CN112111441B - 一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明以相对安全的绿针假单胞菌为出发菌株，通过基因工程技术在其基因组上敲除具有负调控作用的双元调控系统相关基因，最终使得PCN产量由初始270.4mg/L提升至5787.2mg/L，使得吩嗪‑1‑甲酰胺的产量大幅提高，能够更加有效用于生物防治，因此具有良好的实际应用之价值，为PCN的大规模生产奠定重要基础。

Description

一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

化学农药污染严重，不可持续发展，生物农药是一类很好的替代品，与化学农药相比，生物农药具有毒性低、对环境友好和不易产生抗药性等明显优势，已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。其中，上海交通大学许煜泉课题组率先利用铜绿假单胞菌株M18开发出了具有广谱、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和茎腐的生物农药吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，简称PCA，CAS号为2538-68-3)，定名为“申嗪霉素”，主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，并获得了农业部颁发的新农药药证。但最近相关研究发现，与PCA相比，另一种吩嗪类抗生素吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)具有更好的安全性、稳定性及对植物病原菌的抑菌活性，在防治水稻纹枯病和小麦赤霉病等方面具有重要的应用价值。

目前PCN生产方法虽有化工方法，但条件苛刻，并且向环境释放有毒有害物质，所以主要由假单胞菌中的铜绿假单胞菌生产，但发明人发现，铜绿假单胞菌则是目前医院中一种比较常见的机会致病菌，并不太适合作为生产菌株来推广应用。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明以相对安全的绿针假单胞菌为出发菌株，通过基因工程技术在其基因组上敲除具有负调控作用的双元调控系统相关基因，最终使得PCN产量由初始270.4mg/L提升至5787.2mg/L，为PCN的大规模生产奠定重要基础。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个即得。

其中，所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1是一株筛选自潍坊蔬菜大棚菜椒根际的绿针假单胞菌，经测序得知含有phzABCDEFG，以及吩嗪类的修饰基因phzO，可以产生吩嗪-1-羧酸以及2-羟基吩嗪。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2020年05月08日，保藏编号为CCTCCNO：M 2020108。

本发明的第二个方面，提供上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法，所述方法包括：

将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个。

其中，“所述phzO基因替换为外源的phzH基因”的具体步骤包括：敲除phzO基因后得菌株QPCA-1，然后将外源phzH基因导入菌株QPCA-1中。

本发明的第三个方面，提供上述基因工程菌株在生产吩嗪-1-甲酰胺中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法，所述方法包括：将上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株接种于发酵培养基中进行培养。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：

上述技术方案是以绿针假单胞菌Qlu-1为出发菌株，通过基因工程技术从Qlu-1菌株基因组中phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因，构建相应基因工程菌株，使得吩嗪-1-甲酰胺的产量大幅提高，能够更加有效用于生物防治。其中，基因工程菌株QPCN-6具有最佳效果，其PCN产量高达5787.2mg/L，同时生长性能良好，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中突变质粒pK18-rpeA-ud构建电泳图；

(A)rpeA上下游同源臂的扩增：1，DNA Ladder；2，rpeA上游同源臂扩增；3，rpeA下游同源臂扩增；(B)rpeA上游同源臂融合片段扩增：1，DNA Ladder；2，3rpeA基因上下游臂融合片段；

图2为本发明实施例中rpeA基因双亲杂交双抗性平板筛选图；

图3为本发明实施例中影印法筛选rpeA基因双交换阳性单克隆；

图4为本发明实施例中rpeA敲除株PCR验证图；外部引物检测：1，空白对照；2，DNALadder；3，野生株基因组为模板扩增片段；4，rpeA敲除株基因组为模板扩增片段；内部引物检测：1，野生株基因组为模板扩增片段；2，DNA Ladder；3，rpeA敲除株基因组为模板扩增片段；4，空白对照；

图5为本发明实施例中QPCN-1产物NMR碳谱鉴定图；

图6为本发明实施例中QPCN-1产物NMR氢谱鉴定图；

图7为本发明实施例中不同菌株PCN产量图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个即得。

其中，所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1是一株筛选自中国潍坊蔬菜大棚菜椒根际的绿针假单胞菌，经测序得知含有phzABCDEFG，以及吩嗪类的修饰基因phzO，可以产生吩嗪-1-羧酸以及2-羟基吩嗪。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2020年05月08日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020108。

所述phzO基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述外源phzH基因来自铜绿假单胞菌株，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

所述lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的碱基序列分别如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法，所述方法包括：

将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个。

其中，“所述phzO基因替换为外源的phzH基因”的具体步骤包括：敲除phzO基因后得菌株QPCA-1，然后将外源phzH基因导入菌株QPCA-1中。

更具体的，所述敲除phzO基因步骤包括：

i、扩增phzO基因片段的上下游同源臂；采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得phzO基因重组质粒；

ii、将phzO基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与绿针假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养，从而将phzO基因重组质粒导入绿针假单胞菌Qlu-1；

iii、筛选阳性克隆，即得菌株QPCA-1；

其中，扩增phzO基因片段上游同源臂的引物包括phzO-F1和phzO-R1，序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

扩增phzO基因片段下游同源臂的引物包括phzO-F2和phzO-R2，序列分别如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.12所示。

筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。

更具体的，所述外源phzH基因导入菌株QPCA-1中具体方法为：

i、以QPCA-1基因组为模板，以phzO-F1/phzO-R1-2，phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2；以合成的phzH基因为模板，phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2；以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板，以phzO-F1/phzO-R2为引物，扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN；将融合片段phzH-IN插入pK18mobsacB质粒中得phzH基因重组质粒；

ii、将phzH基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与菌株QPCA-1进行双亲杂交培养，从而将phzH基因重组质粒导入菌株QPCA-1；

iii、筛选阳性克隆，即得。

其中，phzO-F1和phzO-R1-2的序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.13所示；

phzO-F2-2和phzO-R2的序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.11所示；

phzH-F1和phzH-R1的序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

phzH-IN基因上下游融合片段的序列如SEQ ID NO.17所示。

筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。

优选的，敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的方法与敲除phzO基因的方法相同。

其中，敲除lon基因方法中，

扩增lon基因片段上游同源臂的引物包括lon-F1和lon-R1，序列分别如SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.19所示；

扩增lon基因片段下游同源臂的引物包括lon-F2和lon-R2，序列分别如SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的lon基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.22所示。

其中，敲除rsmE基因方法中，

扩增rsmE基因片段上游同源臂的引物包括rsmE-F1和rsmE-R1，序列分别如SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示；

扩增rsmE基因片段下游同源臂的引物包括rsmE-F2和rsmE-R2，序列分别如SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rsmE基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.27所示。

其中，敲除psrA基因方法中，

扩增psrA基因片段上游同源臂的引物包括psrA-F1和psrA-R1，序列分别如SEQ IDNO.28和SEQ ID NO.29所示；

扩增psrA基因片段下游同源臂的引物包括psrA-F2和psrA-R2，序列分别如SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.31所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的psrA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.32所示。

其中，敲除parS基因方法中，

扩增parS基因片段上游同源臂的引物包括parS-F1和parS-R1，序列分别如SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34所示；

扩增parS基因片段下游同源臂的引物包括parS-F2和parS-R2，序列分别如SEQ IDNO.35和SEQ ID NO.36所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的parS基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.37所示。

其中，敲除rpeA基因方法中，

扩增rpeA基因片段上游同源臂的引物包括rpeA-F1和rpeA-R1，序列分别如SEQ IDNO.38和SEQ ID NO.39所示；

扩增rpeA基因片段下游同源臂的引物包括rpeA-F2和rpeA-R2，序列分别如SEQ IDNO.40和SEQ ID NO.41所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rpeA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.42所示。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述基因工程菌株在生产吩嗪-1-甲酰胺中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法，所述方法包括：将上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株接种于发酵培养基中进行培养。

其中，所述发酵培养基可以是KB培养基。

为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例

1、将绿针假单胞菌Qlu-1接种进KB(A⁺)培养基，30℃摇床180rpm提取荡培养过夜，利用基因组提取试剂盒提取Qlu-1的基因组，-20℃下保藏备用。

2、在已经测序的Qlu-1基因组数据中搜索phzO基因及其基因上下游序列，利用Qlu-1菌株基因组为模板，以phzO-F1/phzO-R1，phzO-F2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U及线下游片段phzO-D；以phzO-U及phzO-D为模板，phzO-F1/phzO-R2为模板扩增phzO上下游融合片段phzO-UD。

3、将融合片段phzO-UD通过酶切连接的方法与敲除质粒pk18moBsacB构建重组质粒pk18-phzO-UD。

4、将重组质粒pk18-phzO-UD通过热击转化的方式导入大肠杆菌S17-1(λ)。

5、将大肠杆菌S17-1(λ)与假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养，将重组质粒pk18-phzO-UD导入假单胞菌Qlu-1。

6、通过蔗糖平板筛选、影印筛选及PCR筛选等方法共同筛选QLU-1中phzO敲除株，发酵后经HPLC检测，发酵液中只积累吩嗪-1-羧酸，将菌株命名为QPCA-1。

7、以菌株QPCA-1基因组为模板,以phzO-F1/phzO-R1-2，phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2，以合成的phzH基因为模板，phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2，以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板，以phzO-F1/phzO-R2为模板，扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN。

8、将融合片段phzH-IN通过酶切连接的方法与敲除质粒pk18moBsacB构建重组质粒pk18-phzH-IN。

9、将重组质粒pk18-phzH-IN通过热击转化的方式导入大肠杆菌S17-1(λ)。

10、将大肠杆菌S17-1(λ)与假单胞菌QPCA-1进行双亲杂交培养，将重组质粒pk18-phzH-IN导入假单胞菌QPCA-1。

11、通过蔗糖平板筛选、影印筛选及PCR筛选等方法共同筛选QPCA-1phzH插入菌株，发酵后经HPLC检测，发酵液中48h后只积累吩嗪-1-甲酰胺(PCN)，将菌株命名为QPCN-1经检测后得知，PCN产量达到270.4mg/L。

12、双元调控系统在假单胞菌吩嗪类物质的生产中起到重要作用，假单胞菌中双元调控系统众多，如RpeA/RpeB系统、ParS/ParR系统、GacS/GacA系统等，在QPCA-1的基础上，利用上述敲除phzO的方法先后累计无痕敲除了lon、rpeA、psrA、parS、rsmE双元调控相关基因，并命名为QPCN-2(QPCA-1Δlon)、QPCN-3(QPCA-1ΔlonΔrpeA)、QPCN-4(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrA)、QPCN-5(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrAΔparS)、QPCN-6(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrAΔparSΔrsmE)，经发酵后，HPLC检测PCA产量相应提高至645.2mg/L、1558.2mg/L、3024.3mg/L、4132.2mg/L和5787.2mg/L，结果见图7。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用

<130>

<160> 42

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> phzO基因

<400> 1

atgctagatc ttcaaaacaa gcgtaaatat ctgaaaagtg cagaatcctt caaagcttca 60

ctgcgtgatg accgcactgt tatttatcaa ggccaagttg ttgaggatgt gactacacac 120

ttctctacgg ctggaggcat atcgcaagtt gcagaaatct acgaagaaca attcagcggt 180

gaacacgacg acattctgac ttacgtacgc cccgacggtt acctggcctc ttctgcctat 240

atgcccccta gaaacaaaga agacttggcg ttgcgacgcc gcgcaatcac gtacgtctcg 300

caaaaaacct ggggcaccca ctgccgtaac ctggacatga tcgccagctt caccgtcggc 360

atgatgggat atcggccgac attcaggaaa aaatgccctg agtacgcaga aaacattacc 420

gaataccatg actacgccga gcgcaacagc ctgtatttgt ctgaggccat tgttgatcca 480

cagggctatc gggcacgtac ccacggcacc gacctcaacc tgccgccgcc cgatcgtgcc 540

gtgatgagga tcaacaagca gaacgccgag ggcatctgga tcagcggcgt caaaggcgtg 600

ggcacggtag caccgcagtc caatgaaata tttgttggca gcttgttccc cgcagcgccc 660

aacgagtcat tctgggctta cgtccctgcc gatgcgccgg gggtgaagat tttttgccga 720

gagattgtct cccagcctca cgccagcgcc tatgaccacc cgctcatatc caaaggtgaa 780

gaagccgagg cgatggtggt attcgataac gtgttcattc cacgctggcg aatcatggcg 840

gcgaacgtgc cggaactggc caacgccggc ttcttcagcc tgtggacctc atacagccat 900

tggtacacgc tcgtgcgcct ggaaaccaag gctgacctgt atgccggact ggccaaggtg 960

atcatggaag tcctgggcct tgaggggatt gcggtggttc gccagcgggt cagcgaaata 1020

gtgcagcttg cggaaatact caaaggcatg tgcatcgcct ccatcgaaac ggccgagatg 1080

tccgaaggcg acatattgct gcctggcccc aacgcactgg ccgccggaag gatttttgcc 1140

atggagaaat tgcctcgggt gctgcatttg ctcagagagc tgtgcggaca gggcttgatc 1200

ctcaggttca acgagaaaga cttggccacc gacgccgcct ttggccagaa gttctcctgg 1260

tttcttgaca cgcaaagcgt gggcgccaga gagaagaacc tgctgatgaa tctggtgtgg 1320

gacgtggctg ccagtgagca ctccacacgt gcattggtgt ttgaagaaca gcacgcactc 1380

agcgagcccc tgctgcgcga tagcctggtg ctggactacg actaccgcaa aagcacaagc 1440

ctgatacgcc gcatggtggg gctcaacgcc aaatag 1476

<210> 2

<211> 1833

<212> DNA

<213> phzH基因

<400> 2

atgtgcggtc tcgcgggttg ggtggattac acgcgcaagc tcgacgacga atttccggcg 60

atcttcgcca tgaccgatac gctcgccttg cgcgggccgg atgccgaggg catctggaag 120

caccgcaacg ccctgctggg tcaccggcgg ctggcggtca tcgacctcag cggcggcgtg 180

cagccgatgt cctatcgctt tcccaccggc caggaggtca ccctcgtcta caccggcgag 240

gtgtacaacc acgatgccct gcgcgagcgg ttgcgccggg ccggacatga gttccgcacc 300

cgcagcgata ccgaggtggt cctgcacgcc tatctgcaat ggggcgagcg ttgttgcgag 360

tacctgaccg ggatgttcgc cttcgccgtc ttcgatggcc gcgacggcca cctgctgctg 420

gtgcgcgacc gcctgggcat caagccgctg tattacgcgc ggcaccgcga gggactgctg 480

ttcggctcgg agatcaagtc catcctggcg catccggaat tcgccgccag gctcgacgcg 540

gtcggcctgg tcgacctcct gacgctgtcc cggggcactt cgcagacgcc gttccgcgag 600

gtccaggaac tgctgcccgg ccacctgctg tcctggcgtc ccaattccca ggcgaagttg 660

cgccgctact gggaggtgcg ccgccaggag catgccgacg acctgcagag caccgtgcag 720

cgcacccgcg aactggtcac ccgcgccctg ggggcgcaat tgcacgccga cgttccggtg 780

tgttcgctgc tatcgggtgg gctcgattcg accgccctga ccggcatcgc ccagcgcatc 840

gcgaaggcgg agcacggcgg cgacatcaat tcgttctcgg tggacttcgt cggccaggcc 900

gagcagttcc gcagcgacga cctgcgtccc gaccaggacc agccgttcgc cctgctggcc 960

gcgcagtaca tcggcagccg tcatcgcacc gtgctcatcg acaatgccga actggtctgc 1020

gaacgagcgc gcgaagaggt attccgggcc aaggacgtac ctttcacctt cggcgacatg 1080

gatacctcgc tgcacctgat gttcggcgag atccgccggc attccacggt ggccatctcc 1140

ggtgaaggcg ccgacgagct gttcggtggc tacggctggt tccgcgatcc gcaggcggtg 1200

gctgcggcgc gcttcccctg ggcctccagg gtgcgcctgc cggccggctt catcgacgcc 1260

ggtttcaacc gccgctgcga tctcctccag taccagcagg ccagctacga cgatgggctg 1320

cgccaggtcg aacacctggc cggcgacagc ccggaggagc ggcggatgcg cgagttcagc 1380

cacctgcatc tgaagcgctg gatggtgctg ctgctcgaac gcaaggatcg cctgagcatg 1440

tgcaacggcc tggaggtgcg ggtgccctac accgaccatg agctggtgga gtacgtctac 1500

aacgtgccct ggtcgatcaa gagccgggac ggcgaggaga agtggctgct caagcgggcc 1560

tgcgccgact atgtcccgga agccgtgctc aagcgccgca agagccctta tccgacttct 1620

gccaacctcg gctacgagcg tttcctgcgc gggagcgtgc ggcgcctgct ggaggacgcg 1680

gtgaacccgg tgttcggcat cgtttcgcga gagttcctgg ccgccgaact ggagcatccg 1740

gaggggtact tcaacaccca ggtgagccgc cacaacctgg agaccgcact ggcgctggaa 1800

ggctggctca ggttgtacgg gctctccgcc tga 1833

<210> 3

<211> 2421

<212> DNA

<213> lon基因

<400> 3

atgagcgacc agcaagaact tcctgaaacc atgagtgaat acgccgaccc ggaaaacgcc 60

gaactccata catcctccgg caagggtctg gccctgcccg ggcagaatct gccggacaag 120

gtctacatca tcccgatcca caatcggccg ttcttccccg cgcaagtctt gccggtgatc 180

gtcaacgaag aaccctgggc cgaaaccctg gaactggtga gcaagtccga acaccattcg 240

ctggcgctgt tcttcatgga caccccaccg gaagacccac ggcatttcga cacctcggcc 300

ctgccgctgt acggcaccct ggtcaaggtg caccacgcca gccgcgaaaa cggcaagttg 360

cagttcgtgg cccagggcct gacccgcgta cgcatccgca cctggctcaa gcaccatcgc 420

ccaccgtacc tggtggaggt cgagtacccg caccagccga gcgagccgac cgacgaggtc 480

aaggcctacg gcatggcgct gatcaacgcg atcaaggaac tgctgccgct caacccgctg 540

tacagcgaag agctgaagaa ctacctcaac cgcttcagcc ccaacgaccc gtcgccgctg 600

accgacttcg ccgccgcgct gacctcggcc accggcaacg aactgcagga agtgctggac 660

tgcgtaccga tgctcaagcg catggaaaaa gtcctgccga tgctgcgcaa ggaagtcgag 720

gtcgcgcgcc tgcagaaaga gatttccgcc gaggtcaatc gcaagatcgg cgagcatcag 780

cgcgagttct tcctcaagga acagctcaag gtcatccagc aggagctggg tctgaccaag 840

gacgatcgca gcgccgacat cgagcagttc gagcagcgcc tggcaggcaa ggtcctgccg 900

ccccaggccc agaagcgcat cgtggaagag atgaataaac tgtcgatcct cgagaccggc 960

tcgccggagt acgcggtcac ccgcaactac ctggaatggg ccaccgcggt gccctggggc 1020

gtgtacggcg aggacaagct cgacctcaag catgcgcgca aggtgctgga ccagcatcac 1080

gccgggctcg acgacatcaa gagccggatc ctcgaattcc tcgcagtcgg cgcctacaag 1140

ggcgagatca gcggttccat cgtactgctg gtgggcccgc ccggcgtggg caagaccagc 1200

gtcggcaagt ccatcgccga gtccctgggc cggccgttct accgcttcag cgtcggcggc 1260

atgcgtgacg aggccgagat caagggccac cgccgcacct acatcggcgc cctgccgggc 1320

aagctggtgc aggcgttgaa agacgtcgaa gtgatgaacc cggtgatcat gctcgacgag 1380

atcgacaaga tgggccagag ctaccagggc gacccggcct cggcgctgct ggaaaccctc 1440

gacccggaac agaacgtgga atttctcgac cactacctgg acctgcgcct ggacctgtcg 1500

aaagtgctgt tcgtgtgcac cgccaacacc ctggattcga ttcccggccc gttgctggac 1560

cggatggaag tgattcgcct gtcgggctac atcaccgagg aaaaactggc catcgccaag 1620

cgccacctgt ggcccaagca gctggaaaag gccggtgtgt ccaaggccca cctgagcatc 1680

agcgacgccg ccctgcgcgc ggtgatcgat ggttacgccc gcgaggccgg ggtgcgccag 1740

ctggaaaaac agctgggcaa actggtgcgc aaggccgtgg tgcggctgct ggaagatccg 1800

gatgcggtga tcaagctcgg caccaaggac ctggaagcct ccctgggcat gccggtgttc 1860

cgcaacgagc aggtgctcag cggcaccggg gtgatcaccg gcctggcctg gaccagcctg 1920

ggcggcgcca cgctgccgat cgaagccacg cggattcata ccctcaaccg tggtttcaag 1980

ctcaccgggc aactggggga tgtgatgaag gagtcggcgg aaatcgccta cagctacgtc 2040

acctcgcacc tcaagcagtt cggtggcgat gcgaagttct tcgacgaggc gttcgtccac 2100

ctgcacgtgc cggaaggcgc cacgccgaag gatggcccga gcgccggggt gaccatggcc 2160

agcgccctgc tgtccctggc gcgtaaccag ccgccgaaaa agggcgtggc catgaccggc 2220

gagctgaccc tgaccgggca tgtcctgccc atcggcgggg tgcgcgagaa agtcatcgcg 2280

gcgcgccggc agaagctcta cgagctgatc ctgccggaag ccaaccgcgg ccacttcgaa 2340

gagctgccgg actacctcaa ggaaggcatc accgtgcact tcgccaagcg tttcgccgat 2400

gtggcgaaag tgctgttcta a 2421

<210> 4

<211> 195

<212> DNA

<213> rsmE基因

<400> 4

atgctgatac tcacccgcaa agtcggtgaa agcataaata tcggtgacga catcacgatc 60

accattctgg gcgtgagcgg ccagcaagtc cggattggca tcaatgcccc gaaagacgtc 120

gcagtccatc gcgaagaaat ctaccaacgg atccaagccg gcctcaccgc cccggacaaa 180

cgcgaaacac cttga 195

<210> 5

<211> 708

<212> DNA

<213> psrA基因

<400> 5

atggcccagt cggaaaccgt tgaacgcatt ctcgatgctg ccgagcagtt gttcgcggaa 60

aaaggttttg ccgaaacctc attgcggctg atcaccagca aggccggggt caacctggcg 120

gcggtgaatt atcatttcgg ttccaagaag gccctgattc aggcagtgtt ctcgcgcttc 180

ctcgggccgt tctgcatcag cctcgaccgt gagctggagc ggcgttcggc caagccggac 240

agcaagccaa gcctcgaaga gctgctggaa atcctcgtcg agcaggccct ggtggtccag 300

cctcgcagcg gcaacgatct gtccatcttc atgcgtcttc tgggcctggc cttcagccag 360

agccaggggc acctgcggcg ttatctggaa gacatgtacg gcaaggtctt ccgccgctac 420

atgctgctgg tcaacgaagc tgcgccgcgc atccctccga tcgaactgtt ctggcgtgtg 480

cacttcatgc tcggagcggc ggcgttcagc atgtcgggga tcaaggcgtt gcgggcgatt 540

gccgagaccg acttcggggt caatacctcg atcgagcagg taatgcgcct gatggtgcca 600

ttcctcgcgg ccggcatgcg cgctgaaacc ggcgtcaccg acgatgccat ggctgcggcg 660

caactcaagc cgcgcagcaa atcgactccg gcggtcgcca aggcctga 708

<210> 6

<211> 1284

<212> DNA

<213> parS基因

<400> 6

atgctgcggc tgtttctggg tttgtacatt gtcctggcca taggttttgc cggggcgatc 60

accgcggtcg atcacatctt cacggccatc ctcgaagacc cgctggaagc ctacaaccgc 120

gatgcggtgc gcgggccggc ttatagcctg gtggaacagt tgcggccgtt cgacagcgcc 180

gagcgcgaac ggcaattgca ggcgttgcag ccgcattacg gcttgcagtt gcgtctggtg 240

aacgccgacg cgctgggcct gagcgcccgc gaacaggcct tgctggcctc caaccagttg 300

gtggtgcggc aagcgttcac cgagtttatc gccagcatcg accagggccc gcaattgctc 360

agcatcaagt tgccggaaga gccctcgctg acccgcttct ataccaccgc ggcctatttt 420

ctcctcgcta cgctggtggg catcgtcctg tatttctggg tgcgcccgca ctggcgcgat 480

ctggagcaac tgcggctggc ggccgaacgg ttcggcgaca acgacctgag tacgcgcctg 540

cacctgtcgc ggcgctcgaa cattcgcgag ctggccgagc acttcaaccg catggccagc 600

cgcatcgaag gcctgatcgc caatcagcgc gagctgacca acgcggtgtc ccatgagctg 660

cgcacgccca tcgcccgcct gtcgttcgaa ctcgaccagc tcaagcagtc cgatccgaaa 720

cacaaccgcg agctgatcgc cgacatgtac gccgacctcg gcgagctgga ggaaatggtc 780

tccgaactgc tgacctatgc cagcctggaa cacggcgcca cggtgatcaa ccgcgagact 840

atccaggccc acagctggct cgacagcgtg gtcggcagtg tcgccctgga ggcggaagcg 900

gcgggggtac agatcctgat ccgcgcctgc gaggtcgagt gcatcagcat cgagccgcgg 960

ttcatggcgc gggcggtgat caacctgctg cgcaacgcca ttcgctacgc cgagcggcgc 1020

gtcgaggtgt ccctggtgcg ggtcgggcag ggttatgaag tccaggtcaa cgacgacggc 1080

ccgggcgtgc cggtggaagg acgcaagaaa atcttcgagc cgttctcccg gctcgacgcc 1140

agccgcgacc gccgcaccgg cggcttcggc cttggcctgg cgctggtgcg gcgggtgtcg 1200

cagtcccacg gcggccaggt cgaggtgacg gattcgcagt ggggcggcgc gtcgtttcgc 1260

atgacctggg cgcaggtcga gtag 1284

<210> 7

<211> 1302

<212> DNA

<213> rpeA基因

<400> 7

atgctgagaa tcctgattcg cctgtacctg gtgaccatcg tctcgttcag cgcggcgatc 60

tacctggtcc cggagctggt ggtgaaggtc ttccacgagc gtttcatcac ctacaacctg 120

gactattccc ggggcctgca aagcctgatc gtcaaacagt ttcgcggcgt acccgcagag 180

cagtggccgg ccctggccgc ggaaatggac caggagttcc agccgctgca catcgtcctg 240

acccgcaacg acgatgccga tttcaccctg tacgagcgcg aacgcctgca acgcggcgag 300

aacgtggtgc gggtcggcga ctggggctgg cgcaccctcg cggtggcgcc gctggacgag 360

cagatggcgg tgcagatggt ggtgccgccg gacccgatcg acgtcagcct gctgtactgg 420

agcatcaacg tgctgatcgg cgcgaccatg cttgcctgcc tgttgctctg gctgcggccg 480

cactggcgcg acctggaacg cctgaaacac gccgccgagc gcttcggcaa gggccacttg 540

agcgagcgca cgcagatccc ctcgagctcc aacatcggca gcctggccaa tgtcttcgac 600

accatggccg gcgacatcga aaacctgctg aaccagcaac gcgacctgct caacgcggtg 660

tcccacgagc tgcgcacgcc cttgacccgg ctcgacttcg gcctggccct ggcgctctcc 720

gacgacctgc cggcgaccag ccgcgaacgc ctgcaagggc tggtggcgca cattcgcgag 780

ctcgacgaac tggtgctcga gctgctgtcc tacagccggt tgcagatccc ggcgcagttg 840

ccggagcagg tcgaggtgtc gctggacgag ttcatcgaca gcatcctcgg cagcgtcgac 900

gacgagctgg aatccccgga catcgtcatc gatgtgttgc tgctcggcag cctggagcgt 960

ttcaccctcg atccgcggct gaccgcccgg gcgatccaga acctgctgcg caacgccatg 1020

cgttattgcg aaaagcgcat caaggtcggg gtgcaggtca gcgacagcgg ctgtgaaatc 1080

tgggtcgacg acgatggcat cggcattccc gacgatgagc gtgagcgggt gttcgaaccg 1140

ttctaccgcc tggaccgcag ccgcgatcgc gccactggcg gcttcggcct cggcctggcg 1200

atcagccgcc gggccctgga agcccagggc gggaccctga ccgtcgaggc ctcgccgctg 1260

ggcggcgcgc gtttccgcct gtggctgccg acgccggcct ga 1302

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> PhzO-F1

<400> 8

gttgaattca cacgcatcgt ggtgatcagt gagatc 36

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> PhzO-R1

<400> 9

ctagcatggt agcagcctca gtaatgtctg ac 32

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> PhzO-F2

<400> 10

tgctaccatg ctagacctga ttgccgtgta gg 32

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> PhzO-R2

<400> 11

taggatccgt cagcaccgct tgcatggcaa t 31

<210> 12

<211> 1498

<212> DNA

<213> phzO基因上下游融合片段

<400> 12

acacgcatcg tggtgatcag tgagatcagt gacaccgggg tagtgttcag cacccatgcc 60

ggaagccaga aaggtcgcga actgacagaa aacccctggg cctcggggac gctgtattgg 120

cgcgaaacca gccagcagat catcctcaat ggccaggccg tgcgcatgcc ggatgccaag 180

gctgacgagg cctggttgaa gcgcccttat gccacgcatc cgatgtcatc ggcgtctcgc 240

cagagtgaag agctcacgga tgtcgaggcc ctgcgcaacg ccgccaggga actggccgag 300

gttccaggtc cgctgccgcg tcccgagggt tattgcgtgt ttgagttgcg gcttgaatcg 360

ctggagttct ggggtaacgg ccaggatcgc ctgcatgaac gcttgcgcta tgaccgcagc 420

gctgaaggct ggaaacatcg ccgattacag ccgtagggta ccgagataaa tatgctttga 480

agtgctggct gctccaactt cgaactcatt gcgcgaactt caacacttat gacacccggt 540

caacatgaga agagtccaga tgcgaaagaa cgcgtattcg aaataccaaa cagagagtcc 600

ggatcaccaa agtgtgtaac gacattaatt cctatctgaa tcttatagtt gctctagaac 660

gttgtccttg acccagcgat agacatcggg ccaaagacta cacaaacaaa gtcagacatt 720

actgaggctg ctaccatgct agacctgatt gccgtgtagg cgccgcgcaa cccttcattc 780

gtgccgactg aactcggcac gaatgaaggg ttgtccgcct ccggcccctg gcatcccgta 840

agtttccaac cttcaacggt agtacaccgc cccattagca tccaaatgaa tacagcagga 900

gcccgttaca gcgctggcgc tggatgcctg gctacgcttg catgggatct cggtccgaga 960

cgagccaggt ttaccggccc cccctttgtt cgagccatgc cacttggcag gctcgttcag 1020

tcgtagcggt cagcctgtcg ccggttggct tgccacccgc cacctccagg ccagcgtctg 1080

gcatcgggcc ttgcccggaa gcgccagcca tatcggcacc gtagcgatca acgaaaggct 1140

cagcatgggc ccgttcactg ctgtacattc ctccccacgg acgacacatc atttacccag 1200

tgaacggagt tcaacgcgtg ttctcgaccc tcaatccgcg tcaccgccgg cttgccagtt 1260

tctcgctgat agccgtcgcc ctcagcctcg ccgcctgcaa cgcttccgcc ccctcccaca 1320

ccgccctgcc ccccgccccg gaaatcgctt cgggttatcg caccgacctg caagtgcagc 1380

gcgccgacca gcatatggcg gccgcggcca acccgttggc ggccgaagcc gggcgcgaga 1440

tgttgcgcaa gggcggttcg gccatcgatg cggcgattgc catgcaagcg gtgctgac 1498

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> PhzO-R1-2

<400> 13

ggtagcagcc tcagtaatgt ctgactttgt 30

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> PhzO-F2-2

<400> 14

tacctgattg ccgtgtaggc gccgcgcaa 29

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> PhzH-F1

<400> 15

actgaggctg ctaccatgtg cggtctcgcg g 31

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> PhzH-R1

<400> 16

cggcaatcag gtatcaggcg gagagcccgt 30

<210> 17

<211> 3324

<212> DNA

<213> phzH-IN基因上下游融合片段

<400> 17

acacgcatcg tggtgatcag tgagatcagt gacaccgggg tagtgttcag cacccatgcc 60

ggaagccaga aaggtcgcga actgacagaa aacccctggg cctcggggac gctgtattgg 120

cgcgaaacca gccagcagat catcctcaat ggccaggccg tgcgcatgcc ggatgccaag 180

gctgacgagg cctggttgaa gcgcccttat gccacgcatc cgatgtcatc ggcgtctcgc 240

cagagtgaag agctcacgga tgtcgaggcc ctgcgcaacg ccgccaggga actggccgag 300

gttccaggtc cgctgccgcg tcccgagggt tattgcgtgt ttgagttgcg gcttgaatcg 360

ctggagttct ggggtaacgg ccaggatcgc ctgcatgaac gcttgcgcta tgaccgcagc 420

gctgaaggct ggaaacatcg ccgattacag ccgtagggta ccgagataaa tatgctttga 480

agtgctggct gctccaactt cgaactcatt gcgcgaactt caacacttat gacacccggt 540

caacatgaga agagtccaga tgcgaaagaa cgcgtattcg aaataccaaa cagagagtcc 600

ggatcaccaa agtgtgtaac gacattaatt cctatctgaa tcttatagtt gctctagaac 660

gttgtccttg acccagcgat agacatcggg ccaaagacta cacaaacaaa gtcagacatt 720

actgaggctg ctaccatgtg cggtctcgcg ggttgggtgg attacacgcg caagctcgac 780

gacgaatttc cggcgatctt cgccatgacc gatacgctcg ccttgcgcgg gccggatgcc 840

gagggcatct ggaagcaccg caacgccctg ctgggtcacc ggcggctggc ggtcatcgac 900

ctcagcggcg gcgtgcagcc gatgtcctat cgctttccca ccggccagga ggtcaccctc 960

gtctacaccg gcgaggtgta caaccacgat gccctgcgcg agcggttgcg ccgggccgga 1020

catgagttcc gcacccgcag cgataccgag gtggtcctgc acgcctatct gcaatggggc 1080

gagcgttgtt gcgagtacct gaccgggatg ttcgccttcg ccgtcttcga tggccgcgac 1140

ggccacctgc tgctggtgcg cgaccgcctg ggcatcaagc cgctgtatta cgcgcggcac 1200

cgcgagggac tgctgttcgg ctcggagatc aagtccatcc tggcgcatcc ggaattcgcc 1260

gccaggctcg acgcggtcgg cctggtcgac ctcctgacgc tgtcccgggg cacttcgcag 1320

acgccgttcc gcgaggtcca ggaactgctg cccggccacc tgctgtcctg gcgtcccaat 1380

tcccaggcga agttgcgccg ctactgggag gtgcgccgcc aggagcatgc cgacgacctg 1440

cagagcaccg tgcagcgcac ccgcgaactg gtcacccgcg ccctgggggc gcaattgcac 1500

gccgacgttc cggtgtgttc gctgctatcg ggtgggctcg attcgaccgc cctgaccggc 1560

atcgcccagc gcatcgcgaa ggcggagcac ggcggcgaca tcaattcgtt ctcggtggac 1620

ttcgtcggcc aggccgagca gttccgcagc gacgacctgc gtcccgacca ggaccagccg 1680

ttcgccctgc tggccgcgca gtacatcggc agccgtcatc gcaccgtgct catcgacaat 1740

gccgaactgg tctgcgaacg agcgcgcgaa gaggtattcc gggccaagga cgtacctttc 1800

accttcggcg acatggatac ctcgctgcac ctgatgttcg gcgagatccg ccggcattcc 1860

acggtggcca tctccggtga aggcgccgac gagctgttcg gtggctacgg ctggttccgc 1920

gatccgcagg cggtggctgc ggcgcgcttc ccctgggcct ccagggtgcg cctgccggcc 1980

ggcttcatcg acgccggttt caaccgccgc tgcgatctcc tccagtacca gcaggccagc 2040

tacgacgatg ggctgcgcca ggtcgaacac ctggccggcg acagcccgga ggagcggcgg 2100

atgcgcgagt tcagccacct gcatctgaag cgctggatgg tgctgctgct cgaacgcaag 2160

gatcgcctga gcatgtgcaa cggcctggag gtgcgggtgc cctacaccga ccatgagctg 2220

gtggagtacg tctacaacgt gccctggtcg atcaagagcc gggacggcga ggagaagtgg 2280

ctgctcaagc gggcctgcgc cgactatgtc ccggaagccg tgctcaagcg ccgcaagagc 2340

ccttatccga cttctgccaa cctcggctac gagcgtttcc tgcgcgggag cgtgcggcgc 2400

ctgctggagg acgcggtgaa cccggtgttc ggcatcgttt cgcgagagtt cctggccgcc 2460

gaactggagc atccggaggg gtacttcaac acccaggtga gccgccacaa cctggagacc 2520

gcactggcgc tggaaggctg gctcaggttg tacgggctct ccgcctgaac ctgattgccg 2580

tgtaggcgcc gcgcaaccct tcattcgtgc cgactgaact cggcacgaat gaagggttgt 2640

ccgcctccgg cccctggcat cccgtaagtt tccaaccttc aacggtagta caccgcccca 2700

ttagcatcca aatgaataca gcaggagccc gttacagcgc tggcgctgga tgcctggcta 2760

cgcttgcatg ggatctcggt ccgagacgag ccaggtttac cggccccccc tttgttcgag 2820

ccatgccact tggcaggctc gttcagtcgt agcggtcagc ctgtcgccgg ttggcttgcc 2880

acccgccacc tccaggccag cgtctggcat cgggccttgc ccggaagcgc cagccatatc 2940

ggcaccgtag cgatcaacga aaggctcagc atgggcccgt tcactgctgt acattcctcc 3000

ccacggacga cacatcattt acccagtgaa cggagttcaa cgcgtgttct cgaccctcaa 3060

tccgcgtcac cgccggcttg ccagtttctc gctgatagcc gtcgccctca gcctcgccgc 3120

ctgcaacgct tccgccccct cccacaccgc cctgcccccc gccccggaaa tcgcttcggg 3180

ttatcgcacc gacctgcaag tgcagcgcgc cgaccagcat atggcggccg cggccaaccc 3240

gttggcggcc gaagccgggc gcgagatgtt gcgcaagggc ggttcggcca tcgatgcggc 3300

gattgccatg caagcggtgc tgac 3324

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> lon-F1

<400> 18

cgtctagaag cacgaacagc tcgctgcca 29

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> lon-R1

<400> 19

tcgctcatgg ggcacctgcg caat 24

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> lon-F2

<400> 20

cccatgagcg aacgcagacc tgtaggag 28

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> lon-R2

<400> 21

ctaagcttag aacaacaggc cgaggctgat ccag 34

<210> 22

<211> 1493

<212> DNA

<213> lon基因上下游融合片段

<400> 22

agcacgaaca gctcgctgcc acgggtgcca gtgccatgct ggcgcagcgc ctcgagaatc 60

tgctgcgagt cgccgctgat caccgcctgg cgaaactgcg catccaccac cagccagtcc 120

acgccataac gcaagcgccg gccgcgcagt tcgagcaggc gttcgaagac ccgggtgccg 180

gtttgcagtt gcacttgcgc ctggttttcc actgcatggt tggtcgcggc cttgacggcg 240

aagtacacca ccccgatcac gatcaacagc aacaacgcca ataccccagt gatccttacc 300

tggaacgtat ggcgccactt catgagccgg ctctcgtcgc cgcgacctca ctgttgtcga 360

ctctgcacac ccacggcgac acccgccgct ccccgctgaa aagtcccttg atcattacgc 420

gtccctctgg gcagctaaag atgcgtcaaa taaatgccat ttccctgaca gcatttaatc 480

ggtccagatt agaccgccaa gacaagaaga tcacgcaata aaatcagggg gtttacaatg 540

tcatttttct gtcgccgcca atttaccagc gttcctgcgc agaaatgaca gcctcgccct 600

cgccgttttg gaggatgcac cgcgtcgcgg cgacaaggac tgaaataatt gatccggccc 660

gcccgccatt gaaaccgctc gtcacctgcc ccatctaacc tggcataccc cattgcgcag 720

gtgccccatg agcgaacgca gacctgtagg agcggagctt gctcgcgata gccgcacagc 780

ggcggtgtat ccgccgccca gcgctatcct tgatggctta tcgcgagcaa gctcgctcct 840

acaacgtctc gcctacccca ccacagattc ccccatcttc ggttatgctc gccctttgtc 900

atgaccggag ctttctgacc catgtcaccg attcgtctgt tgctacccct cagccttgcc 960

ctgctcgccg cctgcgccag ccaacccaag caaaacgtca cggtcgagaa ccagagcgaa 1020

tgcccagtgc aactgagcaa cgggcaaaac ctgatcctga ccctgccgag caacccgacc 1080

acgggttatc gctgggcgat ccaggactcg gccggcggcg tgctgcgcaa agtcagcccc 1140

gaggtctaca gcaatcccga agacagcggc ctggtgggca gcgccggcca gtccacctgg 1200

cgcttccagg ccttcgccgc cggcaccggg cgcctgttgc tgacctatca gcaaccctgg 1260

gccccggaag tcgcaccggt gaaagccttc gactgcgcca tttcggtcaa gtgacatggg 1320

ctggctgatc ctggcgctga tgggcgcggc gaccttcctc tacggcctga gcatccacgc 1380

caccctgctg tgcttgctgg tcaagccgct gccggtgctg gccctgctcg gctggctgca 1440

cgatgcgccc cccggcgact atcgccgctg gatcagcctc ggcctgttgt tct 1493

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> rsmE-F1

<400> 23

aactctagat caacctgaag gcctgcggct gattc 35

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> rsmE-R2

<400> 24

catgatcttc tccttgattg ctttgtaggg cac 33

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> rsmE-F2

<400> 25

tcaaggagaa gatcatggcg tcatgagcgg c 31

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> rsmE-R2

<400> 26

agaagcttag gcgctgttga tcgtgctgct gg 32

<210> 27

<211> 1514

<212> DNA

<213> rsmE基因上下游融合片段

<400> 27

tcaacctgaa ggcctgcggc tgattccgtc cggattaccg ataaacacct ggggcatgga 60

cagccccttc aagatgactg agcgccgacc aggccggtcg ctcaacgtcg ctgcgacgac 120

ctggcctggc actcagaaga acggcttact gcgcgacgcg gtgctcgatc acttgcggtt 180

cgatattgcg cttcttggcc ttggtcagct tttcgaccag ctcggttttc ttggcttcgg 240

cttcggcctg ggaatcgaac gggccgatca gcacccgatc cttgccctct tcgacgacga 300

cataggaaac gatcccgtgc tcgatcagcc agccagccag atcgctcgtc gcctgaggca 360

gggtgccggc gaccagcaca tcccattgcg gtttcgtggc ggcctgcggc ggctgtgcct 420

ggacgaccgg cgccaccttc ttgtcgacct cgaccttctt gccctcaccg catcccgcca 480

atgccaggac cgccatcatc atcgctactg tgcgcacaac ctaccccttg aaagtctgag 540

gcggcgattt tagcacccca atcccctgcg caaacgccac aaaatcagcg caaaacaagg 600

agaatgatat ttatcgcctc tgtatagttg cagctcggga attaataccg cgtctgcgcg 660

tcagaaagag gcacccacac agtggtactt cgcagtaatc tatacgcact actaccgaca 720

tctgcactgt ctgaatcagg tgccctacaa agcaatcaag gagaagatca tggcgtcatg 780

agcggccagc cctttgtctc atcacaatgg ctggcgcagc gtcgtcgttg attgattccc 840

ccgcagcaca ctcccctctt caaatggcag cggcgcagtt caggccgcca gcgccagccc 900

tggcaaagtg cgttacccaa gccctccacc gatagcgctc catcccggca atctgtcgat 960

acgactcggc cgggagaaag ccctccctcg tttttgtata aatactcagt agcgtggcaa 1020

cgagcaggag gagtaatttc aagacctacc gcctccgcga gcctgccgag gctccccctt 1080

gccaccggca gacgctttac gaacaaggag cggtcaatgc aagagttcgc ttaccttctg 1140

atcaccaacg acctgaatgc aatgcgcacc attgccgcct gctcgacgga ggggctctac 1200

gaagtcaaac gcggaatatt caccttccgc tcccaggcca acgtcgacta cctgcaccgt 1260

gcgctggcca tcgtcagcga cgagttcggc atcattcctg tgcagcaggc cgagttcaaa 1320

accaaccggg ccaccatcag caaggctttc agccaactct gctagcgcgc gcggcgctcg 1380

gtgatgcaca acaacccaca tcgagccaaa gcacactcga ctcgctgctc cttcctcacc 1440

tcatggctgg ctgaacatga ccccacgcgc catgccgctg gccgccacca ccagcagcac 1500

gatcaacagc gcct 1514

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> psrA-F1

<400> 28

gcggattcgt ttcacggtga cttcgtcg 28

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> psrA-R1

<400> 29

gtttccgact gggccatggc tactc 25

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> psrA-F2

<400> 30

atggcccagt cggaaacaag gcctgaccgt cc 32

<210> 31

<211> 31

<212> DNA

<213> psrA-R2

<400> 31

tcaagctttc gtcgttgggg atcgccacgt g 31

<210> 32

<211> 1505

<212> DNA

<213> psrA基因上下游融合片段

<400> 32

gtttcacggt gacttcgtcg ccaatgcggg cgacgacgac ctggccattg cgggcctcgc 60

gagtggtgtg caccgccagc aggtcgccat cgaagatgcc gatgtccttc atgctcatgc 120

cgtgaacccg cagcaggtag tccgcgcgtg gatggaagaa ggccgggttg atattgcagg 180

actcttcgat gtgctgctcg gcgaggatcg gcgcgccggc ggcaacccgg ccgatgatgg 240

gcaggctgga gtcgtcgggc ttggcttcga accccgggat gcgaatgccg cgggaggcgc 300

ctggagtcat ttcgatcgca cccttgcggg ccagcgcctt gaggtgttct tcggcggcgt 360

tgggcgactt gaaacccagt tcctgggcga tttccgcgcg ggtcggtggg tagccgttgt 420

cttcgaggca acgtttgata aaagccagaa tctcagcttg gcgtggcgtc agttttagca 480

tatcgatcgc tctgtctttt tatacagtga ctggaattat atacagtgaa tggcgcttgg 540

caatcctcct ttttccagtc gccgctggac ggtcgggtcg ccgctgcgca tgcctggtgt 600

cgcgtggctg gctacaggac gcggcaggta tggttaaata gctgactgac cggccgcaaa 660

acggacaggc aggcttgaca agactggggc tgaaacgtat gtttcaaaca agtgtttgtc 720

aggcggagta gccatggccc agtcggaaac aaggcctgac cgtccgggtg ggcgcggcag 780

cttacatccg ctaagctagc cgcccatgtc gactctcgtt tcctacctcc tttcacatct 840

ttcgccgatc gtcgcttgcc gggctttgcc gccggcaatg gactcgtgcg tccgcgccac 900

gccagcaccc tttgcgatgc cgtgcgcgca cttcgttact aaggaattgc tatgaccaca 960

ggcctgcaag gctccttgat ggtggatgtc gccggtacct ggctgacagc tgaagatcgc 1020

cagctcctgc gccagcccga agtgggtggg ttgatcatct ttgcccgcaa tatcgagcat 1080

ccgcggcagg tgcgtgagtt gagcgcgtcc attcgggcga ttcgcccgga cctgctgctg 1140

gcggtggacc aggagggcgg tcgcgtgcag cgcctgcgcc agggcttcgt gcggctgccg 1200

gccatgcgtg ccatcgccga caacccgaat gccgaatacc tggccgagca gtgcggctgg 1260

atcatggcca ccgaagtgct ggccgtcggc ctggacctga gcttcgcgcc ggtgctggac 1320

ctcgatcatc agcgcagcgc tgtggtgggt actcgttcct tcgagggcga ccccgagcgc 1380

gccgcgttgc tggcgggtgc ctttatccgt ggcatgaaca gtgccggcat ggcggccacg 1440

ggcaagcatt tccccgggca cggctgggcc gaggcggact cccacgtggc gatccccaac 1500

gacga 1505

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> parS-F1

<400> 33

ttggattccc caattgtgcg cactcagact ggtattt 37

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> parS-R1

<400> 34

atctagagct cccacgcgaa cggatt 26

<210> 35

<211> 36

<212> DNA

<213> parS-F2

<400> 35

gtgggagctc tagattcgag gtgacggatt cgcagt 36

<210> 36

<211> 33

<212> DNA

<213> parS-R2

<400> 36

aaaagcttgc aaggaccgca agagcggcta caa 33

<210> 37

<211> 1527

<212> DNA

<213> parS基因上下游融合片段

<400> 37

cccaattgtg cgcactcaga ctggtattta tggataaccc gggtcttggc aaagtattgc 60

tggtggaaga tgacgagaag ctcgccgggc tgatcgcgca cttcctgtcc caacacggtt 120

tcgaggtcct gacggtacat cgtggcgatg tggcgctggc ggcctttctc gagttcaagc 180

cgaaaatcgt cgtcctcgac ctgatgctgc cgggccagag cggcctgcac gtgtgccggg 240

agatccgcaa cgtggcggac acgcccatcg tcatcctcac cgccaaggaa gacgacctgg 300

accatatcct gggcctggag tccggcgccg acgactacgt gatcaagccg atcaagccag 360

cggtgctgct ggcccgcctg cgcgccctgc aacggcgcca gttgccggag ccgacggtgc 420

gcggcgcgct ggaattcggc cgcctgaccc tcgaccgcag ttgccgcgaa gtgcgcctgg 480

ccggcgagcc gatcgagctg accaccatgg agttcgagct gctgtggctg ctggccagtt 540

cggcgggcaa gatcctctcc cgcgacgaca tcctcaaccg catgcgcggc atcgccttcg 600

acggcctcaa ccgcagcgtc gatgtctaca tcagcaagct gcgcggcaaa ctccaggaca 660

accctcgcga gccggtgtgc atcaagacca tctggggcaa gggctatctg ttcaatccgt 720

tcgcgtggga gctctagatt cgaggtgacg gattcgcagt ggggcggcgc gtcgtttcgc 780

atgacctggg cgcaggtcga gtagccccgg cccataggca catacccgcg gaattgcgca 840

tgcttctgta ggagcgcagc ttgcgcgcga tgaacgataa cgcggtggat caggcggtcc 900

gcgtcgtggt catcgcgggc aagcctcgct cctacagaag cacgcggttc tgtaggagcg 960

agcgggcggc gatccgactt gcccgcgata gcgtcagaac ggccaacgcc gcttagaagc 1020

tgtactccag ggtcgtcgcc agcgacgtct gcagccgccg ctcgacaatc gggctgtccg 1080

ccgcttcccg gcccaggtac tgcagcgcca gtaccgtcga cacgttcatc tgttcgctga 1140

ccggcactgt ccaggtcagg tcgccgcccc ggctgagaaa gccgcccttg gggcgatagg 1200

ctgcgaaacg ggtcctgccg gcctgggccg tgctgacgcc ataccaggtg tgcaggtagt 1260

cgccgtcgcc gaactggctg ttgaggctgc cttcgaggcg gccgtagcgg ccttcataca 1320

gcgtgctgcc aatgctcagt tgcaggtggt tgtaggccga gccggtgtcc gggtcgtcat 1380

tcttcttcag cgcatgctgc agcgtggccc cgagctccac ggtgcccagg gtgtagccca 1440

ggtgggcgcc gaactgcgcg cgggacttga tcgagcccat gccggccaga tggtccgaac 1500

ccttgtagcc gctcttgcgg tccttgc 1527

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> rpeA-F1

<400> 38

ccaagcttac tcaaagacgc tcattcccat gcc 33

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> rpeA -F2

<400> 39

caggattctc agcatcgact cagcattccc 30

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> rpeA-R1

<400> 40

actcagcatt ccctgagcca tgccgggcat 30

<210> 41

<211> 31

<212> DNA

<213> rpeA-R2

<400> 41

aaatctagac cgtcgctcac gcaaggcgct g 31

<210> 42

<211> 1443

<212> DNA

<213> rpeA基因上下游融合片段

<400> 42

actcaaagac gctcattccc atgcccaaca ttcttctggt cgaagacgac cccgcgctct 60

ctgaactgat cgccagttac ctggagcgca acggctatca ggtcaatgtc atcagccgcg 120

gcgaccaggt gcgtgaacgg gcgcgggtca atccgccgga cctggtgatt ctcgacctga 180

tgctgccggg cctggacggc ctgcaggtct gccgcctgct gcgggccgac tcggcgtcgc 240

tgccgatcct gatgctgacc gcccgtgatg atagccacga tcaggtgctg ggtctggaaa 300

tgggcgccga cgattatgtg acaaaaccgt gcgaaccgcg cgtgctgctg gcgcgggtgc 360

gtaccctgtt gcgccgcagc agcctcggcg agccgcagac cgccagcgac cggatcctca 420

tgggcaacct gtgcatcgac ctgtcggagc gcaccgtgag ctggcgcgat caattggtgg 480

aactgtccag cggcgagtac aacctgctgg tggtgctggc ccggcatgcc ggcgaggtgc 540

tgagccgcga ccagatcctg caacgcctgc ggggcatcga gttcaacggc accgaccgct 600

cggtggacgt ggcgatttcc aagctgcggc gcaagttcga cgaccacgcc ggcgaggcgc 660

gcaagatcaa gaccgtatgg ggcaagggct acctgttcag ccgttccgaa tgggaatgct 720

gagtcgatgc tgagaatcct gtgagccatg ccgggcatcc ccagcgacgg gaaggcccgg 780

cagtcggcgt tatggaagag gctgcatcag cacagcgcgg tcggctgtag ctcgctggcc 840

ttgatcaggt tcacgcctgc cgcgcgcatc tgccgggtgg ccttgtccag cgagccgtcc 900

atgtcgatgg cccggcaggc atcgacgatc acgaaggtat tgaagcccgc cgcccgcgca 960

tccagcgccg accaggccac gcagtagtcc agggccagcc ccaccagata caccgtgtcg 1020

atgccgcgct ggctcaggta gccggccagg ccggtcgtgg tgctgcggtc cgcctcgacg 1080

aaggccgagt aactgtcgat atccggattg caacccttgc gcaggatcag ctgggcatgg 1140

ggcaggttga gtttcgggtg cagttcggcg ccacggctgg cctgcacgca atggtccggc 1200

cagagcacct gcgggccata gggcagctgg atgatgtcgt tcggcgcgtg gccttcgtgg 1260

ctggaggcga acgagatatg cccggccggg tgccagtcct gggcgatcac cacctgcttg 1320

aagtggccgc ccaggcgatt gatcaagggc acgatctggt cgccccccgg caccgccagc 1380

gcgccgccgg ggatgaagtc gttctgtacg tcgatgacca gcagcgcctt gcgtgagcga 1440

cgg 1443

Claims (12)

1.一株产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，将绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再先后累计敲除lon基因、rpeA基因、psrA基因、parS基因、rsmE基因即得，并命名为QPCN-2(QPCA-1Δlon)、QPCN-3(QPCA-1ΔlonΔrpeA)、QPCN-4(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrA)、QPCN-5(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrAΔparS)、QPCN-6(QPCA-1ΔlonΔrpeAΔpsrAΔparSΔrsmE)；

所述外源phzH基因碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1已送至中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年05月08日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020108。

2.如权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述phzO基因的碱基序列如SEQ IDNO.1所示；

所述lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的碱基序列分别如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

3.权利要求1或2所述产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

将绿针假单胞菌Qlu-1基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，“所述phzO基因替换为外源的phzH基因”的具体步骤包括：敲除phzO基因后得菌株QPCA-1，然后将外源phzH基因导入菌株QPCA-1中。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述敲除phzO基因步骤包括：

i、扩增phzO基因片段的上下游同源臂；采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得phzO基因重组质粒；

ii、将phzO基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与绿针假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养，从而将phzO基因重组质粒导入绿针假单胞菌Qlu-1；

iii、筛选阳性克隆，即得菌株QPCA-1。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，扩增phzO基因片段上游同源臂的引物包括phzO-F1和phzO-R1，序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；

扩增phzO基因片段下游同源臂的引物包括phzO-F2和phzO-R2，序列分别如SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.11所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.12所示；

筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。

7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述外源phzH基因导入菌株QPCA-1中具体方法为：

i、以QPCA-1基因组为模板，以phzO-F1/phzO-R1-2，phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2；以合成的phzH基因为模板，phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2；以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板，以phzO-F1/phzO-R2为引物，扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN；将融合片段phzH-IN插入pK18mobsacB质粒中得phzH基因重组质粒；

ii、将phzH基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与菌株QPCA-1进行双亲杂交培养，从而将phzH基因重组质粒导入菌株QPCA-1；

iii、筛选阳性克隆，即得。

8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，

所述phzO-F1和phzO-R1-2的序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.13所示；

所述phzO-F2-2和phzO-R2的序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.11所示；

所述phzH-F1和phzH-R1的序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；

所述phzH-IN基因上下游融合片段的序列如SEQ ID NO.17所示；

所述筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。

9.如权利要求5或6所述的构建方法，其特征在于，敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的方法与敲除phzO基因的方法相同；

其中，敲除lon基因方法中，

扩增lon基因片段上游同源臂的引物包括lon-F1和lon-R1，序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；

扩增lon基因片段下游同源臂的引物包括lon-F2和lon-R2，序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的lon基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.22所示；

其中，敲除rsmE基因方法中，

扩增rsmE基因片段上游同源臂的引物包括rsmE-F1和rsmE-R1，序列分别如SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示；

扩增rsmE基因片段下游同源臂的引物包括rsmE-F2和rsmE-R2，序列分别如SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rsmE基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.27所示；

其中，敲除psrA基因方法中，

扩增psrA基因片段上游同源臂的引物包括psrA-F1和psrA-R1，序列分别如SEQ IDNO.28和SEQ ID NO.29所示；

扩增psrA基因片段下游同源臂的引物包括psrA-F2和psrA-R2，序列分别如SEQ IDNO.30和SEQ ID NO.31所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的psrA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.32所示；

其中，敲除parS基因方法中，

扩增parS基因片段上游同源臂的引物包括parS-F1和parS-R1，序列分别如SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34所示；

扩增parS基因片段下游同源臂的引物包括parS-F2和parS-R2，序列分别如SEQ IDNO.35和SEQ ID NO.36所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的parS基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.37所示；

其中，敲除rpeA基因方法中，

扩增rpeA基因片段上游同源臂的引物包括rpeA-F1和rpeA-R1，序列分别如SEQ IDNO.38和SEQ ID NO.39所示；

扩增rpeA基因片段下游同源臂的引物包括rpeA-F2和rpeA-R2，序列分别如SEQ IDNO.40和SEQ ID NO.41所示；

采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的rpeA基因上下游融合片段序列如SEQ IDNO.42所示。

10.权利要求1或2所述基因工程菌株和/或权利要求3-9任一项所述构建方法获得的基因工程菌在生产吩嗪-1-甲酰胺中的应用。

11.一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1或2所述基因工程菌株和/或权利要求3-9任一项所述构建方法获得的基因工程菌接种于发酵培养基中进行培养。

12.如权利要求11所述的一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法，其特征在于，所述的发酵培养基为KB培养基。

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