CN102911962A

CN102911962A - 改造微生物获得改进表型的方法

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Publication number: CN102911962A
Application number: CN2011102194402A
Authority: CN
Inventors: 蔡真; 栾国栋; 李寅
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2011-08-02
Filing date: 2011-08-02
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2031-08-02
Also published as: CN102911962B

Abstract

本发明涉及改造微生物获得改进表型的方法。具体而言，本发明涉及一种改造微生物、获得改进表型的方法。本发明的方法将向微生物中导入一个或十几个具有较强的基因组DNA复制突变率的DNA聚合酶突变体，改为导入一个具有不同DNA复制突变率和/或不同突变偏好性的DNA聚合酶突变体的文库，大大增加了微生物在基因组DNA复制时的突变率和突变类型方面的多样性，从而增加了筛选到表型提高的微生物突变体的可能性。

Description

改造微生物获得改进表型的方法

技术领域

本发明涉及一种改造微生物获得改进表型的方法。特别是涉及一种通过增加微生物自身基因组DNA在复制时产生错误的频率，使微生物在生长过程中不断发生基因组DNA突变，从而连续、快速地获得改进表型的方法。

背景技术

随着化石资源枯竭和环境问题恶化，将微生物作为细胞工厂来生产燃料、化学品等的潜力正日益凸显。据经合组织(OECD)预计，到2030年大约将有35％的化学品来自工业生物技术(http://scitech.people.com.cn/GB/14883438.html)。但是天然的微生物往往存在产量低、生长过程受多种化合物抑制、对生产过程中环境条件要求严格等缺点，因此，改造微生物，使之具备高产、耐受抑制物、抵抗酸度、温度等环境压力胁迫的能力，一直是工业生物技术领域的核心目标。

现有的微生物改造技术主要包括以下几类。第一类以基因工程和代谢工程为代表(Wendisch，V.F.，et al.(2006).Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids.Curr.Opin.Microbiol.9，268-274；Lee，S.K.，et al.(2008).Metabolic engineering of microorganisms for biofuels production：from bugs to synthetic biology to fuels.Curr.Opin.Biotechnol.19，556-563)。即，已知某个待改造表型与某个或某几个基因相关，然后通过敲除、过表达或改性这些基因来对微生物进行“自上而下”的改造。这类方法虽然目标明确、操作方便，但越来越多的研究表明，许多重要的细胞表型(如高产、耐受抑制物、抗压力胁迫等)并不是由单个或几个基因决定的，而是许多基因相互协调作用的结果(Alper，H.，et al.(2006).Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production.Science 314，1565-1568)。更重要的是，由于目前人们对微生物体内错综复杂的生物化学、调控代谢网络还缺乏清晰认识，还无法将微生物的宏观表型与其微观基因型对应起来，因此，此类方法在具体应用时普通存在理论基础不足、改造效果不佳等问题。

第二类微生物改造技术则是模拟自然进化的理念，采取随机突变、定向筛选的策略。即通过物理(如紫外线、辐射等)或化学诱变(如二甲亚胺、亚硝基甲胍、乙基甲磺酸等)(Vinci，V.，et al.(1998).Strain Improvement by non-recombinant methods.In Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology；Demain，A.D.J.E，Ed.；American Society for Microbiology：Washington，DC，1998；pp 103-113；Butler，P.B.M.，et al.(1996).Improvement of antibiotic titers from Streptomyces bacteria by interactive continuous selection.Biotechnol.Bioeng.49，185-196)的方法在微生物基因组水平上随机产生突变，获得一个微生物突变菌株库，接着根据所需表型进行筛选，然后再以筛选获得的最优突变株为起点，重复上述突变-筛选过程，直到达到所需目标。这类改造技术不需要事先知道待改造性状是由哪些基因决定的，原则上可用于各种微生物的各种性质改造，具有很强的操作性和实用性。但是这类“阶梯式”的微生物改造方法需要大量频繁的人为操作，步骤繁琐，周期长。

近几年发展起来的第三类微生物改造技术是通过改变微生物细胞内某些具备全局调控能力的因子，从而达到“牵一发而动全身”的改造效果。这些全局调控因子可以是细胞自身负责多个基因转录的sigma因子(Alper，H.，et al.(2006).Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production.Science 314，1565-1568)，也可以是来源于某些特殊微生物、功能未知的全局调节因子(Chen，T.，et al.(2011).Laboratory-evolved mutants of an exogenous global regulator，IrrE from Deinococcus radiodurans，enhance stress tolerances of Escherichia coli.PLoS One 6，e16228)。由于全局调控因子改变程度的不同会导致细胞内不同基因发生不同变化，因此此类方法通常是对全局调控因子进行随机改变，获得一系列不同的全局调控因子，然后再导入微生物细胞内，获得一系列不同表型的微生物细胞，最后通过筛选得到表型提高的微生物。同样，可以以这个表型提高的微生物中的全局调控因子为起始，重复上述过程，直到达到改造目标。这类方法具有很强的操作性和很好的改造效果，但是和第二类方法一样属于“阶梯式”的改造，需要频繁的人为操作，步骤繁琐，周期长。

国际专利WO2009/150848A1(美国，日本，2009年12月17日公开)及几篇研究论文(Tanabe，K.，et al.(1999).A conspicuous adaptability to antibiotics in the Esherichia coli mutaor strain，dnaQ49.FEMS Microbiology Letters 176，191-196；Selifonova，O.，et al.(2001).Rapid evolution of novel traits in microorganisms.Applied and Environmental Microbiology 67，3645-3649；Abe，H.，et al.(2009).Ethanol-tolerant Saccharomyces cerevisiae strains isolated under selective conditions by over-expression of a proofreading-deficient DNA polymerase δ.Journal of Bioscience and Bioengineering 3，199-204；Shimoda，C.，et al.(2008).Isolation of thermotolerant mutants by using proofreading-deficient DNA polymerase δ as an effective mutator in Saccharomyces cerevisiae.Genes Genet.Syst.81，391-397；Abe，H.，et al.(2009).Development of valuable yeast strains using a novel mutagenesis technique for the effective production of therapeutic glycoproteins.Glycobiology 19，428-436；Itakura，M.，et al.(2008).Generation of Bradyrhizobium japonicum mutants with increased N2O reductase activity by selection after introduction of a mutated dnaQ gene.Applied and Environmental Microbiology 74，7258-7264)报道了一种通过改变生物体内DNA复制突变率来进化微生物的方法。即向生物体内导入一个或多个具有较低保真性和/或核酸外切酶活性缺失的突变基因(如DNA聚合酶突变体)，提高生物体内基因组DNA的突变率，然后培养这些细胞，并从中筛选出具有目标性状的细胞。由于该方法是在生物体自身基因组DNA复制和遗传时引入突变。因此只要细胞生长，它体内的基因就会自动发生突变。而如果在细胞培养过程中加入筛选条件，即可使细胞在生长的同时完成突变和筛选的过程。另外，如果在细胞培养过程中不断提高筛选条件，那么细胞就会不断地朝着筛选的方向进化，从而将以往“阶梯式”地改造变成“连续式”的改造。虽然该方法具有操作简单，不需要频繁地人工介入，周期短的优点，但同时在应用范围方面也受到以下两类局限：

一、只能对那些具有DNA聚合酶突变体的微生物适用，即能改造的微生物种类受限。由于上述专利的所有实施例及研究论文中使用的均是前人研究中已经鉴定出的、或者根据相关研究推测出的，具有较低保真性和/或核酸外切酶活性缺失的DNA聚合酶突变体。比如，分别携带氨基酸突变D321A、E323A、L612A、L612C、L612D、L612E、L612A、L612F、L612G、L612H、L612I、L612K、L612M、L612N、L612P、L612Q、L612R、L612S、L612T、L612V、L612W、L612Y的酿酒酵母DNA聚合酶POL3；分别携带氨基酸突变D398A、D398A+L602M的中国仓鼠卵巢细胞DNA聚合酶Pold 1；分别携带氨基酸突变D275A+E277A、D275A+E277A+L576D的烟草细胞DNA聚合酶Pold 1；分别携带氨基酸突变D155A+E157A、D155A+E157A+L422G的大肠杆菌DNA聚合酶POLII；分别携带氨基酸突变D425A、E427A、E427Q、G430E、D510N、D510A、D510G、S972P、L1177W、F1264S枯草芽孢杆菌DNA聚合酶POLIII；携带氨基酸突变V96G的大肠杆菌DNA聚合酶dnaQ；携带氨基酸突变L73W+A164V的大肠杆菌DNA聚合酶mutD；携带氨基酸突变D7A+E9A的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)DNA聚合酶dnaQ。因此，对于那些目前研究尚未发现、且不易推测的它的DNA聚合酶突变体的微生物，如在生产燃料、化学品方面有重要应用前景的丙酮丁醇梭菌、蓝细菌等，很难利用上述方法对他们进行改造。

二、不能有效地改造多种微生物表型，即能改造的微生物表型受限。前述国际专利和研究论文均是将构建好的一个或十几个DNA聚合酶突变体分别导入微生物细胞内进行筛选。由于不同的DNA聚合酶突变体的DNA复制突变率相差巨大(WO2009/150848 A1)，且不同的DNA聚合酶突变体通常具有不同的突变偏好性，如某些偏好形成A·T→T·A突变(Schaaper，R.M.(1988).Mechanisms of mutagenesis in the Escherichia coli mutator mutD5：role of DNA mismatch repair.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，8126-8130)，某些偏好形成G·C→T·A突变(Nghiem，Y.et al.(1988).The mutY gene：a mutator locus in Escherichia coli that generates G·C→T·A transversions.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85， 2709-2713)。而对一个微生物而言，不同的表型可能需要在基因组DNA上引入不同数量和不同类型的突变才能获得，因此，若改造微生物各种表型时都用这一个或十几个DNA聚合酶突变体，很难保证改造有效。

因此，依然存在对能有效改造不同的微生物种类和微生物表型的微生物进化方法的需求。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于提供一种能有效改造不同的微生物种类和微生物表型的微生物进化方法。

因此，本发明的第一方面涉及一种改造微生物、获得改进表型的方法，其包括下述步骤：

a)对微生物中参与基因组DNA复制和/或修复的DNA聚合酶的基因进行突变，获得具有不同基因组复制突变率和/或突变偏好性的DNA聚合酶基因的突变体文库；

b)将该DNA聚合酶基因突变体文库导入微生物细胞中，实现各个DNA聚合酶基因突变体的表达，获得一个具有不同基因组DNA复制突变率和/或突变类型的微生物突变体文库；

c)在目标表型筛选压力下培养该微生物突变体文库，并从中筛选出具有改进表型的微生物突变体，优选地，所述目标表型筛选压力被不断提高；

d)可选地，重复步骤c)以产生更好的微生物表型。

优选地，所述方法还包括步骤：

e)将筛选出的具有改进表型的微生物突变体的基因组DNA复制突变率恢复到正常细胞水平，优选地，将筛选出的具有改进表型的微生物突变体中的DNA聚合酶突变体去除和/或替换成具有正常突变率的野生型DNA聚合酶。

优选地，所述微生物为原核微生物或真核微生物，优选地，所述原核微生物为细菌、蓝细菌或放线菌，优选地，所述真核微生物为酵母或霉菌。

优选地，所述目标表型为对不能天然利用的营养物质的利用能力、代谢物生产能力、对有害条件的耐受性或对缺陷的表型的恢复或代偿，优选地，所述代谢物为代谢中间体或终产物，优选地，所述有害条件为有毒的代谢物、抗生素、有抑制作用的底物、高温、低温、过高或者过低的pH、过高或过低的渗透压、有害辐射、缺水环境，优选地，所述缺陷的表型是天然缺陷的表型或人工引入的缺陷表型。

优选地，所述微生物中参与基因组DNA复制和/或修复的DNA聚合酶为DNA聚合酶I、II、III或其亚基δ、ε，或3’-5’核酸外切酶，或5’-3’核酸外切酶，或与其具有相似功能的酶。

优选地，所述DNA聚合酶基因突变体是先连接到载体上后再导入微生物细胞或所述DNA聚合酶基因突变体通过整合到微生物细胞的基因组上进行表达，优选地，所述载体为质粒、噬菌粒、病毒基因组或人工染色体。

优选地，突变的方法为定点突变、易错PCR、DNA改组、核苷酸合成或其组合。

优选地，将DNA聚合酶基因突变体文库导入微生物细胞时采用氯化钙介导的化学转化、电击穿孔、显微注射、原生质体融合或转导进行。

本发明的第二方面涉及根据上述的改造微生物、获得改进表型的方法获得的具有改进表型的微生物突变体。

本发明的第三发明涉及一种微生物突变体文库，其根据上述的改造微生物、获得改进表型的方法获得。

换言之，本发明涉及一种通过提高微生物基因组DNA复制突变率来改造微生物，获得改进表型的方法。特别地，本发明涉及向微生物细胞导入一个具有不同DNA复制突变率和/或不同突变偏好性的基因组DNA聚合酶突变体文库。随后文库中DNA聚合酶突变体在微生物自身基因组DNA复制时可以产生不同数量和/或不同类型的突变，形成众多表型变化的突变子代。而突变子代同样会在其基因组DNA复制时产生新的突变子代，从而获得一系列表型变化的微生物突变体。最后通过筛选将那些表型改进的微生物突变体选择出来。

与背景技术中提及的现有微生物改造技术相比，本发明将向微生物中导入一个或十几个具有较强的基因组DNA复制突变率的DNA聚合酶突变体，改为导入一个具有不同DNA复制突变率和/或不同突变偏好性的DNA聚合酶突变体的文库，大大增加了微生物在基因组DNA复制时的突变率和突变类型方面的多样性，从而增加了筛选到表型提高的微生物突变体的可能性。由于该方法构建的是一个突变率和/或突变类型各异的DNA聚合酶突变体的文库，而不是特定的具有高突变率的DNA聚合酶突变体，所以还可以适用于那些还未报道出相应DNA聚合酶突变体的微生物。另外，由于该文库中的DNA聚合酶突变体具有不同的DNA复制突变率和/或偏好性，因此也能够满足改造不同表型的需要。

本发明的一个目的，是提供一种改造微生物、获得改进表型的方法。该方法包括对微生物中参与基因组DNA复制和/或修复的DNA聚合酶的基因进行突变，获得一个具有不同基因组复制突变率和/或突变偏好性的DNA聚合酶基因的突变体文库；将该DNA聚合酶基因突变体文库导入微生物细胞中，实现各个DNA聚合酶基因突变体的表达，获得一个具有不同基因组DNA复制突变率和/或突变类型的微生物突变体文库；以及培养该微生物突变体文库，并从中筛选出具有改进表型的微生物突变体。在某些实施方案中，所述方法还包括重复筛选过程以产生更好的微生物表型。其中优选的实施方案包括在不断提高筛选压力的情况下对微生物细胞进行连续传代培养。在某些实施方案中，所述方法还包括将筛选出的具有改进表型的微生物突变体的基因组DNA复制突变率恢复到正常细胞水平。其中优选的实施方案包括去除微生物细胞中的DNA聚合酶突变体或将其替换成具有正常突变率的野生型DNA聚合酶。

在某些实施方案中，所述微生物为原核微生物，优选为细菌、蓝细菌或放线菌。在另外一些实施方案中，所述微生物为真核微生物，优选为酵母、霉菌等。

所述的表型是指微生物细胞表现出来的能力或者特质或微生物细胞未表现出来或缺陷的能力或特质，包括但不限于对不能天然利用的营养物质的利用能力、代谢物生产能力、对有害条件的耐受性、对缺陷的表型的恢复或代偿等。其中不能天然利用的营养物质是指微生物不能天然利用的化学物质，如糖类碳源、氨基酸类氮源等，代谢物是指在细胞中产生的任何分子，包括代谢中间体或终产物，如小分子化合物、肽、蛋白质、糖等。有害条件是指不利于微生物细胞生长的任何条件，如乙醇、丁醇等对细胞有毒的代谢物、卡那霉素、氨苄青霉素等抗生素、高糖浓度等对细胞有抑制作用的底物、高温、低温、过高或者过低的pH、过高或过低的渗透压、有害辐射、缺水环境等。所述缺陷的表型是天然缺陷的表型或人工引入的缺陷表型，如色氨酸代谢能力缺陷等。所述的改进的表型是指改造后的微生物子代细胞比亲本细胞在该表型方面具有更好的表现。所述的参与基因组DNA复制和/或修复的DNA聚合酶是指对基因组DNA复制突变率和/或突变类型有影响的DNA聚合酶或其亚基，包括但不限于DNA聚合酶I、II、III及其亚基δ、ε，3’-5’核酸外切酶，5’-3’核酸外切酶等，以及与它们具有相似功能的酶。

所述的对DNA聚合酶基因进行突变是指对DNA聚合酶的基因进行核苷酸的替换、缺失、添加等变化，获得DNA聚合酶基因的突变体。突变的方法可以采取本领域普通技术人员公知的方法，优选为使用定点突变、易错PCR、DNA改组、核苷酸合成等一种或多种组合方法，对整个核酸分子，或者其中一个或多个核苷酸位点，进行定点和/或随机的突变。

在某些实施方案中，DNA聚合酶基因的突变体是先连接到载体上后再导入微生物细胞，优选的载体为质粒、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。在另外一些实施方案中，DNA聚合酶基因的突变体是通过整合到微生物细胞的基因组上进行表达。

所述的将DNA聚合酶基因的突变体导入微生物细胞，可以使用本领域普通技术人员公知的方法，如氯化钙介导的化学转化、电击穿孔、注射、原生质体融合、转导等。

所述的DNA聚合酶基因突变体的表达是指该基因突变体在微生物细胞内通过转录、翻译、以及翻译后修饰等，形成具有功能的DNA聚合酶突变体，参与到微生物细胞内基因组DNA的复制和/或修复中。本发明的另一个目的，是提供通过本申请所述的任何方法得到的表型提高的微生物突变体。所述的微生物突变体可用于多种目的，比如某些代谢物生产能力和/或对有害条件耐受性提高的微生物突变体可以用于工业生产；某些对表面活性剂等有害物质耐受性提高的微生物突变体可以用于生物除污；某些对害虫杀菌效果提高的霉菌突变体可以用于农业杀菌剂。

本发明的另一个目的，是为微生物提供一系列具有不同DNA复制突变率和/或不同突变类型的DNA聚合酶基因突变体。所述的DNA聚合酶基因突变体可用于多种目的，比如可以根据突变率和突变类型的需要，使用本发明提供的单个DNA聚合酶基因突变体对微生物细胞的其它表型进行改造。

本发明所提供的改造微生物的方法是对微生物的整个基因组进行突变，随后根据需要筛选出表型改进的微生物，因而在提高微生物中由多基因、特别是未知基因调控的复杂表型(如代谢能力、耐受性等)方面具有较大优势。由于突变是由导入微生物细胞内的DNA聚合酶突变体在微生物基因组DNA复制和遗传时完成，因此整个突变和筛选过程可以在微生物的培养过程中自动、连续地进行，具有操作方便、快速的优点。另外，所导入的DNA聚合酶突变体是一个具有不同DNA复制突变率和/或不同突变偏好性的DNA聚合酶突变体的文库，即能应用于目前还没有报道DNA聚合酶突变体的微生物中，还能满足改造不同表型时对DNA复制突变率和/或突变类型要求不同的需要，具有应用范围广的优点。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1：显示带有pUC18、pQ-dnaQ和pQ-dnaQ-lib的大肠杆菌细胞在含有不同卡那霉素浓度的培养基中的生长情况。A：15ng/μl卡那霉素；B：100ng/μl卡那霉素；C：200ng/μl卡那霉素；A：300ng/μl卡那霉素。

图2：显示带有pUC18和pQ-dnaQ-M1的大肠杆菌细胞在6℃的生长情况。

图3：显示大肠杆菌丁醇耐受菌株BT-12、BT-13、BT-16与野生型大肠杆菌DH5α在含有不同浓度丁醇的LB培养基中的生长情况。

图4：显示酿酒酵母乙醇耐受菌株EthT与野生型酿酒酵母W303 在含有60g/l乙醇浓度的尿嘧啶缺失的合成培养基中的生长情况。

具体实施方式

下述实施例中所用方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，具体步骤可参见(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular cloning：a laboratory manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。若无特殊说明，所用引物均有Invitrogen公司合成；所用酶均为NEB公司生产；所用试剂盒均为Omega公司生产。

实施例1：构建大肠杆菌DNA聚合酶dnaQ基因的突变体文库

(1)大肠杆菌DNA聚合酶dnaQ基因(GeneBank登录号U00096.2)的克隆

使用基因组DNA提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α(购于Takara公司，目录号D9057)的基因组DNA。并以此DNA为模板，使用引物P1：5’-GGGCCGGAATTCTATGAGCACTGCAATTACACG-3’(SEQ ID NO.：1)和P2：5’-GGGCCGAAGCTTTGCTGCAAAAATCGCCCAAGT-3’(SEQ ID NO.：2)(带下划线为碱基分别为限制性内切酶EcoRI和Hind III的识别位点)和Taq DNA聚合酶，PCR扩增出dnaQ基因。扩增条件为：先98℃1min，然后98℃15sec，52℃30sec，72℃30sec，共30个循环；最后72℃10min。。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大约750bp的条带，与dnaQ基因大小相符。使用DNA纯化试剂盒对该扩增产物进行纯化，随后用EcoRI和HindIII酶切。然后与同样酶切的pUC18质粒(购于Takara公司，目录号D3218)进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于含有100ng/μl氨苄青霉素的LB平板上。挑取平板上长出的阳性克隆进行质粒提取和测序。结果表明质粒构建正确，命名为pQ-dnaQ。

(2)大肠杆菌DNA聚合酶dnaQ基因突变体文库的构建

以步骤1构建的重组质粒pQ-dnaQ为模板，在相同引物P1和P2的引导下进行易错PCR扩增。反应体系中MnCl₂浓度为0.2mM，PCR反应条件为：先94℃2min；然后94℃1min，52℃1min，72℃40 sec，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、DNA纯化试剂盒纯化、EcoR I和Hind III酶切、与同样酶切的质粒pUC18连接，得到含有dnaQ基因突变体的质粒文库，命名为pQ-danQ-lib。将该质粒文库电击导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过涂布于含有100ng/μl氨苄青霉素的LB平板上计数，表明大肠杆菌DNA聚合酶dnaQ基因突变体文库的大小约为1×10⁶-1.5×10⁶。随机挑选文库中5个dnaQ基因突变体进行测序，结果如表1所示。由此可见，该文库中每个dnaQ基因平均发生2.8个碱基突变，对应2个氨基酸突变，突变位置和种类没有明显偏好性。

表1大肠杆菌dnaQ基因突变体文库突变率分析

实施例2：提高大肠杆菌对卡那霉素的抗性

等量量取实施例1中构建的含有dnaQ基因突变体的质粒文库pQ-danQ-lib、含有野生型dnaQ基因的质粒pQ-dnaQ、以及没有连接任何dnaQ基因的空载体对照pUC18，分别电击转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。取0.2OD₆₀₀转化液，转接至含有100ng/μl氨苄青霉素和15ng/μl卡那霉素的LB液体培养基(LB/Amp¹⁰⁰/Kan¹⁵)中培养48h，并每24h测定一次培养液的OD₆₀₀值。然后重复上述培养过程并逐步提高培养基中卡那霉素的浓度(分别为100ng/μl、200ng/μl、300ng/μl卡那霉素)。整个培养(即突变和筛选)过程中细胞生长状况如图1所示。从图1A可以看出，在15ng/μl这个较低的卡那霉素筛选压力下，导入三种质粒的大肠杆菌细胞表现出类似的生长状况，但是随着卡那霉素筛选压力的逐步提高，特别是在含有300ng/μl卡那霉素的液体培养基中，只有含有dnaQ基因突变体的质粒文库pQ-danQ-lib的大肠杆菌细胞能够生长。

实施例3：提高大肠杆菌卡那霉素抗性的dnaQ基因突变体分析

将实施例2中能在含有300ng/μl卡那霉素的培养基生长的，带有pQ-danQ-lib质粒文库的大肠杆菌细胞涂布到含有同样卡那霉素浓度的固体培养基中，分离单菌落。随机挑选5个单菌落进行质粒提取和测序。如表2所示，所筛选到的dnaQ基因突变体分别含有1-5个氨基酸突变。将这5个dnaQ基因突变体质粒分别转入DH5α中培养16小时，取0.1OD₆₀₀的菌液涂布到含有100ng/μl利福平的LB平板上，避光培养48小时，对平板上长出的利福平抗性菌落计数，计算突变率，并将突变率结果列于表2中。可见，这5个dnaQ基因突变体的突变率各异，从15.3×10^-8到1155×10^-8，可以用于将来改进不同表型时所需不同突变率的要求。

表2.提高大肠杆菌卡那霉素抗性的dnaQ基因突变体性质分析

实施例4：大肠杆菌中dnaQ基因突变体的去除

将实施例3中分离得到的含有dnaQ基因突变体质粒pQ-dnaQ-M1的大肠杆菌单菌落在含有300ng/μl卡那霉素的LB平板上划线，分离单菌落。挑取30个单菌落分别在含有100ng/μl氨苄霉素的LB平板上划线。若划线后没有任何菌体长出，则证明原单菌落中突变体质粒pQ-dnaQ-M1已经消除。将该大肠杆菌命名为KanR1。

将野生型大肠杆菌DH5a，携带突变体质粒的大肠杆菌DH5a/pQ-dnaQ-M1，以及上述突变体质粒消除的大肠杆菌KanR1，分别挑取单克隆，接种到含有300ng/μl卡那霉素的LB液体培养基中，检验这些菌株是否能在该卡那霉素浓度下生长。另外，挑取上述4株菌株接种到LB液体培养基中，过夜培养16小时，取0.1OD₆₀₀的菌液涂布到含有100ng/μl利福平的LB平板上，避光培养48小时，对平板上长出的利福平抗性菌落计数，计算突变率。如表3所示，只有突变体质粒消除的大肠杆菌KanR1和携带突变体质粒的DH5a/pQ-dnaQ-M1能在含有300ng/μl卡那霉素的LB液体培养基中生长。另外，消除突变体质粒后，大肠杆菌KanR1的突变率大大降低，与野生型大肠杆菌DH5a处于同一水平，这表明对筛选获得的表型改进的大肠杆菌细胞进行突变体质粒消除，并不会导致改进表型的丧失，另外还可以降低细胞进一步发生突变的可能性，增加细胞的遗传稳定性。

表3比较大肠杆菌中dnaQ基因突变体质粒去除前后的表型及突变率

实施例5：提高大肠杆菌低温生长能力

等量量取实施例3中分离得到的含有dnaQ基因突变体质粒pQ-dnaQ-M1以及对照质粒pUC18，分别电击转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将转化液按1∶10⁵的比例转接到含有100ng/μl氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于6℃培养96h，并每24h测定一次培养液的OD₆₀₀值。如图2所示，经过96h的细胞培养(即突变和筛选过程)，含有dnaQ基因突变体质粒pQ-dnaQ-M1的大肠杆菌细胞在低温下的生长速度明显优于含有对照质粒的大肠杆菌细胞。

实施例6：提高大肠杆菌对丁醇的耐受能力

等量量取实施例1中构建的含有dnaQ基因突变体的质粒文库pQ-danQ-lib、含有野生型dnaQ基因的质粒pQ-dnaQ、以及没有连接任何dnaQ基因的空载体对照pUC18，分别电击转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。取300μl转化液，转接至含有100ng/μl氨苄青霉素和4g/l丁醇的LB液体培养基(LB/Amp¹⁰⁰/Btl⁴)中培养48h。然后重复上述培养过程并逐步提高培养基中丁醇的浓度(分别为5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l丁醇)。最终只有含有dnaQ基因突变体的质粒文库pQ-danQ-lib的大肠杆菌细胞能够在含有10g/l丁醇的培养基中生长。

将上述能在10g/l丁醇的培养基中生长的，带有pQ-danQ-lib质粒文库的大肠杆菌细胞涂布到含有同样丁醇浓度的固体培养基中，分离单菌落。随机挑选其中3个单菌落，按照实施例4消除其中的突变体质粒，最终获得三株能耐受10g/l丁醇胁迫的大肠杆菌菌株，分别命名为BT12、BT13、BT16(图3)。

实施例7：构建酿酒酵母DNA聚合酶polIII基因的突变体文库

(1)酿酒酵母DNA聚合酶pol3基因(GeneBank登录号X61920.1)的克隆

使用基因组DNA提取试剂盒提取酿酒酵母INVSc1(购于Invitrogen公司，货号C81000)的基因组DNA。并以此DNA为模板，使用引物P35’-AAATTCGAGCTCGGGCAATGGTGAAATTTCGACG-3’(SEQ ID NO.：3)和P45’-GGGCGGGAATTCGATTTTTCCAAGTATCTATTTATA-3’(SEQ ID NO.：4)(带下划线为碱基分别为限制性内切酶SacI和EcoRI的识别位点)和Taq DNA聚合酶，PCR扩增出Sce-pol3基因以及相应启动子。扩增条件为：先98℃1min；然后98℃15sec，58℃30sec，72℃2min，共30个循环；最后72℃10min。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大约3900bp的条带，与pol3基因大小相符。使用DNA纯化试剂盒对该扩增产物进行纯化，随后用EcoRI和SacI酶切。然后与同样酶切的pYES-2质粒(购于Invitrogen公司，货号V825-20)进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于含有100ng/μl氨苄青霉素的LB平板上。挑取平板上长出的阳性克隆进行质粒提取和测序，结果表明质粒构建正确，命名为pQ-pol3。

(2)酿酒酵母DNA聚合酶pol3基因突变体文库的构建

以步骤1构建的重组质粒pQ-pol3为模板，在相同引物P3和P4的引导下进行易错PCR扩增。反应体系中MnCl₂浓度为0.5mM，PCR反应条件为：先94℃2min；然后94℃1min，58℃1min，72℃4min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、DNA纯化试剂盒纯化、EcoR I和SacI酶切、与同样酶切纯化的质粒pYES-2连接，得到含有pol3基因突变体的质粒文库，命名为pQ-pol3-lib。将该质粒文库电击导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过涂布于含有100ng/μl氨苄青霉素的LB平板上计数，表明酿酒酵母DNA聚合酶pol3基因突变体文库的大小约为0.5×10⁶-1.0×10⁶。随机挑选文库中5个pol3基因突变体进行测序，结果如表1所示。由此可见，该文库中每个pol3基因平均发生3.5个碱基突变，对应2.8个氨基酸突变，突变位置和种类没有明显偏好性。

表4酿酒酵母pol3基因突变体文库突变率分析

实施例8：提高酿酒酵母对乙醇的耐受能力

等量量取实施例8中构建的含有pol3基因突变体的质粒文库pQ-pol3-lib、含有野生型pol3基因的质粒pQ-pol3、以及没有连接任何pol3基因的空载体对照pYES-2，分别电击转化到酿酒酵母INVSc1的感受态细胞中，取300μl转化液转接至含有30g/l乙醇的尿嘧啶缺失的合成培养基中培养48小时。然后重复上述培养过程并逐步提高培养基中乙醇的浓度(分别为35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l、60g/l乙醇)。最终只有含有pol3基因突变体的质粒文库pQ-pol3-lib的酿酒酵母细胞能够在含有60g/l乙醇的培养基中生长。

将上述能在60g/l乙醇的培养基中生长的，带有pQ-pol3-lib质粒文库的酿酒酵母细胞涂布到含有同样乙醇浓度的固体培养基中，分离单菌落。挑选其中1个单菌落，按照实施例4消除其中的突变体质粒，最终获得一株能耐受60g/l乙醇胁迫的酿酒酵母菌株，命名为EthT(图4)。

实施例9：构建丙酮丁醇梭菌DNA聚合酶CAC0738基因的突变体文库

(1)丙酮丁醇梭菌DNA聚合酶CAC0738基因(GeneBank登录号NC_003030.1)的克隆

使用基因组DNA提取试剂盒提取丙酮丁醇梭菌ATCC824(购于ATCC，目录号824^TM)的基因组DNA。并以此DNA为模板，使用引物P5：5’-GCCGGGGATCCATGAAATTCACAGCTATAGATT-3’(SEQ ID NO.：5)和P6：5’-GCCGGGAATTCCAAGCAAAATAATTATGTTAGT-3’(SEQ ID NO.：6)(带下划线为碱基分别为限制性内切酶BamHI和EcoR I的识别位点)和Taq DNA聚合酶，PCR扩增出CAC0738基因(SEQ ID：No.3)。扩增条件为：先98℃1min，然后98℃15sec，55℃30sec，72℃0.5min，共30个循环；最后72℃10min。。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大约900bp的条带，与CAC0738基因大小相符。使用DNA纯化试剂盒对该扩增产物进行纯化，随后用BamHI和EcoRI酶切。然后与同样酶切的pITF质粒(本实验室构建，在Dong，H.，et al.(2011).Engineering Clostridium Strain to Accept Unmethylated DNA.PLoS One 5，e9038中公开)进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于含有100ng/μl氨苄青霉素的LB平板上。挑取平板上长出的阳性克隆进行质粒提取和测序。结果表明质粒构建正确，命名为pQ-CAC0738。

(2)丙酮丁醇梭菌DNA聚合酶CAC0738基因突变体文库的构建

以步骤1构建的重组质粒pQ-CAC0738为模板，在相同引物P5和 P6的引导下进行易错PCR扩增。反应体系中MnCl₂浓度为0.15mM，PCR反应条件为：先94℃2min；然后94℃1min，55℃1min，72℃0.5min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、DNA纯化试剂盒纯化、BamHI和EcoR I酶切、与同样酶切的质粒pITF连接，得到含有CAC0738基因突变体的质粒文库，命名为pQ-CAC0738-lib。将该质粒文库电击导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过涂布于含有100ng/μl氨苄青霉素的LB平板上计数，表明丙酮丁醇梭菌CAC0738基因突变体文库的大小约为0.8×10⁶-1.3×10⁶。随机挑选文库中5个CAC0738基因突变体进行测序，结果如表1所示。由此可见，该文库中每个CAC0738基因平均发生2.2个碱基突变，对应1.2个氨基酸突变，突变位置和种类没有明显偏好性。

表5丙酮丁醇梭菌CAC0738基因突变体文库突变率分析

实施例10：提高丙酮丁醇梭菌对丁醇的耐受能力

等量量取实施例9中构建的含有CAC0738基因突变体的质粒文库pQ-CAC0738-lib、含有野生型CAC0738基因的质粒pQ-CAC0738、以及没有连接任何CAC0738基因的空载体对照pITF，分别电击转化到丙酮丁醇梭菌SMB009感受态细胞中。取2.5ml转化液，转接至含有50ng/μl红霉素和10g/l丁醇的RCM液体培养基(RCM/Em⁵⁰/Btl¹⁰)中培养48h。然后重复上述培养过程并逐步提高培养基中丁醇的浓度(分别为12g/l、13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l丁醇)。最终只有含有CAC0738基因突变体的质粒文库pQ-CAC0738-lib的丙酮丁醇梭菌细胞能够在含有18g/l丁醇的培养基中生长。

将上述能在18g/l丁醇的培养基中生长，带有pQ-CAC0738-lib质粒文库的丙酮丁醇细胞涂布到含有同样丁醇浓度的固体培养基中，分离单菌落。挑选其中1个单菌落，按照实施例4消除其中的突变体质粒，最终获得一株能耐受18g/l丁醇胁迫的丙酮丁醇梭菌菌株，命名为BtlR。与野生型菌株只能耐受13g/l丁醇相比，突变菌株的丁醇耐受能力提高了38.5％。

实施例11：提高丙酮丁醇梭菌的丁醇生产能力

将实施例9中构建的含有CAC0738基因突变体的质粒文库pQ-CAC0738-lib电击转化到丙酮丁醇梭菌SMB009感受态细胞中。将转化液涂布到含有16g/l丁醇和的RCM平板上，挑取生长最好的100个单克隆，接种至含有50ng/μl红霉素的RCM液体培养基中培养48h。用HPLC测定各菌株产生的丁醇的浓度，选取丁醇产量最高的30个菌落接种至含有50ng/μl红霉素的RCM液体培养基中培养48小时，将培养液涂布到含有18g/l丁醇的RCM平板上，挑取生长最好的100个单克隆，接种至含有50ng/μl红霉素的RCM液体培养基中培养48小时。用HPLC测定各菌株产生的丁醇的浓度，选取丁醇产量最高的30个菌落，重复上述培养过程。最终筛选得到一株丁醇生产能力提高的丙酮丁醇梭菌菌株，命名为BP-1。该菌株可以在60小时发酵时间内产生15.2g/l的丁醇，而改造前的原始菌株相同发酵条件下只能达到12.9g/l。

Claims

1.一种改造微生物、获得改进表型的方法，其包括下述步骤：

d)可选地，重复步骤c)以产生更好的微生物表型。

2.根据权利要求1所述的改造微生物、获得改进表型的方法，其特征在于还包括步骤：

3.根据权利要求1或2所述的改造微生物、获得改进表型的方法，其特征在于所述微生物为原核微生物或真核微生物，优选地，所述原核微生物为细菌、蓝细菌或放线菌，优选地，所述真核微生物为酵母或霉菌。

4.根据权利要求1-3任一项所述的改造微生物、获得改进表型的方法，其特征在于所述目标表型为对不能天然利用的营养物质的利用能力、代谢物生产能力、对有害条件的耐受性或对缺陷的表型的恢复或代偿，优选地，所述代谢物为代谢中间体或终产物，优选地，所述有害条件为有毒的代谢物、抗生素、有抑制作用的底物、高温、低温、过高或者过低的pH、过高或过低的渗透压、有害辐射、缺水环境，优选地，所述缺陷的表型是天然缺陷的表型或人工引入的缺陷表型。

5.根据权利要求1-4任一项所述的改造微生物、获得改进表型的方法，其特征在于所述微生物中参与基因组DNA复制和/或修复的DNA聚合酶为DNA聚合酶I、II、III或其亚基δ、ε，或3’-5’核酸外切酶，或5’-3’核酸外切酶，或与其具有相似功能的酶。

6.根据权利要求1-5任一项所述的改造微生物、获得改进表型的方法，其特征在于所述DNA聚合酶基因突变体是先连接到载体上后再导入微生物细胞或所述DNA聚合酶基因突变体通过整合到微生物细胞的基因组上进行表达，优选地，所述载体为质粒、噬菌粒、病毒基因组或人工染色体。

7.根据权利要求1-6任一项所述的改造微生物、获得改进表型的方法，其特征在于突变的方法为定点突变、易错PCR、DNA改组、核苷酸合成或其组合。

8.根据权利要求1-7任一项所述的改造微生物、获得改进表型的方法，其特征在于将DNA聚合酶基因突变体文库导入微生物细胞时采用氯化钙介导的化学转化、电击穿孔、显微注射、原生质体融合或转导进行。

9.根据权利要求1-8任一项所述的改造微生物、获得改进表型的方法获得的具有改进表型的微生物突变体。

10.一种微生物突变体文库，其根据权利要求1-8任一项所述的改造微生物、获得改进表型的方法获得。