JP2011515086A - Nrps−pks遺伝子群ならびにその操作および有用性 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;または
(b)配列番号1の相補体であるヌクレオチド配列;または
(c)配列番号1が縮重したヌクレオチド配列;または
(d)配列番号1と少なくとも85%の配列同一性(好ましくは、少なくとも87%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%もしくは99%の配列同一性)を有するヌクレオチド配列;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つの一部を含む核酸分子を提供するものであり、該一部は、BE−14106生合成遺伝子もしくはオープンリーディングフレーム(ORF)に対応する配列、またはそれと相補的な配列もしくはそれが縮重した配列を含むことが好ましい。
(a)配列番号3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43もしくは45のいずれか1つ以上で示されるアミノ酸配列の全部または一部;
あるいは
(b)配列番号3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43もしくは45のいずれか1つ以上と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列の全部または一部
を含むポリペプチドを提供する。
図2Aは、提唱されている、BE−14106の生合成経路の開始を示す;
図2Bは、提唱されている、BE−14106生合成の終了を示す。
ISP2寒天成長培地(ディフコ社,USA)上:基質菌糸は淡黄色であり、ISP2寒天プレートと同じ色である。気中菌糸体は白く、胞子もほぼ白くてわずかに緑がかっているだけである。
DNeasy Blood&Tissue Kit(キアゲン社)を用いてDSM21069(MP28−13)から全DNAを単離した。Izumikawaら((2003) Bioorg. Med. Chem., 11, 3401-3405)に記載の縮重したプライマーであるKSMA−F(5’−TS GCS ATG GAC CCS CAG CAG−3’[配列番号47])およびKSMB−R(5’−CC SGT SCC GTG SGC CTC SAC−3’[配列番号48])を用いて、β−ケトアシルシンターゼ(KS)ドメインを増幅した。50μlの反応ミックスに、MP28−13から単離された全DNA(10〜20ng),1×ThermoPol Reaction Buffer(ニュー・イングランド・バイオラボ社),400nMの各プライマー,200μMの各dNTPおよび2.5UのTaq DNA Polymerase(ニュー・イングランド・バイオラボ社)を含ませた。この反応は、95℃で5分、そして95℃で1分,60℃で1分および72℃で2分の35サイクルの後、最後に72℃で5分伸長させることで実行した。
DSM21069(MP28−13)菌株を遺伝的に修飾する手順を確立するために、E.coliであるET12567(pSOK804+pUZ8002)(Sekurovaら, 2004, J. Bacteriol., 186, 1345-1354)との接合を、Flettら(1997 FEMS Microbiol. Lett., 155, 223-229)に記載された手順に従って試験した。この手順に対して、いくらか改変した。OD600が0.4〜0.5になるまで、ドナーであるE.coliを増殖させた。MP28−13の新鮮な胞子の懸濁液のみを用い、この胞子懸濁液を2×YTで作製した(Sambrookら, 2000 Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク, NY)。胞子およびドナー細胞を混合して、遠心分離によりペレット化し、このペレットを極少量に再懸濁して、SFMプレート2枚に塗布した。抗生物質(0.9mg/mlのナリジキシン酸および1.5mg/mlのアプラマイシン)を添加する前に、接合用のプレートを24時間インキュベーションした。インキュベーションする時間およびヒートショックの温度と時間とを、その最適条件を見つけるために変えた。インキュベーション時間を25℃、ヒートショックを50℃で5分間とすることで最良の結果が得られた。
pDriveベクターでクローニングされた、DSM21069(MP28−13)菌株のno.6のPKS配列を、BamHIおよびHindIIIの制限酵素を用いてこのプラスミドから切り取り、pSOK201ベクター(Zotchevら, 2000 Microbiol., 146, 611-619)のBamHI/HindIII断片(3.1kb)とライゲーションし、E.coliであるDH5αに形質転換した。制限分析によってこの新しい構造物を確認した後、E.coliであるET12567(pUZ8002)に形質転換した。上記手順に従い接合することによって、この構造物をDSM21069に乗り換えさせた。pSOK201ベクターのBamHI/HindIII断片(3.1kb)は、ストレプトミセスの自律複製に必要とされる遺伝因子を含んでいない。従って、ベクターのこの部分が、DSM21069の染色体DNA断片と高いレベルで相同性を有する断片とライゲーションしなければ、トランス接合体が得られることはない。このような相同性を有すると、ベクター全体がその対応する染色体領域に統合する組換えを可能にしてしまう。このクローン化断片が遺伝子の開始コドンまたは終止コドンを含まない場合、このような統合は、遺伝子破壊に繋がることになり、遺伝子の染色体コピーを効率的に失活させる。
メーカーの使用説明書(ストラタジーン社,2005年)に従って、DSM21069のゲノムライブラリを、コスミドベクターであるSuperCos1(ストラタジーン社)に構築した。Kirbyミックス手順(Kieserら, 2000 Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, ノリッジ, イギリス)に従ってDSM21069からゲノムDNAを単離し、MboIで部分的に消化し、XbaI,CIAPおよびBamHIで処理したSuperCos1とライゲーションする前に、脱リン酸化した。ライブラリを構築するために、E.coliであるXL1−Blue MR(ストラタジーン社)を宿主として用いた。
このライブラリを、100μg/mlのアンピシリンを含むルリア−ベルターニ(LB)寒天プレート(Corning(登録商標) Low Profile Square BioAssay Dish)に塗布し、プレート1枚当り〜2000個のコロニーが得られた。Genetix QPixII Colony Pickerを用いて2304個のコロニーを選定し、LBブロスを含む96ウェルプレート(ヌンク社)24枚に移した。24枚の96ウェルプレートはReduced Hi+YE培地(各ウェルに120μl)を含んでいる。このウェルプレートを、終夜30℃で振盪(900rpm)してインキュベートした。最終濃度が15%(v/v)になるよう24枚のLBプレートにグリセロールを添加した後、−80℃で保存した。
コスミド1〜4に含まれる遺伝子群がBE−14106産生に関与するか確認するために、もう一つの遺伝子失活実験を実施した。コスミド用の1つのプライマー(SuperCos_forw[配列番号52]またはSuperCos_rev[配列番号53])およびKSドメイン用の1つの縮重プライマー(KSMA−F[配列番号47]またはKSMB−R[配列番号48])を用いて、コスミド2および3からPKS断片を増幅した。コスミド2から1.2kbの断片が、コスミド3から3.7kbの断片が得られた。上記のpDriveおよびpSOK201に両方の断片をクローニングし、接合によって得られた構造物をMP28−13内に移した。コスミド2の断片について、トランス接合体は1個しか得られなかった。コスミド3の断片について、いくつかのトランス接合体が得られ、さらなる分析のため6個を選定した。
MP28−13の培養
標準的な植菌物の調製
植菌物:ブドウ糖を補充した50mlの修飾TSB培地(表9に組成を示す)を有する振盪フラスコ(250ml,邪魔板付き)に、寒天プレートの胞子を移した。振盪フラスコの剪断力を増すために、3mmのガラスビーズを3g添加した。
培養: この培養物を25℃で3日間、225rpmでインキュベーションした(Infors Multitron振盪培養機,環状運動,振幅2.5cm)。
保存: 15%の濃度となるようにグリセロールを培養物に添加した。この混合物を、凍結用バイアル[cryo vial]に移し、−80℃で保存した。
植菌物:1.5mlの標準的な植菌物を、ブドウ糖を補充した50mlの修飾TSB培地(表10に組成を示す)および3gの3mmガラスビーズを有する振盪フラスコ(250ml,邪魔板付き)に移した。
培養:この培養物を25℃で2日間、200rpmでインキュベーションした(Infors Multitron振盪培養機,環状運動,振幅2.5cm)。
植菌物:産生のための前培養物3mlを、ブドウ糖を補充した100mlの0.3×BPS培地(表11に組成を示す)および5gの3mmガラスビーズを有する振盪フラスコ(500ml,邪魔板付き)に移した。
培養:この培養物を25℃で2日間、200rpmでインキュベーションした(Infors Multitron振盪培養機,環状運動,振幅2.5cm)。
細胞集団の回収およびホモジナイゼーション
産生培養物中の細胞集団を遠心分離で回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥したペレットを、磁鉄ビーズを用いて微細なペレットになるまでホモジナイゼーションした。
凍結乾燥した細胞のペレットを、240mlのメタノ−ル/gで1時間抽出した。剪断力が増すようガラスビーズを添加した。細胞ペレットを遠心分離によって除去した後、不溶物をすべて除去するため濾過した。透明な上澄み液を水に添加し、BE−14106を沈殿させるため、約30分間氷上に置いた。沈殿物を遠心分離して回収して、残留するメタノールを除去するために水で洗浄し、凍結乾燥した。凍結乾燥産物は、粗生成物に相当する。
粗生成物をDMSOに溶解し、逆相カラムで精製した。
HPLC系:分別捕集系[fraction collection system]を有するAgilent 1100シリーズ分取用HPLC
カラム:PREP−C18,10μm,50×250mm(PN410910)
カラム温度:室温
移動相:10mMの酢酸アンモニウム pH4.0(A)およびメタノール(B)。
画分を1%の2M NH3溶液に添加し−20℃で保存した。
画分中のメタノールのほとんどを、ロータリ真空エバポレータを用いて50℃で蒸発させた。BE−14106を含む残りの水相を、沈殿収率を上げるために凍結し、沈殿物を遠心分離してペレット化した。このペレットを水で洗浄し、凍結乾燥して、終末産物が得られた。
LC−DAD−TOFによる純度の計算
分取用LCによる精製後のBE−14106は、UVおよびTOFデータからわかるように、291nmで吸収する検体に含まれる化合物の>99%を構成することがわかった。汚染物質の吸光係数はBE−14106と同じであるとみなされる。
TOF−MSによって、精製されたBE−14106のLCTOFプロットが得られる。BE−14106(C27H73NO3)の理論的で正確なm/z(陰イオン)が422.2701であることが、これからわかる。このm/zは、許容し得る精度で観測され、422のピークは、ヘプタエンのUVピークとよく相関する。
カラム:Zorbax Bonus−RP 2.1×50mm,3.5μm(アジレント・テクノロジー社)。
移動相A: 10mMの酢酸アンモニウム(Riedel−de−Haen Cat#:34674),
移動相B:100%のアセトニトリル特級品(Labscan UN1648)
フロー:0.3ml/分
カラム温度: 室温
API−ESの陰イオン化
乾燥ガス: 10l/分
噴霧器圧: 40psig
乾燥ガス温度: 350℃
キャピラリ電圧: 3000V
フラグメンター[fragmentor]:200V
実施例9−DSM21069菌株の抗真菌活性の特徴付け
DSM21069菌株が抗真菌活性を産生するか調べた。PM2培地(Bredholtら, 2008, Marine Drugs, 6(1) pp. 12-24)で7日間25℃という条件で増殖させたら、抗真菌活性が強くなった。培養後、培地を乾燥させて、DMSOで抽出した。濾過後、指標生物としてカンジダ・アルビカンスCCUG3943およびC.グラブラタ[C. glabrata]CCUG3942の菌株を用いるロボット・バイオアッセイ手順において、DMSO抽出物を検体として用いた。後者の菌株はポリエン抗生物質に対して高いレベルで抵抗性を有する一方で、C.アルビカンス菌株はポリエンに感受性を有する。このバイオアッセイで用いる培地は、AM19(B)(9.4g/lのペプトン[オキソイド社],4.7g/lの酵母エキス[オキソイド社],2.4g/lの牛肉エキス[ディフコ社],10g/lのブドウ糖[BDH社],蒸留水)であった。
BE−14106生合成における特定の遺伝子の役割を検証するために、一連の遺伝子失活実験を実施した。上記(実施例7)のとおり、コスミド2および3の、PCRで増幅した断片を用いて遺伝子失活実験も行った。これら断片のシークエンシングおよびBE−14106群との比較によって、これら断片両方が、becA遺伝子の一部、モジュール2のKSおよびATドメインをコードする1.1kb断片およびモジュール2のKS,ATおよびDHドメインをコードする3.7kb断片であることが示された。両方の変異体において、BE−14106が明らかに産生された(表9)。
becI置換ベクター:コスミド2由来のBglII−KpnI断片(3.63kb)を、BamHI−KpnIで消化されたpGEM3Zf(−)にクローニングした結果、構造物であるpBIR1が得られた。この構造物からNruI−FspAI断片(0.8kb)を除去し、この構造物を再度ライゲーションした結果、構造物であるpBIR2が得られた。新しい構造物からEcoRI−HindIII断片(2.86kb)を切り取り、pSOK201由来のEcoRI−HindIII断片(3.11kb)とライゲーションした結果、becI置換ベクターであるpBIR3が得られた。
15N Silantes OD2培地(Silantes pr.No.103202)に基づく明確な製品の培地を用いて、DSM21069の供給研究を実施した。この培地の組成は、15N Silantes OD2培地536ml/lに、MgSO4×7H2O,0.4;CaCO3,5.0;(15NH4)2SO4,0.54;KH2PO4,0.2およびブドウ糖,10(1リットル当りのグラム数)を加えたものである。この培地に、微量元素液TMS1(Borgosら, 2006, Arch. Microbiol., 185, pp. 165-171)3ml/lを補充した。標識されていないアミノ酸の取り込みは、0.14g/lのD−アスパラギンもしくは0.06g/lのグリシンもしくは0.10g/lのグルタミン酸ナトリウムを添加する、または標識されていないアミノ酸を添加しないことで試験した。上記のとおりに培養した(ただし、プレカルチャーから成分を除去するために植菌前に一度この細胞を産生培養物で洗浄したことを除く。)3%の0.5×TSBプレカルチャーに、産生培養物を植菌した。産生培養物およびプレカルチャーの両方を、上記のとおりに、ガラスビーズを有する邪魔板付き振盪フラスコの中で培養した。
Claims (21)
- 下記(a)〜(e):
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;または
(b)配列番号1の相補体であるヌクレオチド配列;または
(c)配列番号1が縮重したヌクレオチド配列;または
(d)配列番号1と少なくとも85%の配列同一性(好ましくは、少なくとも87%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%もしくは99%の配列同一性)を有するヌクレオチド配列;または
(e)(a)〜(d)のいずれか1つの一部
を含む核酸分子であって、
1以上のポリペプチドをコードする核酸分子をコードするか、もしくは、1以上のポリペプチドをコードする核酸分子と相補的であるか;または
1以上の遺伝因子を含む核酸分子を含むか、もしくは、1以上の遺伝因子を含む核酸分子と相補的であり、
ポリケチドをベースとした分子またはマクロラクタム[macrolactam]分子の合成に機能的な活性を有する、核酸分子。 - ポリケチドをベースとした分子またはマクロラクタム分子を合成するNRPS−PKS生合成系をコードする請求項1に記載の核酸分子。
- 配列番号2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24、26,28,30,32,34,36,38,40,42もしくは44のいずれか1つで示されるヌクレオチド配列;または
該配列と相補的であるヌクレオチド配列、もしくは、該配列が縮重したヌクレオチド配列;あるいは
該配列と少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含む請求項1または2に記載の核酸分子。 - 配列番号3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43もしくは45から選択される1以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;または
該ヌクレオチド配列と少なくとも80%(好ましくは、少なくとも85%,97%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%もしくは99%)の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含む請求項1または2に記載の核酸分子。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子にコードされるポリペプチド。
- 下記(a),(b):
(a)配列番号3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43もしくは45のいずれか1つ以上で示されるアミノ酸配列の全部または一部;
あるいは
(b)配列番号3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43もしくは45のいずれか1つ以上と少なくとも80%の配列同一性(好ましくは、少なくとも80%の配列同一性、85%,87%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%もしくは99%の同一性)を有するアミノ酸配列の全部または一部
を含む請求項5に記載のポリペプチド。 - 修飾されたBE−14106分子を調製するための、修飾されたBE−14106生合成遺伝子群の調製における請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸分子の使用。
- 修飾されたBE−14106のNRPS−PKS系をコードする核酸分子の調製方法であって、
該BE−14106のNRPS−PKS系をコードする請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子を修飾することを含む、方法。 - 上記核酸分子が、該核酸分子にコードされた1以上の活性またはタンパク質をコードする配列を、導入すること,突然変異すること,欠失すること,置換すること,または失活することによって修飾される請求項8に記載の方法。
- 配列番号2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42もしくは44のいずれか1つで示されるヌクレオチド配列;または
該配列と相補的であるヌクレオチド配列、もしくは、該配列が縮重したヌクレオチド配列;あるいは
該配列と少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列
から選択される1以上のヌクレオチド配列が修飾される請求項8または請求項9に記載の方法。 - 上記核酸分子が、下記(i)〜(vii):
(i)PKSをコードする配列の修飾であって、ローディングモジュールのドメインを修飾することで、スターターユニットの特徴を変更する;
(ii)PKSをコードする配列の修飾であって、モジュール数を変更する(好ましくは、モジュール数を減少する);
(iii)PKSをコードする配列の修飾であって、ATドメインを修飾することで、伸長ユニットに対するその特異性を変更する;
(iv)PKSをコードする配列の修飾であって、デヒドラターゼ(DH)ドメインまたはケトレダクターゼ(KR)ドメインの活性を変更する(好ましくは、DHドメインまたはKRドメインを失活または欠失する);
(v)ヒドロキシラーゼをコードする配列(becO;配列番号26)の修飾であって、ヒドロキシラーゼ酵素を失活するか、またはその特異性を変更する;
(vi)PKSをコードする配列の欠失、またはPKSをコードする配列の修飾であって、このコードされたPKS酵素を失活する;
(vii)グリコシル化酵素をコードするヌクレオチド配列の導入
のやり方の1以上を用いて修飾される請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 上記核酸分子に対する上記修飾が、下記(i)〜(v):
(i)表3に記載の、DHドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または失活;
(ii)表4に記載の、KRドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または失活;
(iii)becA(配列番号5)またはそのモジュールの欠失または失活;
(iv)表2に記載のヌクレオチドの位置で定義される、BecB,BecD,BecE,BecFもしくはBecGのモジュールをコードする1以上のヌクレオチド配列の欠失または失活;
(v)becO(配列番号26)の欠失または失活
の1以上を含む請求項11に記載の方法。 - 上記核酸分子が、BE−14106またはその誘導体を産生する微生物に内在的に存在し、
該微生物中で実施される請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 上記微生物が、BE−14106またはその誘導体を産生する、2008年1月25日にDSMZに寄託したストレプトミセス種(寄託番号DSM21069)またはその突然変異株もしくはその修飾株である、請求項13に記載の方法。
- 請求項8〜14のいずれか1項に従って得られる修飾核酸分子を微生物中で発現させることを含む、修飾されたBE−14016のNRPS−PKS系の調製方法。
- 請求項8〜14のいずれか1項に従って得られる修飾された核酸分子を微生物中で発現させることを含む、ポリペプチドをベースとした分子またはマクロラクタム分子の調製方法。
- さらに、上記のポリケチドをベースとした分子またはラクタム分子を回収することを含む請求項16に記載の方法。
- 請求項8〜14のいずれか1項に従って得られる修飾された核酸分子を含む微生物。
- BE−14106またはその誘導体を産生する、DSMZに寄託したストレプトミセスの菌株(寄託番号DSM21069)またはその突然変異体もしくはその修飾された菌株。
- 請求項16に記載の方法によって産生されるか、または得ることができるBE−14106類似体(ただし、BE−14106の8−デオキシ類似体を除く)。
- 3−,5−,7−,11−,13−,15−,17−もしくは23−ヒドロキシBE−14106、3−,5−,7−,9−,11−,13−,15−,17−,もしくは23−オキソBE−14106、または、それらの組合せを含む任意の群の1以上から選択される修飾を含むBE−14106類似体;あるいは
3,5,7,11,13,15,17もしくは23の任意の位置でのヒドロキシ基またはオキソ基の導入、あるいは、9の位置でのオキソ基の導入から選択される1以上の修飾との8−デオキシ基の組合せを含む類似体。
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH041179A (ja) * | 1990-04-17 | 1992-01-06 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | 抗腫瘍性物質be―14106 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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EP1320611B1 (en) * | 2000-04-28 | 2005-11-09 | Kosan Biosciences, Inc. | Heterologous production of polyketides |
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH041179A (ja) * | 1990-04-17 | 1992-01-06 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | 抗腫瘍性物質be―14106 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6013007195; Environ.Microbiol.,Vol.9,No.11(2007)p.2756-2764 * |
JPN6013007197; J.Antibiot.,Vol.45,No.6(1992)p.868-874 * |
JPN6013007199; J.Nat.Prod.,Vol.67(2004)p.1400-1402 * |
JPN6013007201; Chem.Rev.,Vol.97(1997)p.2557-2575 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018524998A (ja) * | 2015-08-05 | 2018-09-06 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングMerck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung | 人工非リボソームペプチドシンセターゼ |
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