CN111378673B

CN111378673B - 转录调控因子tr2的突变体在制备维生素b12中的应用

Info

Publication number: CN111378673B
Application number: CN202010289270.4A
Authority: CN
Inventors: 张大伟; 董会娜
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2020-01-07
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2040-01-07
Also published as: CN110904126A; CN111378673A; CN110904126B

Abstract

本发明公开一种转录调控因子TR2的突变体在制备维生素B₁₂中的应用。在苜蓿中华根瘤菌中过表达的转录调控因子TR2，或其突变体基因的基因工程菌，其生产维生素B₁₂的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。

Description

转录调控因子TR2的突变体在制备维生素B12中的应用

本申请是申请号为202010012114.3，申请日为2020年1月7日，发明名称为“转录调控因子和其突变体及其在制备维生素B₁₂中的应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及转录调控因子TR2的突变体在制备维生素B₁₂中的应用。

背景技术：

维生素B₁₂(VB₁₂)在药物和食品工业中具有广泛的应用，其又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基(R基团)种类不同，维生素B₁₂可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B₁₂参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。

由于维生素B₁₂分子结构复杂，化学法人工合成需要消耗大量的人力与物力，而且合成周期长。在合成过程中对操作人员的要求过高，导致不能大量的生产。微生物发酵法目前是生产维生素B₁₂的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。

目前，国内外针对维生素B₁₂生产菌生物合成维生素B₁₂的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH和供氧的控制等。有文献报道通过在脱氮假单胞菌基因组上表达单拷贝的透明颤菌vgb 基因来增加细胞生产维生素B₁₂的能力(程立芳等,不同来源的尿卟啉原III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B12的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期)。

微生物拥有一系列通过调节自身基因的表达来使生物体适应不同环境的机制。在基因表达过程中，一种称为转录调控因子的蛋白质分子通过结合在特定的DNA区域调节特定基因的表达。然而，在产维生素B₁₂菌种中哪个转录调控因子影响维生素B₁₂的产量尚未见到报道。

发明内容：

本发明人前期筛选出了一株高产维生素B₁₂的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株(CN104342390A)，可发酵生产维生素B₁₂。通过对其进行诱变，获得产维生素B₁₂能力提高的诱变菌株，再挖掘分析其中能够增加产维生素B₁₂的能力转录调控因子，本发明其中两个转录因子TR1和TR2有重要影响，因而做了进一步研究，最终完成本发明，而提供两个转录调控因子和其突变体，以及它们制备维生素B₁₂中的应用。

因此，本发明首先提供一种转录调控因子基因TR1或TR2，其编码的多肽氨基酸序列分别如SEQ ID No.5或7所示。

优选地，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1或3所示。

进一步本发明提供所述的转录调控因子基因编码的多肽。

另外，本发明还提供一种转录调控因子TR1的突变基因，其编码的多肽氨基酸序列在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列上具有第117位氨基酸替换V的突变，优选的其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；同时，提供一种转录调控因子TR2的突变基因，其在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列上具有第235位氨基酸替换为F的突变，优选地核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供上述的转录调控因子的突变基因编码的多肽。

本发明还提供转录调控因子TR1或TR2的编码基因在制备维生素B₁₂中的应用。

在具体实施方式中，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达，其中导入的编码基因位于质粒或染色体上。

优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。

在一个具体实施方式中，所述转录调控因子TR1的编码基因编码具有SEQ ID NO：5、或 SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽；所述转录调控因子TR2的编码基因编码具有SEQID NO：7、或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

优选地，所述转录调控因子TR1的编码基因具有SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；所述转录调控因子TR2的编码基因编码具有SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：4 所示核苷酸序列。

本发明还提供一种制备维生素B12的方法，其包括培养过表达转录调控因子的编码基因的基因工程菌，并从发酵液中收集维生素B12的步骤，其中所述编码基因编码具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

在具体实施方式中，所述基因工程菌为苜蓿中华根瘤菌。优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。

通过对多个转录因子的研究，表明其中转录因子基因TR1和TR2及其突变体基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，不仅对基因工程菌生物安全(菌内过表达未对菌体的生长造成影响)，同时可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B₁₂的能力。实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，过表达转录因子TR1和其突变，可提高产维生素B₁₂的能力达12.8％和19.2％；过表达转录因子TR2和其突变，可提高产维生素B₁₂的能力15.4％和20.5％。因此，对于制备维生素B₁₂具有较高的应用价值。

附图说明

图1：质粒载体pBBR-P21-TR1的图谱。

图2：质粒载体pBBR-P21-TR2的图谱。

图3：质粒载体pBBR-P21-TR3的图谱。

图4：质粒载体pBBR-P21-TR4的图谱。

图5：质粒载体pBBR-P21-TR5的图谱。

图6：维生素B₁₂的标准曲线图。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

1、培养基配方：

LB培养基(g/L)：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。

种子培养基(g/L)：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH₄)₂SO₄ 1，(NH₄)₂HPO₄ 2，MnSO₄·H₂O 0.8，CoCl₂·6H₂O 0.02，MgO 0.3，DMBI 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.01，CaCO₃ 1.5,pH通过NaOH 控制在7.0～7.4。

发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH₄)₂SO₄ 2，MgSO₄ 1.5,K₂HPO₄0.75， CoCl₂·6H₂O 0.14,DMBI 0.075，ZnSO₄·7H₂O 0.08，CaCO₃ 1，pH通过NaOH控制在7.0～7.4。

2、检测方法

(1)样品预处理

取1mL发酵液，加入8％的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜

过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl 2％的NaCN(w/v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。

(2)标准品的制备

配置梯度维生素B₁₂标准品(20mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L)。

(3)HPLC检测条件

C18-250A柱(Agilent，4.6mmid 9×250mm，5μm)。流动相为70％有机相(乙腈)和30％无机相(乙酸钠水溶液)，吸收波长为361nm，柱温为35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL。

(4)维生素B₁₂标准曲线的绘制

将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB₁₂浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B₁₂质量浓度C(mg/L)记为横坐标，绘制维生素B₁₂标准曲线。见图6，得回归方程y＝19.846x-80.857，R²＝0.999，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素B₁₂标准曲线计算样品产量。

实施例1：常压室温等离子体(ARTP)诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得

(1)致死率的测定

为了获得一个比较广的突变体库，我们对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638进行了常压室温等离子体(ARTP)诱变。首先，对等离子诱变条件下CGMCCNO.9638的致死率进行测定。将种子用LB培养基培养至对数中期的CGMCCNO.9638细胞(OD₆₀₀＝1)用0.85％NaCl溶液冲洗两遍，然后用0.85％NaCl溶液稀释成10⁸个细胞/mL的悬液。取10uL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、25s，每个诱变时间点2个重复，每个时间点的涂板3个重复。诱变后将带有细胞的铁片置于1mL 无菌水中漩涡震荡洗下细胞，将细胞悬液10倍梯度稀释至10^-3，取稀释后的细胞悬液100μL 涂LB培养基平板，30℃培养72h后统计菌落数。根据下列公式计算不同诱变时间下的致死率，以诱变时间为横坐标，不同诱变时间下的致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率的计算公式为：致死率(％)＝[(诱变0s菌落数－诱变Ns菌落数)/诱变0s菌落数]×100％，其中 N＝5、10、15、20、25。

从表1中可知，诱变10s时的致死率为82.2％，诱变15s时的致死率达到95％以上，致死率为80％-90％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择10s作为最终构建突变体库的诱变时间。

(2)突变体库的构建及筛选

取浓度为10⁸个/mL的细胞悬液10uL涂布于铁片上进行ARTP诱变，诱变时间为10s，共对3个铁片上的细胞进行诱变处理，诱变结束后，将这3个铁片上的细胞在含有1mL LB 培养基的1.5mL离心管中涡旋振荡重悬。将细胞悬液10倍梯度稀释至10^-3，取稀释后的细胞悬液100μL涂LB培养基平板，30℃培养72h，长出270个单菌落。

(3)突变株96深孔板发酵初筛

分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500uL的种子培养基的96深孔板中(每个孔板上包含6株对照菌株CGMCC NO.9638)，30℃、800rpm、80％湿度振荡培养36h后，按10％ (v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

(4)突变株96深孔板发酵复筛

将步骤(3)中产量排前30的株菌的单菌落(包含一个对照菌株CGMCC NO.9638)接种于含有500uL种子培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80％湿度振荡培养36h后，按 10％(v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中(每株菌3个平行)，30℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B₁₂产量。

重复步骤(3)和(4)三次，最后获得一株高产维生素B₁₂的菌种SM*，96孔板中产量从50mg/L提高到80mg/L，是底盘菌株产量的1.6倍。

实施例2：突变菌株与出发菌株进行比较基因组分析

将菌种SM*和出发菌株CGMCC NO.9638送金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序。通过比较两个菌株的全基因组序列发现有5个转录调控因子发生了点突变，见表2。为了验证突变位点对维生素B₁₂产量的影响，我们将突变后的转录调控因子基因在出发菌种CGMCC NO.9638中进行了过量表达。

实施例3：质粒载体的构建

1、pBBR-P21-TR1的构建

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21片段。P21启动子序列如SEQ ID No.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。

分别利用表3的引物对TR1-F和TR1-EcoRI-R，以CGMCC NO.9638基因组为模板，通过PCR扩增，引入EcoRI酶切位点，得到TR1片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的TR1片段。TR1基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如 SEQ IDNo.5所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和TR1-EcoRI-R，以纯化的P21片段和TR1片段为模板，通过融合PCR，得到P21-TR1片段(含XbaI和EcoRI酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-TR1片段。

将上述纯化的P21-TR1片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和EcoRI进行双酶切，将P21-TR1片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养 16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-TR1。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-TR1备用，质粒图谱如图1所示。

2、pBBR-P21-TR1(C350T)的构建

以菌种SM*基因组为模板用于获得TR1(C350T)片段(如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)，按照pBBR-P21-TR1的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pBBR-P21-TR1(C350T)。

3、pBBR-P21-TR2的构建：

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R2，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-2片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-2 片段。P21启动子序列如SEQ ID No.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。

分别利用表3的引物对TR2-F和TR2-EcoRI-R，以CGMCC NO.9638基因组为模板，通过PCR扩增，引入EcoRI酶切位点，得到TR2片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的TR2片段。TR2基因序列如SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列如 SEQ IDNo.7所示。TR2基因为rbsR基因。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和TR2-EcoRI-R，以纯化的P21-2片段和TR2片段为模板，通过融合PCR，得到P21-TR2片段(含XbaI和EcoRI酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-TR2片段。

将上述纯化的P21-TR2片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和EcoRI进行双酶切，将P21-TR2片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养 16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-TR2。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-TR2备用，质粒图谱如图2所示。

4、pBBR-P21-TR2(C703T)的构建

以菌种SM*基因组为模板用于获得TR2(C703T)片段(如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示)，按照pBBR-P21-TR2的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pBBR-P21-TR2(C703T)。

5、pBBR-P21-TR3的构建

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R3，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-3片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-3 片段。P21启动子序列如SEQ ID No.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。

分别利用表3的引物对TR3-F和TR3-EcoRI-R，以CGMCC NO.9638基因组为模板，通过PCR扩增，引入EcoRI酶切位点，得到TR3片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的TR3片段。TR3基因序列如SEQ ID No.10所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo.11所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和TR3-EcoRI-R，以纯化的P21-3片段和TR3片段为模板，通过融合PCR，得到P21-TR3片段(含XbaI和EcoRI酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-TR3片段。

将上述纯化的P21-TR3片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和EcoRI进行双酶切，将P21-TR3片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养 16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-TR3。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-TR3备用，质粒图谱如图3所示。

6、pBBR-P21-TR3(G575A)的构建

以菌种SM*基因组为模板用于获得TR3(G575A)片段(如SEQ ID NO：12所示核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示)，按照pBBR-P21-TR3的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pBBR-P21-TR3(G575A)。

7、pBBR-P21-TR4的构建

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R4，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-4片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-4 片段。P21启动子序列如SEQ ID No.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。

分别利用表3的引物对TR4-F和TR4-EcoRI-R，以CGMCC NO.9638基因组为模板，通过PCR扩增，引入EcoRI酶切位点，得到TR4片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的TR4片段。TR4基因序列如SEQ ID No.14所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo.15所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和TR4-EcoRI-R，以纯化的P21-4片段和TR4片段为模板，通过融合PCR，得到P21-TR4片段(含XbaI和EcoRI酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-TR4片段。

将上述纯化的P21-TR4片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和EcoRI进行双酶切，将P21-TR4片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-TR4。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-TR4备用，质粒图谱如图4所示。

8、pBBR-P21-TR4(G734A)的构建

以菌种SM*基因组为模板用于获得TR4(G734A)片段(如SEQ ID NO：16所示核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示)，按照pBBR-P21-TR4的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pBBR-P21-TR4(G734A)。

9、pBBR-P21-TR5的构建：

分别利用表3的引物对P21-XbaI-F和P21-R5，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21-5片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-5 片段。P21启动子序列如SEQ ID No.9所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。

分别利用表3的引物对TR5-F和TR5-EcoRI-R，以CGMCC NO.9638基因组为模板，通过PCR扩增，引入EcoRI酶切位点，得到TR5片段，经电泳验证，DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的TR5片段。TR5基因序列如SEQ ID No.18所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo.19所示。

然后，利用引物对P21-XbaI-F和TR5-EcoRI-R，以纯化的P21-5片段和TR5片段为模板，通过融合PCR，得到P21-TR5片段(含XbaI和EcoRI酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-TR5片段。

将上述纯化的P21-TR5片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和EcoRI进行双酶切，将P21-TR5片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养 16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-TR5。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-TR5备用，质粒图谱如图5所示。

10、pBBR-P21-TR5(A632G)的构建

以菌种SM*基因组为模板用于获得TR5(A632G)片段(如SEQ ID NO：20所示核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示)，按照pBBR-P21-TR5的构建过程用相同的引物进行构建以获得质粒pBBR-P21-TR5(A632G)。

表3引物表

实施例4：含质粒载体菌株的构建

将实施例3中的11个质粒pBBR1MCS2、pBBR-P21-TR1、pBBR-P21-TR1(C350T)、pBBR-P21-TR2、pBBR-P21-TR2(C703T)、pBBR-P21-TR3、pBBR-P21-TR3(G575A)、 pBBR-P21-TR4、pBBR-P21-TR4(G734A)、pBBR-P21-TR5、pBBR-P21-TR5(A632G)按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中：

(1)接种新活化的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638、大肠杆菌(含有相应的质粒)以及辅助载体MT616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到OD值为1.0左右；

(2)无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638的菌液、MT616和大肠杆菌的菌液各500μL转移至1.5mL无菌EP管中并在4℃，12,000rpm条件下离心1min。

(3)在无菌条件下弃掉上清液，并用1mL 0.85％的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。

(4)再次在4℃，12,000rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。

(5)分别采用500μL新鲜的LB液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和MT616的沉淀进行悬浮。

(6)分别取各2μL的三种菌液，滴在不添加抗性的LB固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。

(7)待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。

(8)挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。

(9)从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落PCR验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌:SM/pBBR(对照菌)、SM/pBBR-P21-TR1(简写为SM1)、SM/pBBR-P21-TR1(C350T)(简写为SM1*)、SM/pBBR-P21-TR2(简写为SM2)、SM/pBBR-P21-TR2(C703T)(简写为SM2*)、 SM/pBBR-P21-TR3(简写为SM3)、SM/pBBR-P21-TR3(G575A)(简写为SM3*)、 SM/pBBR-P21-TR4(简写为SM4)、SM/pBBR-P21-TR4(G734A)(简写为SM4*)、 SM/pBBR-P21-TR5(简写为SM5)、SM/pBBR-P21-TR5(A632G)(简写为SM5*)。

实施例5：不同菌株评价

1、苜蓿中华根瘤菌的培养条件：

将对照菌、SM1、SM1*、SM2、SM2*、SM3、SM3*、SM4、SM4*、SM5和SM5*共 11株菌在无菌条件下用接种针在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，30℃恒温静置48h培养，获得单菌落。用接种针挑取单菌落于装有5mL含有100mg/L卡那霉素的LB 液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养36h。将种子培养基按照10％比例接种至含有 100mg/L卡那霉素的30mL发酵培养基中(250ml摇瓶)。30℃震荡(220r/min)培养144h 后收集菌体并检测产量。摇瓶发酵每个实验做3个平行。

2、不同苜蓿中华根瘤菌菌株产VB₁₂能力和生物量的比较

其结果如表4所示。

从表4中可以看出，SM1、SM1*、SM2和SM2*四个菌株与对照菌相比生产维生素B₁₂的能力均得到提高。其中SM1提高12.8％，SM1*提高19.2％，SM2提高15.4％，SM2*提高20.5％。而其他几株工程菌生产维生素B₁₂的能力有不同程度的降低。结果说明本发明中的过量表达转录调控因子TR1、TR2和它们的突变体的苜蓿中华根瘤菌生产维生素B₁₂的能力得到了增强。并且各菌株生物量变化不大，说明各转录调控因子基因的过表达未对菌体的生长造成影响。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>转录调控因子TR2的突变体在制备维生素B12中的应用

<160>37

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211> 441

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 1

atggccatcc tcgggcgcgc ctaccggctt tccaatctgg tgcgcccctc gatcgaggag 60

acctttgcct ctttcggcat cgaccgcggc gagttcgacg tgatctcgac gctgcggcga 120

tccggcccgc cttaccggct gacgccgacg gatctctata cgctgctgat gatttcgtcc 180

ggtggactga cgcaccggct cgaccggctg cagaaggcag gattgatcca gcgggaacgc 240

tcggcgtccg acggccgcag cagcgtcgtc gggctgacgg aaaagggaat agcccttgcg 300

gaaaccgcct ttcgcgccga catggcgagc gagtcgcgct acctcgaggc gctgagcaag 360

caagaccgca cggcgctggc ggcgctcctc aggaaactgc tgatttcgtt ggagcaagcg 420

ccaccgagtg atccggcctg a 441

<210>2

<211>441

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 2

atggccatcc tcgggcgcgc ctaccggctt tccaatctgg tgcgcccctc gatcgaggag 60

acctttgcct ctttcggcat cgaccgcggc gagttcgacg tgatctcgac gctgcggcga 120

tccggcccgc cttaccggct gacgccgacg gatctctata cgctgctgat gatttcgtcc 180

ggtggactga cgcaccggct cgaccggctg cagaaggcag gattgatcca gcgggaacgc 240

tcggcgtccg acggccgcag cagcgtcgtc gggctgacgg aaaagggaat agcccttgcg 300

gaaaccgcct ttcgcgccga catggcgagc gagtcgcgct acctcgaggt gctgagcaag 360

caagaccgca cggcgctggc ggcgctcctc aggaaactgc tgatttcgtt ggagcaagcg 420

ccaccgagtg atccggcctg a 441

<210>3

<211>1041

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 3

atgacggatg tcgccaggat agccggcgtt tcccagtcaa gcgtttccct ggtgctgaac 60

gagatgtcgg gctcgcgcat ctcgcccgaa acgcagcaga aggtgcgcga ggctgctcat 120

aaaatcggtt ataaactgcc agcgacccga ggtccggttg cagcggcgcc ggcggtggaa 180

aaggacacaa tcgccttcat cgtcgatgaa atctccacca gcccgcaccc ggtcgtcagc 240

ctcgatggca ttcgcgatta tgctttcgag caaggcatgc tggtctcggc gcatgtcacc 300

cgctcgaatc cggaactcga ggaagcggtg ttgcggtcgg tcctgcgcga cccctccatc 360

gccggcgtca tttacgcgac gatcttcact cgcaaggttg ccgttcccga ggcgttggcg 420

ccgctgccga ccgtgcttct caattgttac tgcgagccgc gccagcatgt ggcgatcgtg 480

ccgggggagg tcgccggcgg tttcgccgcc acagcgcatc tgacggcgct cggccacaag 540

cgcatcggct tcatcaacgg cgagtgctgg atggacgccg ccatggatag gctaaaaggc 600

tacaagcagg cgcttgcctc agccgacatc gccttcgacg aaacgcttgt gcgcgatggc 660

gactggctgc cgcttcgcgg ctacgaggcc gggttggacc tgctctccat gcccaacccg 720

ccgacagcca ttttctgcgg gaacgacctg atggcgatcg gcgtcatgga ggcggcccag 780

gagaagggct tgcgggtgcc caccgatctc tcggtgatgg gctatgacga ccaggaactg 840

gcgcgctaca cccatccgcc gctctcgacc ctcgtgctgc cgaactacga aatgggccag 900

aaggcggctg aactcctgat cgacatggcg atccacggaa aacacatgcg gccgatgaca 960

ataaaagtcg acggaccgct ggtggttcgc gataccaccg ctatcctgtc cgaagccaga 1020

gcttcaaaga gcgctcgata a 1041

<210>4

<211>1041

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400>4

atgacggatg tcgccaggat agccggcgtt tcccagtcaa gcgtttccct ggtgctgaac 60

gagatgtcgg gctcgcgcat ctcgcccgaa acgcagcaga aggtgcgcga ggctgctcat 120

aaaatcggtt ataaactgcc agcgacccga ggtccggttg cagcggcgcc ggcggtggaa 180

aaggacacaa tcgccttcat cgtcgatgaa atctccacca gcccgcaccc ggtcgtcagc 240

ctcgatggca ttcgcgatta tgctttcgag caaggcatgc tggtctcggc gcatgtcacc 300

cgctcgaatc cggaactcga ggaagcggtg ttgcggtcgg tcctgcgcga cccctccatc 360

gccggcgtca tttacgcgac gatcttcact cgcaaggttg ccgttcccga ggcgttggcg 420

ccgctgccga ccgtgcttct caattgttac tgcgagccgc gccagcatgt ggcgatcgtg 480

ccgggggagg tcgccggcgg tttcgccgcc acagcgcatc tgacggcgct cggccacaag 540

cgcatcggct tcatcaacgg cgagtgctgg atggacgccg ccatggatag gctaaaaggc 600

tacaagcagg cgcttgcctc agccgacatc gccttcgacg aaacgcttgt gcgcgatggc 660

gactggctgc cgcttcgcgg ctacgaggcc gggttggacc tgttctccat gcccaacccg 720

ccgacagcca ttttctgcgg gaacgacctg atggcgatcg gcgtcatgga ggcggcccag 780

gagaagggct tgcgggtgcc caccgatctc tcggtgatgg gctatgacga ccaggaactg 840

gcgcgctaca cccatccgcc gctctcgacc ctcgtgctgc cgaactacga aatgggccag 900

aaggcggctg aactcctgat cgacatggcg atccacggaa aacacatgcg gccgatgaca 960

ataaaagtcg acggaccgct ggtggttcgc gataccaccg ctatcctgtc cgaagccaga 1020

gcttcaaaga gcgctcgata a 1041

<210>5

<211>146

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 5

MAILGRAYRL SNLVRPSIEE TFASFGIDRG EFDVISTLRR SGPPYRLTPT DLYTLLMISS 60

GGLTHRLDRL QKAGLIQRER SASDGRSSVV GLTEKGIALA ETAFRADMAS ESRYLEALSK 120

QDRTALAALL RKLLISLEQA PPSDPA 146

<210>6

<211>146

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400>6

MAILGRAYRL SNLVRPSIEE TFASFGIDRG EFDVISTLRR SGPPYRLTPT DLYTLLMISS 60

GGLTHRLDRL QKAGLIQRER SASDGRSSVV GLTEKGIALA ETAFRADMAS ESRYLEVLSK 120

QDRTALAALL RKLLISLEQA PPSDPA 146

<210>7

<211>346

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 7

MTDVARIAGV SQSSVSLVLN EMSGSRISPE TQQKVREAAH KIGYKLPATR GPVAAAPAVE 60

KDTIAFIVDE ISTSPHPVVS LDGIRDYAFE QGMLVSAHVT RSNPELEEAV LRSVLRDPSI 120

AGVIYATIFT RKVAVPEALA PLPTVLLNCY CEPRQHVAIV PGEVAGGFAA TAHLTALGHK 180

RIGFINGECW MDAAMDRLKG YKQALASADI AFDETLVRDG DWLPLRGYEA GLDLLSMPNP 240

PTAIFCGNDL MAIGVMEAAQ EKGLRVPTDL SVMGYDDQEL ARYTHPPLST LVLPNYEMGQ 300

KAAELLIDMA IHGKHMRPMT IKVDGPLVVR DTTAILSEAR ASKSAR 346

<210>8

<211>346

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 8

MTDVARIAGV SQSSVSLVLN EMSGSRISPE TQQKVREAAH KIGYKLPATR GPVAAAPAVE 60

KDTIAFIVDE ISTSPHPVVS LDGIRDYAFE QGMLVSAHVT RSNPELEEAV LRSVLRDPSI 120

AGVIYATIFT RKVAVPEALA PLPTVLLNCY CEPRQHVAIV PGEVAGGFAA TAHLTALGHK 180

RIGFINGECW MDAAMDRLKG YKQALASADI AFDETLVRDG DWLPLRGYEA GLDLFSMPNP 240

PTAIFCGNDL MAIGVMEAAQ EKGLRVPTDL SVMGYDDQEL ARYTHPPLST LVLPNYEMGQ 300

KAAELLIDMA IHGKHMRPMT IKVDGPLVVR DTTAILSEAR ASKSAR 346

<210>9

<211> 1000

<212>DNA

<213>Ensifer adhaerens Casida A

<400>9

caaacagacc gggatatgcg ggtattcttc cgccgcgccg aggatgaggt ggcgcaggaa 60

cgcgtcaccg gcataggagc gggcgccacg gcttgcctga aggatgaccg ggctgtcggt 120

cgcatcggcg gcgcgcatga cggcctgaat gtattccaga ttgttcacat tgaacgccgg 180

cagcgcgtaa tcgttctccg ccgcatggtc gagcagttgc cgcaatgtga tcaatgccat 240

tcgctatctc cctttggata ctcggtgcaa cctatgcggc gcaccacaaa aacaatccgg 300

ccgttgaacc gcacgaaatg catcgatggc aaagtcgatg gccggctttt tcgtgcggcg 360

tgacggcgcg cgcgaattgg tcgcgcccac cgaagtcagg cgcacaatag ttcatcgaag 420

tggtttgaca accgggcaaa aggcaggttg ccagaggtcg aaactcgctt caatcgattt 480

tactgtggac tggatgcaac accttcagtg tgaagtgttt tcactttctg gtggtgcctg 540

agaggagggg gagtcgaggg cagtggatgc aaccattggg cgctgatttt gtctgttaca 600

ccatcgtggt ggatgccctg tcggaaacag tctgtcgaca ggaggtgaac gtcccgcaag 660

aagattgcgg caacgcccct ctttctttgc gcagattacg taaactgccg ctaaaattca 720

caaactttgc atcgcggatg attcgaggct caatccggcc gacaaaaagc gcggacctaa 780

aacgttgcag tagatttcgc aaaaatgccc tgttcacgtc atatgcccgt cgcaaaggcg 840

acgaaaagaa tcgcaaacaa aatacaacct atgggatagg ccgattcccc tcctatagat 900

aaagatgcag acagccgcag aatccgcctt gcgttcgcga acgatttgcg cttctctcct 960

gcgatcacaa acccaaaaca aggggaagga gagaaacaaa 1000

<210>10

<211>954

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 10

atggcacgca ggggcgaggc gaacaacagg cttgacgatg ctgcccgggc gggctggtta 60

tactatgtcg ctggccgcac ccaggatgag atcgccaccg tcatgggaat ctcgcgccag 120

tcggcgcagc ggttggtttc gctcgccatg tccgagcggc tgatcaaggt tcggctcgac 180

catccgattg ccgcctgcct cgaggcggcc gcaggtcttc gcgacaaata cggactgaaa 240

catgtggagg tggtgccgag cgatcccggc tcgacctcga cgaccgttgg catcgcggaa 300

gccggggcgg ccgagatcga gcgctggctg aaatcgtccg agccgcaggt gctggcgatc 360

ggtaccgggc gcacgctgaa agcggcggtc gatcagttgc cgccgatgga atgtccgcag 420

caccgcatcg tgtcgctcac gggcaatatc ggcctcgacg gttcggccgc ctattacaac 480

gtcatcttca gcatggccga tgcggtcaag gcccggcatt ttccgatgcc gctgccggtg 540

ctcgccgctt cggccgagga gcgggaggtg ctgcgcagcc agagcctggt gcaggtggct 600

ctgaagctag gcgccgaagc caatgtcgcc ttcgtcggcg tcggcgagct cggcccggac 660

gcgccgctct gccaggacgg gttcctcgcc caggacgaga tggccggtct gaccaaggcg 720

ggtgccgcgg gcgagatctg tggctggatg ttcgatcatg atggcgcgtt gctctcgggc 780

agcttcaacg agcgcgtcgc ctccgttccc ttgccgccgc gcgaccgggc gtctgtcatc 840

ggacttgcca aggggcagcg caaatatgag gcgctgcggg cggccgtaaa gggcggcatt 900

atcaacggcc ttatcaccga tgaggcgacg gcgatctatc tgctcaacgc atga 954

<210>11

<211>317

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400>11

MARRGEANNR LDDAARAGWL YYVAGRTQDE IATVMGISRQ SAQRLVSLAM SERLIKVRLD 60

HPIAACLEAA AGLRDKYGLK HVEVVPSDPG STSTTVGIAE AGAAEIERWL KSSEPQVLAI 120

GTGRTLKAAV DQLPPMECPQ HRIVSLTGNI GLDGSAAYYN VIFSMADAVK ARHFPMPLPV 180

LAASAEEREV LRSQSLVQVA LKLGAEANVA FVGVGELGPD APLCQDGFLA QDEMAGLTKA 240

GAAGEICGWM FDHDGALLSG SFNERVASVP LPPRDRASVI GLAKGQRKYE ALRAAVKGGI 300

INGLITDEAT AIYLLNA 317

<210>12

<211> 954

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 12

atggcacgca ggggcgaggc gaacaacagg cttgacgatg ctgcccgggc gggctggtta 60

tactatgtcg ctggccgcac ccaggatgag atcgccaccg tcatgggaat ctcgcgccag 120

tcggcgcagc ggttggtttc gctcgccatg tccgagcggc tgatcaaggt tcggctcgac 180

catccgattg ccgcctgcct cgaggcggcc gcaggtcttc gcgacaaata cggactgaaa 240

catgtggagg tggtgccgag cgatcccggc tcgacctcga cgaccgttgg catcgcggaa 300

gccggggcgg ccgagatcga gcgctggctg aaatcgtccg agccgcaggt gctggcgatc 360

ggtaccgggc gcacgctgaa agcggcggtc gatcagttgc cgccgatgga atgtccgcag 420

caccgcatcg tgtcgctcac gggcaatatc ggcctcgacg gttcggccgc ctattacaac 480

gtcatcttca gcatggccga tgcggtcaag gcccggcatt ttccgatgcc gctgccggtg 540

ctcgccgctt cggccgagga gcgggaggtg ctgcacagcc agagcctggt gcaggtggct 600

ctgaagctag gcgccgaagc caatgtcgcc ttcgtcggcg tcggcgagct cggcccggac 660

gcgccgctct gccaggacgg gttcctcgcc caggacgaga tggccggtct gaccaaggcg 720

ggtgccgcgg gcgagatctg tggctggatg ttcgatcatg atggcgcgtt gctctcgggc 780

agcttcaacg agcgcgtcgc ctccgttccc ttgccgccgc gcgaccgggc gtctgtcatc 840

ggacttgcca aggggcagcg caaatatgag gcgctgcggg cggccgtaaa gggcggcatt 900

atcaacggcc ttatcaccga tgaggcgacg gcgatctatc tgctcaacgc atga 954

<210>13

<211> 317

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 13

MARRGEANNR LDDAARAGWL YYVAGRTQDE IATVMGISRQ SAQRLVSLAM SERLIKVRLD 60

HPIAACLEAA AGLRDKYGLK HVEVVPSDPG STSTTVGIAE AGAAEIERWL KSSEPQVLAI 120

GTGRTLKAAV DQLPPMECPQ HRIVSLTGNI GLDGSAAYYN VIFSMADAVK ARHFPMPLPV 180

LAASAEEREV LHSQSLVQVA LKLGAEANVA FVGVGELGPD APLCQDGFLA QDEMAGLTKA 240

GAAGEICGWM FDHDGALLSG SFNERVASVP LPPRDRASVI GLAKGQRKYE ALRAAVKGGI 300

INGLITDEAT AIYLLNA 317

<210>14

<211>906

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 14

atgatcgacg tcattgcccg gtttgccaaa accgacggtg atcacatgac gcagattgcc 60

ggcctgagcc tgcaccgcca cggcggcgac gccccggtca actgctccgc ctacaggccg 120

agtttggcga tcatcgtgca aggagcaaag cgcgtggtgc tcggcgaaga gacgctgatc 180

tacggcgcct cggattatct gctgacgtcg atcgacctgc cggttctgtc ccaagtctgc 240

caggcctctg cagacgagcc ctatctcagc atggccttca cgctcgatcc cggtaagatc 300

caggcgctgc ttgcgtccct gtcgcagctg ccgacacccg ccgcctccgt gcgcggcatg 360

agcgtcagca agatcactgt cgaactcgaa gatgccgcac ttcgcttgct gcgtctgctc 420

gagcggccgg acgatatccc tgcgctgctg ccactgatcg agcaggaaat cctctaccgg 480

cttttgaccg ggccgcacgg ccatcgcctc agacagatgg cgacgaccga cagccagccg 540

catcaggtcg gccgcgcagt cgcctggctg aaggaacact attcgcggcc cttgcggatc 600

gacgatctcg ccaaccgtgt ttccatgagc gtctcgtcgc tacaccatca cttcaaggcg 660

atcaccgcga tgagccccct gcaataccag aaacagcttc ggttgcagga ggcccggcgg 720

ctgatgctgg aggggagtct cgacgccggc gatgccggcc atcaggtggg ttatgaaagc 780

cagtcgcagt tcagtcgcga atatgcccgc catttcggcg agccaccgat gcgcgacatc 840

ggccgcgtgc gccgctcgct gctcgaacgg cttgctccgc aagcggagat gctgagcgag 900

ggctga 906

<210>15

<211>301

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 15

MIDVIARFAK TDGDHMTQIA GLSLHRHGGD APVNCSAYRP SLAIIVQGAK RVVLGEETLI 60

YGASDYLLTS IDLPVLSQVC QASADEPYLS MAFTLDPGKI QALLASLSQL PTPAASVRGM 120

SVSKITVELE DAALRLLRLL ERPDDIPALL PLIEQEILYR LLTGPHGHRL RQMATTDSQP 180

HQVGRAVAWL KEHYSRPLRI DDLANRVSMS VSSLHHHFKA ITAMSPLQYQ KQLRLQEARR 240

LMLEGSLDAG DAGHQVGYES QSQFSREYAR HFGEPPMRDI GRVRRSLLER LAPQAEMLSE 300

G 301

<210>16

<211>906

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 16

atgatcgacg tcattgcccg gtttgccaaa accgacggtg atcacatgac gcagattgcc 60

ggcctgagcc tgcaccgcca cggcggcgac gccccggtca actgctccgc ctacaggccg 120

agtttggcga tcatcgtgca aggagcaaag cgcgtggtgc tcggcgaaga gacgctgatc 180

tacggcgcct cggattatct gctgacgtcg atcgacctgc cggttctgtc ccaagtctgc 240

caggcctctg cagacgagcc ctatctcagc atggccttca cgctcgatcc cggtaagatc 300

caggcgctgc ttgcgtccct gtcgcagctg ccgacacccg ccgcctccgt gcgcggcatg 360

agcgtcagca agatcactgt cgaactcgaa gatgccgcac ttcgcttgct gcgtctgctc 420

gagcggccgg acgatatccc tgcgctgctg ccactgatcg agcaggaaat cctctaccgg 480

cttttgaccg ggccgcacgg ccatcgcctc agacagatgg cgacgaccga cagccagccg 540

catcaggtcg gccgcgcagt cgcctggctg aaggaacact attcgcggcc cttgcggatc 600

gacgatctcg ccaaccgtgt ttccatgagc gtctcgtcgc tacaccatca cttcaaggcg 660

atcaccgcga tgagccccct gcaataccag aaacagcttc ggttgcagga ggcccggcgg 720

ctgatgctgg aggagagtct cgacgccggc gatgccggcc atcaggtggg ttatgaaagc 780

cagtcgcagt tcagtcgcga atatgcccgc catttcggcg agccaccgat gcgcgacatc 840

ggccgcgtgc gccgctcgct gctcgaacgg cttgctccgc aagcggagat gctgagcgag 900

ggctga 906

<210>17

<211> 301

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 17

MIDVIARFAK TDGDHMTQIA GLSLHRHGGD APVNCSAYRP SLAIIVQGAK RVVLGEETLI 60

YGASDYLLTS IDLPVLSQVC QASADEPYLS MAFTLDPGKI QALLASLSQL PTPAASVRGM 120

SVSKITVELE DAALRLLRLL ERPDDIPALL PLIEQEILYR LLTGPHGHRL RQMATTDSQP 180

HQVGRAVAWL KEHYSRPLRI DDLANRVSMS VSSLHHHFKA ITAMSPLQYQ KQLRLQEARR 240

LMLEGSLDAG DAGHQVGYES QSQFSREYAR HFGEPPMRDI GRVRRSLLER LAPQAEMLSE 300

G 301

<210>18

<211>897

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 18

atggccaagg aagacttcaa tgacctgcta tggttcctcg ccgtcgccga ggagcgcaac 60

ttcaccaagg cagccgccaa gcttggcata acccagtcga cgcttagtca cacgatcaag 120

cggctcgaaa cccggatggg gctgagattg ctgacccgga cgacgcgaag cgttgccttg 180

actgaagccg gggatcgctt gtttcattcg ttgtcaccga gaatatccgc catcaggagc 240

gatctggcgg cacttaccgc gttgcgcgat acgccgtcgg gtacgatcaa gatcaccctg 300

tcggatcatg cgctcgaaac catcgtctgg cccaagctga agccgatcct gtcgaaatat 360

cctgatatca agattgagct cagtcgcgat aatggcctgc gcaacatcgt cgaagacggc 420

ttcgacgcgg gtattcggct cggcgagagc atcgaaaaag acatgatcgc ggtcaggatc 480

gggcctgact ggcggatgct tgccgtggcc tctccgaagt atcttgcaga tcgttcgatc 540

ccagagcacc cgcaggattt gatgcaacac gactgcatca acatgcggca ggcaaccggc 600

ggaggtctct atatctggga gtttgagaag aacggccagg agcttcgcgt caggatcgac 660

gggcagctca cgttcaacac gtcctatccg atggtagacg ccgcgcttgc aggtcatggg 720

atagccttcc tgccggagga tctggcgact gagcatatcg aagcaggccg tttggtcgcg 780

ctgctttccg actggtcgcc gccctttccc ggctactaca tctactatcc gagccggcat 840

cagaactcgc cggcattcaa ggtggtggta gacgccttga gatatcaaag atcgtag 897

<210>19

<211>298

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 19

MAKEDFNDLL WFLAVAEERN FTKAAAKLGI TQSTLSHTIK RLETRMGLRL LTRTTRSVAL 60

TEAGDRLFHS LSPRISAIRS DLAALTALRD TPSGTIKITL SDHALETIVW PKLKPILSKY 120

PDIKIELSRD NGLRNIVEDG FDAGIRLGES IEKDMIAVRI GPDWRMLAVA SPKYLADRSI 180

PEHPQDLMQH DCINMRQATG GGLYIWEFEK NGQELRVRID GQLTFNTSYP MVDAALAGHG 240

IAFLPEDLAT EHIEAGRLVA LLSDWSPPFP GYYIYYPSRH QNSPAFKVVV DALRYQRS 298

<210>20

<211> 897

<212>DNA

<213>Sinorhizobium meliloti

<400>20

atggccaagg aagacttcaa tgacctgcta tggttcctcg ccgtcgccga ggagcgcaac 60

ttcaccaagg cagccgccaa gcttggcata acccagtcga cgcttagtca cacgatcaag 120

cggctcgaaa cccggatggg gctgagattg ctgacccgga cgacgcgaag cgttgccttg 180

actgaagccg gggatcgctt gtttcattcg ttgtcaccga gaatatccgc catcaggagc 240

gatctggcgg cacttaccgc gttgcgcgat acgccgtcgg gtacgatcaa gatcaccctg 300

tcggatcatg cgctcgaaac catcgtctgg cccaagctga agccgatcct gtcgaaatat 360

cctgatatca agattgagct cagtcgcgat aatggcctgc gcaacatcgt cgaagacggc 420

ttcgacgcgg gtattcggct cggcgagagc atcgaaaaag acatgatcgc ggtcaggatc 480

gggcctgact ggcggatgct tgccgtggcc tctccgaagt atcttgcaga tcgttcgatc 540

ccagagcacc cgcaggattt gatgcaacac gactgcatca acatgcggca ggcaaccggc 600

ggaggtctct atatctggga gtttgagaag aacggccagg agcttcgcgt caggatcgac 660

gggcagctca cgttcaacac gtcctatccg atggtagacg ccgcgcttgc aggtcatggg 720

atagccttcc tgccggagga tctggcgact gagcatatcg aagcaggccg tttggtcgcg 780

ctgctttccg actggtcgcc gccctttccc ggctactaca tctactatcc gagccggcat 840

cagaactcgc cggcattcaa ggtggtggta gacgccttga gatatcaaag atcgtag 897

<210>21

<211> 298

<212>PRT

<213>Sinorhizobium meliloti

<400> 21

MAKEDFNDLL WFLAVAEERN FTKAAAKLGI TQSTLSHTIK RLETRMGLRL LTRTTRSVAL 60

TEAGDRLFHS LSPRISAIRS DLAALTALRD TPSGTIKITL SDHALETIVW PKLKPILSKY 120

PDIKIELSRD NGLRNIVEDG FDAGIRLGES IEKDMIAVRI GPDWRMLAVA SPKYLADRSI 180

PEHPQDLMQH DCINMRQATG GGLYIWEFEK NGQELRVRID GQLTFNTSYP MVDAALAGHG 240

IAFLPEDLAT EHIEAGRLVA LLSDWSPPFP GYYIYYPSRH QNSPAFKVVV DALRYQRS 298

<210>22

<211> 32

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>22

ctagtctaga caaacagacc gggatatgcg gg 32

<210>23

<211> 42

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>23

ggcgcgcccg aggatggcca ttttgtttct ctccttcccc tt 42

<210>24

<211> 42

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>24

aaggggaagg agagaaacaa aatggccatc ctcgggcgcg cc 42

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>25

ccggaattct caggccggat cactcggtgg 30

<210>26

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列引物

atcctggcga catccgtcat tttgtttctc tccttcccct 40

<400>26

<210>27

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>27

aggggaagga gagaaacaaa atgacggatg tcgccaggat 40

<210>28

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>28

ccggaattct tatcgagcgc tctttgaagc t 31

<210>29

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>29

gcctcgcccc tgcgtgccat tttgtttctc tccttcccct 40

<210>30

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>30

aggggaagga gagaaacaaa atggcacgca ggggcgaggc 40

<210>31

<211> 31

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>31

ccggaattct catgcgttga gcagatagat c 31

<210>32

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>32

cgggcaatga cgtcgatcat tttgtttctc tccttcccct 40

<210>33

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>33

aggggaagga gagaaacaaa atgatcgacg tcattgcccg 40

<210>34

<211> 30

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>34

ccggaattct cagccctcgc tcagcatctc 30

<210>35

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>35

tgcggctgtc tgcatcttta tctataggag gggaatcggc 40

<210>36

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>36

gccgattccc ctcctataga taaagatgca gacagccgca 40

<210>37

<211> 30

<212>DNA

<213>人工序列引物

<400>37

ccggaattcc tacgatcttt gatatctcaa 30

Claims

1.一种转录调控因子的编码基因在制备维生素B₁₂中的应用，其中所述编码基因编码如SEQ ID NO：7、或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。

3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述苜蓿中华根瘤菌的保藏号为CGMCC NO：9638。

4. 如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述转录调控因子的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：4所示。

5. 一种制备维生素 B₁₂的方法，其特征在于：包括培养过表达转录调控因子的编码基因的基因工程菌，并从发酵液中收集维生素 B₁₂的步骤，其中所述编码基因编码如SEQ IDNO：7、或SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽。

6. 如权利要求5所述制备维生素 B₁₂的方法，其特征在于：所述基因工程菌的宿主为苜蓿中华根瘤菌。

7.如权利要求6所述制备维生素 B₁₂的方法，其特征在于：所述苜蓿中华根瘤菌的保藏号为CGMCC NO：9638。