CN104774788A - 垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法及应用。本发明的方法就是：采用逐步提高NaCl的浓度来强化城市生活垃圾堆肥中的微生物，最终筛选得到制备出的强化耐盐微生物菌剂。本发明旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪应用提供技术支撑。本发明更进一步公开了强化复合微生物菌群在提高盐胁迫草坪草高羊茅保护酶活性方面的应用。本发明旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪低温应用提供技术支撑。

Description

垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法及应用

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及生活垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法。

背景技术

微生物菌剂尤其是由多种微生物组成的复合微生物菌剂是近年来发展起来具有广泛应用前景的生物技术。微生物菌剂不仅可以修复石油污染的土壤和降解水体中的有机污染物，还可以防治病虫害，促进作物生产和增产增收，有些微生物菌剂可以提高植物的抗逆性自20世纪70年代以来，欧美日本等国家或地区都相继研制成功了一些复合菌剂，很多已经开始进行大规模的生产，并形成了系列化的产品。其中20世纪80年代由日本琉球大学教授研制的EM（有效微生物群）获得了极大的成功，已经广泛应用在90多个国家涉及植业养殖业及环境净化方面，并取得了显著的经济效益和社会效益。基于微生物菌剂在一些发达国家研究和推广得较早，相关技术较为成熟，应用也更普遍。近年来，国外也没有再出现像EM那样可以在全世界都引起很大效应的微生物菌剂。

相对于国外发达国家相关微生物菌剂的研究，我国是从20世纪80年代才开始微生物菌剂的相关研究，从理论到实践，从单一菌种的利用到多个菌种的复合应用，也相继取得了一些成果。南京农业大学生物防治产品主要有防治黄瓜根结线虫病害的蜡质芽孢杆菌AT31菌剂（使命/线灭，LS20120060）、防治蔬菜土传病害的微生态制剂（蔬得康）、宁盾系列产品，已获生物肥料正式登记。山东生物所木霉菌剂（防治灰霉病）、湖南植保所光合细菌（促进光合作用）、镇江润州短吻杆菌（防治鳞翅目害虫）以及宁夏诺得曼生物技术公司根瘤菌（促进豆科植物生长）等。最近几年，国内有很多关于复合菌剂研制的报道，主要利用微生物净化环境，降解有机污染、提高粮食产量和提高植物抗性等方面。有研究表明利用从水产养殖的优良水质中分离得到的优势菌种研制出水质净化剂，将其用于淡水鱼养殖池中，对降低水体中的COD，NH₃-N，亚硝酸盐等起到了理想的效果。还有研究表明，微生物菌肥均能在适宜的浓度下不同程度的促进生菜的生长，改善生菜品质，降低硝酸盐含量。但这些大都还处于试验研究与初步应用水平，还没有广泛应用于实际。生防菌本身具有固氮、解磷、解钾的作用，刺激植物产生适量生长素；降解大分子有机物，提高有机肥利用率；微生物菌剂就像是植物的开胃剂；保护细胞膜的完整性、维持较高水平的根系活力和叶绿素含量，这方面就不光是一个促生的作用，也有一种抗逆的作用。微生物菌剂诱导植物体内多种抗逆基因的表达，显著提高植物体的抗氧化酶活性。同时微生物菌剂可以防止作物收获后产生病害，诱导抗逆基因表达，诱导SOD等多种相关物质的产生。所以，微生物菌剂对于改善植物在逆境即盐胁迫、干旱胁迫和低温胁迫条件下的建植有积极的影响。

草坪草除了具有美化环境、净化空气、防止水土流失、保持生态平衡、给人们提供休息和运动场所等功能外，尚有调节小气候的作用。然而草坪草同其它植 物一样，常遭受不良环境的影响，如干旱、高温、低温、盐渍等逆境都会抑制草坪草的生长，使草坪质量下降。尤其是盐碱、低温（冷害）和干旱是强烈限制草坪生长的3大非生物因素。

盐渍化土壤在世界各地都有广泛的分布，全世界盐渍化土地面积约为955×106hm²，约占陆地总面积的10%。目前，我国有20×106hm²以上盐碱地和7×106hm²以上盐渍化土壤，约占耕地面积的20%。而盐碱逆境胁迫是限制草坪草生长的一个主要环境因素之一。土壤盐渍化对植物的危害主要表现在抑制植物生长，破坏光合作用功能、造成细胞膜伤害、保护酶活性降低等。长期以来，盐碱土的改良主要采用的是灌溉排水、施加化学改良剂或一些矿质肥料和种植耐盐碱的植物。近年来，微生物菌剂在改良盐碱地的应用也成为了研究的热点。施用微生物菌剂后盐碱土的细菌总数有所增加，土壤的容重降低明显。即改善了土壤微生物区系，提高生物活性。有研究表明对表土层和5cm土层滨海盐碱土壤施用活性微生物菌剂，结果表土层硫酸盐含量显著降低，而氯化盐含量下降需要较高菌剂浓度。５cm土层硫酸盐升高明显，氯化盐变化较小，最终土壤酸碱度降至中性。这就说明微生物菌剂可以降低土壤盐碱度，提高养分利用率。总体来看，微生物菌剂在盐渍化土壤中表现出较好的效果，这充分显示了微生物菌剂在盐碱地改良上的应用潜力。

城市生活垃圾堆肥是自然界中的微生物，比如说是细菌和真菌等，通过它们的生理代谢，可以加快对有机物的分解速度，进而将其变成腐植酸的过程。城市生活垃圾堆肥有氧处理过程中，会产生大量的热量，垃圾中的有机物被分解完成，同时也杀死了垃圾中的病菌等，而产芽孢的杆菌能够大量存在。各种微生物对有机物分解能力和分解速度是不尽相同的，随着温度、季节的变化，堆肥过程中的微生物群落和数量亦不相同；且已有研究表明，堆肥中的微生物群落是相当复杂的。堆肥中微生物数量及种群分布与堆肥有机物质成分和含量、微生物间的相互作用等多种因素密切相关。有人研究接种外源菌剂对堆肥中微生物数量和酶活性变化的影响，为微生物菌剂的应用和堆肥工艺的改进提供了依据。猪粪秸秆堆肥复合微生物菌剂能够更有效地促进和优化堆肥过程迅速提高堆体温度提高最高温度延长高温期时间并能更有效地提高堆体养分水平。牛粪堆肥试验表明，添加本源菌剂能快速提高堆肥温度，促进堆体发酵腐熟，缩短堆制时间；从纤维素和半纤维素降解率看，添加菌剂处理后明显比未添加菌剂的对照处理强，由此可见，添加微生物菌剂有利于牛粪堆肥腐熟。而针对从固体废气物基质中提取微生物菌种，并将其用于实验和生产中，还有人分别从鸡粪发酵和牛粪中筛选出高效降解菌并配制成相应的复合微生物菌剂，为复合微生物菌剂的应用奠定了一定的基础，这对前期堆肥微生物菌剂的配置都提供了依据。近期的相关文献及生产表明：微生物菌剂作为成为一种新型的生物技术已经应用到我们的社会生活和生产当中。尤其是微生物菌剂在促进植物生长、提高植物抗性等方面的研究不胜枚举。但是关于微生物菌剂的来源与制备，大多数研究者也仅仅只限于从土壤或污泥中提取和筛选。有关堆肥中微生物菌落结构、堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性。强化制备垃圾堆肥中微生物菌种，将强化堆肥微生物菌种作为接种剂，配制成不同浓度的强化复合微生物菌剂接种应用，将具有重要的意义。

从生活垃圾堆肥（以下简称堆肥）中筛选出有效菌株，再配制成相应微生物菌剂，具有广泛的应用前景。一些研究表明城市生活垃圾堆肥过程中发现，在有机物被分解的过程中，生物群落也发生了重要的变化，主要是致病菌大量减少，而产芽孢的杆菌则数量剧增。生活垃圾在经过高温发酵处理后得到的堆肥酸性变大而且含盐量变高，因此处于高渗体系环境中的微生物具有一定的耐酸、耐盐和耐高温特性。不论是一般的微生物菌剂，还是堆肥微生物菌剂中菌种的选育，都是直接从自然环境（或堆肥）中筛选出有效的菌株，再配制成微生物菌剂应用于相应的领域。而将自然环境（或堆肥）中的微生物经过某些特定方向的强化，进而得到一些高效强化微生物菌剂的研究尚无报道。

发明内容

本发明的方法就是采用逐步提高NaCl的浓度来强化城市生活垃圾堆肥中的微生物，最终筛选得到制备出的强化耐盐微生物菌剂。本发明旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪应用提供技术支撑。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种垃圾堆肥中耐盐强化复合微生物菌群的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg^-1，全钾50.83 g·kg^-1，容重0.85 g·L^-1，饱和含水量66.58 g·mL^-1；

（2）培养基：

1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；

2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；

3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 20g，K₂HPO₃ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；

4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO₃ 1g，MgSO(7H₂O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30μg；

（3）菌种的富集：

将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；

（4）耐盐复合微生物菌群的强化

混合微生物菌群耐盐强化采用的是逐步增加盐浓度的方法进行，NaCl的浓度分别为（w/w）0.5%、1%、1.5%、2% 、2.5%和3%，在驯化过程中，视OD₆₀₀增长而逐步提高盐浓度，NaCl的浓度以5g/L的梯度增加到30g/L，每增加一次NaCl的浓度，待菌体增长量稳定后，继续增加NaCl的浓度，逐级驯化出耐盐混合微生物菌群；

(5)强化复合微生物的分离及纯化：

1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55-60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30μg/ml，混均匀后分别倒平板；

2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10^-1稀释液，以此类推制成(μg/ml)10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6几种浓度的稀释液；

3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；

4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；

（6）平板划线分离法

挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群

本发明更进一步公开了强化复合微生物菌群在提高盐胁迫草坪草高羊茅保护酶活性方面的应用；特别是在降低高羊茅叶片中脯氨酸含量方面的应用。其中所述的强化复合微生物菌群指的是强化枯草芽孢杆菌，强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。

本发明更加详细的制备方法如下：

1研制材料与方法

1.1材料：

生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂。堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg^-1，全钾50.83 g·kg^-1，容重0.85 g·L^-1，饱和含水量66.58 g·mL^-1。

1.2培养基

富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；

高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 20g，K₂HPO₃ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基（配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml）；

马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO₃ 1g，MgSO(7H₂O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基（临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30μg）。

1.3菌种的富集

将堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为混合微生物菌群。

1.4微生物的强化

混合微生物菌群耐盐强化采用的是逐步增加盐浓度的方法，以减轻瞬间高浓度盐对混合菌株造成的冲击和毒害。未经过驯化的混合菌群一般在NaCl浓度为5g/L的条件下生长较好，而此次研究的目标NaCl浓度为30g/L，即在本研究中NaCl的浓度分别为0.5%、1%、1.5%、2% 、2.5%和3%。在驯化过程中，视OD₆₀₀增长而逐步提高盐浓度，NaCl的浓度以5g/L的梯度增加到30g/L，每增加一次NaCl的浓度，要待菌体增长量稳定后，才能继续增加NaCl的浓度，逐级驯化出耐盐混合微生物菌群。

1.5强化微生物的分离及纯化

1.5.1稀释涂布平板法

1)  倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55~60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为30μg/ml），混均匀后分别倒平板。

2)  制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10^-1稀释液，以此类推制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6几种浓度的稀释液。

3)  涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次。用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。

4)  培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养。

1.5.2平板划线分离法

挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化。直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤。

1.6强化微生物的鉴定

按照Ezup柱式试剂盒的操作手册提取优势菌种的DNA。优势细菌的PCR体系：10×Buffer（with MgCl₂）2 μL，dNTP（10mmol/L）0.4μL，341f（10μmol/L）1μL，534r（10μmol/L）1μL，Taq酶（5u/μL）0.4μL，模板DNA 1μL，加超纯水定容至终体积20μL。PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。引物为341f （5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′）和534r（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′）。优势真菌的PCR反应体系：10×Buffer （without MgCl₂）2 μL，MgCl₂（25mmol/L）1.6μL，dNTP（10mmol/L）0.4μL，Geo11（10μmol/L）0.4μL，GeoA2（10μmol/L）0.4μL，Taq酶（5u/μL）0.2μL，模板DNA 1μL，加超纯水定容至终体积20μL。PCR反应条件：94℃4min预变性，94℃变性1min，54℃复性1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸7min。引物为GeoA2 （5′-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）和Geo11 （5′-ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3′）。将得到的PCR产物送到北京华大基因测序部，根据测序的结果，在BLAST系统中找出对应菌种。

2 研制结果分析

2.1强化耐盐微生物曲线的测定

对在不同NaCl浓度的培养基中培养的菌群，分别在刚转接时测其OD值，即为菌体的OD初值.以后每隔一定时间（间隔4小时）测一次菌体的OD值，绘制OD-时间曲线图。

（1）混合堆肥微生物菌群生长曲线（直接升高NaCl浓度）

从图1中可以看出，在NaCl浓度较低，即NaCl浓度低于1%时，混合菌群的生长曲线基本重合的。微生物通常是在NaCl浓度为0.5%时，生长较好。而本实验中，在NaCl浓度上升到1.5%时，也未对菌体的生长造成明显的抑制现象。从而可以得出，堆肥中的微生物本身就具有一定的耐盐性。

随着NaCl浓度的升高，菌群的生长状况逐渐变差，适应期增长，达到最大生长值的时间也相应延长，最大生长值也随之降低。这主要是由于随着NaCl浓度的升高，菌体要承受NaCl浓度带来的压力，大量不能适应的个体会死亡，这需要一个相应的适应过程。能够适应该NaCl浓度的菌体就会大量增值，所以适应期后出现对数生长期。

 从而得出，在接下来的逐步强化过程中，可以直接从NaCl浓度为2%开始。

（2）混合堆肥微生物菌群生长曲线（逐步提高NaCl浓度）

从图2可以看到，经过逐步强化的混合菌群进行转接后，适应期明显缩短，很快就可以进入到对数生长期，达到最大生长值所需要的时间也缩短了，而且达到的最大生长值也有所提高。这主要是因为经过强化的混合菌群已经适应了前一个相对较高的NaCl浓度环境。而转接也是菌群的生长对数期进行的，转接后的培养基的营养丰富，菌群生长稳定而迅速，与直接调高NaCl浓度相比，相应的适应期缩短，很快进入了对数期，达到最大生长值的时间也缩短了很多，且达到的最大生长值也有所提高。

2.2强化耐盐微生物分离及纯化结果

本次实验对堆肥中的微生物进行耐盐强化，最终经过多次划线纯化得到的3种纯种微生物，为2种细菌和1种真菌，结果如图3所示。

依据培养特征和菌体形态进行初步鉴定，可以将得到的2种细菌，归为芽孢杆菌，而真菌为霉菌. 详细的微生物菌落形态见表1：

                                                 

2.3强化耐盐微生物分子鉴定结果

对上述3菌种通过对其菌落形态观察，结合分子鉴定结果（PCR序列相似度）比较，鉴定出2种芽孢杆菌分别为：枯草芽孢杆菌和赖氨酸芽孢杆菌，1种霉菌为产黄青霉。

3 研制结论

本方法最后成功强化、分离、纯化和鉴定得到3种耐盐堆肥微生物，即枯草芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉。将得到的强化耐盐微生物制成不同浓度梯度的复合微生物菌剂，可以改善草坪植物在盐碱地生长不良的状况。

附图说明：

图1 不同NaCl浓度下混合菌群的生长曲线；

图2为不同NaCl浓度下经过强化的混合菌群的生长曲线；

图3为强化耐盐优势细菌和真菌。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。需要特别说明是：本发明筛选得到的复合微生物菌群枯草芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和产黄青霉市场上均有销售，也可以采用本发明的方法从生活垃圾堆肥中分离得到复合微生物菌群，其得到的菌群的生化特性与市售的相同故未在保藏。

实施例1

垃圾堆肥中耐盐强化复合微生物菌群的制备方法：

（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg^-1，全钾50.83 g·kg^-1，容重0.85 g·L^-1，饱和含水量66.58 g·mL^-1；

（2）培养基：

1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4，加15g琼脂成固体培养基；

2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0，加15g琼脂成固体培养基；

3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 20g，K₂HPO₃ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.01g，水1000ml， pH 7.2，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；

4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO₃ 1g，MgSO(7H₂O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30μg；

（3）菌种的富集：

将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；

（4）耐盐复合微生物菌群的强化

混合微生物菌群耐盐强化采用的是逐步增加盐浓度的方法进行，NaCl的浓度分别为（w/w）0.5%、1%、1.5%、2% 、2.5%和3%，在驯化过程中，视OD₆₀₀增长而逐步提高盐浓度，NaCl的浓度以5g/L的梯度增加到30g/L，每增加一次NaCl的浓度，待菌体增长量稳定后，继续增加NaCl的浓度，逐级驯化出耐盐混合微生物菌群；

(5)强化复合微生物的分离及纯化：

1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30μg/ml，混均匀后分别倒平板；

2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10^-1稀释液，以此类推制成(μg/ml)10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6几种浓度的稀释液；

3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；

4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；

（6）平板划线分离法

挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。

实施例2

（1）强化复合微生物菌剂对盐胁迫下高羊茅丙二醛和脯氨酸含量的影响

所述的强化复合微生物菌群指的是强化枯草芽孢杆菌，强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。

盐胁迫下复合微生物菌剂处理高羊茅后，其叶片中的丙二醛含量均显著低于未接种复合微生物菌剂的对照组。不同盐梯度下都是在经过100倍稀释复合微生物菌剂处理后，高羊茅丙二醛含量降低的最多，分别比对照降低了32.39%、24.99%、29.35%。在200倍稀释液复合菌剂的处理下，高羊茅丙二醛含量和对照相比都有显著性差异（P<0.05）。

表1 不同浓度盐胁迫下复合微生物菌剂对高羊茅丙二醛、脯氨酸含量的影响

 

不同浓度的强化复合微生物菌剂对盐胁迫下高羊茅叶片中脯氨酸含量的影响见表1。与对照相比，不同盐梯度下，接种强化复合微生物菌剂显著降低了高羊茅叶片中的脯氨酸含量。以施加稀释100倍的复合微生物菌剂效果最好，分别比对照降低了32.75%、29.69%、23.96%。而施加稀释200倍复合微生物菌剂的处理组的脯氨酸含量与对照相比，也存在显著性差异（P <0.05）。

（2）复合微生物菌剂对盐胁迫下高羊茅保护酶活性的影响

施加复合微生物菌剂显著提高盐胁迫下高羊茅叶片SOD、POD和CAT这三种保护酶活性（表2）。在施加稀释100倍的复合微生物菌剂时，高羊茅SOD、POD和CAT的活性达到最高，在轻度（0.3%）胁迫下，分别是对照组的2.7倍、1.2倍和1.7倍；中度（0.6%）胁迫下，是对照组的2.99倍、1.22倍和1.87倍；重度（0.9%）胁迫下，是对照组的3.54倍、1.08倍和2.34倍。复合微生物菌剂稀释200倍时，处理组高羊茅的这3种保护酶的活性与对照组相比也存在显著性差异（P <0.05）。

表2不同浓度盐胁迫下复合微生物菌剂对高羊茅保护酶活性的影响

 

3 研制结论

在盐胁迫下，接种强化复合微生物菌剂，能明显提高了保护酶活性从而缓解了盐胁迫对高羊茅带来的伤害，进而提高了高羊茅的耐盐性。复合微生物菌剂100倍稀释液的效果显著优于200倍稀释液。所以本技术所获得的复合强化微生物菌剂就可以有效缓解盐碱土对草坪草的伤害；筛选和培养相应的强化耐盐堆肥微生物菌种，并进行人工接种，是提高草坪草的耐盐性的一条新出路。

Claims (4)

1.一种垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg^-1，全钾50.83 g·kg^-1，容重0.85 g·L^-1，饱和含水量66.58 g·mL^-1；

（2）培养基：

1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；

2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；

3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO₃ 20g，K₂HPO₃ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；

4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO₃ 1g，MgSO(7H₂O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30μg；

（3）菌种的富集：

将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；

（4）耐盐复合微生物菌群的强化

混合微生物菌群耐盐强化采用的是逐步增加盐浓度的方法进行，NaCl的浓度分别为（w/w）0.5%、1%、1.5%、2% 、2.5%和3%，在驯化过程中，视OD₆₀₀增长而逐步提高盐浓度，NaCl的浓度以5g/L的梯度增加到30g/L，每增加一次NaCl的浓度，待菌体增长量稳定后，继续增加NaCl的浓度，逐级驯化出耐盐混合微生物菌群；

(5)强化复合微生物的分离及纯化：

1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55~60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30μg/ml，混均匀后分别倒平板；

2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10^-1稀释液，以此类推制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6μg/ml几种浓度的稀释液；

3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；

4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；

（6）平板划线分离法

挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。

2.权利要求1所述垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法，其中得到强化复合微生物菌群指的是：强化枯草芽孢杆菌，强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉。

3.采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在提高盐胁迫草坪草高羊茅保护酶活性方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是强化枯草芽孢杆菌，强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。

4.采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在降低高羊茅叶片中脯氨酸含量方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是强化枯草芽孢杆菌，强化赖氨酸芽孢杆菌和强化产黄青霉按重量份数比为1:1:1的比例进行配置。