WO2013067719A1 - 一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用 - Google Patents

一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2013067719A1
WO2013067719A1 PCT/CN2011/082531 CN2011082531W WO2013067719A1 WO 2013067719 A1 WO2013067719 A1 WO 2013067719A1 CN 2011082531 W CN2011082531 W CN 2011082531W WO 2013067719 A1 WO2013067719 A1 WO 2013067719A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
phenazine
carboxylic acid
gene
bioengineered
Prior art date
Application number
PCT/CN2011/082531
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
许煜泉
申慧峰
何亚文
周万平
Original Assignee
上海交通大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 上海交通大学 filed Critical 上海交通大学
Priority to MYPI2014701183A priority Critical patent/MY184195A/en
Priority to US14/356,636 priority patent/US9491943B2/en
Publication of WO2013067719A1 publication Critical patent/WO2013067719A1/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/60—1,4-Diazines; Hydrogenated 1,4-diazines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/05—Carbon-nitrogen ligases with glutamine as amido-N-donor (6.3.5)
    • C12Y603/05004—Asparagine synthase (glutamine-hydrolyzing) (6.3.5.4)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of microbial source pesticide production, and particularly relates to a bioengineered strain for producing a novel microbial source fungicide and an application thereof.
  • Pesticides are difficult to decompose and will accumulate in the ecosystem for a long time, causing environmental pollution, which is not conducive to the sustainable development of the social economy.
  • existing chemical pesticides are not completely effective for certain plant diseases. Therefore, while striving to develop a new generation of chemical pesticides, it is also necessary to vigorously research and develop bio-sourced pesticides that are efficient, safe, economical, and environmentally compatible.
  • bio-sourced pesticides that have been promoted in production are relatively small, and some varieties have been resistant to plant pathogenic bacteria due to their long-term use, and the control effect is not satisfactory.
  • the agent for controlling the disease mainly relies on the old bio-sourced pesticide, Jinggangmycin.
  • Bio-pesticide promotes antagonistic M18 has an efficient, safe and broad-spectrum bactericidal effect on plant diseases, has good compatibility with the environment, and is easy to disintegrate in the environment.
  • the growth-promoting antibacterial M18 was deposited on June 27, 2000 at the Chinese Patent Office: Beijing, China Microbial Culture Collection Management Committee General Microbiology Center, the deposit number is CGMCC NO.
  • bio-pesticide-promoting antibacterial activity M18 is a live bacterial agent, and its mechanism of action is mainly to inhibit the plant pathogenic bacteria by synthesizing the active ingredients against plant diseases by M18 live bacteria, and the content of the synthesized active ingredients is easy. It is affected by the metabolic regulation mechanism of the bacteria itself and environmental conditions. Therefore, the control effect on plant diseases Defects with instability, it is difficult to carry out large-scale popularization and application in agricultural production.
  • the main active ingredient of the antagonistic antibacterial agent M18 for controlling plant diseases is phenazine-1-carboxylic acid, which extracts phenazine-1-carboxylic acid from the fermentation broth of the probiotic antagonistic M18, using active ingredients instead of living
  • the control of crop diseases on crop diseases is also characterized by high efficiency, safety, broad spectrum and good compatibility with the environment. At the same time, it can overcome the defects of using the growth-promoting antagonistic M18 to control the instability of diseases.
  • the genetically engineered method was used to carry out the directed inactivation mutation of the two-component regulatory gene gacA in the pro-active antagonistic M18 genome, and the M18-derived strain M18G was obtained, which greatly improved the phenazine-1-carboxylic acid.
  • the yield is about 1500-1700 mg per liter.
  • the technical method of the research results has been published in the Journal of Microbiology, Vol. 44, pp. 761 ⁇ 765, in the title of "Pseudomonas gacA insertion mutation on anaphyllin and phenazine-1-carboxylic acid anabolism. Differential regulation.
  • the Chinese invention patent entitled "Method for preparing bactericides by promoting growth-promoting antibacterial M18-derived strains" provides a use of the pro-amphibitory antibacterial M18-derived strains M18G and M18R.
  • the method for preparing a bactericide is to prepare a bactericide by using a metabolite of a microorganism instead of a living organism of a microorganism, and the purpose of improving the control effect is achieved by compounding the metabolites of the two derived strains.
  • the invention utilizes a strain producing phenazine-1-carboxylic acid, carrying a gene capable of expressing and encoding PhZH (gl U tamin e phenazine-l-carboxylic acid amidotransferase, glutamine phenazine-1-carboxylic acid amide transferase, PhzH)
  • PhZH gl U tamin e phenazine-l-carboxylic acid amidotransferase, glutamine phenazine-1-carboxylic acid amide transferase, PhzH
  • the recombinant expression plasmid is supplemented and added to the copy number of the gene and expressed in an engineered strain to convert phenazine-1-carboxylic acid to phenazine-1-carboxylic acid amide.
  • the antibacterial activity of phenazine-1-carboxylic acid amide is not affected by the acidity value of the conditions of use, thereby stabilizing its antibacterial activity and more effectively controlling crop diseases.
  • the present invention firstly discloses a bioengineered strain for producing a microbial source bactericide, which is obtained by converting a ⁇ ⁇ / gene recombinant expression plasmid into a strain producing phenazine-1-carboxylic acid, the bioengineered strain producing phenotype Pyrazine-1-carboxylic acid amide.
  • the invention also discloses a method for constructing the bioengineered strain for producing the microbial source fungicide, comprising the following steps:
  • the constructed / ⁇ z/gene recombinant expression plasmid was introduced into a strain producing phenazine-1-carboxylic acid to construct the bioengineered strain for producing a microbial source fungicide.
  • the recombinant expression plasmid is a recombinant expression plasmid in which a phz# gene fragment is cloned.
  • the phzi can express/gene in the phenazine-1-carboxylic acid-producing strain due to the recombinant expression plasmid, and encodes PhzH (glutamine phenazine-1-carboxylic acid amide transferase).
  • the ⁇ ⁇ / gene of the present invention comprises the coding region of the gene and its non-coding region.
  • the ⁇ ⁇ / gene fragment may be a complete ⁇ ⁇ / gene or a part of ⁇ ⁇ / gene.
  • the ⁇ ⁇ / gene fragment of the present invention should contain at least the entire coding region of ⁇ ⁇ / gene.
  • the gene fragment comprises the entire coding region of the gene and the non-coding region at the 5' end thereof.
  • the non-coding region at the 5' end of the ⁇ gene fragment may be a partial or complete / ⁇ z / gene 5' non-coding region.
  • the 5' non-coding region of the gene contained in the gene fragment should facilitate the expression of PhzH.
  • the non-coding region at the 5' end of the gene fragment contains a polynucleotide fragment from the first base upstream of the p ⁇ /gene translation initiation codon to the 683th base upstream thereof.
  • the PhzH is PhzH of Pseudomonas.
  • the gene fragment is a gene of Pseudomonas Fragment.
  • the Pseudomonas is Pseudomonas aeruginosa or Pseudomonas chlororaphis.
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 1:
  • the / ⁇ z / gene fragment is derived from the Pseudomonas aeruginosa strain PA01 genome.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 2 gtccgaggac ccgtgcagcg ggccggtgtt cggtccgtcg acctgcgaat gcccttgagg 60 taggtcgtct ggcgggcccg gtgcagcggg cccgcttccg gatgtatcgc tcgctcgaag 120 ttgccttcttt taattctcca cgccctactt ttccccgcgcgcgc 240 atctgagttt gttgtagtca ttccccgcgtcgtccatcgtc 240 atctgagtt
  • the expression vector for constructing the recombinant plasmid is an Escherichia coli/Pseudomonas shuttle expression plasmid.
  • the E. coli/Pseudomonas shuttle expression plasmid contains a strong promoter, and the ⁇ ⁇ / gene fragment is cloned after the strong promoter, and the strong promoter is Control its expression.
  • the strong promoter may be the bacteriophage promoter ⁇ 3 prom or ⁇ 7 prom. Insertion of the gene of interest at a specific position of the plasmid and ensuring that the reading frame of the gene of interest is correct is a technique well known to those skilled in the art.
  • the E. coli/Pseudomonas shuttle expression plasmid can be a pBBR1MCS series plasmid and various expression plasmids derived therefrom. As exemplified in the examples, the E. coli/Pseudomonas shuttle expression plasmid is pBBR1MCS-5.
  • the gene expression vector pBBRphzH can be obtained under the control of the phage promoter T3 prom of pBBR1MCS-5 by appropriate primer design, amplification/gene fragmentation under the premise of correct reading frame.
  • the phenazine-1-carboxylic acid-producing strain refers to a wild type strain which can produce phenazine-1-carboxylic acid by fermentation and an engineered strain derived therefrom. Further, the phenazine-1-carboxylic acid-producing strain belongs to Pseudomonas, such as M18 and M18G. The storage number of the M18 is CGMCC NO.
  • M18G strain is a derivative strain of M18 (CGMCC NO. 0462) and is a prior art.
  • the preparation method thereof is well known, for example, in 2004, in the Journal of Microbiology, Vol. 44, pp. 761-765, "Pseudomonas gacA insertion mutation differentially regulates the anabolism of lignan and phenazine-1-carboxylic acid. ⁇ .
  • the yield of phenazine-1-carboxylic acid of M18G is greatly improved, and therefore, the preferred phenazine-1-carboxylic acid engineering strain of the present invention is M18G. Since the wild type strain producing phenazine-1-carboxylic acid and the engineered strain derived therefrom can produce phenazine-1-carboxylic acid, the / ⁇ z / gene recombinant expression plasmid can produce phenazine-1-carboxylic acid.
  • the engineered strain expresses ⁇ ⁇ /gene, which encodes the product glutamine phen Pyrazine-l-carboxylic acid amide transferase can amidate phenazine-l-carboxylic acid to synthesize phenazine-1-carboxylic acid amide (the molecular structure of phenazine-1-carboxylic acid amide is shown in Figure 1).
  • the metabolite of the bioengineered strain of the invention contains phenazine-1-carboxylic acid amide.
  • the method for introducing a ⁇ ⁇ /gene recombinant expression plasmid into a phenazine-1-carboxylic acid-engineered strain is a conventional transformation or transduction method.
  • the bioengineered strain of the present invention for producing a microbial source bactericide can be used for fermentative production of the microbial source bactericide of the present invention.
  • the present invention further provides a microbial source bactericide which is a fermentation broth of the bioengineered strain of the present invention.
  • the main bactericidal active ingredient is phenazine-1-carboxylic acid amide.
  • it contains a trace amount of the bactericidal active ingredient garcinia.
  • the content of phenazine-1-carboxylic acid amide is 2,500 to 2,800 mg per liter.
  • the invention further discloses a preparation method of the microbial source bactericide, which is obtained by fermenting the bioengineered strain of the invention under the condition of appropriately expressing phenazine-1-carboxylic acid and PhzH. Further, the method for preparing the microbial source bactericide comprises the following steps:
  • Seed expansion culture After shaking flask culture in glycerol culture solution, transfer to the fermentation medium to obtain fermentation broth.
  • the engineered strain can be activated by solid glycerol medium activation.
  • the weight percentage of the components contained in the glycerin culture solution is: peptone 1.8 ⁇ 2.2%, glycerol 1.3 ⁇ 1.7%, magnesium sulfate 0.05 ⁇ 0.1%, potassium dihydrogen phosphate 0.01 ⁇ 0.05%, balance water, pH 6.8 ⁇ 7.2.
  • the weight percentage of the components contained in the solid glycerin medium is: peptone 1.8 ⁇ 2.2%, glycerol 1.3 ⁇ 1.7%, magnesium sulfate 0.05 ⁇ 0.1%, potassium dihydrogen phosphate 0.01 ⁇ 0.05%, agar 1.2-1.5%, The balance is water, pH 6.8 ⁇ 7.2.
  • the component weight percentage of the vegetative culture solution is: peptone 2.2 ⁇ 3.0%, glucose 2.0 ⁇ 2.5%, potassium nitrate 0.5 ⁇ 0.7%, balance is water, pH 6.5 ⁇ 7.0.
  • the activation condition of the engineering strain is: connecting the engineering bacteria to the glycerin culture plate at 26 to 30 ° C, Activated growth for 20 to 24 hours; then sterilized on a plate of glycerol medium again, 26 ⁇ 3 (activated for 10 to 12 hours under TC.
  • the seed expansion culture shake the flask in glycerol culture solution
  • the culture conditions are as follows: the activated strain is connected to the glycerol culture solution, and shake cultured at 26 to 30° C. for 9 to 11 hours. When the culture is shaken, the shaker rotation speed may be 160 to 180 rpm.
  • the conditions for amplifying the fermentation culture in the culture medium for the production of the fermented broth are: transferring the strain cultured in the glycerol culture solution to the culture medium containing the production hormone, and fermenting the culture at 60 to 30 ° C for 60 to 72.
  • the shaking speed of the shaker may be 160 to 180 rpm.
  • the microbial source bactericide of the present invention can be used for controlling plant diseases or for preparing a medicament for controlling plant diseases.
  • the present invention further discloses an agent for controlling plant diseases, comprising a bactericidal effective amount of the microbial source bactericide of the present invention or a bactericidal active ingredient thereof.
  • the fermentation broth of the bioengineered strain for producing the microbial source bactericide is directly used as a medicament for controlling plant diseases; the broth can be dried as a powder and then used as a bactericidal active ingredient raw material together with other conventional excipients to control plant diseases.
  • the phenazine-1-carboxylic acid amide which is the main bactericidal active ingredient in the fermentation broth, may be isolated and used as a bactericidal active ingredient raw material for formulating a medicament for controlling plant diseases.
  • the present invention utilizes phenazine-producing agent-1.
  • the genetically engineered strain of carboxylic acid carries a recombinant expression vector, and the method for producing phenazine-1-carboxylic acid amide has the following advantages:
  • the phenazine-1-carboxylic acid amide produced by the present invention has high-efficiency antifungal ability, and is not affected by the acidity of the use environment in the range of pH 4.0 to 0.8, regardless of the acidity in the planting. It is also used on crops in an alkaline environment to achieve stable control effects.
  • phenazine-1-carboxylic acid in a host is converted into phenazine-1-carboxylic acid amide by constructing a recombinant plasmid carrying the entire coding region of the gene/gene and the non-coding region at the 5' end thereof.
  • the / ⁇ z / gene and its 5 ' non-coding region fragment are efficiently expressed under the control of the phage strong promoter T3 prom , and the recombinant plasmid has multiple copies in the host M18G , and the gene in the host M18G A large amount of expression and synthesis of amidase, The phenazine-l-carboxylic acid is completely converted into phenazine-l-carboxylic acid amide, and the conversion efficiency can reach 100%.
  • Figure 1 shows the molecular structural formula of phenazine-1-carboxylic acid amide in the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the construction of the plasmid pBBRphzH in the present invention.
  • the invention relates to a method for producing phenazine_1_carboxylic acid amide by using the engineering strain M18G carrying the plasmid pBBRphzH, and amplifying the ⁇ ⁇ / gene and the 5 ' non-coding region fragment thereof from the P. aeruginosa PA01 genome.
  • the fragment was inserted into the expression plasmid pBBR1MCS-5 and placed under the control of the phage promoter T3 prom to construct the recombinant plasmid pBBRphzH.
  • the recombinant plasmid was then introduced into the proliferating antagonist M18-derived strain M18G to construct a genetic engineering. Strain M18G/pBBRphzH.
  • This engineered strain achieved an efficient and stable expression of the glutamine phenazine-1-carboxylic acid amide transferase PhzH.
  • the genetically engineered strain M18G/pBBRphzH was cultured in the culture medium to efficiently and stably produce phenazine_1-carboxylic acid amide.
  • the phenazine-1-carboxylic acid amide is prepared by using the high-yield genetic engineering strain of the invention, and the effect of controlling the disease is not affected by the acidity condition, and the production cost can be further reduced, and the plant can be effectively controlled whether used in an acidic or alkaline environment. Disease.
  • Figure 3 is the same concentration of phenazine-1-carboxylic acid (PCA) and phenazine-1-carboxylic acid amide (PCN), antibacterial activity against Rhizoctonia solani in potato glucose medium with different acidity conditions Comparison of the results of the map.
  • the weight percentage of potato glucose medium used in the experiment was 20% for potato, 2% for glucose, and 1. 2% for agar powder. The balance was water.
  • a preferred embodiment of the present invention constructs the genetically engineered strain M18G/pBBRphzH by carrying the recombinant plasmid pBBRphzH by using the proliferating antagonist M18-derived strain M18G, and complements and adds the complete coding region of the gene in the M18G strain. And the copy number of the non-coding region fragment of its 5' end, the phenazine-1-carboxylic acid is converted to phenazine-1-carboxylic acid amide to produce phenazine-1-carboxylic acid amide.
  • a preferred embodiment of the present invention amplifies the entire coding region of the ⁇ ⁇ / gene and the non-coding region fragment thereof at the 5' end from the P.
  • aeruginosa strain PA01 aeruginosa strain PA01, and inserts the fragment into the expression plasmid pBBR1MCS-5, and is placed in the phage promoter.
  • the recombinant plasmid pBBRphzH was constructed.
  • the recombinant plasmid pBBRphzH was introduced into the proliferating antagonist M18-derived strain M18G to construct a genetically engineered strain M18G/pBBRphzH, which can achieve high efficiency and stability of the gene. expression.
  • the genetically engineered strain M18G/pBBRphzH was cultured in the culture medium to produce phenazine-1-carboxylic acid amide efficiently and stably, instead of phenazine-1-carboxylic acid, and the yield of phenazine-1-carboxylic acid amide reached liters per liter. 2500 ⁇ 2800 mg level.
  • the activity of phenazine-1-carboxylic acid amide against rice sheath blight was increased by more than 5 times compared with phenazine-1-carboxylic acid.
  • the antibacterial activity of phenazine-1-carboxylic acid amide produced per unit volume of fermentation broth greatly exceeds the antibacterial activity of phenazine-1-carboxylic acid.
  • the specific scheme for constructing the genetic engineering strain M18G/pBBRphzH and using the strain to produce phenazine_1-carboxylic acid amide is:
  • the underline is the restriction endonuclease 3 ⁇ 4 0 I, /i2t III
  • the restriction enzyme cleavage site; then using Pseudomonas aeruginosa PA01 genomic DNA as a template, using DNA polymerase 73 ⁇ 4 and designed primers, amplifying the non-coding region fragment of the z/gene and its 5' end, and amplifying the product through agar
  • the sugar electrophoresis assay detects a 2.5 kb ⁇ ⁇ /gene and a 5' non-coding region fragment thereof.
  • a pair of primers were designed to amplify the / ⁇ /gene and its non-coding region fragment at the 5' end.
  • the nucleotide sequence of the primer is as follows:
  • the underlined nucleotide in the sequence is the restriction endonuclease ⁇ 3 ⁇ 4. I, III enzyme cleavage sites.
  • the primer was commissioned by Shanghai Shenggong Bioengineering Co., Ltd. for synthesis. Then, using Pseudomonas aeruginosa PA01 genomic DNA as a template, using DNA polymerase 73 ⁇ 4 ⁇ and the primers designed above, the entire coding region of the / ⁇ z / gene and the non-coding region of the 5' end were amplified, and the product was passed.
  • the electrophoresis was carried out to recover a complete coding region of ⁇ ⁇ / gene and a fragment of the non-coding region at the 5' end of the gene, and the gene fragment was verified to be accurate by nucleotide sequencing.
  • the Pseudomonas aeruginosa PA01 genomic DNA is prepared by using the AxyPr printing bacterial genomic DNA kit, and the gene fragment is recovered by using the AxyPrep DNA gel recovery kit, both of which are manufactured by Aisijin Biotechnology (Hangzhou) Co., Ltd.
  • the catalog numbers are AP-MN-BT-GDNA-4 and AP-GX-50, respectively; the conditions of the gene amplification reaction and agarose electrophoresis are edited according to J. Sambrook, DW Russell, respectively.
  • the DNA polymerase LA 73 ⁇ 4 ⁇ and the gene amplification kit were purchased from TAKARA Shanghai Agency, catalog number: DRR002AG. Agarose was purchased from GENE TECH's Shanghai agency.
  • the nucleotide sequencing of the gene fragment (/ ⁇ and its non-coding region at the 5' end) was commissioned by Shanghai Yingjun Biotechnology Co., Ltd., and the sequencing result confirmed that the gene fragment contained SEQ ID NO: 2, and the encoded amino acid sequence of the protein was SEQ ID NO: 1.
  • the pBBRphzH-transformed E. coli transformants were screened on gentamicin-resistant plates; finally, the constructed recombinant plasmid pBBRphzH was extracted from E. coli transformants and verified.
  • the constructed recombinant plasmid pBBRphzH is shown in Figure 2.
  • the complete coding region of the gene and the non-coding region of the 5' end thereof were digested with restriction enzymes o and ffi ⁇ III, and then inserted into the plasmid under the action of ligase.
  • pBBR1MCS-5 The corresponding restriction site in pBBR1MCS-5 was placed under the control of phage promoter T3 prom to construct recombinant plasmid P BBRphzH.
  • 4766 bp indicates the length of the plasmid pBBR1MCS-5, which is 4766 base pairs; in the figure, it represents the gene encoding the glutamine phenazine-1-carboxylamide transferase; ⁇ is the symbol of the shortened fragment of the gene; 3 ⁇ 4o I, III is a restriction endonuclease site; the numbers in the figure indicate the coding sequence of the gene linked to the pBBR1MCS-5 plasmid and the length of the nucleotide sequence of the 5 'non-coding region, respectively, 1833 bp and 683 bp; Gm is The selectable marker gene for gentamicin in plasmid pBBR1MCS-5; T3 prom and T7 prom are two
  • Plasmid PBBR1MCS-5 plasmid was provided by Shanghai Jiaotong University School of Life Science and Technology. Restriction enzymes and ligases were purchased from Shenzhen Zhongjing Biotechnology Co., Ltd. The recombinant plasmid was extracted from E.
  • plasmid B rapid extraction kit provided by Beijing Boda Tektronix Biogene Technology Co., Ltd., catalog number: MK014-2.
  • the restriction enzymes, DNA polymerase and gene amplification kits used for the verification of recombinant plasmids were purchased from TAKARA Shanghai Agency, catalog number: DRR002AG. Agarose was purchased from GENE TECH's Shanghai agency.
  • the obtained phenazine-1-carboxylic acid amide content was 2500 mg per liter, and the content of phenazine-1-carboxylic acid was not detected, indicating that all phenazine-1-carboxylic acid had been converted to phenazine-1-carboxylate.
  • the acid amide showed that the conversion of phenazine-1-carboxylic acid to phenazine-1-carboxylic acid amide was 100%.
  • the weight percentage of the components in the glycerin broth is: 8%, glycerol, 1.3%, magnesium sulfate 0. 07%, potassium dihydrogen phosphate, 0.03%, balance water, pH7 . 0.
  • the glycerin medium (solid) also contains Agar 1.5%.
  • the yield of phenazine_1-carboxylic acid amide was 652.5 mg in 65 ml of M18G/pBBRphzH fermentation broth, and the content of phenazine-1-carboxylic acid was zero, diluted in a certain ratio, and configured per liter.
  • Potato glucose medium (pH 7.0) containing 16 mg of phenazine-1-carboxylic acid amide, while diluting M18G/pME6032Phz fermentation broth (ZL200910198664. 2) in a certain ratio, with 16 mg of phenazine_1 per liter.
  • the potato glucose medium (pH 7.0) of the carboxylic acid was measured with potato glucose medium (pH 7.0) without fermentation broth, and the rice bacterial blight was measured in various potato glucose medium (pH 7.0).
  • the growth rate in the middle, and the bacteriostatic activity of phenazine-1-carboxylic acid amide and phenazine-1-carboxylic acid were calculated according to the calculation method of Example 6, and calculated according to the biological activity under the same pH 7.0 condition.
  • the bacteriostatic activity is increased by about 1.9 times, the bacteriostatic activity is increased by about 1.9 times.
  • the singularity of about 2. 5 kb is obtained by the same method as in Example 1 and the entire coding region of the gene and the non-coding region of the 5' end. ⁇ ⁇ / gene and its non-coding region fragment at the 5' end.
  • the recovered / ⁇ ⁇ / gene and its 5' non-coding region fragment were digested with restriction endonuclease 3 ⁇ 4o I, Hind III, ligase ligated, and inserted into Escherichia coli / Pseudomonas shuttle plasmid PBBR1MCS -5, and the expression of the gene and its 5' non-coding region fragment was placed under the control of the phage promoter T3 prom to form the recombinant plasmid pBBRphzH and transformed into E. coli.
  • the E. coli transformants transformed with PBBRphzH were screened on gentamicin-resistant plates; finally, recombinant plasmids were extracted from E. coli transformants and verified.
  • the competent cells of the M18-derived strain M18G were prepared, and the recombinant plasmid pBBRphzH was transformed into a competent cell of M18G, and cultured at 30 ° C for 1 day.
  • a method for preparing a competent cell for promoting the antagonistic M18-derived strain M18G, a method for transforming a recombinant plasmid pBBRphzH into a competent cell of M18G, and a screening method for a genetically engineered strain M18G/pBBRphzH for efficiently producing phenazine-1-carboxylic acid amide is the same Example 1.
  • the genetically engineered strain M18G/pBBRphzH was inoculated on a plate of glycerol medium, activated and grown at 28 ° C for 22 hours, and then sterilized on a plate of glycerol medium again, activated at 28 ° C for 11 hours, then Activated Transfer the M18G/pBBRphzH bacteria to a flask containing 25 ml of glycerol medium in a volume of 250 ml, shake culture in a shaker at 28 ° C for 10 hours, and shake the speed at 170 rpm.
  • the weight percentage of the components contained in the glycerin medium is: peptone 2.2%, glycerol 1.7%, magnesium sulfate 0.05%, potassium dihydrogen phosphate 0.01%, balance water, pH 7.2.
  • the glycerin medium (solid) also contained agar 1.5%.
  • the component weight percentage of the vegetative culture solution was: peptone 2.2%, glucose 2.5%, potassium nitrate 0.5%, balance water, pH 7.2.
  • the yield of phenazine_1-carboxylic acid amide was 655.5 mg in 65 ml of M18G/pBBRphzH fermentation broth, and the content of phenazine-1-carboxylic acid was zero, diluted in a certain ratio, and contained 16 per liter.
  • the potato glucose medium (pH 7.0) was used to determine the rice sheath blight fungus in various potato glucose medium (pH 7.0) with the potato dextrose medium (pH 7.0) without fermentation broth.
  • the growth rate, and the bacteriostatic activity of phenazine-1-carboxylic acid amide and phenazine-1-carboxylic acid were calculated according to the calculation method of Example 6, and calculated according to the bacteriostatic activity under the same pH 7.0 conditions.
  • the yield of phenazine_1-carboxylic acid amide obtained from the fermentation broth of M18G/pBBRphzH was equivalent to the antibacterial effect of 13500 mg of phenazine_1-carboxylic acid, and the antibacterial activity was increased by about 2.1 times.
  • the recovered / ⁇ z/ gene and its 5' non-coding region fragment were digested with restriction endonuclease 3 ⁇ 4o I and Hind III, and inserted into E. coli/Pseudomonas shuttle under the action of ligase.
  • the corresponding restriction site in the expression plasmid PBBR1MCS-5 was placed under the control of the phage promoter T3 prom to form a recombinant plasmid pBBRphzH and transformed into E. coli.
  • E. coli transformants transformed with pBBRphzH were screened on gentamicin-resistant plates; finally, from the large intestine rod
  • the recombinant plasmid was extracted from the bacteria and verified.
  • a method for preparing a competent cell for promoting the antagonistic M18-derived strain M18G, a method for transforming a recombinant plasmid pBBRphzH into a competent cell of M18G, and a screening method for a genetically engineered strain M18G/pBBRphzH for efficiently producing phenazine-1-carboxylic acid amide is the same Example 1.
  • the engineering strain M18G/pBBRphzH constructed by genetic engineering technology was inoculated on a plate of glycerol medium, activated and grown at 30 ° C for 20 hours, and then sterilized on a plate of glycerol medium again, 30 ° C After activation for 12 hours, the activated M18G/pBBRphzH strain was transferred to a flask containing 25 ml of glycerol medium in a volume of 250 ml and amplified by shaking at 11 ° C for 11 hours in a shaker at 30 ° C.
  • the yield of phenazine-1-carboxylic acid amide was 2800 mg per liter.
  • the content of phenazine-1-carboxylic acid was not detected, indicating that all phenazine-1-carboxylic acid had been converted to phenazine-1-carboxylic acid amide.
  • the results showed that the conversion of phenazine-1-carboxylic acid to phenazine-1-carboxylic acid amide was 100%.
  • the weight percentage of the components in the glycerin medium is: peptone 2.0%, glycerol 1.5%, magnesium sulfate 0.1%, potassium dihydrogen phosphate 0. 05%, balance water, pH6 5 % ⁇
  • a glycerin medium (solid) also contains agar 1. 5 %. 0 ⁇
  • the composition of the composition of the broth is: 0. 0%, glucose 2. 5 %, potassium nitrate 0. 8 %, the balance is water, pH 7.0.
  • the yield of phenazine_1-carboxylic acid amide was 182 mg in 65 ml of M18G/pBBRphzH fermentation broth, and the content of phenazine-1-carboxylic acid was zero, diluted in a certain ratio, and the configuration contained 16 per liter.
  • Millipum phenazine-1-carboxylic acid amide potato glucose medium (pH 7.0), while diluting M18G/pME6032Phz fermentation broth (ZL200910198664.
  • the singularity of about 2. 5 kb is obtained by the same method as in Example 1 and the entire coding region of the gene and the non-coding region of the 5' end. A non-coding region fragment at the 5' end of the gene phzH.
  • the recovered / ⁇ z/gene and its 5' non-coding region fragment were digested with restriction endonuclease 3 ⁇ 4o I and Hind III, and inserted into E. coli/Pseudomonas shuttle under the action of ligase.
  • the corresponding restriction site in the expression plasmid PBBR1MCS-5 was placed under the control of the phage promoter T3 prom to form a recombinant plasmid pBBRphzH and transformed into E. coli.
  • the E. coli transformants transformed with pBBRphzH were screened on gentamicin-resistant plates; finally, recombinant plasmids were extracted from E. coli and verified.
  • the engineered strain M18/pBBRphzH constructed by genetic engineering technology was inoculated on a plate of glycerol medium, activated and grown at 30 ° C for 20 hours, and then sterilized on a plate of glycerol medium again, 30 ° C After activation for 12 hours, the activated M18/pBBRphzH strain was transferred to a flask containing 25 ml of glycerol broth in a volume of 250 ml and amplified by shaking at 11 ° C for 11 hours in a shaker at 30 ° C.
  • the yield of phenazine-1-carboxylic acid amide under this formula is 300 mg per liter of phenazine-1-carboxylic acid amide, the content of phenazine-1-carboxylic acid is zero, and all phenazine-1-carboxylic acid has been Conversion to phenazine-1-carboxylic acid amide.
  • the test results showed that in the M18/pBBRphzH engineering strain, the conversion of phenazine_1-carboxylic acid to phenazine_1-carboxylic acid amide was 100%.
  • the singularity of about 2. 5 kb is obtained by the same method as in Example 1 and the entire coding region of the gene and the non-coding region of the 5' end. A non-coding region fragment at the 5' end of the gene phzH.
  • the recovered / ⁇ z/gene and its 5' non-coding region fragment were digested with restriction endonuclease 3 ⁇ 4o I and Hind III, and inserted into E. coli/Pseudomonas shuttle under the action of ligase.
  • the corresponding cleavage site of the expression plasmid PBBR1MCS-5 was expressed, and the expression of the gene was placed under the control of the phage promoter T3 prom to form a recombinant plasmid pBBRphzH and transformed into Escherichia coli.
  • E. coli transformants transformed with PBBRphzH were screened on gentamicin-resistant plates; finally, recombinant plasmids were extracted from E. coli and verified.
  • the engineering strain PAO1/pBBRphzH constructed by genetic engineering technology was inoculated on a plate of glycerol medium, activated and grown at 30 ° C for 20 hours, and then sterilized on a plate of glycerol medium again, 30 ° C After activation for 12 hours, the activated PAO1/pBBRphzH strain was transferred to a flask containing 25 ml of glycerol medium in a volume of 250 ml, and shaken for 10 hours in a shaker at 30 ° C for 11 hours.
  • the yield of phenazine-1-carboxylic acid amide was 50 mg per liter, and the content of phenazine-1-carboxylic acid was not detected.
  • the components of the glycerin medium and the broth culture solution are the same as those in the first embodiment. Under this formula, the yield of phenazine-1-carboxylic acid amide was 50 mg per liter, and the content of phenazine-1-carboxylic acid was not detected.
  • a certain amount of M18G/pME6032Phz fermentation broth and M18G/pBBRphzH fermentation broth were added to the potato glucose medium with different acidity values to obtain the final concentration of phenazine_1-carboxylic acid and phenazine diluted to 16 mg/L.
  • Potato glucose medium with different acidity values of 1-carboxylic acid amide was poured into a petri dish with a diameter of 9 cm into a plate, and a potato glucose medium plate without a fermentation broth was used as a blank control, and three replicates were set for each treatment.
  • PCA indicates phenazine-1-carboxylate Acid
  • PCN stands for phenazine-1-carboxylic acid amide.
  • PCA phenazine-1-carboxylic acid
  • the activities were 95.5%, 82.9%, 67.5%, 15.9%, and 0; the bacteriostatic activities of phenazine-1-carboxylic acid amide (PCN) were 65%, 69%, 73.6%, 80.1%, and 90%, respectively.
  • the bacteriostatic activity of phenazine-1-carboxylic acid amide against Rhizoctonia solani is stable compared with phenazine-1-carboxylic acid at a pH of 4 to 8. At the same time, the acidity value is 7.0.
  • the bacteriostatic activity of phenazine-1-carboxylic acid amide against Rhizoctonia solani is 5 times that of phenazine-1-carboxylic acid.
  • the weight of the component contained in the potato glucose medium The percentages are: 20% potato, 2% glucose, 1.5% agar, and the balance is water.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

提供了一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用，其中生物工程菌株是将phzH基因重组表达质粒转化入产吩嗪-1-羧酸的菌株后获得。携带phzH基因重组表达质粒转入生产吩嗪-1-羧酸的菌株后，实现了phzH基因的高效表达，并将吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-羧酸酰胺，所以该生物工程菌株能够生产吩嗪-1-羧酸酰胺。还进一步公开了该生物工程菌株的用途，包括发酵生产微生物源杀菌剂，还公开了该杀菌剂的制备方法与应用。吩嗪-1-羧酸酰胺的抗菌活性不受其使用条件的酸度值影响，具有更稳定的抗菌活性。

Description

一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物源农药生产技术领域， 尤其涉及一种用于生产新型微生物源杀菌剂 的生物工程菌株及其应用。
背景技术
农作物病害引起的损失幅度约占总产量的 25〜75 %， 以我国主要的粮食作物水稻为 例， 每年种植面积约 4亿亩， 按亩产量 400公斤， 水稻病害平均引起减产 10 %计， 每年造 成经济损失达 300多亿元人民币之巨， 严重威胁粮食作物的安全生产。 目前， 生产上控制 植物病害除了选用良种和改进栽培措施外， 主要依靠喷洒化学杀菌剂。 目前使用的大多化 学杀菌剂对人体和动物具有不同程度的毒害作用， 残留在植物可食部分的有害成份会对人 体健康造成潜在威胁， 已经引起政府和社会各阶层的关注； 不仅如此， 有些化学农药难以 分解， 会长期地累积在生态系统中， 造成对环境的污染， 不利于社会经济的可持续发展； 而且， 现有的化学农药对某些植物病害并不完全有效。 因此， 在努力发展新一代化学农药 的同时， 还需要大力研究和发展高效、 安全、 经济、 对环境相容性好的生物源农药。 目前， 在生产上已经推广使用的生物源农药， 其种类和数量都较少， 有些品种则由于使用年久， 引起了植物病原菌的抗药性， 防治效果不够理想。 以水稻纹枯病为例， 防治该病害的药剂 主要依赖于老牌生物源农药井岗霉素。 但是， 经过将近 40 年的长期使用， 部分水稻纹枯 病菌的融合群已产生抗药性； 而且， 井岗霉素仅对水稻纹枯病菌有效， 对其他病原菌没有 明显的防治效果， 使用范围具有很大的局限性。 生物农药促生拮抗菌 M18， 对植物病害具有高效、 安全、 广谱的杀菌作用， 与环境相 容性好， 易于在环境中解体。 该促生拮抗菌 M18已于 2000年 6月 27日在中国专利局指定 的保藏单位：北京， 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为 CGMCC NO. 04620 生物农药促生拮抗菌 M18 的制备和应用， 已经获得国家发明专利， 专利号为 00119857. 2。但是，生物农药促生拮抗菌 M18是一种活菌菌剂，其作用机理主要是通过 M18 活菌合成抗植物病害的活性成分实现对农作物植物病源菌的抑制作用， 其合成的活性成分 含量容易受到菌体本身的代谢调控机制和环境条件的影响。 因而， 对植物病害的防治效果 具有不稳定性的缺陷， 难以在农业生产中进行大规模的推广应用。 已经查明， 促生拮抗菌 M18 防治植物病害的主要活性成分是吩嗪 -1-羧酸， 从促生拮 抗菌 M18 的发酵液中提取吩嗪 -1-羧酸， 利用活性成分而不是活菌对农作物病害的防治同 样具有高效、 安全、 广谱、 与环境相容性好等特征； 同时， 能克服利用促生拮抗菌 M18防 治病害效果不稳定性的缺陷。 但是， 利用促生拮抗菌 M18 发酵， 合成活性成分吩嗪 -1-羧 酸的效价很低， 仅为每升 200毫克左右， 如何提高发酵效价， 降低使用成本， 成为开发本 产品的瓶颈所在。 近年来， 我们已经运用分子生物学的技术， 对促生拮抗菌 M18合成吩嗪 -1-羧酸的调控机制， 开展深入地研究。 在此基础上， 运用基因工程手段， 对促生拮抗菌 M18基因组中的双组分调控基因 gacA开展了定向失活突变， 获得了 M18衍生菌株 M18G, 大大提高了吩嗪 -1-羧酸的产量， 使其发酵效价达到每升 1500-1700 毫克左右。 该研究成 果的技术方法已经于 2004年在《微生物学报 44卷第 761〜765页公开， 论文题目为《假单 胞菌 gacA插入突变对藤黄绿菌素和吩嗪 -1-羧酸合成代谢的差异性调控 。 在 2006年，名 称为 "利用促生拮抗菌 M18 衍生菌株制备杀菌剂的方法" 的中国发明专利中 （专利号： ZL200610023459. 9)， 提供一种了利用促生拮抗菌 M18衍生菌株 M18G和 M18R制备杀菌剂 的方法， 利用微生物的代谢产物而非微生物活体制备杀菌剂， 通过两种衍生菌株的代谢产 物的复配， 达到提高防治效果的目的。 2009年， 我们又发明了利用工程菌株 M18G携带质 粒 pME6032Phz生产吩嗪 _1_羧酸的方法，能使吩嗪 _1_羧酸的发酵效价达到每升 5700〜6600 毫克的水平， 进一步降低生产成本， 实现在农业生产的大规模推广应用。 该项技术已经获 得国家发明专利， 专利号： ZL200910198664. 2。 以吩嗪 _1_羧酸为主要成分的微生物源杀 菌剂，我国农药命名单位已经定名为申嗪霉素。申嗪霉素原药和 1%申嗪霉素悬浮剂于 2011 年获得了农业部颁发的正式登记证 （登记号： PB20110314和 PB20110315)。 农业部已经将 申嗪霉素列入 "十二五"期间全国推广产品 （证书号： TG2011-002)。 但是， 吩嗪 -1-羧酸对病源菌的防病作用与使用时的酸度 （pH) 值密切相关， 在 pH值 7. 0的条件下， 其抗菌活性仅为 pH值 5. 0条件下的 20%， 大大降低了吩嗪 -1-羧酸在碱性 条件下的防病效果。 同时发现， 促生拮抗菌 M18及其衍生菌株 M18G的基因组中， phzi 因是一个已经发生突变的失活基因。
发明内容 本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷， 提供一种用于生产新型微生物源杀菌 剂的生物工程菌株及其应用技术。 本发明利用生产吩嗪 -1-羧酸的菌株，携带能表达 基因、编码产生 PhzH(glUtamine phenazine-l-carboxylic acid amidotransferase, 谷酰胺吩嗪 -1-羧酸酰胺转移酶， PhzH) 的重 组表达质粒， 补充并添加 基因的拷贝数， 并在工程菌株中进行表达， 将吩嗪 -1-羧酸 转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺。 吩嗪 -1-羧酸酰胺的抗菌活性不受其使用条件的酸度值影响， 从 而稳定其抗菌活性， 能更加有效地防治作物病害。 本发明首先公开了一种用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株， 为将 Ρ Ζ /基因重 组表达质粒转化入产吩嗪 -1-羧酸的菌株后获得， 所述生物工程菌株产吩嗪 -1-羧酸酰胺。 本发明还公开了所述用于生产该微生物源杀菌剂的生物工程菌株的构建方法， 包括下 列步骤：
1) 扩增^ ζ /基因片段；
2) 将扩增的 基因片段插入表达载体中构建成 ^基因重组表达质粒；
3) 将构建的/^ z /基因重组表达质粒导入产吩嗪 -1-羧酸的菌株， 构建成所述用于生产 微生物源杀菌剂的生物工程菌株。 所述 基因重组表达质粒为克隆有 phz#基因片段的重组表达质粒。 所述 phzi 因重组表达质粒能在所述产吩嗪 -1-羧酸的菌株中表达/ 基因， 编码产生 PhzH (谷酰胺 吩嗪 -1-羧酸酰胺转移酶）。 本发明所述的 ρ ζ /基因包含/^ z /基因的编码区及其非编码区。 所述的 ρ ζ /基因片段可以是完整的 ρ ζ /基因也可以是 ρ ζ /基因的一部分。 本发明 所述的 ρ ζ /基因片段应至少包含 ρ ζ /基因的完整编码区。 较佳的， 为利于高效表达为 PhzH, 所述 基因片段包含 基因的完整编码区及其 5' 端的非编码区。所述^ 基因片段所包含的 5' 端的非编码区可以为部分的或是完整的/ ^z /基因 5'端非编码区。所 述 ^基因片段所包含的 基因 5'端非编码区应当有利于 PhzH的表达。优选的，^ 基因片段所包含的 5' 端的非编码区含有自 ρ ζ/基因翻译起始密码子上游第 1位碱基始至 其上游第 683位碱基止的多核苷酸片段。 进一步的所述 PhzH为假单胞菌的 PhzH。 所述 基因片段为假单胞菌的 ^基因 片段。 优选的， 所述假单胞菌为铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ) 或绿针假单胞菌 { Pseudomonas chlororaphis) . 具体可选自铜绿假单胞菌株 PA01、 LESB58、 PA14、 PUPa3 或绿针假单胞菌株 PCL1391。 进一步的， 所述 PhzH来源于铜绿假单胞菌株 PA01。 如实施例所列举的， 其氨基酸序 列为 SEQ ID N0 : 1 :
MCGLAGWVDY TRKLDDEFPA IFAMTDTLAL RGPDAEGIWK HRNALLGHRR LAVIDLSGGV 60
QPMSYRFPTG QEVTLVYTGE VYNHDALRER LRRAGHEFRT RSDTEVVLHA YLQWGERCCE 120
YLTGMFAFAV FDGRDGHLLL VRDRLGIKPL YYARHREGLL FGSEIKSILA HPEFAARLDA 180
VGLVDLLTLS RGTSQTPFRE VQELLPGHLL SWRPNSQAKL RRYWEVRRQE HADDLQSTVQ 240
RTRELVTRAL GAQLHADVPV CSLLSGGLDS TALTGIAQRI AKAEHGGDIN SFSVDFVGQA 300
EQFRSDDLRP DQDQPFALLA AQYIGSRHRT VLIDNAELVC ERAREEVFRA KDVPFTFGDM 360
DTSLHLMFGE IRRHSTVAIS GEGADELFGG YGWFRDPQAV AAARFPWASR VRLPAGFIDA 420
GFNRRCDLLQ YQQASYDDGL RQVEHLAGDS PEERRMREFS HLHLKRWMVL LLERKDRLSM 480
CNGLEVRVPY TDHELVEYVY NVPWSIKSRD GEEKWLLKRA CADYVPEAVL KRRKSPYPTS 540
ANLGYERFLR GSVRRLLEDA VNPVFGIVSR EFLAAELEHP EGYFNTQVSR HNLETALALE 600
GWLRLYGLSA 610 进一步的， 所述/ ^z /基因片段来源于铜绿假单胞菌株 PA01基因组。 如实施例所列举 的， 其碱基序列为 SEQ ID NO : 2: gtccgaggac ccgtgcagcg ggccggtgtt cggtccgtcg acctgcgaat gcccttgagg 60 taggtcgtct ggcgggcccg gtgcagcggg cccgcttccg gatgtatcgc tcgctcgaag 120 ttgccttctt taattctcca ttccccgcgc cgccctactt ttcccgctcg tccatcgtcg 180 cgtcgaacgt tgccacgaaa tcagcgtcga tggacaactc ttatattcaa tagttgtacg 240 atctgagttt gttgtagtca tttgcttagt tggctattca tatgattgcc gtaaagcaac 300 tataagttta attggattag ccttctaagt ctttggaaag agccgtgaac gaccctgtaa 360 tatctggttg tagagccgcg taatgatgtt tcaggatatt tcattaattt tgtagattat 420 tgtttttcct ttgttttttt aaaaacagct accagattta gatagatatt aattaactcg 480 gccacgtttt ttcctgttct atcattggcc ttccttgggc gcaggcctgc cgaaactgct 540 tatcttcagg tcctcgaaaa gttcatacat cgaccgcctt gggcgaagca ttcgtacgcc 600 ggaaatctgt ccggccgcac ggatgttttc agcatgttct ctggatgagt ttcccgataa 660 gaggagtttc cctatgtgcg gtctcgcggg ttgggtggat tacacgcgca 720 agctcgacga cgaatttccg gcgatcttcg ccatgaccga tacgctcgcc atgcgcgggc 780 cggatgccga gggcatctgg aagcaccgca acgccctgct gggtcaccgg cggctggcgg 840 tcatcgacct cagcggcggc gtgcagccga tgtcctatcg ctttcccacc ggccaggagg 900 tcaccctcgt ctacaccggc gaggtgtaca accacgatgc cctgcgcgag cggttgcgcc 960 gggccggaca tgagttccgc acccgcagcg ataccgaggt ggtcctgcac gcctatctgc 1020 aatggggcga gcgttgttgc gagtacctga ccgggatgtt cgccttcgcc gtcttcgatg 1080 gccgcgacgg ccacctgctg ctggtgcgcg accgcctggg catcaagccg ctgtattacg 1140 cgcggcaccg cgagggactg ctgttcggct cggagatcaa gtccatcctg gcgcatccgg 1200 aattcgccgc caggctcgac gcggtcggcc tggtcgacct cctgacgctg tcccggggca 1260 cttcgcagac gccgttccgc gaggtccagg aactgctgcc cggccacctg ctgtcctggc 1320 gtcccaattc ccaggcgaag ttgcgccgct attgggaggt acgccgccag gagcatgccg 1380 acgacctgca gagcaccgtg cagcgcaccc gcgaactggt cacccgcgcc ctgggggcgc 1440 aattgcacgc cgacgttccg gtgtgttcgc tgctatcggg tgggctcgat tcgaccgccc 1500 tgaccggcat cgcccagcgc atcgcgaagg cggagcacgg cggcgacatc aattcattct 1560 cggtggactt cgtcggccag gccgagtagt tccgcagcga cgacctgcgt cccgaccagg 1620 accagccgtt cgccctgctg gccgcgcagt acatcggcag ccgtcatcgc accgtgctca 1680 tcgacaatgc cgaactggtc tgcgaacgag cgcgcgaaga ggtattccgg gccaaggacg 1740 tacctttcac cttcggcgac atggatacct cgctgcacct gatgttcggc gagatccgcc 1800 ggcattccac ggtggccatc tccggtgaag gcgccgacga gctgttcggt ggctacggct 1860 ggttccgcga tccgcaggcg gtggctgcgg cgcgcttccc ctgggcctcc agggtgcgcc 1920 tgccagccgg cttcatcgac gccggtttca accgccgctg cgatctcctc cagtaccagc 1980 aggccagcta cgacgatggg ctgcgccagg tcgaacacct ggccggcgac agcccggagg 2040 agcggcggat gcgcgagttc agccacctgc atctgaagcg ctggatggtg ctgctgctcg 2100 aacgcaagga tcgcctgagc atgtgcaacg gcctggaggt gcgggtgccc tacaccgacc 2160 atgagctggt ggagtacgtc tacaacgtgc cctggtcgat caagagccgg gacggcgagg 2220 agaagtggct gctcaagcgg gcctgcgccg actatgtccc ggaagccgtg ctcaagcgcc 2280 gcaagagccc ttatccgact tctgccaacc tcggctacga gcgtttcctg cgcgggagcg 2340 tgcggcgtct gctggaggac gcggcgaacc cggtgttcgg catcgtttcg cgagagttcc 2400 tggccgccga actggagcat ccggaggggt acttcaacac ccaggtgagc cgccacaacc 2460 tggagaccgc gctggcgctg gaaggctggc tcaggttgta cgggctctcc gcctga 2516 碱基序列中带有下划线并加粗的密码子分别为/ 因的起始密码子和终止密码子， 起始密码子之前的碱基为/ 因的 5 ' 端的非编码区。
进一步的， 用于构建/^ z /基因重组表达质粒的表达载体为大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表 达质粒。 为了让 基因重组表达质粒能够正确表达 ^基因，需要保证插入大肠杆菌 /假单 胞菌穿梭表达质粒多克隆位点处的 基因读码框正确。 较佳的， 为了促进 PhzH的高效表达， 所述大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒含有强启 动子， 且所述 ρ ζ /基因片段克隆于所述强启动子之后， 由该强启动子控制其表达。 所述 强启动子可为噬菌体启动子 Τ3 prom或 Τ7 prom。 在所述质粒的特定位置插入目的基因并保证目的基因的读码框正确是本技术领域的 技术人员熟知的技术。 所述大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒可为 pBBRlMCS系列质粒及其 衍生的各种表达质粒。 如实施例列举的， 所述大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒为 pBBRlMCS-5。 可以通过合适的引物设计， 扩增/ 基因片段在保证读码框正确的前提下， 置于 pBBRlMCS-5的噬菌体启动子 T3 prom控制下获得基因重组表达质粒 pBBRphzH。 所述产吩嗪 -1-羧酸的菌株是指可经发酵生产吩嗪 -1-羧酸的野生型菌株及其衍生的 工程菌株。 进一步的， 所述产吩嗪 -1-羧酸的菌株属于假单胞菌， 如 M18、 M18G。 所述 M18的保藏号为 CGMCC NO. 0462 , 为一种生物农药促生拮抗菌， 可活菌合成抗植 物病害的活性成分吩嗪 -1-羧酸， M18为现有技术。 所述 M18G菌株为 M18 ( CGMCC NO. 0462 ) 的衍生菌株， 为现有技术。 其制备方法已为 公知， 如 2004年在《微生物学报 44卷第 761〜765页， 《假单胞菌 gacA插入突变对藤黄 绿菌素和吩嗪 -1-羧酸合成代谢的差异性调控》。 相比 M18， M18G 的吩嗪 -1-羧酸的产量获 得了很大的提升， 因此， 本发明优选的产吩嗪 -1-羧酸工程菌株为 M18G。 由于产吩嗪 -1-羧酸的野生型菌株及其衍生的工程菌株能产生吩嗪 -1-羧酸，所述/ ^z / 基因重组表达质粒又能在产吩嗪 -1-羧酸工程菌株中表达 ρ ζ /基因， 其编码产物谷酰胺吩 嗪 -l-羧酸酰胺转移酶能将吩嗪 -l-羧酸酰胺化，合成吩嗪 -1-羧酸酰胺 （吩嗪 -1-羧酸酰胺 的分子结构式见图 1)， 因此， 本发明所述生物工程菌株的代谢产物中含有吩嗪 -1-羧酸酰 胺。 ρ ζ/基因重组表达质粒导入产吩嗪 -1-羧酸工程菌株的方法为常规转化或转导方法。 本发明的用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株可用于发酵生产本发明的微生物 源杀菌剂。 本发明进一步提供了一种微生物源杀菌剂， 所述微生物源杀菌剂为本发明的生物工程 菌株的发酵液。 所述发酵液中， 主要的杀菌活性成分为吩嗪 -1-羧酸酰胺。 此外， 还含有微量的杀菌 活性成分藤黄绿菌素。 进一步的， 所述发酵液中， 吩嗪 -1-羧酸酰胺的含量为每升 2500〜2800毫克。 本发明进一步公开了所述微生物源杀菌剂的制备方法， 为在合适表达吩嗪 -1-羧酸及 PhzH的条件下， 发酵培养本发明的生物工程菌株后获得。 进一步的， 所述微生物源杀菌剂的制备方法包括下列步骤：
1. 工程菌株的活化；
2. 种子扩大培养： 先在甘油培养液中摇瓶培养后， 转接入产素培养液中放大发酵培 养获得发酵液。 所述工程菌株活化可采用固体甘油培养基活化培养。 所述的甘油培养液中含有的组分重量百分比为： 蛋白胨 1.8〜2.2%、 甘油 1.3〜1.7 %、 硫酸镁 0.05〜0.1%、 磷酸二氢钾 0.01〜0.05%、 余量为水， pH 6.8〜7.2。 所述的固体甘油培养基中含有的组分重量百分比为： 蛋白胨 1.8〜2.2%、 甘油 1.3〜 1.7%、硫酸镁 0.05〜0.1%、磷酸二氢钾 0.01〜0.05%、琼脂 1.2-1.5%、余量为水， pH6.8〜 7.2。 所述的产素培养液的组分重量百分比为： 蛋白胨 2.2〜3.0%、 葡萄糖 2.0〜2.5%、 硝酸钾 0.5〜0.7%、 余量为水， pH6.5〜7.0。 较佳的， 工程菌株的活化条件为： 将工程菌接入甘油培养基平板， 在 26〜30°C下， 活化生长 20〜24小时； 而后再次在甘油培养基的平板上划菌块， 26〜3(T C下活化 10〜12 小时。 较佳的， 所述种子扩大培养中， 在甘油培养液中摇瓶培养条件为： 将活化后的菌株接 入甘油培养液、 26〜30° C振荡培养 9〜11小时。 震荡培养时， 摇床转速可为 160〜180转 / 分。 较佳的， 所述种子扩大培养中， 接入产素培养液中放大发酵培养的条件为： 将甘油培 养液中摇瓶培养的菌株转接入含有产素培养液中， 在 26〜30° C下发酵培养 60〜72小时。 发酵培养时， 摇床转速可为 160〜180转 /分。 本发明所述微生物源杀菌剂可用于防治植物病害或用于制备防治植物病害的药剂。 进一步的， 用于对农作物进行喷雾或灌根施用， 防治水稻纹枯病、 水稻白叶枯病、 水 稻稻曲病、 小麦赤霉病、 黄瓜枯萎病、 西瓜枯萎病、 甜瓜蔓枯病、 棉花枯萎病、 炭疽病、 立枯病和各种腐霉或疫霉引起的植物病害。 本发明还进一步公开了一种防治植物病害的药剂， 含有杀菌有效量的本发明所述微生 物源杀菌剂或其杀菌活性成分。 可将本发明的用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株的发酵液直接用作防治植物 病害的药剂； 也可将所述发酵液常规方法干燥成粉后作为杀菌活性成分原料与其他常规辅 料一并配置防治植物病害的药剂； 或者， 也可将发酵液中的主要杀菌活性成分吩嗪 -1-羧 酸酰胺分离出后， 作为杀菌活性成分原料用于配制防治植物病害的药剂。 本发明利用产吩嗪 -1-羧酸的基因工程菌株携带重组表达载体， 生产吩嗪 -1-羧酸酰胺 的方法的优点是：
1 抗菌活性稳定性好， 不受酸度影响。 利用本发明生产的吩嗪 -1-羧酸酰胺， 不仅具 有高效的抗真菌能力， 而且在 pH值 4. 0至 8. 0的范围内， 不受使用环境的酸度影响， 无 论在种植在酸性还是碱性环境中的作物上使用， 都能获得稳定的防治效果。
2 转化率高。本发明中通过构建携带/^ z /基因的完整编码区及其 5 ' 端的非编码区的 基因重组质粒，将宿主中的吩嗪 -1-羧酸转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺。在优选方案中，由于/ ^z / 基因及其 5 ' 端的非编码区片段置于噬菌体强启动子 T3 prom的控制下高效表达， 同时重 组质粒在宿主 M18G具有多个拷贝， 在宿主 M18G中 基因能大量表达并合成酰胺化酶， 将吩嗪 -l-羧酸全部转化为吩嗪 -l-羧酸酰胺， 转化效率可达 100%。
3 生产成本低， 经济效益高。 运用本发明生产吩嗪 -1-羧酸酰胺， 除了研制和构建工 程菌株所耗费的一次性的前期成本外， 一旦实施产业化生产， 除了消耗培养基外， 不需要 进一步的添加其他原料和消耗额外的能量， 随着生产规模的扩大和延续， 单位产量的平均 生产成本不断下降， 利于在农业生产中获得大规模推广应用。
4 实现清洁生产， 保护环境。 运用生物技术发酵生产吩嗪 -1-羧酸酰胺， 能将全部吩 嗪 -1-羧酸转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺， 在生产过程中， 除了消耗培养基外， 不使用其它特殊 的原料， 也不形成任何其它的中间产物。 所以， 不会产生新的污染物释放到环境中去， 能 实现清洁生产， 保护环境生态。 附图说明
图 1为本发明中吩嗪 -1-羧酸酰胺的分子结构式。
图 2为本发明中质粒 pBBRphzH的构建示意图。
本发明涉及一种利用工程菌株 M18G携带质粒 pBBRphzH生产吩嗪 _1_羧酸酰胺的方法， 从铜绿假单胞菌 PA01基因组中扩增出 ρ ζ /基因及其 5'端的非编码区片段， 并将该片段插 入表达质粒 pBBRlMCS-5 中， 置于噬菌体启动子 T3 prom 的控制下， 构建成重组质粒 pBBRphzH; 然后将该重组质粒导入促生拮抗菌 M18的衍生菌株 M18G中， 构建成基因工程 菌株 M18G/pBBRphzH。该工程菌株实现了谷酰胺吩嗪 -1-羧酸酰胺转移酶 PhzH的高效稳定表 达。 最后将基因工程菌株 M18G/pBBRphzH在培养液中培养， 高效稳定地生产吩嗪 _1_羧酸 酰胺。 利用本发明的高产基因工程菌株制备吩嗪 -1-羧酸酰胺， 其防治病害的效果不受酸 度条件影响， 其生产成本能进一步降低， 无论在酸性或碱性环境使用， 都有效地防治植物 病害。
图 3为相同浓度的吩嗪 -1-羧酸 （PCA) 和吩嗪 -1-羧酸酰胺 (PCN)， 在不同酸度条件的 马铃薯葡萄糖培养基中，对水稻纹枯病菌的抑菌活性的比较结果图。 实验中采用的马铃薯 葡萄糖培养基成分的重量百分比为， 马铃薯 20%， 葡萄糖 2%， 琼脂粉 1. 2%， 余量为水。 具体实施方式
本发明优选的实施例利用促生拮抗菌 M18的衍生菌株 M18G携带重组质粒 pBBRphzH的 方法构建基因工程菌株 M18G/pBBRphzH，在 M18G菌株中补充并添加 基因的完整编码区 及其 5'端的非编码区片段的拷贝数， 将吩嗪 -1-羧酸转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺， 以生产吩嗪 -1-羧酸酰胺。 本发明优选的实施例从铜绿假胞菌株 PA01中扩增出 ρ ζ/基因的完整编码区及其 5'端 的非编码区片段， 并将该片段插入表达质粒 pBBRlMCS-5 中， 置于噬菌体启动子 T3 prom 的控制下， 构建成重组质粒 pBBRphzH; 然后， 将该重组质粒 pBBRphzH导入促生拮抗菌 M18 的衍生菌株 M18G中， 构建成基因工程菌株 M18G/pBBRphzH， 该工程菌株能够实现 基 因的高效稳定表达。 最后， 基因工程菌株 M18G/pBBRphzH在培养液中培养， 高效稳定地生 产吩嗪 -1-羧酸酰胺， 而不是吩嗪 -1-羧酸， 吩嗪 -1-羧酸酰胺的产量达到每升 2500〜2800 毫克的水平。 在 pH等于或大于 7.0的条件下， 吩嗪 -1-羧酸酰胺的抗水稻纹枯病的活性， 与吩嗪 -1-羧酸相比， 提高了 5 倍以上。 按此抗菌活性推算， 单位体积发酵液中生产的吩 嗪 -1-羧酸酰胺的抗菌活性大大超过吩嗪 -1-羧酸的抗菌活性。 本发明构建基因工程菌株 M18G/pBBRphzH及利用该菌株生产吩嗪 _1_羧酸酰胺的具体 方案为：
1、 扩增^ z/基因及其 5'端的非编码区片段。 设计一对引物， 引物的核苷酸序列如下：
正向： 5' - CGCGCTCGAGGTCCGAGGACCCGTGCAGC- 3， (SEQ ID NO: 3) 反向： 5' - CGCGAAGCTTTCAGGCGGAGAGCCCGTAC- 3， (SEQ ID NO: 4) 序列中下划线为限制性内切酶 ¾0I、 /i2t III的酶切位点；然后以铜绿假单胞菌 PA01 基因组 DNA为模板， 利用 DNA聚合酶 7¾和设计的引物， 扩增^ z/基因及其 5'端的非 编码区片段， 扩增产物通过琼脂糖电泳检测， 回收长度为 2.5kb的 ρ ζ/基因及其 5'端的 非编码区片段。
2、 构建重组质粒 pBBRphzH 将回收的基因扩增片段/^ z/及其 5'端的非编码区， 经限制性内切酶 ¾oI、 Hind III 酶切， 在连接酶的作用下， 插入大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒 PBBR1MCS-5中的相应酶 切位点， 将 ρ ζ/基因的完整编码区及其 5'端的非编码区的表达置于噬菌体启动子 Τ3 prom 控制下， 形成重组质粒 pBBRphzH并转化进入大肠杆菌； 在庆大霉素抗性平板上， 筛出经 pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子； 从大肠杆菌中提取构建的基因重组质粒 PBBRphzH。 3、 构建基因工程菌株 M18G/pBBRphzH。 制备促生拮抗菌 M18衍生菌株 M18G的感受态细胞， 并将上述基因重组质粒 pBBRphzH 转化到 M18G的感受态细胞中， 在 28〜37 C条件下， 培养 1〜2天， 从中筛选出基因工程 菌株 M18G/pBBRphzH0
4、 基因工程菌株 M18G/pBBRphzH的培养。 将基因工程菌株 M18G/pBBRphzH接种在甘油培养基的平板上， 在 26〜30° C下， 活化 生长 20〜24小时， 再次在甘油培养基的平板上划菌块， 26〜30° C下活化 10〜12小时， 然 后将活化的 M18G/pBBRphzH菌块， 转接到含有 25毫升甘油培养液、 体积为 250毫升的三 角瓶中， 在 26〜3(T C的摇床中振荡培养 9〜11小时， 摇床转速为 160〜180转 /分； 最后 转接到含有 65毫升的产素培养液、 体积为 500毫升的三角瓶中， 进行放大发酵培养， 温 度和转速不变， 发酵时间为 60〜72小时， 得到吩嗪 -1-羧酸酰胺的产量为每升 2500〜2800 毫克。
下面结合实施例进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明， 而非限 制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照 常规条件如分子克隆试验手册中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配制。 以下实施 例不构成对本发明的限定。 实施例 1
1、 扩增/ ^z /基因及其 5'端的非编码区片段
设计一对引物， 用以扩增/^ /基因及其 5'端的非编码区片段， 引物的核苷酸序列 如下：
正向： 5 ' - CGCGCTCGAGGTCCGAGGACCCGTGCAGC- 3， 反向： 5 ' - CGCGAAGCTTTCAGGCGGAGAGCCCGTAC- 3， 序列中带有下划线的核苷酸为限制性内切酶^¾。 I、 I I I的酶切位点。 该引物委 托上海生工生物工程有限公司合成。 然后， 以铜绿假单胞菌 PA01基因组 DNA为模板， 利用 DNA聚合酶 7¾ ^和上述设计 的引物， 扩增/ ^z /基因的完整编码区及其 5'端的非编码区的片段， 产物通过 0. 7%琼脂糖 电泳检测， 回收长度约为 2. 5kb的 ρ ζ /基因的完整编码区及其 5'端的非编码区的片段， 基因片段经核苷酸测序验证为准确。 其中， 所述铜绿假单胞菌 PA01基因组 DNA的制备利 用 AxyPr印细菌基因组 DNA试剂盒进行， 基因片段的回收利用 AxyPrep DNA凝胶回收试剂 盒进行，均由爱思进生物技术（杭州）有限公司提供，产品目录号分别为 AP-MN-BT-GDNA-4 和 AP-GX-50; 所述基因扩增反应的条件以及琼脂糖电泳， 分别按照 J.萨姆布鲁克、 D. W. 拉塞尔编著， 2002年科学出版社出版的 《分子克隆实验指南 （第三版）》， 第 8章第 611〜 618页和第 5章第 387〜400页中所述的方法进行。 其中， 所使用的 DNA聚合酶 LA 7¾ ^和 基因扩增试剂盒， 购自 TAKARA 公司上海代理公司， 产品目录号： DRR002AG。 琼脂糖购自 GENE TECH公司上海代理公司。 基因片段 （/^^及其 5'端的非编码区） 的核苷酸测序验证 委托上海英骏生物技术有限公司完成， 测序结果证实基因片段含 SEQ ID NO : 2， 其编码的 蛋白氨基酸序列为 SEQ ID N0 : 1。
2、 构建重组质粒 pBBRphzH 将步骤 1中回收的基因扩增片段 (ρ ζ /及其 5'端的非编码区），经限制性内切酶 ¾o I、 酶切后， 在连接酶的作用下， 插入大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒 pBBRlMCS-5 中相应的位点， 并将基因 pkzHR 5'端的非编码区片段的表达置于噬菌体启动子 T3 prom 控制下， 形成重组质粒 pBBRphzH并转化进入大肠杆菌。 在庆大霉素抗性平板上， 筛出经 pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子； 最后， 从大肠杆菌转化子中提取构建的基因重组质粒 pBBRphzH并验证。 构建的基因重组质粒 pBBRphzH如图 2所示， 含有 基因的完整编码区及其 5'端的 非编码区片段经限制性酶 o I、ffi ^ I I I酶切后，在连接酶的作用下，插入质粒 pBBRlMCS-5 中的相应酶切位点， 置于噬菌体启动子 T3 prom的控制下， 构建成重组质粒 PBBRphzH。 图 2中： 4766bp表示质粒 pBBRlMCS-5的长度， 为 4766个碱基对； 图中， 代表谷酰胺吩 嗪 -1-羧酸酰胺转移酶编码基因； 〃为基因缩短片段的符号； ¾o I、 I I I为限制性内 切酶位点； 图中的数字表示连接到 pBBRlMCS-5质粒中的 基因的编码序列及其 5 ' 非 编码区的核苷酸序列的长度， 分别为 1833bp和 683bp; Gm为质粒 pBBRlMCS-5中抗庆大霉 素的选择标记基因； T3 prom和 T7 prom为两个噬菌体启动子； mob所标记的为质粒转移 所需要的基因； rep所标记的为质粒的复制所需要的序列； acZ所标记的基因编码大肠杆 菌的 lacZ' 基因所编码的 a -肽链。 上述基因片段定向插入质粒、 感受态大肠杆菌的制备、 转化以及重组质粒的提取和验 证分别按照 J.萨姆布鲁克、 D. W.拉塞尔编著， 2002 年科学出版社出版的 《分子克隆实验 指南 （第三版）》， 第 1章第 68〜71页和第 96〜99页及第 8章第 663〜666页中所述的方 法进行。 其中： 质粒 PBBR1MCS-5 质粒由上海交通大学生命科学技术学院提供。 限制性内 切酶和连接酶， 均购自深圳中晶生物技术有限公司。 大肠杆菌中重组质粒的提取， 采用 B 型少量质粒快速提取试剂盒， 由北京博大泰克生物基因技术有限责任公司提供， 产品目录 号： MK014-2。 重组质粒的验证所使用的限制性酶、 DNA聚合酶 和基因扩增试剂盒， 均购自 TAKARA公司上海代理公司， 产品目录号： DRR002AG。 琼脂糖购自 GENE TECH公司 上海代理公司。
3、 构建基因工程菌株 M18G/pBBRphzH 制备促生拮抗菌 M18衍生菌株 M18G的感受态细胞， 并将上述重组质粒 pBBRphzH转化 到 M18G 的感受态细胞中， 在 28 C 条件下， 培养 2 天， 从中筛选出基因工程菌株 M18G/pBBRphzH0 促生拮抗菌 M18衍生菌株 M18G的感受态细胞的制备方法、 重组质粒 pBBRphzH转化到 M18G的感受态细胞以及高效生产吩嗪 -1-羧酸酰胺的基因工程菌株 M18G/pBBRphzH的筛选 方法， 均按照 J.萨姆布鲁克、 D. W.拉塞尔编著， 2002 年科学出版社出版的 《分子克隆实 验指南 （第三版）》， 第 1章第 96〜99页中所述的方法进行。
4、 基因工程菌株 M18G/pBBRphzH的培养 将基因工程菌株 M18G/pBBRphzH接种在甘油培养基平板上， 在 26° C下活化生长 24小 时， 然后再次在甘油培养基的平板上划菌块， 26° C 下活化 10 小时， 然后， 将活化的 M18G/pBBRphzH菌块转接到含有 25毫升甘油培养液、体积为 250毫升的三角瓶中，在 26° C 的摇床中振荡培养 9小时，摇床转速为 160转 /分；最后转接到含有 65毫升的产素培养液、 体积为 500 毫升的特殊三角瓶中， 进行放大发酵培养， 温度和转速不变， 发酵时间为 60 小时， 在发酵液中， 获得的吩嗪 -1-羧酸酰胺含量为每升 2500 毫克， 检测不出吩嗪 -1-羧 酸的含量， 表明全部吩嗪 -1-羧酸已经转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺， 检测结果表明吩嗪 -1-羧 酸转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺的转化率为 100%。 其中， 所述甘油培养液中含有的组分重量百分比为： 蛋白胨 1. 8 %、 甘油 1. 3 %、 硫 酸镁 0. 07 %、 磷酸二氢钾 0. 03 %、 余量为水， pH7. 0。 所述甘油培养基 （固体） 中还含有 琼脂 1. 5 %。 所述的产素培养液的组分重量百分比为： 蛋白胨 2. 2 %、 葡萄糖 2. 0 %、 硝酸 钾 0. 5 %、 余量为水， pH6. 8。 在此配方下， 65毫升的 M18G/pBBRphzH发酵液中获得吩嗪 _1_羧酸酰胺产量为 162. 5 毫克， 吩嗪 -1-羧酸的含量为零， 按一定比例稀释，配置每升含有 16毫克吩嗪 -1-羧酸酰胺 的马铃薯葡萄糖培养基（PH7. 0)， 同时按一定比例稀释 M18G/pME6032Phz 发酵液 ( ZL200910198664. 2 记载） ，配置每升含有 16 毫克吩嗪 _1_羧酸的马铃薯葡萄糖培养基 (pH7. 0)， 以不加发酵液的马铃薯葡萄糖培养基 (pH7. 0)为对照，分别测定水稻纹枯病菌在 各种马铃薯葡萄糖培养基 (pH7. 0)中的生长速率，并按照实施例 6的计算方法，计算吩嗪 -1- 羧酸酰胺和吩嗪 -1-羧酸的抑菌活性， 按照在相同 PH7. 0 条件下的生物活性计算， 每升 M18G/pBBRphzH发酵液获得吩嗪 _1_羧酸酰胺产量相当于吩嗪 _1_羧酸 12500毫克的抑菌效 果， 抑菌活性提高了约 1. 9倍。
实施例 2
1、 采用与实施例 1相同的方法扩增/^ z /基因的完整编码区及其 5'端的非编码区， 产 物通过 1. 0%琼脂糖电泳检测， 回收获得长度约为 2. 5kb的 ρ ζ /基因及其 5'端的非编码区 片段。
2、 将回收的/^ ζ /基因及其 5'端的非编码区片段， 经限制性内切酶 ¾o I、 Hind I I I 酶切， 连接酶连接， 插入大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒 PBBR1MCS-5, 并将 基因及 其 5'端的非编码区片段的表达置于噬菌体启动子 T3 prom控制下， 形成重组质粒 pBBRphzH 并转化进入大肠杆菌。 在庆大霉素抗性平板上， 筛出经 PBBRphzH转化的大肠杆菌转化子； 最后， 从大肠杆菌转化子中提取重组质粒并验证。
3、 制备促生拮抗菌 M18衍生菌株 M18G的感受态细胞， 并将上述重组质粒 pBBRphzH 转化到 M18G的感受态细胞中， 在 30° C条件下， 培养 1天。 促生拮抗菌 M18衍生菌株 M18G的感受态细胞的制备方法、 重组质粒 pBBRphzH转化到 M18G的感受态细胞以及高效生产吩嗪 -1-羧酸酰胺的基因工程菌株 M18G/pBBRphzH的筛选 方法， 均同实施例 1。
4、 将基因工程菌株 M18G/pBBRphzH接种在甘油培养基的平板上， 在 28° C下活化生长 22 小时， 然后再次在甘油培养基的平板上划菌块， 28° C 下活化 11 小时， 然后将活化的 M18G/pBBRphzH菌块转接到含有 25毫升甘油培养液、体积为 250毫升的三角瓶中，在 28° C 的摇床中振荡培养 10小时， 摇床转速为 170转 /分； 最后转接到含有 65毫升的产素培养 液、 体积为 500 毫升的三角瓶中， 进行放大发酵培养， 温度和转速不变， 发酵时间为 66 小时， 在发酵液中， 得到吩嗪 -1-羧酸酰胺含量为每升 2700毫克，检测不出吩嗪 -1-羧酸的 含量， 表明全部吩嗪 -1-羧酸已经转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺， 检测结果表明吩嗪 -1-羧酸转 化为吩嗪 -1-羧酸酰胺的转化率为 100%。 其中， 所述甘油培养基中含有的组分重量百分比为： 蛋白胨 2.2%、 甘油 1.7%、 硫 酸镁 0.05%、 磷酸二氢钾 0.01%、 余量为水， pH 7.2。 所述甘油培养基 （固体） 中还含 有琼脂 1.5%。 所述产素培养液的组分重量百分比为： 蛋白胨 2.2%、 葡萄糖 2.5%、 硝酸 钾 0.5%、 余量为水， pH7.2。 在此配方下， 65毫升的 M18G/pBBRphzH发酵液中获得吩嗪 _1_羧酸酰胺产量为 175.5 毫克， 吩嗪 -1-羧酸的含量为零， 按一定比例稀释，配置每升含有 16毫克吩嗪 -1-羧酸酰胺 的马铃薯葡萄糖培养基（PH7.0)， 同时按一定比例稀释 M18G/pME6032Phz 发酵液 (ZL200910198664.2 记载） ，配置每升含有 16 毫克吩嗪 _1_羧酸的马铃薯葡萄糖培养基 (pH7.0)， 以不加发酵液的马铃薯葡萄糖培养基 (pH7.0)为对照，分别测定水稻纹枯病菌的 在各种马铃薯葡萄糖培养基 (PH7.0)中的生长速率，并按照实施例 6 的计算方法，计算吩嗪 -1-羧酸酰胺和吩嗪 -1-羧酸的抑菌活性， 按照在相同 PH7.0条件下的抑菌活性计算， 每升 M18G/pBBRphzH发酵液获得吩嗪 _1_羧酸酰胺的产量相当于吩嗪 _1_羧酸 13500毫克的抑菌 效果， 抑菌活性提高了约 2.1倍。
实施例 3
1、 采用与实施例 1相同的方法扩增/^ z/基因的完整编码区及其 5'端的非编码区， 产 物通过 1.0%琼脂糖电泳检测， 回收获得长度约为 2.5kb的基因 phzH 5'端的非编码区 片段。
2、 将回收的/^ z/基因及其 5'端的非编码区片段， 经限制性内切酶 ¾o I、 Hind III 酶切， 在连接酶的作用下， 插入大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒 PBBR1MCS-5中相应的酶 切位点， 置于噬菌体启动子 T3 prom控制下， 形成重组质粒 pBBRphzH并转化进入大肠杆 菌。 在庆大霉素抗性平板上， 筛出经 pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子； 最后， 从大肠杆 菌中提取重组质粒并验证。
3、制备促生拮抗菌 M18的衍生菌株 M18G的感受态细胞， 并将上述重组质粒 pBBRphzH 转化到 M18G的感受态细胞中， 在 32 C条件下， 培养 2天， 从中筛选出高效生产吩嗪 _1_ 羧酸酰胺的基因工程菌株 M18G/pBBRphzH。 促生拮抗菌 M18衍生菌株 M18G的感受态细胞的制备方法、 重组质粒 pBBRphzH转化到 M18G的感受态细胞以及高效生产吩嗪 -1-羧酸酰胺的基因工程菌株 M18G/pBBRphzH的筛选 方法， 均同实施例 1。
4、将利用基因工程技术构建的工程菌株 M18G/pBBRphzH，接种在甘油培养基的平板上， 在 30° C下活化生长 20小时， 然后再次在甘油培养基的平板上划菌块， 30° C下活化 12小 时， 然后将活化的 M18G/pBBRphzH菌株转接到含有 25毫升甘油培养液、 体积为 250毫升 的三角瓶中放大， 在 30° C的摇床中振荡培养 11小时， 摇床转速为 180转 /分； 最后转接 到含有 65毫升的产素培养液、 体积为 500毫升的三角瓶中， 进行放大发酵培养， 温度和 转速不变， 发酵时间为 72小时， 在发酵液中， 得到吩嗪 -1-羧酸酰胺产量为每升 2800毫 克，检测不出吩嗪 -1-羧酸的含量， 表明全部吩嗪 -1-羧酸已经转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺， 检 测结果表明吩嗪 -1-羧酸转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺的转化率为 100%。 其中， 所述甘油培养基中含有的组分重量百分比为： 蛋白胨 2. 0 %、 甘油 1. 5 %、 硫 酸镁 0. 1 %、 磷酸二氢钾 0. 05 %、 余量为水， pH6. 8; 所述甘油培养基 （固体） 中还含有 琼脂 1. 5 %。 所述的产素培养液的组分重量百分比为： 蛋白胨 3. 0 %、 葡萄糖 2. 5 %、 硝 酸钾 0. 8 %、 余量为水， pH7. 0。 在此配方下， 65毫升的 M18G/pBBRphzH发酵液中获得吩嗪 _1_羧酸酰胺产量为 182毫 克， 吩嗪 -1-羧酸的含量为零， 按一定比例稀释，配置每升含有 16毫克吩嗪 -1-羧酸酰胺的 马铃薯葡萄糖培养基（PH7. 0)， 同时按一定比例稀释 M18G/pME6032Phz 发酵液 ( ZL200910198664. 2 记载） ，配置每升含有 16 毫克吩嗪 _1_羧酸的马铃薯葡萄糖培养基 (pH7. 0)， 以不加发酵液的马铃薯葡萄糖培养基 (pH7. 0)为对照，分别测定水稻纹枯病菌的 生长速率，并按照实施例 6的计算方法，计算吩嗪 -1-羧酸酰胺和吩嗪 -1-羧酸的抑菌活性， 按照在相同 PH7. 0条件下的抑菌活性计算， 每升 M18G/pBBRphzH发酵液获得吩嗪 _1_羧酸 酰胺产量相当于吩嗪 -1-羧酸 14000毫克的抑菌效果， 抑菌活性提高了约 2. 2倍。 实施例 4
1、 采用与实施例 1相同的方法扩增/^ z /基因的完整编码区及其 5'端的非编码区， 产 物通过 1. 0%琼脂糖电泳检测， 回收获得长度约为 2. 5kb的基因 phzH 5'端的非编码区 片段。
2、 将回收的/^ z /基因及其 5'端的非编码区片段， 经限制性内切酶 ¾o I、 Hind I I I 酶切， 在连接酶的作用下， 插入大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒 PBBR1MCS-5中相应的酶 切位点， 置于噬菌体启动子 T3 prom控制下， 形成重组质粒 pBBRphzH并转化进入大肠杆 菌。 在庆大霉素抗性平板上， 筛出经 pBBRphzH转化的大肠杆菌转化子； 最后， 从大肠杆 菌中提取重组质粒并验证。
3、 制备促生拮抗菌 M18株的感受态细胞， 并将上述重组质粒 pBBRphzH转化到 M18的 感受态细胞中， 在 32° C条件下， 培养 2天， 从中筛选出生产吩嗪 -1-羧酸酰胺的基因工程 菌株 M18/pBBRphzHo 促生拮抗菌 M18株的感受态细胞的制备方法、 重组质粒 pBBRphzH转化到 M18的感受 态细胞以及生产吩嗪 -1-羧酸酰胺的基因工程菌株 M18/pBBRphzH 的筛选方法， 均按照 J. 萨姆布鲁克、 D. W.拉塞尔编著， 2002年科学出版社出版的《分子克隆实验指南（第三版）》， 第 1章第 96〜99页中所述的方法进行。
4、将利用基因工程技术构建的工程菌株 M18/pBBRphzH， 接种在甘油培养基的平板上， 在 30° C下活化生长 20小时， 然后再次在甘油培养基的平板上划菌块， 30° C下活化 12小 时， 然后将活化的 M18/pBBRphzH菌株转接到含有 25毫升甘油培养液、 体积为 250毫升的 三角瓶中放大， 在 30° C的摇床中振荡培养 11小时， 摇床转速为 180转 /分； 最后转接到 含有 65毫升的产素培养液、 体积为 500毫升的三角瓶中， 进行放大发酵培养， 温度和转 速不变， 发酵时间为 72小时， 在发酵液中， 得到吩嗪 -1-羧酸酰胺产量为每升 300毫克， 检测不出吩嗪 -1-羧酸的含量。 其中， 所述甘油培养基及产素培养液的组分同实施例 1。 在此配方下的吩嗪 -1-羧酸酰胺产量为每升产吩嗪 -1-羧酸酰胺 300 毫克， 吩嗪 -1-羧 酸的含量为零， 全部吩嗪 -1-羧酸已经转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺。 检测结果表明在 M18/pBBRphzH工程菌株中， 吩嗪 _1_羧酸转化为吩嗪 _1_羧酸酰胺的转化率为 100%。 实施例 5
1、 采用与实施例 1相同的方法扩增/^ z /基因的完整编码区及其 5'端的非编码区， 产 物通过 1. 0%琼脂糖电泳检测， 回收获得长度约为 2. 5kb的基因 phzH 5'端的非编码区 片段。
2、 将回收的/^ z /基因及其 5'端的非编码区片段， 经限制性内切酶 ¾o I、 Hind I I I 酶切， 在连接酶的作用下， 插入大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒 PBBR1MCS-5中相应的酶 切位点， 将/^ ^基因的表达置于噬菌体启动子 T3 prom控制下， 形成重组质粒 pBBRphzH 并转化进入大肠杆菌。 在庆大霉素抗性平板上， 筛出经 PBBRphzH转化的大肠杆菌转化子； 最后， 从大肠杆菌中提取重组质粒并验证。
3、制备铜绿假单胞菌 PA01株的感受态细胞，并将上述重组质粒 pBBRphzH转化到 PA01 的感受态细胞中， 在 32° C条件下， 培养 2天， 从中筛选出生产吩嗪 -1-羧酸酰胺的基因工 程菌株 PA01 /pBBRphzH 铜绿假单胞菌 PA01株的感受态细胞的制备方法、 重组质粒 pBBRphzH转化到 PA01的 感受态细胞以及生产吩嗪 -1-羧酸酰胺的基因工程菌株 PAOl/pBBRphzH 的筛选方法， 均按 照 J.萨姆布鲁克、 D. W.拉塞尔编著， 2002 年科学出版社出版的 《分子克隆实验指南 （第 三版）》， 第 1章第 96〜99页中所述的方法进行。
4、将利用基因工程技术构建的工程菌株 PAOl/pBBRphzH,接种在甘油培养基的平板上， 在 30° C下活化生长 20小时， 然后再次在甘油培养基的平板上划菌块， 30° C下活化 12小 时， 然后将活化的 PAOl/pBBRphzH菌株转接到含有 25毫升甘油培养液、 体积为 250毫升 的三角瓶中放大， 在 30° C的摇床中振荡培养 11小时， 摇床转速为 180转 /分； 最后转接 到含有 65毫升的产素培养液、 体积为 500毫升的三角瓶中， 进行放大发酵培养， 温度和 转速不变， 发酵时间为 72小时， 在发酵液中， 得到吩嗪 -1-羧酸酰胺产量为每升 50毫克， 检测不出吩嗪 -1-羧酸的含量。 其中， 所述甘油培养基及产素培养液的组分同实施例 1。 在此配方下， 得到吩嗪 -1-羧酸酰胺产量为每升 50 毫克， 检测不出吩嗪 -1-羧酸的含 量， 全部吩嗪 -1-羧酸已经转化为吩嗪 -1-羧酸酰胺， 检测结果表明在工程菌株 PAOl/pBBRphzH中， 吩嗪 _1_羧酸转化为吩嗪 _1_羧酸酰胺的转化率为 100%。 实施例 6: 吩嗪 -1-羧酸酰胺发酵产物抗菌活性稳定性检测 用磷酸盐-柠檬酸缓冲液将马铃薯葡萄糖培养基的酸度值分别调节为 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0。 在不同酸度值的马铃薯葡萄糖培养基中， 分别加入一定量的 M18G/pME6032Phz 发酵液和 M18G/pBBRphzH发酵液， 获得最终含有浓度分别稀释为 16毫克 /升的吩嗪 _1_羧 酸和吩嗪 -1-羧酸酰胺的不同酸度值的马铃薯葡萄糖培养基， 倒入直径为 9cm 的培养皿中 成平板， 以不加发酵液的马铃薯葡萄糖培养基平板为空白对照， 每个处理设置三个重复； 在平板中央接入直径为 8mm的水稻纹枯病的病原菌菌丝块， 置于 28°C恒温培养箱中培养; 待空白对照中的病原菌丝长满整个平皿时， 采用十字交叉法分别测定接种在各种马铃薯葡 萄糖培养基中的菌块的直径。 抑菌率即对真菌生长的抑制效率的计算方法为： 抑菌率 = (1-(Z-A ) /Ol/-A )) X100%。 式中： 表示处理组的菌丝块平均直径； Α„表示菌丝块的 初始直径； 表示对照的菌丝块的平均直径。分析结果如图 3所示，其中 PCA表示吩嗪 -1- 羧酸， PCN表示吩嗪 -1-羧酸酰胺。 结果表明在酸度值为 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0的条件 下吩嗪 -1-羧酸 (PCA)对水稻纹枯病菌的抑菌活性分别为 95.5%、 82.9%、 67.5%、 15.9%、 0； 吩嗪 -1-羧酸酰胺（PCN)的抑菌活性分别为 65%、 69%、 73.6%、 80.1%、 90%。 BP: 在 pH值在 4到 8的条件下吩嗪 -1-羧酸酰胺对水稻纹枯病菌的抑菌活性与吩嗪 -1-羧酸相比， 具有稳 定性； 同时， 酸度值为 7.0 的条件下吩嗪 -1-羧酸酰胺对水稻纹枯病菌的抑菌活性是吩嗪 -1-羧酸抑菌活性的 5倍。 其中， 所述马铃薯葡萄糖培养基中含有的组分重量百分比为： 马铃薯 20%、 葡萄糖 2 % 琼脂 1.5 %、 余量为水。

Claims

权利 要 求书
1. 一种用于生产微生物源杀菌剂的生物工程菌株，为将 ρ ζ /基因重组表达质粒转化入产 吩嗪 -1-羧酸的菌株后获得， 所述生物工程菌株产吩嗪 -1-羧酸酰胺。
2. 如权利要求 1所述的生物工程菌株，其特征在于，所述 ρ ζ /基因重组表达质粒能在产 吩嗪 -1-羧酸的菌株中表达/ 基因， 编码产生 PhzH (谷酰胺吩嗪 -1-羧酸酰胺转移 酶） 。
3. 如权利要求 2所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述 PhzH的氨基酸序列为 SEQ ID N0 : 1。
4. 如权利要求 2所述的生物工程菌株，其特征在于，所述 基因重组表达质粒为克隆 有 基因片段的重组表达质粒。
5. 如权利要求 4所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述的 ρ ζ /基因片段包含 ρ ζ /基 因的完整编码区及其 5 ' 端的非编码区。
6. 如权利要求 5所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述 PhzH为假单胞菌的 PhzH, 且 所述/ ^z /基因片段为假单胞菌的/^ z /基因片段。
7. 如权利要求 6所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述假单胞菌为铜绿假单胞菌或绿 针假单胞菌。
8. 如权利要求 7所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述假单胞菌选自铜绿假单胞菌株 PA01、 LESB58、 PA14、 PUPa3或绿针假单胞菌株 PCL1391。
9. 如权利要求 4所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述/ ^z /基因片段的碱基序列为 SEQ ID NO : 2。
10. 如权利要求 1-9任一权利要求所述的生物工程菌株， 其特征在于， 用于构建所述
基因重组表达质粒的表达载体为大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达质粒。
11. 如权利要求 10所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达 质粒含有强启动子，且所述 Ρ Ζ /基因片段克隆于所述强启动子之后， 由该强启动子控 制其表达。
12. 如权利要求 11所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达 质粒为 pBBRlMCS系列质粒及其衍生的表达质粒。
13. 如权利要求 12所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述大肠杆菌 /假单胞菌穿梭表达 质粒为 pBBRlMCS-5, 所述 基因在保证读码框正确的前提下， 置于 pBBRlMCS_5的 噬菌体启动子 T3 prom控制下。
14. 如权利要求 1-13任一权利要求所述的生物工程菌株， 其特征在于， 所述产吩嗪 -1-羧 酸的菌株为促生拮抗菌 M18或其衍生的工程菌株 M18G。
15. 如权利要求 1-14任一权利要求所述的生物工程菌株用于发酵生产微生物源杀菌剂的 用途。
16. —种微生物源杀菌剂， 为权利要求 1-14任一权利要求所述生物工程菌株的发酵液。
17. 如权利要求 16所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述发酵液的主要杀菌活性成分含 吩嗪 -1-羧酸酰胺。
18. 如权利要求 17所述微生物源杀菌剂， 其特征在于， 所述发酵液中， 吩嗪 -1-羧酸酰胺 的含量为每升 2500〜2800毫克。
19. 如权利要求 16所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述微生物源杀菌剂为在合适表达 吩嗪 -1-羧酸及 PhzH的条件下，发酵培养权利要求 1-13任一权利要求所述的生物工程 菌株后获得。
20. 如权利要求 19所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述微生物源杀菌剂采用包括下列 步骤的方法获得：
1) 生物工程菌株的活化；
2) 种子扩大培养： 先在甘油培养液中摇瓶培养后， 转接入产素培养液中放大发酵培 养获得发酵液。
21. 如权利要求 20所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述工程菌株活化采用固体甘油培 养基活化培养。
22. 如权利要求 21所述微生物源杀菌剂，其特征在于，所述的甘油培养液中含有的组分重 量百分比为： 蛋白胨 1.8〜2.2%、 甘油 1.3〜1.7%、 硫酸镁 0.05〜0.1%、 磷酸二氢 钾 0.01〜0.05%、 余量为水， pH 6.8〜7.2; 所述的固体甘油培养基中含有的组分重 量百分比为： 蛋白胨 1.8〜2.2%、 甘油 1.3〜1.7%、 硫酸镁 0.05〜0.1%、 磷酸二氢 钾 0.01〜0.05%、 琼脂 1.2-1.5%、 余量为水， pH 6.8〜7.2; 所述的产素培养液中含 有的组分重量百分比为： 蛋白胨 2.2〜3.0%、 葡萄糖 2.0〜2.5%、 硝酸钾 0.5〜0.7 %、 余量为水， pH6.5〜7.0。
23. 如权利要求 22所述微生物源杀菌剂， 其特征在于， 所述工程菌株的活化条件为： 在将 工程菌接入甘油培养基平板， 在 26〜30° C下， 活化生长 20〜24小时； 而后再次在甘 油培养基的平板上划菌块， 26〜30° C下活化 10〜12小时； 所述种子扩大培养中， 在 甘油培养液中摇瓶培养条件为： 将活化后的菌株接入甘油培养液、 26〜30° C振荡培养 9〜11小时； 所述种子扩大培养中， 接入产素培养液中放大发酵培养的条件为： 将甘 油培养液中摇瓶培养的菌株转接入产素培养液、 26〜30° C发酵培养 60〜72小时。
24. 如权利要求 16-23任一权利要求所述微生物源杀菌剂用于防治植物病害或用于制备防 治植物病害的药剂的用途。
25. 一种防治植物病害的药剂， 含有杀菌有效量的权利要求 16-23任一权利要求所述微生 物源杀菌剂或来源于所述微生物源杀菌剂的杀菌活性成分。
PCT/CN2011/082531 2011-11-07 2011-11-21 一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用 WO2013067719A1 (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MYPI2014701183A MY184195A (en) 2011-11-07 2011-11-21 A bioengineering strain for production of novel microorganism-originated fungicides and uses thereof
US14/356,636 US9491943B2 (en) 2011-11-07 2011-11-21 Bioengineering strain for production of novel microorganism-originated fungicides and uses thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110347790.7 2011-11-07
CN201110347790.7A CN102399737B (zh) 2011-11-07 2011-11-07 一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013067719A1 true WO2013067719A1 (zh) 2013-05-16

Family

ID=45882392

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2011/082531 WO2013067719A1 (zh) 2011-11-07 2011-11-21 一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9491943B2 (zh)
CN (1) CN102399737B (zh)
MY (1) MY184195A (zh)
WO (1) WO2013067719A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104285945A (zh) * 2014-09-26 2015-01-21 郑州大学 一种申嗪霉素水悬浮剂及其制备方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103704224B (zh) * 2012-10-08 2015-07-22 上海农乐生物制品股份有限公司 防治植物线虫的申嗪霉素·阿维菌素悬乳剂及其制备方法
CN104222098A (zh) * 2013-06-08 2014-12-24 江西珀尔农作物工程有限公司 一种甲酰胺酚嗪生物杀菌剂的制备方法
CN103704274B (zh) * 2013-06-21 2015-05-27 湖南农业大学 一种铜绿假单胞菌株的应用
CN103834585B (zh) * 2013-10-24 2016-02-10 上海交通大学 高产吩嗪-1-羧酸和吩嗪-1-酰胺的根际假单胞菌
CN104017744B (zh) * 2013-11-07 2016-08-17 上海交通大学 抗病促生的绿针假单胞菌剂的制备方法与用途
CN104263748A (zh) * 2014-07-14 2015-01-07 武汉汉申生物科技有限责任公司 生物工程菌株及其制备方法和用途
CN104946552B (zh) * 2015-02-03 2018-02-09 上海交通大学 安全高效生产申嗪霉素的基因工程菌株及其应用
CN107522571A (zh) * 2017-06-20 2017-12-29 上海农乐生物制品股份有限公司 一种有机功能营养肥及其制备方法
CN112111440B (zh) * 2020-09-25 2022-03-04 齐鲁工业大学 用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途
CN112111441B (zh) * 2020-09-25 2022-02-22 齐鲁工业大学 一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用
CN112094795B (zh) * 2020-09-25 2022-02-22 齐鲁工业大学 一种生产1-羟基吩嗪的绿针假单胞菌qohphz-8及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002101051A2 (en) * 2001-06-11 2002-12-19 Ecopia Biosciences Inc. Genes and proteins for the biosynthesis of anthramycin
CN1802927A (zh) * 2006-01-19 2006-07-19 上海交通大学 利用促生拮抗菌m18衍生菌株制备杀菌剂的方法
CN101705265A (zh) * 2009-11-12 2010-05-12 上海交通大学 利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法
CN101973946A (zh) * 2010-10-15 2011-02-16 上海交通大学 吩嗪-1-羧酸系列衍生物及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002101051A2 (en) * 2001-06-11 2002-12-19 Ecopia Biosciences Inc. Genes and proteins for the biosynthesis of anthramycin
CN1802927A (zh) * 2006-01-19 2006-07-19 上海交通大学 利用促生拮抗菌m18衍生菌株制备杀菌剂的方法
CN101705265A (zh) * 2009-11-12 2010-05-12 上海交通大学 利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法
CN101973946A (zh) * 2010-10-15 2011-02-16 上海交通大学 吩嗪-1-羧酸系列衍生物及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIN-A-WOENG TFC ET AL.: "Introduction of the phzH gene of Pseudomonas chlororaphis PCL1391 extends the range of biocontrol ability of phenazine - 1 - carboxylic acid - producing Pseudomonas spp. Strains", MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS, vol. 14, no. 8, 2001, pages 1006 - 1015, XP055067161 *
WANG, JINYING ET AL.: "Construction of Pseudomonas sp.M18 relA mutant and its regulation on phenazine-1-carboxylic acid biosynthesis", MICROBIOLOGY CHINA, vol. 38, no. 2, February 2011 (2011-02-01), pages 275 - 280 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104285945A (zh) * 2014-09-26 2015-01-21 郑州大学 一种申嗪霉素水悬浮剂及其制备方法
CN104285945B (zh) * 2014-09-26 2016-07-06 郑州大学 一种申嗪霉素水悬浮剂及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20140309232A1 (en) 2014-10-16
CN102399737A (zh) 2012-04-04
CN102399737B (zh) 2015-04-08
MY184195A (en) 2021-03-25
US9491943B2 (en) 2016-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013067719A1 (zh) 一种用于生产新型微生物源杀菌剂的生物工程菌株及其应用
Datta et al. Siderophore biosynthesis genes of Rhizobium sp. isolated from Cicer arietinum L.
JP2021500907A (ja) 植物の形質の改良を目的とした窒素固定のための遺伝子標的
JP2022000024A (ja) リファクターされたｎｉｆクラスターを使用する窒素固定
WO2014121724A1 (zh) 5-氨基乙酰丙酸高产菌株及其制备方法和应用
CN106635937B (zh) 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法
Behnken et al. Anaerobic bacteria as producers of antibiotics
CN101705265B (zh) 利用工程菌株M18G携带质粒pME6032Phz生产吩嗪-1-羧酸的方法
WO2013141815A1 (en) Nitrogen-fixing bacterial inoculant for improvement of crop productivity and reduction of nitrous oxide emission
US20140336050A1 (en) Recombinant nitrogen-fixing bacterial strain, inoculum containing the same and application methods
JP2016507251A (ja) 植物病原菌を防除する技術、方法、および組成物
CN113969269B (zh) D-氨基酸氧化酶突变体及其在制备l-草铵膦中的应用
Swain et al. Nitrogen fixation and its improvement through genetic engineering
Patel et al. Bioreactor studies of production of mycophenolic acid by Penicillium brevicompactum
CN106635938A (zh) 用于生产2‑羟基吩嗪的基因工程菌株及其制备方法和用途
CN109971773A (zh) 一种编码可降解3-氯龙胆酸的龙胆酸双加氧酶DsmI的基因dsmI及其应用
WO2018036479A1 (zh) 高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和用途
CN111019965B (zh) 新霉素生物合成基因簇遗传改造的工程菌及其应用
CN110713964B (zh) 一株cspA基因加倍的须糖多孢菌工程菌株及其应用
CN104293692A (zh) 生物工程菌株及其制备方法和用途
JP7480707B2 (ja) バチルス属細菌の培養液を含有する農園芸用組成物
CN114891806B (zh) 一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用
CN105695429A (zh) 一种发酵培养基及用该发酵培养基发酵nmn转移酶的方法
An et al. Reconstitution of TCA cycle involving l-isoleucine dioxygenase for hydroxylation of l-isoleucine in Escherichia coli using CRISPR-Cas9
AU2021103864A4 (en) Engineering strain for producing 2-hydroxy-phenazine and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11875281

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12014501018

Country of ref document: PH

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14356636

Country of ref document: US

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205 DATED 05/09/2014)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11875281

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1