CN103901128B - 一种中生菌素含量的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中生菌素含量的分析方法，采用液相色谱紫外检测法测定，采用纯水作溶剂，使用反相C18色谱柱，以离子对水溶液与纯乙腈的混合体系为流动相，所述离子对水溶液主要由占质量分数为0.01%-0.05%庚烷磺酸钠与PH=1.7-3.0的酸性缓冲溶液组成。该中生菌素含量分析方法中，采用离子对水溶液与纯乙腈为流动相以及反相C18色谱柱，能够得到出色的峰形，且色谱柱再生时更加的方便，延长了色谱柱的使用寿命，使用的流动相大部分是水，从而降低了检测成本，适合于中生菌素含量的实时监测，所得的结果更加准确。
Description
技术领域
本发明涉及分析测试技术领域，具体涉及一种中生菌素含量的分析方法。
背景技术
中生菌素是我国自主研发成功的一种新型农用抗生素，由淡紫灰链霉菌海南变种B-7发酵产生，英文通用名zhongshengmycin，化学名称为1-N甙基链里定基-2-氨基L-赖氨酸-2脱氧古罗糖胺，分子由三部分组成，古洛糖胺、链里定和β-赖氨酸。结构式如下：
式中：主要有效成份为n=1，2，3，次要成分为n=4，5。
中生菌素它为杀菌谱较广的保护性杀菌剂，能抗革兰氏阳性及阴性细菌、分枝杆菌、酵母菌及丝状真菌；具有触杀、渗透作用。由于其广谱高效的杀菌功能在农药中具有可观的发展前景，市场潜力大。
作为一类生物农药，中生菌素也面临着其它药剂所出现的问题：农药有效成分含量是否达标；药剂如何合理使用；其药物残留可能给人类健康带来严重危害。因此，生产和使用中需建立一种高效、准确、快捷的测定方法，来确定有效成分中生菌素的准确含量。
目前中生菌素含量分析方法为生物效价或柱前衍生后荧光检测法。生物效价法由于无法将一些有效杂质分离，不能客观反应有效成分的含量，且费时，重现性与准确性远不及仪器分析。柱前衍生后荧光检测法，需要柱前衍生，步骤繁琐、溶剂毒性大；另外，由于中生菌素原药及其制剂中除了含有中生菌素之外，还含有其他物质，采用衍生的分析方法衍生试剂与杂质对有效成分的测定都会带来严重的干扰，无法准确测定中生菌素的含量。
发明内容
有鉴于此，提供一种中生菌素含量的分析方法，采用液相色谱紫外检测分析方法，具有简便、准确、快速、可靠的特点，对中生菌素原药及其制剂中有效成分中生菌素的定量分析有重要的实用价值。
一种中生菌素含量分析方法，采用液相色谱紫外检测法测定，采用纯水作溶剂，使用反相C18色谱柱，以离子对水溶液与纯乙腈的混合体系为流动相，所述离子对水溶液主要由占质量分数为0.01%-0.05%庚烷磺酸钠与PH=1.7-3.0的酸性缓冲溶液组成。
在上述中生菌素含量分析方法中，选用这种色谱柱后，能够得到出色的峰形，且色谱柱再生时更加的方便，延长了色谱柱的使用寿命；同时由于采用了这种C18硅胶作为填充物，可以使用的流动相大部分是水，从而降低了检测成本，适合于中生菌素含量的实时监测，所得的结果更加准确。现有的技术中没有相应的采用液相色谱紫外检测的分析方法，本发明填补了现有技术中相应领域的技术空白，采用上述方法检测中生菌素的含量，杂质峰少，结果准确，重复性好，分析快速，所得的结果可信度高，特别适用于中生菌素原药及其农药制剂产品中有效成分中生菌素的质量控制，对保证中生菌素农药产品的质量和拓展中生菌素农药制剂在农业生产实践中的应用，具有重要作用和现实意义。
附图说明
图1是中生菌素对照品（标准品）的HPLC紫外检测色谱图。
图2是10%中生菌素原粉的HPLC紫外检测色谱图。
图3是3%中生菌素可湿性粉剂的HPLC紫外检测色谱图。
图4是中生菌素纯品（对照品）的UPLC紫外检测色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的详细说明。
本发明实施例提供一种中生菌素含量分析方法，采用液相色谱紫外检测法测定，采用纯水作溶剂，使用反相C18色谱柱，以离子对水溶液与纯乙腈的混合体系为流动相，所述离子对水溶液主要由占质量分数为0.01%-0.05%庚烷磺酸钠与PH=1.7-3.0的酸性缓冲溶液组成。
该色谱柱优选采用粒径为1.7-5微米的十八烷基硅烷键合硅胶填充，柱长5-25厘米，内径为2.1-4.6毫米，理论塔板数3000-5000。更优选地，色谱柱采用粒径为5微米的十八烷基硅烷键合硅胶填充，柱长15-25厘米，理论塔板数3000-5000的色谱柱。
优选地，所采用的流动相中乙腈的体积分数为10%至25%，流动相的流速为0.3-1.0mL/min。更优选地，所述的流动相中乙腈的体积分数为17%。流动相的流速可以是低于0.4mL/min，例如可以是0.3mL/min，0.35mL/min，0.38mL/min等。所述酸性缓冲溶液为0.02-0.5%体积分数的磷酸或0.01-0.25%体积分数的三氟乙酸。优选地，所述庚烷磺酸钠的质量分数为0.02%-0.04%，所述酸性缓冲溶液为0.05-0.20%体积分数的磷酸，磷酸体积分数可以是0.06%，0.07%，0.08%，0.09%，0.10%，0.12%，0.15%，0.18%等;或0.02-0.10%%体积分数的三氟乙酸，三氟乙酸体积分数可以是0.03%，0.04%，0.05%，0.06%，0.07%，0.08%，0.09%等。更优选地，所述庚烷磺酸钠的质量分数为0.02%，所述酸性缓冲溶液为0.10%体积分数的磷酸或0.05%体积分数的三氟乙酸。优选地，所述酸性缓冲溶液的PH=1.7-2.0，例如可以是1.8，1.9，2.0等。所述液相色谱紫外检测方法采用等度洗脱法。所述液相色谱紫外检测的检测波长为195nm-220nm，优选为低于210nm，例如可以是195nm，198nm，200nm，210nm等。每次进样的样品体积为5-10微升。可以理解的是，酸性缓冲溶液所用的酸并不限于以上种类，例如可以是醋酸、柠檬酸、草酸等。
上述色谱分析采用纯水作为溶剂，以及离子对试剂也为水溶液，克服现有技术中通常采用有机溶剂或采用有机相的不足。更为有利的是，上述色谱分析优选采用等度洗脱法，可以避免梯度洗脱法的复杂程序，传统的液相色谱分析为了将杂质与有效成分得到较好的分离，通常需要采用梯度洗脱法。离子对水溶液对色谱的作用机理是：延长被分离化合物在色谱柱中的保留，也即加强被分离化合物在色谱柱上的吸附。中生菌素容易从色谱柱上洗脱，本发明实施例采用酸性缓冲溶液和庚烷磺酸钠混合水溶液作为离子对试剂，加强中生菌素在色谱柱上的吸附。
具体检测方法如下：以下的流动相比例全是体积分数。
为了得到良好的分离效果，采用0.02%质量分数的庚烷磺酸钠与0.10%体积分数的磷酸或0.05%体积分数的三氟乙酸组成的离子对水溶液与乙腈的混合体系为流动相，所述乙腈含量为10%至25%体积分数，优选采用乙腈含量为17%体积分数，由此可知采用的流动相中大部分为水，从而降低了检测的成本，同时减少了有机溶剂对环境的污染，降低了对操作人员的危害。
用纯水作溶剂分别溶解标准物质和待测样品，得到标样和试样；
将检测波长设定为195-220nm，仪器基线稳定后按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，分别对标样和试样的中生菌素峰面积进行平均，得其峰面积平均值；
按式（1）对中生菌素的含量进行计算：
（式1）
式中：
A1——标样中，中生菌素峰面积的平均值；
A2——试样中，中生菌素峰面积的平均值；
m1——标样的质量(g)；
m2——试样的质量(g)；
P——标样中中生菌素的含量(%)；
X——试样中中生菌素的含量(%)。
针对于中生菌素，现有的技术中没有相应的采用液相色谱紫外检测的分析方法，而其检测波长也是未知的，通过对其自身性质的研究，本实施例将其检测波长确定在195nm至220nm，在该波长内，可以采用液相色谱紫外检测对其进行含量的分析，提高了检测的精确度和准确度，同时也填补了现有技术中的空白。
为了达到更好的检测效果和准确度，开启机器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5%时再进行依次进样，这样可以有效的降低由于仪器开机后的不稳定而造成的误差，提高最终检测结果的准确度。
同时采用高效液相色谱紫外检测法，本实施例将流动相中乙腈的体积分数优选为17%，每次进样的样品体积为10微升；控制流动相的流速为1.0mL/min，检测的波长为210nm。在这样的检测条件下，能够达到较好的检测结果和准确度。
实施过程中例一至例七所采用的液相色谱仪为UltiMate3000型高效液相色谱仪(戴安中国有限公司)、配有二极管阵列检测器、WPS3100SL自动进样器、LPG3400A四元泵、chromeleon工作站。
实施例一
1.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径5微米，色谱柱长250毫米，内径4.6毫米的不锈钢柱，柱室温度为室温，理论塔板数4000，采用0.02%庚烷磺酸钠与0.10%体积分数的磷酸组成的离子对水溶液：乙腈体积比=81：19的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，进样体积为10微升。
2.标样配制
准确称取中生菌素标样（由国家农药检测中心提供，含量为100%)0.0532克于100mL容量瓶中，用水溶解定容，摇匀（此标准溶液为A液），再用移液管准确吸取该液5.00mL于50mL容量瓶中，用水定容，摇匀备用（以下实施例二至实施例八中标样配制同此）。
3.试样配制
准确称取含中生菌素0.05g（精确至0.2mg）的同一批号(20110923)试样（10%中生菌素原粉）6份分别置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，超声振荡溶解后，冷却至室温，再用移液管准确吸取该液5.00mL于50mL容量瓶中，用水定容，摇匀，用0.22微米的针头过滤器过滤后得到平行试样备用。
4.测试与数据处理
开启仪器自检通过后，在规定的操作条件下，仪器基线稳定后，连续注入数针标样，计算各针相对响应值，达到相邻两针相对响应值变化小于1.5%时，按标样、试样、试样、标样的顺序依次进样，在210nm波长下检测，见图1和图2。按式（1）计算试样的有效成分含量，中生菌素的含量为11.21%,标准偏差为0.10,变异系数为0.89%,结果表明方法的精密度好(见表1)。
表1平行测定结果（精密度）
实施例二
1.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径4微米，色谱柱长200毫米，内径4.6毫米的不锈钢柱，柱室温度为室温，理论塔板数5000，采用0.02%庚烷磺酸钠与0.10%体积分数的磷酸组成的离子对水溶液：乙腈体积比=83：17的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为200nm，进样体积为10微升。
2.试样配制
准确量取上述实施例一中标准溶液A液10、5、2.5、0.5、0.25、0.125、0mL，分别置于7个25mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀待测。
3.测试与数据处理
依法在200nm进行测定，以试样质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线,计算得到中生菌素的线性回归方程为y=0.2138x-0.5920，R2=0.9997，可看出中生菌素在2.66～532mg/L（见表2）范围内有良好的线性关系。
表2中生菌素浓度与峰面积对应表
| 样品名称 | 中生菌素浓度(mg/L) | 中生菌素峰面积 |
| 浓度1 | 532 | 113.7732 |
| 浓度2 | 212.8 | 43.5763 |
| 浓度3 | 106.4 | 21.9471 |
| 浓度4 | 53.2 | 10.5574 |
| 浓度5 | 10.64 | 1.6654 |
| 浓度6 | 5.32 | 0.7414 |
| 浓度7 | 2.66 | 0.3301 |
| 浓度8 | 0 | 0.0599 |
实施例三
1.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径3微米，色谱柱长150毫米，内径4.6毫米的不锈钢柱，柱室温度为室温，理论塔板数3500，采用0.02%庚烷磺酸钠与0.10%体积分数的磷酸组成的离子对水溶液：乙腈体积比=87：13的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为205nm，进样体积为10微升。
2.试样配制
准确称取10%中生菌素原粉0.5189g置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，超声振荡溶解后，冷却至室温，再用移液管准确吸取该液5.00mL于50mL容量瓶中，用水定容，摇匀，用0.22微米的针头过滤器过滤后，得到试样备用。
3.测试与数据处理
不同时间依法在205nm进行测定，按式（1）计算试样的有效成分含量，结果列于表3。由表中数据可见，该方法的时间稳定性良好。
表3
| 时间（h） | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 24 | CV,% |
| 峰面积 | 7.7068 | 7.7344 | 7.7550 | 7.7206 | 7.6998 | 7.7482 | 0.26 |
实施例四
1.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径4微米，色谱柱长250毫米，内径4.6毫米的不锈钢柱，柱室温度为室温，理论塔板数4000，采用0.02%庚烷磺酸钠与0.05%体积分数的三氟乙酸组成的离子对水溶液：乙腈体积比=80：20的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，进样体积为10微升。
2.试样配制
分别称取已知含量的中生菌素可湿性粉剂(中生菌素含量1.78%)试样0.3232g、0.3056g、0.3075g、0.2633g、0.2841g,置于5个不同100mL容量瓶中,并用移液管分别加入实施例一中的标准溶液A液1、2、5、10、20mL，用水超声溶解,冷却至室温后加水定容,摇匀。准确吸取上述不同样品溶液各5.00mL于5个不同50mL容量瓶中，用水稀释并定容,摇匀，用0.22微米的针头过滤器过滤后备用。
3.测试与数据处理
依法在210nm进行测定，见图3。按式（1）计算试样的有效成分含量，按式（2）计算其加标回收率,结果列于表4。由表中数据可见，该方法的准确度好。其加标回收率计算公式（2）为:
表4
实施例五
1.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径5微米，色谱柱长200毫米，内径4.6毫米的不锈钢柱，柱室温度为室温，理论塔板数4500，采用0.02%庚烷磺酸钠与0.05%体积分数的三氟乙酸组成的离子对水溶液：乙腈体积比=83：17的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，进样体积为10微升。
2.试样配制
不同人员在不同实验室准确称取含中生菌素0.05g（精确至0.2mg）的同一批号(20120908-9)试样（10%中生菌素原粉）各3份，分别置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，超声振荡溶解后，冷却至室温，再用移液管准确吸取该液5.00mL于50mL容量瓶中，用水定容，摇匀，用0.22微米的针头过滤器过滤后备用。
3.测试与数据处理
依法在210nm进行测定，按式（1）计算试样的有效成分含量，结果列于表5。由表中数据可见，该方法实验结果的再现性良好，适用性强。
表5
实施例六
1.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径5微米，色谱柱长150毫米，内径4.6毫米的不锈钢柱，柱室温度为室温，理论塔板数3000，采用0.02%庚烷磺酸钠与0.10%体积分数的磷酸组成的离子对水溶液：乙腈体积比=90：10的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为195nm，进样体积为10微升。
2.试样配制
准确称取含中生菌素0.05g（精确至0.2mg）的药肥A，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，超声振荡溶解后，冷却至室温，再用移液管准确吸取该液5.00mL于50mL容量瓶中，用水定容，摇匀，用0.22微米的针头过滤器过滤后备用。
3.测试与数据处理
依法在195nm进行测定，按式（1）计算试样的有效成分含量,结果为2.67%，数据如下:
实施例七
1.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，粒径3.5微米，色谱柱长250毫米，内径4.6毫米的不锈钢柱，柱室温度为室温，理论塔板数4500，采用0.02%庚烷磺酸钠与0.05%体积分数的三氟乙酸组成的离子对水溶液：乙腈体积比=75：25的混合溶液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，进样体积为10微升。
2.试样配制
准确称取含中生菌素0.05g（精确至0.2mg）的药肥B，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，超声振荡溶解后，冷却至室温，再用移液管准确吸取该液5.00mL于50mL容量瓶中，用水定容，摇匀，用0.22微米的针头过滤器过滤后备用。
3.测试与数据处理
依法在220nm进行测定，按式（1）计算试样的有效成分含量,结果为1.94%，数据如下:
实施例八
1.仪器
WatersAcquityUPLC超高效液相色谱仪、ACQUITYUPLCBinarySolventMgr、ACQUITYUPLCAutosampler、ACQUITYUPLCColumnHeater、二极管阵列检测器、Empower工作站（美国沃特世有限公司）。
2.色谱条件
色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC181.7μm2.1×50mm(i.d.)不锈钢柱，柱室温度为室温，采用0.02%庚烷磺酸钠与0.05%体积分数的三氟乙酸组成的离子对水溶液：乙腈体积比=81：19的混合溶液为流动相，流速为0.3mL/min，检测波长为197nm，进样体积为5微升。
3.试样配制
准确称取中生菌素纯品0.0516g，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，超声振荡溶解后，冷却至室温，再用移液管准确吸取该液5.00mL于50mL容量瓶中，用水定容，摇匀，用0.22微米的针头过滤器过滤后备用。
4.测试与数据处理
依法在197nm进行测定，见图4。按式（1）计算试样的有效成分含量,结果为99.35%，数据如下:
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种中生菌素含量分析方法，其采用液相色谱紫外检测法测定，液相色谱分析采用等度洗脱法，检测波长为195nm-220nm，采用纯水作溶剂，使用反相C18色谱柱，以离子对水溶液与纯乙腈的混合体系为流动相，所述流动相中乙腈的体积分数为10%至25%，流动相的流速为0.3-1.0mL/min，所述离子对水溶液主要由占质量分数为0.01%-0.05%庚烷磺酸钠与PH=1.7-2.0的酸性缓冲溶液组成，所述酸性缓冲溶液为磷酸、三氟乙酸、醋酸、柠檬酸或草酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所用色谱柱采用粒径为1.7-5微米的十八烷基硅烷键合硅胶填充，柱长5-25厘米，内径为2.1-4.6毫米，理论塔板数3000-5000。
3.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于，所用色谱柱采用粒径为5微米的十八烷基硅烷键合硅胶填充。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的流动相中乙腈的体积分数为17%，流速为1.0mL/min。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述酸性缓冲溶液为在离子对水溶液中占0.02-0.5%体积分数的磷酸或0.01-0.25%体积分数的三氟乙酸。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，所述庚烷磺酸钠在离子对水溶液中所占的质量分数为0.02%，所述酸性缓冲溶液为在离子对水溶液中占0.10%体积分数的磷酸或0.05%体积分数的三氟乙酸。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，每次进样的样品体积为5-10微升。
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