8), който е създаден, за да се свързва към комплементарната последователност на аптамерната част на рибопревключвателя SAMI, е тестван в клетки на безусловния човешки патоген Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) и в условния човешки патоген S. aureus (фигура 10). Клетки от условния патоген Е. coli също се използват и като контролен експеримент, в който не трябва да има инхибиращ ефект на бактериалния растеж на Е. coli, тъй като SAM-Ι рибопревключвателя не присъства.
В пробите, съдържащи най-високата концентрация (2000 пМ) на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) се наблюдава максимално инхибиране на бактериалния растеж на S. aureus и L. monocytogenes (фигура 901). Линията с триъгълниците на фигура 901 показва бактериалния растеж на L. monocytogenes в отсъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8), който достига максимум около 1.3 оптични единици след инкубационно време от три и половина часа. Обратно, за същите бактерии при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) се наблюдава максимално по-малко от 0.3 оптични единици след инкубационно време от четири часа (линията с обърнатите надолу триъгълници, фигура 901). За S. aureus при отсъствие на Иден. №: 3 (АСО -1, фигура 8) се наблюдава максимум приблизително 1,3 оптични единици след инкубационно време от четири часа (линията с правоъгълници, фигура 901). Обратно, при S. aureus при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) се наблюдава максимално 0.3 оптични единици след инкубационно време от четири часа (линията с правоъгълниците, фигура 901). И при двете бактерии, S. aureus и L. monocytogenes, в отсъствието на Иден. №: 3 (АСО -1, фигура 8) се наблюдава минимален бактериален растеж от 0.6 оптични единици след инкубационно време от пет и половина час (линиите с триъгълници и с правоъгълници фигура 901). Същевременно при присъствието на Иден. №: 3 (АСО -1, фигура 8) се наблюдава най-малко 0.1 оптични единици след инкубационно време от пет часа и половина (линиите с обърнати триъгълници и с триъгълници , фигура 901).
Следващите проби съдържат Иден. №: 3 (АСО -1, фигура 8) в концентрация от 1000 пМ. Тази концентрация на Иден. №: 3 (АСО -1, фигура 8) инхибира бактериалния растеж на L. monocytogenes, както и при високата концентрация на Иден. №: 3 (АСО -1, фигура 8). Същевременно в S. aureus се наблюдава силно инхибиране (фигура 902). Линията с обърнатите триъгълници показва бактериален растеж на L. monocytogenes при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8), който достига максимум по-малко от 0.4 оптични единици след инкубация от четири часа (фигура 902). Линията с кръговете показва бактериален растеж на S. aureus при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8), който достига максимум по-малко от 0.3 оптични единици след инкубационно време от три и половина часа (фигура 902). Бактериалният растеж на S. aureus и L. monocytogenes в отсъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) достига максимум около 1.3 оптични единици, като L. monocytogenes достига този максимум след инкубация на три и половина часа (линията с триъгълници, фигура 902), докато S. aureus след четири часа (фигура 902). Двете бактерии достигат минимален бактериален растеж, както при присъствието, както в отсъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8), на 0.1 оптични единици след инкубация за седем часа.
Следващата използвана концентрация Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) е 700 пМ. При тази концентрация също се наблюдава инхибиране на бактериалния растеж на L. monocytogenes и S. aureus, както в предишните две концентрации на Иден. №: 3 (АСО-1) (фигура 903). При присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) L. monocytogenes достига максимален бактериален растеж от около 0.5 оптични единици след инкубационно време от четири часа (линията с обърнатите триъгълници, фигура 903). Същевременно S. aureus при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) достига максимален бактериален растеж с по-малко от 0,4 оптични единици след инкубационно време от три часа и половина (линията с Кръгове, фигура 903). Линиите с триъгълници и с правоъгълници показват максимума на бактериалния растеж на L. monocytogenes, както и на S. aureus в отсъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) на 1.3 оптични единици след инкубационно време от четири часа (фигура 903). В L. monocytogenes и S. aureus се наблюдават минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем часа при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8), показано на фигура 903, съответно с линии с триъгълници с главата надолу и с кръгове. В L. monocytogenes се наблюдава минимум 0.2 оптични единици след инкубационно време от седем часа в отсъствието на Иден. №: 3 (АСО -1, фигура 8), докато в S. aureus се наблюдава най-малко 0.3 оптични единици (линията с правоъгълниците, фигура 903).
В следващата концентрация от 350 пМ от Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) почти не се наблюдава разлика в бактериалния растеж на L. monocytogenes и S. aureus както при присъствието, така и в отсъствието на Иден. №: №: 3 (АСО-1, фигура 904). И при двете бактерии при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) се наблюдава максимален бактериален растеж от приблизително 1.2 оптични единици (линиите с обърнатите надолу триъгълници и с кръговете, фигура 904) след инкубационно време от четири часа и няма разлика с бактериалния растеж, наблюдаван в отсъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) (пиниите с триъгълниците и с правоъгълниците, фигура 904). При най-ниската концентрация от 150 пМ от Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) няма инхибиране на бактериалния растеж на L. monocytogenes и S. aureus (фигура 905). И двете бактерии достигат максимум на бактериален растеж от 1.3 оптични единици в отсъствие (линиите с триъгълници и с правоъгълниците, фигура 905) или при присъствието на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) (линиите с обърнатите надолу триъгълници и кръговите линии, фигура 905) след инкубационно време от четири часа.
Най-високата концентрация от 2000 пМ на Иден. №: 3 (АСО-1, фигура 8) също се използва в бактериални клетки на Е. coli, но не се наблюдава инхибиране на бактериалния растеж, тъй като SAM-Ι не присъства и Иден. №: No: 3 (АСО-1, фигура 8) не може да се свърже специфично. Кинетиката на бактериалния растеж на Е. coli е идентична с пробите без Иден. №: 3 (АСО-1, линията с обърнатите триъгълници, фигура 906). За АСО, който хибридизира с комплементарната последователност на аптамерната част на S AM-I рибопревключвателя и контролира генната експресия на S-box оперона, МИК 80% е
4.5 pg/ml. Тази концентрация включва АСО и pVEC КПП. Рибопревключвателя SAM-Ι се среща само в грам-положителни патогенни бактерии. Този рибопревключвател се намира в следните 9 патогенни бактерии: Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Staphylococcus saprophyticus и Streptococcus epidermidis.
Пример 4: Инхибиращо действие на антисенс олигонуклеотид за ТРР рибопревключвател
Инхибиращият ефект на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11), който е създаден, за да се свърже към комплементарната последователност на аптамерната част на ТРР рибопревключвателя, е тестван в клетки на човешката облигатна патогенна бактерия L. monocytogenes и в непатогенната за човека бактерия В. subtilis (фигура 13).
В пробите, съдържащи най-високата концентрация на Иден. №: 4 (АСО-1, 2000 пМ, фигура 11), се наблюдава максимално инхибиране на бактериалния растеж на L. monocytogenes и В. subtilis (фигура 1201). Линията с кръговете показва бактериален растеж на L. monocytogenes при присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11), който достига максимум по-малко от 0.3 оптични единици след инкубационно време от четири часа. Пинията с обърнати надолу триъгълници показва бактериалния растеж на В. subtilis при присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11), който достига максимум повече от 0.3 оптични единици след инкубационно време от пет часа. При отсъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) бактериалният растеж на L. monocytogenes достига максимум 1,3 оптични единици след инкубационно време от пет часа (линията с правоъгълници, фигура 1201), докато бактериалният растеж на В. subtilis достига максимум 1,4 оптични единици след инкубационно време от четири часа (линията с триъгълници, фигура 1201). Бактериалният растеж на L. monocytogenes (линията с кръгове, фигура 1201) и В. subtilis (линията с обърнати триъгълници, фигура 1201) достига минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем часа при присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11). Същевременно в отсъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) бактериалният растеж на L. monocytogenes (линията с правоъгълници, фигура 1201) и В. subtilis (линията с триъгълници, фигура 1201) достигат минимум 0,2 оптични единици след инкубационно време от седем и половина часа.
Следващите проби са с 1000 пМ концентрация на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11). Тази концентрация на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) инхибира бактериалния растеж на L. monocytogenes и В. subtilis (фигура 1202) на същото ниво както при по-високата концентрация на Иден. №: 4 , фигура 1201). При присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) бактерияттният растеж на L. monocytogenes достига максимум 0.3 оптични единици след инкубационно време от четири часа (линията с кръговете, фигура 1202). Същевременно бактериалният растеж на В. subtilis при присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) достига максимум около 0.4 оптични единици след инкубационно време от три часа и половина (линията с обърнати надолу триъгълници, фигура 1202). При отсъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11), бактериалният растеж на L. monocytogenes достига максимум 1,3 оптични единици след инкубационно време от пет и половина часа (линията с правоъгълниците, фигура 1202), докато В. subtilis достига максимум 1,3 оптични единици след инкубационно време от три и половина часа (линията с триъгълници, фигура 1202). Както и при предишната по-висока концентрация, показана на фигура 1201, бактериалният растеж на L. monocytogenes (линията с кръгове, фигура 1202) и В. subtilis (линията с обърнати триъгълници, фигура 1202) при присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) достига минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем часа. При отсъствието на Иден. №: 4 (АСО -1, фигура 11) те достигат минимум 0,2 оптични единици за L. monocytogenes (линията с правоъгълници, фигура 1202) и за В. subtilis (линията с триъгълници, фигура 1202) след инкубационно време от седем и половина часа.
При следващата концентрация на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) от 700 пМ също се наблюдава инхибиране на бактериалния растеж на L. monocytogenes и В. subtilis (фигура 1203), както при предишните две по-високи концентрации, показани на фигури 1201 и 1202. Пинията с кръговете показва бактериален растеж на L. monocytogenes, докато линията с обърнатите триъгълници показва бактериален растеж на В. subtilis, който достига максимум 0,4 оптични единици при присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) след инкубационно време от три часа. Същевременно в отсъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) бактериалният растеж наС. monocytogenes (линията с правоъгълници, фигура 1202) и В. subtilis (пинията с триъгълници, фигура 1202) е с максимум от 1,3 оптични единици след инкубационно време от четири часа. Бактериалният растеж на L. monocytogenes при присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) (линията с кръгове, фигура 1203) и В. subtilis (пинията с обърнати триъгълници, фигура 1202) достигат минимум 0,1 оптични единици след инкубационно време от седем часа. Същевременно в отсъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) бактериалният растеж на L. monocytogenes (линията с правоъгълници, фигура 1202) и В. subtilis (линията с триъгълници, фигура 1202) достигат минимум от 0,2 оптични единици след инкубационно време от седем и половина часа. При концентрация от Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) от 350 пМ, няма инхибиране на бактериалния растеж на L. monocytogenes и В. subtilis (фигура 1204). При присъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11), бактериалният растеж на L. monocytogenes (линията с кръговете, фигура 1204) достига максимум 1,2 оптични единици след инкубационно време от три часа за L. monocytogenes и четири часа за В. subtilis (линията с обърнатите триъгълници, фигура 1204).
При най-ниската концентрация на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) от 150 пМ, инхибирането на бактериалния растеж на L. monocytogenes и В. subtilis напълно липсва (фигура 1205). Последните две концентрации на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) не могат да инхибират бактериалния растеж на тестваните бактерии. Кинетиката на растежа на тези бактерии е идентична с кинетиката на растежа на Е. coli при присъствието и отсъствието на Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11 и фигура 1206). Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) не може да инхибира бактериалния растеж на Е. coli, тъй като ТРР рибопревключвателят не присъства в Е. coli и Иден. №: 4 (АСО-1, фигура 11) и инхибира бактериалния растеж. За АСО, който хибридизира с допълнителната последователност на аптамерната част на ТРР рибопревключвателя и контролира генната експресия на съответния оперон, МИК80 е 750 пМ, 5.2 pg/ ml. Тази концентрация включва АСО и pVEC КПП. ТРР рибопревключвателят се разпространява широко в патогенните за човека бактерии. Той присъства в общо 40 патогени, които са преобладаващи в следните 15 патогенни бактерии: Francisella tularensis, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitides, Pseudiminas aeruginosa, Salmonella enterica, Enterobacter sp., Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecium, Mycobacterium leprae, Streptococcus agalactiae и Listeria monocytogenes.
ПРИЛОЖЕНИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Тук ние описваме дизайна, създаването и приложенията на различни антисенс олигонуклеотиди, прикачени към проникващи в клетката олигопептиди като антибактериални агенти, които се прицелват в специфични бактериални мРНК и инхибират техния бактериален растеж (фигура 1). Във фигура 1 е представено инхибирането на специфична мРНК, която е мишена за три различни типа химерни антисенс олигонуклеотиди. Всички антисенс олигонуклеотиди са свързани с проникващи в клетката пептиди, които навлизат в бактериалните клетки след (фигура 101). Инхибирането на транслацията на специфичен протеин може да се постигне чрез разрушаване на съоветната мРНК с РНаза Н (фигура 102) или чрез превенция на транслацията на мРНК (фигура 103). Тези подходи водят до инхибиране на растежа на определени патогенни бактерии, както е описано в патентната заявка (фигури 102 и 103).
ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
Претенция 1: Употребата на Иден. №: 1 за инхибиране на бактериалния растеж на Saprophyticus staphylococcus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Streptococcus agalactiae и Pneumoniae streptococcus.
Претенция 2: Употребата на Иден. №: 2 за инхибиране на бактериалния растеж на Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis V583, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus aureus.
Претенция 3: Употребата на Иден. №: 3 за инхибиране на бактериалния растеж на Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.
Претенция 4: Употребата на Иден. №: 4 за инхибиране на бактериалния растеж на Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Brucella meltensis, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diphtheriae и Salmonella enterica.
Претенция 5: Употребата на Иден. №: 5 за инхибиране на бактериалния растеж на Saprophyticus staphylococcus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Bacillus anthracis, Streptococcus agalactiae и Streptococcus pneumoniae.
Претенция 6: Употребата на Иден. №: 6 за инхибиране на бактериалния растеж на Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis V583, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus aureus.
Претенция 7: Употребата на Иден. №: 7 за инхибиране на бактериалния растеж на Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.
Претенция 8: Употребата на Иден. №: 8 за инхибиране на бактериалния растеж на Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Brucella meltensis, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diphtheriae и Salmonella enterica.
Претенция 9: Употребата на Иден. №: 9 за инхибиране на бактериалния растеж на Saprophyticus staphylococcus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Streptococcus agalactiae и Streptococcus pneumoniae.
Претенция 10: Употребата на Иден. №: 10 за инхибиране на бактериалния растеж на Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis V583, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus aureus.
Претенция 11: Употребата на Иден. №: 11 за инхибиране на бактериалния растеж на Staphylococcus aureus и Listeria monocytogenes.
Претенция 12: Употребата на Иден. №: 12 за инхибиране на бактериалния растеж на Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Brucella meltensis, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diphtheriae и Salmonella enterica.
Претенция 13: Употребата на Иден. №: 13, която се цели в мРНК на ADK гена, за да инхибира бактериалния растеж на Staphylococcus aureus.
Претенция 14: Употребата на Иден. №: 14, която се цели в мРНК на ADK гена, за да инхибира бактериалния растеж на Staphylococcus aureus.
Претенция 15: Употребата на Иден. №: 15, която се цели в мРНК на ADK гена, за да инхибира бактериалния растеж на Staphylococcus aureus.
Претенция 16: Употребата на Иден. №: 16, която се цели в мРНК на GMK гена, за да инхибира бактериалния растеж на Staphylococcus aureus.
Претенция 17: Употребата на Иден. №: 17, която се цели в мРНК на GMK гена, за да инхибира бактериалния растеж на Staphylococcus aureus.
Претенция 18: Употребата на Иден. №: 18, която се цели в мРНК на GMK гена, за да инхибира бактериалния растеж на Staphylococcus aureus.
Претенция 19: Използването на 5'-нетранслирана област (5'-UTRs) и целите секвенции на мРНК-и, които съдържат рибопревключвателя флавин мононуклеотид (FMN), познат още като RFN елемент, при следните бактерии Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus sapropyticus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Vibrio cholera, Echerichia coli, Shigella sonnei, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Yersinia pestis, Brucella canis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Haemophilus influenzae, Stretococcus pneumoniae, Stretococcus pyogenes, Bordetella pertussis, Streptococcus agalactiae, Francisella tularensis, Salmonella typhi, Acinetobacter baumannii и Klebsiella pneumoniae като антисенс олигонуклеотидни мишени за антибактериални лекарства.
Претенция 20 Използването на 5'-нетранслирана област (5'-UTRs) и целите секвенции на мРНК-и, които съдържат рибопревключвателя глюкозамин-6-фосфат активизуема рибозима (glmS) при следните бактерии Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium като антисенс олигонуклеотидни мишени за антибактериални лекарства.
Претенция 21: Използването на 5'-нетранслирана област (5'-UTRs) и целите секвенции на мРНК-и, които съдържат рибопревключвателя S-аденозил метионин (SAM-Ι), познат още като S-box лидър при следните бактерии Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium 30 difficile, Staphylococcus saprophyticus и Streptococcus epidermidis като антисенс олигонуклеотидни мишени за антибактериални лекарства.
Претенция 22: Използването на 5'-нетранслирана област (5'-UTRs) и целите секвенции на мРНК-и, които съдържат рибопревключвателя тиамин пирофосфат (ТРР), познат още като Thi-box елемент при следните бактерии Francisella tularensis, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitides, Pseudiminas aeruginosa, Salmonella enterica, Enterobacter sp., Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecium, Mycobacterium leprae, Streptococcus agalactiae и Listeria monocytogenes като антисенс олигонуклеотидни мишени за антибактериални лекарства.
Претенция 23: Употребата на мРНК последователности на аденозин киназата при Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella avium, Bordetella pertusis, Borrelia garinii, Borrelia burgdorferii, Borrelia afzelii, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica и Klebsiella pneumonia като антисенс o тгигонуклеотидни мишени за антибактериални лекарства.
Претенция 24: Употребата на мРНК последователности на гуанилат киназата(ОМК) при Corynebacterium diphtheria, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella avium, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis,
Chlamydia psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica и Klebsiella pneumonia като антисенс олигонуклеотидни мишени за антибактериални лекарства.
Претенция 25: Употребата на проникващ в клетката пептид (КПП) със секвенция Иден. №: 19 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 19.
Претенция 26: Употребата на проникващ в клетката пептид (КПП) със секвенция Иден. №: 20 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 20.
Претенция 27: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 21 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 21.
Претенция 28: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 22 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 22.
Претенция 29: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 23 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 23.
Претенция 30: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 24 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 24.
Претенция 31: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 25 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 25.
Претенция 32: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 26 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 26.
Претенция 33: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 27 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 27.
Претенция 34: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 28 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 28.
Претенция 35: Употребата на проникващ в клетката пептид със секвенция Иден. №: 29 за предаване в клетката на антисенс олигонуклеотиди, които са ковалентно свързани с Иден. №: 29.
Претенция 36: Употребата на химична процедура за свързване на свободна карбоксилна група при С- края на КПП с 5'-края на тиол-модифицирани синтетични ДНК олигомери, използвайки двустепенна реакция (фигура 14).
Претенция 37: Употребата на химична процедура за свързване на SH-модифицирани АСО със свободната карбоксилна група в С-края на КПП, използвайки ЕМСН (Ν-εmaleimidocaproic acid hydrazide) (фигура 15).
ЛИТЕРАТУРА

Claims (8)

1. ЕР2471925. Breaker RR, Sudarsan N, Wachter A, Cheah MT. Methods and compositions related to riboswitches that control alternative splicing.
2. US20080269258. Breaker RR, Lim J, Blount KF, Puskarz I, Batey R. Riboswitches, structure-based compound design with riboswitches, and methods and compositions for use of and with riboswitches.
3. US20100041742. Breaker RR, Nahvi A, Sudarsan N, Ebert MS, Winkler W, Bamck JE, Wickiser JK. Riboswitches, methods for their use, and compositions for use with riboswitches.
4. US20100286082. Breaker RR, Weinberg Z, Sudarsan N, Wang JX, Meyer MM, Roth A, Regulski EE. Riboswitches and methods and compositions for use of and with riboswitches.
5. US20100324123. Breaker RR, Lim J, Strobel SA, Cochrane JC. GlmS riboswitches, structure-based compound design with glmS riboswitches, and methods and compositions for use of and with glmS riboswitches.
Непатентни цитати:
6. Penchovsky R, Traykovska M. Designing drugs that overcome antibacterial resistance: where do we stand and what should we do? Expert Opinion on Drug Discovery (2015) 10, 631-650.
7. Penchovsky R, Stoilova CC. Riboswitch-based antibacterial drug discovery using highthroughput screening methods. Expert Opinion on Drug Discovery, (2013) 8, 65-82.
8. Penchovsky R. Computational design and biosensor applications of small moleculesensing allosteric ribozymes. Biomacromolecules (2013) 14, 1240-1249.
BG112506A 2017-04-26 2017-05-17 Използване на антисенс олигонуклеотиди с антибактериално действие BG67019B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2017/052402 WO2018197926A1 (en) 2017-04-26 2017-04-26 Methods for creating novel antibacterial agents using chimeric antisense oligonucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG112506A true BG112506A (bg) 2019-02-15
BG67019B1 BG67019B1 (bg) 2020-02-28

Family

ID=63920317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG112506A BG67019B1 (bg) 2017-04-26 2017-05-17 Използване на антисенс олигонуклеотиди с антибактериално действие

Country Status (2)

Country Link
BG (1) BG67019B1 (bg)
WO (1) WO2018197926A1 (bg)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109679879B (zh) * 2019-01-25 2021-07-30 石河子大学 一种菌株、菌剂及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8501930B2 (en) * 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system
WO2013110005A1 (en) * 2012-01-18 2013-07-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Boronate-mediated delivery of molecules into cells
WO2016146143A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 Amal Therapeutics Sa Cell penetrating peptides and complexes comprising the same
GB201507723D0 (en) * 2015-05-06 2015-06-17 Norwegian Univ Sci & Tech Ntnu Anti-bacterial agents and their use in therapy

Also Published As

Publication number Publication date
BG67019B1 (bg) 2020-02-28
WO2018197926A1 (en) 2018-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Irving et al. Triggering the stringent response: signals responsible for activating (p) ppGpp synthesis in bacteria
Miller et al. Ccr4-Not complex: the control freak of eukaryotic cells
Huelga et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins
US20200392550A1 (en) Reagents and methods for replication, transcription, and translation in semi-synthetic organisms
US20140113376A1 (en) Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
Liang et al. Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene
US10508276B2 (en) Methods and compositions for the production of siRNAs
JP2018525037A (ja) 遺伝子発現の調節のためのポリヌクレオチドナノ粒子及びその使用
WO2010075424A2 (en) Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
KR20220080136A (ko) 비천연 폴리펩티드의 생체내 합성을 위한 조성물 및 방법
McKellar et al. RNase III CLASH in MRSA uncovers sRNA regulatory networks coupling metabolism to toxin expression
Diallo et al. A tRNA-derived fragment present in E. coli OMVs regulates host cell gene expression and proliferation
KR101508219B1 (ko) 포도상구균의 테이코산에 대한 ｒｎａ 앱타머
Coleman et al. The small RNAs PA2952. 1 and PrrH as regulators of virulence, motility, and iron metabolism in Pseudomonas aeruginosa
KR101535892B1 (ko) 살모넬라 티피뮤리움 균주의 ｏｍｐＣ단백질에 대해 결합하는 ＲＮＡ 앱타머
BG112506A (bg) Методи за създаване на антибактериални агенти, използвайки химерни антисенс олигонуклеотиди
Muldoon-Jacobs et al. Specific effects of ribosome-tethered molecular chaperones on programmed− 1 ribosomal frameshifting
US20030068803A1 (en) Purification of functional ribonucleoprotein complexes
Kumar et al. Regulation of gene expression
Huh et al. An adaptive stress-induced tRNA depletion response mediates codon-based gene repression and growth suppression
Kenny Molecular requirements for FMRP and RNA helicase MOV10 in the translational regulation of co-bound mRNAs
Chow Destabilization of IL-8 mRNA by Anthrax Lethal Toxin: Demonstration of the Requirement for TTP and Examination of its Cellular Interactions
Hock Siew Functional characterization of an acid-regulated sRNA in\(Helicobacter\)\(pylori\)
Rogowski Identification and characterization of non-coding RNAs and their associated proteins involved in cellular stress responses
Huh A Stress-Induced TRNA Depletion Response Mediates Codon-Based Translational Repression and Growth Suppression