CN103102396A - 新型硫链丝菌素类似物及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型硫链丝菌素类似物及其制法和用途。具体地,本发明提供了对硫链丝菌素(Thiostrepton)侧链末端的喹啉H进行氟取代而获得的硫链丝菌素类似物。所获得的硫链丝菌素类似物具有更高的抗菌活性。与硫链丝菌素相比,氟代硫链丝菌素对枯草杆菌等革兰氏阴性菌的抗菌活性提高了3倍。
Description
技术领域
本发明属于药物领域和生物技术工程领域,具体地,本发明涉及一类新型硫链丝菌素类似物及其制法和用途。
背景技术
硫肽类抗生素是一类富含硫元素,氨基酸残基被高度修饰的环肽类化合物,它们中大部分都是由放线菌产生,具有良好的抗菌活性。这类化合物都拥有一个三或四取代的吡啶核心,多个噻唑、噁唑或噻唑啉等氮杂环及脱水氨基酸,有的还带有高度修饰的芳香环侧链。
研究表明,硫肽类抗生素大都可以抑制细菌(尤其是革兰氏阳性菌)的生长,对多种耐药性的条件致病菌具有较强的杀伤作用。硫肽类抗生素作用机制都是通过与核糖体结合,从而抑制蛋白质的合成来实现的。根据它们结合位点的不同,大体上可分为两类:(1)与50S核糖体亚单元上的23S rRNA-L11蛋白复合物结合,抑制延长因子的GTPase活性,从而抑制蛋白质的合成;(2)与延长因子Tu蛋白复合物结合,抑制Ef-Tu·GTP·aa-tRNA复合物的形成,从而抑制蛋白质的合成。
硫链丝菌素(Thiostrepton)是硫肽类抗生素家族中较早发现的成员之一,由于其优良的抗菌活性,很早就在工业上得到广泛的应用。但是由于其结构复杂,直到1989才年借助X晶体衍射技术才最终确定了其分子结构。在结构上,硫链丝菌素除了具有硫肽类抗生素的特征大环骨架以外,还具有一个特殊的喹啉侧环,因此合成途径非常复杂。即使是在有机合成化学高度发达的今天,通过化学全合成来获得产品也是一项艰巨的挑战。直到2004年才首次报道了硫链丝菌素的化学全合成[Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,5087;Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,5092],但是整个合成过程操作繁琐,产率低下。
为了提高硫链丝菌素的抗菌活性以及其他特性,本领域一直在尝试开发硫链丝菌素的各类衍生物或类似物,然而迄今为止尚未成功开发出具有活性更高等优点的硫链丝菌素类似物。因此,本领域迫切需要开发各类新型的硫链丝菌素类似物。
发明内容
本发明的目的就是提供一类具有更高活性的新型硫链丝菌素类似物。
本发明的另一目的是提供所述的硫链丝菌素类似物的制法和用途。
本发明的另一目的是提供一种用于制备硫链丝菌素类似物的突变合成元及其制备方法和用途。
在本发明的第一方面,提供了一种硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐,所述的硫链丝菌素类似物具有式Ⅰa或Ⅰb所示的结构式:
式Ⅰa 式Ⅰb
在本发明的第二方面,提供了一种药物组合物,所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面,提供了本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐的用途,所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐被:
(a)用于制备抗菌的组合物;
(b)用于抑制微生物生长的组合物;
(c)用于制备治疗微生物或细菌感染的组合物;或
(d)用作饲料添加剂。
在另一优选例中,所述的组合物是药物组合物和饲料组合物。
在另一优选例中,所述的饲料添加剂是抗菌剂。
在另一优选例中,所述的微生物或细菌包括革兰氏阳性菌。
在本发明的第四方面,提供了一种体外非治疗性地抑制微生物生长或者杀灭微生物的方法,包括步骤:在需要处理的场所施用本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐。
在本发明的第五方面,提供了一种制备药物组合物的方法,包括步骤:将本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体进行混合,从而形成药物组合物。
在本发明的第六方面,提供了一种治疗动物细菌感染的方法,包括步骤:给需要治疗的动物施用本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐或本发明第二方面所述的药物组合物。
在另一优选例中,所述的动物包括:哺乳动物、家畜(如牛、猪、羊等)和家禽(如鸡、鸭、鹅等)。
在本发明的第七方面,提供了一种制备饲料组合物的方法,包括步骤:将本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐作为饲料添加剂和饲料原料进行混合,从而形成含有硫链丝菌素类似物或其盐的饲料组合物。
在本发明的第八方面,提供了一种可用于产生本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物的劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)突变菌株,所述的菌株中硫腺苷甲硫氨酸转移酶基因(tsrT)被失活或敲除。
在本发明的第九方面,提供了一种制备本发明第一方面所述的硫链丝菌素类似物的方法,包括步骤:
(a)用突变合成元饲喂本发明的第八方面所述的劳伦链霉菌(Streptomyceslaurentu)突变菌株,从而产生本发明的第一方面所述的硫链丝菌素类似物;和
(b)从发酵产物中分离出所述的硫链丝菌素类似物。
在另一优选例中,所述的突变合成元具有式Ⅱa或式Ⅱb所示的结构:
式Ⅱa 式Ⅱb
在本发明的第十方面,提供了一种制备具有式Ⅱa或式Ⅱb所示突变合成元的方法,包括步骤:
(a)式Ⅲa化合物与醇ROH进行反应,生成式Ⅳa化合物;
式Ⅲa 式Ⅳa
或,式Ⅲb化合物与醇ROH进行反应,生成式Ⅳb化合物;
(b)式Ⅳa化合物与乙醛进行反应,生成式Ⅴa化合物;
式Ⅳa 式Ⅴa
或,式Ⅳb化合物与乙醛进行反应,生成式Ⅴb化合物;
式Ⅳb 式Ⅴb
(c)式Ⅴa化合物水解,获得式Ⅱa所示的突变合成元;
式Ⅴa 式Ⅱa
或,式Ⅴb化合物水解,获得式Ⅱb所示的突变合成元。
式Ⅴb 式Ⅱb
在另一优选例中,步骤(a)所述的醇ROH任选自下组:甲醇,乙醇,正丙醇,或正丁醇。
在另一优选例中,步骤(a)所述的反应在二氯亚砜作用下反应。
在另一优选例中,步骤(b)所述的反应在三氯乙酸、硫酸铁和双氧水的作用下反应。
在另一优选例中,步骤(c)所述水解为碱解。
在另一优选例中,步骤(c)所述水解为氢氧化钠水解。
在本发明的第十一方面,提供了一种具有式Ⅱa或式Ⅱb所示突变合成元的用途,所述突变合成元用于制备本发明第一方面所述的硫链丝菌素衍生物其药学上可接受的盐。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定本发明的范围。
图1表示突变合成元4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的化学合成路线。
图2为6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的1H NMR(400MHz,CDCl3)。
图3为6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的13C NMR(100MHz,CDCl3)。
图4为6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的19F NMR(282MHz,CDCl3)。
图5为4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的1H NMR(300MHz,CDCl3)。
图6为4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的13C NMR(100MHz,CDCl3)。
图7为4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的19F NMR(282MHz,CDCl3)。
图8为4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸的1H NMR(300MHz,acetone-d6)。
图9为4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸的13C NMR(100MHz,acetone-d6)。
图10为4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸的19F NMR(282MHz,acetone-d6)。
图11为6’-氟硫链丝菌素的1H NMR(600MHz,CDCl3)。
图12为6’-氟硫链丝菌素的13C NMR(150MHz,CDCl3)。
图13为6’-氟硫链丝菌素的19F NMR(282MHz,CDCl3)。
图14为6’-氟硫链丝菌素的HMBC(600MHz,CDCl3)。
图15为6’-氟硫链丝菌素的1H-1H COSY(600MHz,CDCl3)。
图16为6’-氟-链丝菌素的HSQC(600MHz,CDCl3)。
图17表示通过喂养突变株SL1102获得6’-氟代硫链丝菌素的HPLC分析结果,其中,图17A为野生型Streptomyces laurentii ATCC31255的发酵结果;图17B为突变株SL1102的负对照(无4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸)的发酵结果;图17C为突变株SL 1102与4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸共同发酵产生6’-氟硫链丝菌素的发酵结果。
符号说明
图1中,TFA:三氟乙酸;THF:四氢呋喃。
图17中,TSR:硫链丝菌素;6’-fluoro-TSR:6’-氟-硫链丝菌素。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,对硫链丝菌素生物合成基因簇的克隆以及生物合成机制研究,利用突变生物合成方法,意外地发现,当用氟取代硫链丝菌素喹啉环上的H(式Ⅰa和Ⅰb化合物)时,制备的硫链丝菌素衍生物的生物活性大大提高。具体地,当用氟取代硫链丝菌素喹啉环上的6-H或5-H时(式Ⅰa和Ⅰb化合物),生物活性提高3倍。在此基础上完成了本发明。
活性成分
如本文所用,术语“本发明的活性成分”、“本发明化合物”和“本发明的硫链丝菌素衍生”可以互换使用,都指氟取代的硫链丝菌素,如式Ⅰa所示的6’-氟硫链丝菌素和式Ⅰb所示的5’-氟硫链丝菌素。
应理解,所述术语还包括及本发明化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
一类优选的硫链丝菌素类似物具有下式Ⅰ所示的结构式:
式Ⅰa 式Ⅰb
如本文所用,术语“6’-氟-TSR”表示6’-氟硫链丝菌素,其结构式如式Ⅰa所示。
如本文所用,术语“5’-氟-TSR”表示5’-氟硫链丝菌素,其结构式如式Ⅰb所示。
如本文所用,术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的盐。可以由阳离子与本发明化合物上的带负电荷的基团(例如羧酸根)形成盐。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子,例如四甲基铵离子。适合形成盐的碱包括但并不限于:碱金属和碱土金属的氢氧化物(如NaOH、KOH)、碱金属和碱土金属的氧化物、碱金属和碱土金属的碳酸盐(如碳酸钠)、氨水、有机胺等。
本发明人不仅通过对氟代硫链丝菌素的大量发酵以及分离纯化,确证了化合物的结构。此外,通过抗菌活性实验证实了,本发明的氟代硫链丝菌素比硫链丝菌素的抗菌活性有显著提高。
本发明化合物除了抗菌的活性成分用于制备药物以及作为饲料添加剂用于制备饲料组合物之外,本发明化合物还可用作制备其他硫链丝菌素衍生物的中间体,可用于进一步化学衍生化产生其他硫链丝菌素的类似物。
突变合成元
如本文所用,术语“突变合成元”指参与本发明氟代硫链丝菌素合成的化合物,其中所述的化合物具有式Ⅱ所述的结构。此化合物被用于合成或制备本发明的硫链丝菌素衍生物,可以自行制备。
本发明还提供了一种制备具有式Ⅱ所示突变合成元的方法,以6’-氟取代为例,所述方法包括步骤:
(a)式Ⅲa化合物与醇ROH进行反应,生成式Ⅰva化合物;
式Ⅲa 式Ⅳa
(b)式Ⅳa化合物与乙醛进行反应,生成式Ⅴa化合物;
式Ⅳa 式Ⅴa
(c)式Ⅴa化合物水解,获得式Ⅱa所示的突变合成元。
式Ⅴa 式Ⅱa
在另一优选例中,步骤(a)所述醇ROH任选自下组:甲醇,乙醇,正丙醇,或正丁醇。
在另一优选例中,步骤(a)所述的反应在二氯亚砜作用下反应。
在另一优选例中,步骤(b)所述的反应在三氯乙酸、硫酸铁和双氧水的作用下反应。
在另一优选例中,步骤(c)所述水解为碱解。
在另一优选例中,步骤(c)所述水解为氢氧化钠水解。
出发菌株
如本文所用,术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”指编号为ATCC31255的劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)。本发明的出发菌株由美国华盛顿大学H.G.Floss教授馈赠,保存在美国模式培养物集存库(ATCC),编号为Streptomyces laurentii ATCC31255。应理解,出发菌株不仅包括编号为Streptomyces laurentii ATCC31255的菌株,还包括其衍生菌株。
工程菌及其制备
本发明还提供了可用于生产本发明化合物的工程菌。
在本发明的一个优选例中,提供了一种生产本发明硫链丝菌素类似物的劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)突变菌株,其中,所述的菌株中硫链丝菌素生物合成基因簇中的硫腺苷甲硫氨酸转移酶基因(tsrT)敲除。
本发明的工程菌可以用任何含有硫链丝菌素生物合成基因簇、能够产生硫链丝菌素的菌株为出发菌株,通过基因敲除或失活的方法(例如通过同框缺失的手段)而构建。例如,目前常用的产生硫链丝菌素的菌株包括(但并不限于):劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)。
本发明还提供了一种构建可产生硫链丝菌素类似物突变株的方法,它包括同框质粒的构建,将质粒导入野生型菌株,通过同源臂的与野生型菌株基因组的重组,从而从基因组中敲除相应基因,从而获得基因同框缺失或失活的突变株。缺失硫链丝菌素生物合成基因簇中的硫腺苷甲硫氨酸转移酶(tsrT)的突变株无法正常合成硫链丝菌素。
在本发明的一个优选例中,提供了一种构建突变株,并发酵突变株制备甲酯硫链丝菌素和羧酸硫链丝菌素的方法,其中包括:
1.构建tsrT同框缺失质粒的
PCR扩增用于基因敲除的tsrT基因的左臂和右臂片段,将这两个片段连入pKC1139中(US5,955,319),获得重组质粒。将重组质粒转化到E.coli DH5α,挑取单克隆菌落扩增培养,并将扩增后并验证正确的质粒转化E.coli ET12567中。
2.制备重组菌株
收集野生型的Streptomyces laurentii的新鲜孢子,并用SET缓冲溶液清洗两次。清洗后的孢子重悬在500uLSET缓冲液中,放于50℃水浴中热激。热激后的孢子在30℃萌发3小时左右,与含有重组质粒的E.coli ET 12567在MS平板上按照一定比例混合涂抹,并30℃中培养12小时后用阿伯拉霉素覆盖平板。接合子在温箱培养2到3天后长出,挑选接合子到阿伯拉抗性平板上37℃培养2到3天。选取长势良好的接合子于TSB(无抗性)溶液中传代三次以上,再于平板上划线筛选单菌落。通过阿伯拉抗性筛选,选取不具有阿伯拉抗性的菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得tsrT同框缺失的重组菌株。
活性成分的制备
本发明还提供了一种制备式Ⅰ化合物的方法,包括步骤:
用式Ⅱ化合物对经改造的工程菌株(重组株)进行饲喂;
从培养物中提取式Ⅰ化合物;
离心弃去上清,丙酮浸泡菌体,过滤除去不溶物,滤液经减压蒸馏抽干,获得的膏状物先用100-200目硅胶预装的正相柱进行粗分,再用HPLC制备进一步纯化,收集式Ⅰ化合物的流出液,最终得到目标产物。
本发明人不仅通过对式Ⅰ化合物的大量发酵以及分离纯化确证了化合物的结构,而且通过抗菌活性实验证实了本发明的活性产物比硫链丝菌素的抗菌活性有显著的提高。
药物组合物和施用方法
本发明化合物中的具有优良的抑菌(抗菌)活性,因此可用作抗菌素(或抗生素)。例如,6’-氟代硫链丝菌素硫链丝菌素具有高于硫链丝菌素约3倍优异的抑菌(抗菌)活性,且其性质有助于制成注射剂。
本发明化合物可施用于哺乳动物(如人),可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部等方式给药。所述化合物可以单独给药,或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。需要指出,本发明的化合物可以混合给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中,活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合,如柠檬酸钠或磷酸二钙,或与下述成分混合:(a)填料或增容剂,例如,淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸;(b)粘合剂,例如,羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶;(c)保湿剂,例如,甘油;(d)崩解剂,例如,琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠;(e)缓溶剂,例如石蜡;(f)吸收加速剂,例如,季胺化合物;(g)润湿剂,例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯;(h)吸附剂,例如,高岭土;和(i)润滑剂,例如,滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠,或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中,剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备,如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂,并且,这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时,活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外,液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂,如水或其它溶剂,增溶剂和乳化剂,例知,乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油,特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外,组合物也可包含助剂,如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂和香料。
除了活性化合物外,悬浮液可包含悬浮剂,例如,乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液,和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂,或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药,或者与其他活性成分(如抗生素)联合给药。
使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人),其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量,对于60kg体重的个体而言,日给药剂量通常为1~1000mg,优选20~500mg。当然,具体剂量还应考虑给药途径、个体健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
饲料添加剂和饲料组合物
本发明还提供了本发明化合物在饲料领域中的应用。本发明化合物因为具有优良的抗菌和抑菌性,非常适合作为饲料添加剂。
本发明还提供了一种制备饲料组合物的方法,包括步骤:将本发明化合物或其药学上可接受的盐作为饲料添加剂和饲料原料进行混合,从而形成含有硫链丝菌素类似物(或其盐)的饲料组合物。
本发明的主要优点包括:
(a)提供了一种具有式Ⅰ结构的新颖的、具有活性更高等优点的硫链丝菌素类似物。
(b)以本发明的硫链丝菌素类似物为基础,有助于制备其他类型硫链丝菌素衍生物。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本发明的内容。
实施例1
突变合成元4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的合成
1.6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯的合成
将10mmol 6-氟-喹啉-2-羧酸溶解于10ml甲醇中,在冰水浴下缓慢滴入0.92ml二氯亚砜,缓慢升温至室温,加热回流12小时。反应液冷却至室温,小心倾倒入碳酸氢钠的饱和液中,然后用二氯甲烷多次萃取。萃取液合并,用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩后经柱分离得产品1.25克,产率为61%。
对6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯进行NMR鉴定,鉴定结果如下:
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(dd,J=9.2,5.6,1H),8.27(d,J=8.8,1H),8.22(d,J=8.8,1H),7.57(dt,J=9.2,2.8,1H),7.50(dd,J=8.8,2.8,1H),4.09(s,3H)(图2)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.75,161.72(d,J=250.9),147.39(d,J=3.6),144.67,136.70(d,J=5.8),133.43(d,J=9.5),130.27(d,J=10.2),121.80,120.95(d,J=25.6),110.65(d,J=21.9),53.28(图3)。
19F NMR(282MHz,CDCl3)δ-109.78(dd,J=13.8,7.9,1F)(图4)。
2.4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯的合成
将0.38克硫酸亚铁加入到50ml乙醛溶液中,乙醛溶液中含有10.0mmol 6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯和0.97ml三氟乙酸。在冰水浴条件下,缓慢加入30%双氧水5.5ml,30分钟后再次加入30%双氧水5.5ml,继续反应90分钟。缓慢升温至室温,以5%的硫代硫酸钠溶液终止反应,再加入饱和碳酸氢钠溶液中和剩余的三氟乙酸。用乙酸乙酯多次萃取水相,萃取液经无水硫酸钠干燥,过滤后减压浓缩后,经柱分离,获得产品4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯共2.05g,产率为83%。
对4-乙酰-6-氟-2-喹啉酸甲酯进行NMR鉴定,鉴定结果如下:
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.49(s,1H),8.36(t,J=3.0,1H),8.30~8.29(m,1H),7.58(dt,J=8.4,3.0,1H),4.09(s,3H),2.79(s,3H)(图5)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ199.91,165.26,163.34(d,J=251.6),146.94(d,J=2.9),146.03,141.77(d,J=6.6),133.72(d,J=9.4),126.13(d,J=11.6),121.33,121.29(d,J=26.2),109.83(d,J=24.8),53.50,29.61(图6)。
19F NMR(282MHz,CDCl3)δ-106.03(m,1F)(图7)。
HR-MALDI-MS(m/z):[M+Na]+测量值为270.0537(C13H10FNO3Na+1,的计算值为270.0542)。
突变合成元4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的合成流程见图1。
3.4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸的合成
室温下,将1.0mmol 4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸甲酯溶解于3.5ml四氢呋喃中,然后加入30%的氢氧化钠溶液。溶液很快变成黄色并伴有沉淀生成。反应进行100分钟后再加入0.1M氢氧化钠使沉淀物溶解。水相经过二氯甲烷萃取后以2M稀盐酸酸化至pH=1后再以乙酸乙酯多次萃取。萃取液经无水硫酸钠干燥后过滤,减压浓缩后得白色固体。乙酸乙酯-石油醚重结晶,得到产品4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸135mg,产率为58%。
对4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸进行NMR鉴定,结果如下:
1H NMR(300MHz,Acetone-d6)δ8.58(s,1H),8.33~8.25(m,2H),7.77(dt,J=8.7,3,1H),2.87(s,3H)(图8)。
13C NMR(100MHz,Acetone-d6)δ200.15,164.61,162.89(d,J=249.1),147.23(d,J=2.8),145.17,133.27(d,J=9.7),126.02(d,J=11.6),124.96(d,J=26.4),120.61,109.63(d,J=25.0),28.97(图9)。
19F NMR(282MHz,Acetone-d6)δ-108.99(m,1F)(图10)。
HR-MALDI-MS(m/z):[M+H]+测量值为234.0561(C12H9FNO3 +1的计算值为234.0566)。
NMR和MS结果表明,本发明人成功合成了突变合成元4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸。
实施例2
链霉菌重组菌株SL1102的构建
1.构建tsrT同框缺失质粒
克隆tsrT同框缺失左臂的引物序列如下:
tsrT左臂正向引物(SEQ ID NO:1)
5’-AAG CTT TCC ACG TCT TCC CTC CCA TGG-3’
tsrT左臂反向引物(SEQ ID NO:2)
5’-AGA TCT GTC GAT GAC CGC CTT GTA CCC-3’
克隆tsrT同框缺失右臂的引物序列如下:
tsrT右臂正向引物(SEQ ID NO:3)
5’-AGA TCT GTC GAC CGG ATG ATG GAA CTC-3’
tsrT右臂反向引物(SEQ ID NO:4)
5’-TCT AGA TTC TTG TCC TGG TAC GAG ACC-3’
以pS L1001(以pOJ446为基础的粘粒,包含整个硫链丝菌素生物合成基因簇)为模板,以dNTP,DMSO,无酶水,高保真的Primestar DNA聚合酶及缓冲液组成PCR反应体系,扩增用于tsrT基因敲除的左臂和右臂片段。
将克隆后的两个片段凝胶电泳分离,切胶回收并纯化,分别加入限制性内切酶BglII和HindIII以及BglII和XbaI消化回收片段,将其连入用限制性内切酶XbaI和HindIII同样酶处理过的pKC1139中,将连接体系转化到E.coli DH5α,挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿伯拉霉素抗生素)中培养过夜,至菌液较浓。提取质粒经酶切验证后送测序进一步验证。将验证正确的质粒转化E.coliET12567中。
2.重组菌株SL1102的获得
收集野生型的Streptomyces laurentii的新鲜孢子,并用SET缓冲溶液清洗两次。清洗后的孢子重悬在500uLSET缓冲液中,放于50℃水浴中热激。热激后的孢子在30℃萌发3小时左右,与含有重组质粒的E.coli ET 12567在MS平板上按照一定比例混合涂抹,并30℃中培养12小时后用阿伯拉霉素覆盖平板。接合子在温箱培养2到3天后长出,挑选接合子到阿伯拉抗性平板上37℃培养2到3天。选取长势良好的接合子于TSB(无抗性)溶液中传代三次以上,再于平板上划线筛选单菌落。通过阿伯拉抗性筛选,选取不具有阿伯拉抗性的菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得tsrT同框缺失的重组菌株SL1102。
实施例3
6-氟代硫链丝菌素的发酵、检测、分离纯化和结构鉴定
将突变株ΔTsrT接种于50ml预发酵培养基中(含TSB 15g/L,可溶性淀粉15g/L,蔗糖50g/L),28℃培养48小时。将5ml预发酵菌液接种于50ml发酵培养基中(含TSB 15g/L,硫酸钙15g/L,酵母提取物11g/L,葡萄糖50g/L,七水磷酸氢二钾0.05g/L,七水硫酸镁0.1g/L,硫酸钠0.2g/L,七水硫酸锌0.001g/L,七水硫酸亚铁0.002g/L,碳酸钙0.3g/L)并加入突变合成元4-乙基-6-氟-喹啉-2-羧酸至终浓度为0.2mmol,28℃,250rpm下培养。培养120小时后处理发酵液和菌丝。
离心后上清弃去,菌体用丙酮浸泡过夜,过滤除去不溶物,滤液经减压蒸馏抽干得深褐色膏状物。膏状物第一步进行粗分,用100-200目硅胶预装的正相柱,梯度洗脱条件见表1。
表1
氟代硫链丝菌素出现在95%二氯甲烷/5%甲醇的洗脱部分中,将洗脱液减压抽干,溶于10ml甲醇,然后进行HPLC制备。
HPLC的制备条件为:
仪器:Agilent 1100HPLC系统
柱子:Agilent ZORBAX SB-C18column(21.2x 250mm,number 877250-102)
检测波长:UV=254nm
流动相:A=H2O;B=CH3CN
流速:18ml/min。
流动相梯度配比为见表2。
表2
时间(min) | A% | B% |
0 | 40 | 60 |
20 | 40 | 60 |
按上述的HPLC的洗脱条件,收集6’-氟硫链丝菌素的流出液,最终得到目标产物。对目标产物进行鉴定,结果如下:
1H NMR(600MHz,CDCl3):0.92(d,3H),0.97(t,3H),0.99(d,3H),1.12(m,1H),1.19(s,3H),1.20(d,3H),1.28(m,1H),1.34(d,3H),1.37(d,3H),1.47(d,3H),1.58(m,1H),1.63(d,3H),1.69(m,1H),1.74(d,3H),1.95(s,1H),2.28(m,1H),2.95(m,1H),3.02(d,1H),3.13(dd,1H),3.47(m,1H),3.68(d,1H),3.72(dd,1H),3.83(m,1H),3.86(m,1H),3.91(s,1H),4.11(m,1H),4.45(dd,1H),4.76(d,1H),4.76(m,1H),4.98(dd,1H),5.13(s,1H),5.16(q,1H),5.21(d,1H),5.21(s,1H),,5.37(s,1H),5.48(s,1H),5.57(s,1H),5.75(d,1H),5.78(d,1H),5.85(d,1H),6.21(q,1H),6.39(m,1H),6.43(d,1H),6.45(d,1H),6.69(d,1H),6.80(d,1H),6.90(d,1H),7.04(d,1H),7.27(s,1H),7.46(s,1H),7.54(s,1H),7.55(d,1H),7.56(d,1H),7.61(d,1H),7.81(s,1H),8.11(s,1H),8.28(s,1H),8.29(s,1H),8.49(s,1H),9.00(s,1H),9.84(s,1H),9.97(s,1H)(图11)。
13C NMR(150MHz,CDCl3):δ174.39,173.06,172.46,171.19,170.24,168.59,168.38,168.03,165.81,165.50,165.31,164.45,163.28,162.23,162.05,161.79,161.52,160.86,159.48,157.56,153.87(d),152.03,150.52,150.37,146.90,142.86,134.36,132.91,132.42,132.37,128.76,127.67,127.15,125.24,124.94,122.77,122.20,117.84,103.40,103.08,101.33,100.91(d),100.73,78.99,77.98,72.29,68.11,67.43,67.06,66.42,64.63,64.45,62.00(d),61.81,57.31,55.80,55.74,53.42,52.42,48.81,38.86,35.69,28.95,26.13,24.87,22.96,19.80,19.63,19.53,18.93,17.40,16.19,15.91,15.62,11.31(图12)。
19F NMR(282MHz,CDCl3)δ-101.663(1F,d,J=5.9Hz)(图13)
HR-MALDI-MS(m/z):[M+Na]+测量值为1704.4707(C72H84N19O18FS5Na计算值为1704.4722)。
图14、图15、图16分别为6’-氟硫链丝菌素的HMBC(600MHz,CDCl3)、1H-1H COSY(600MHz,CDCl3)、和HSQC(600MHz,CDCl3)图谱。
鉴定结果表明,本发明人成功制备了6’-氟代硫链丝菌。
实施例4
出发菌株和改造菌株的发酵产物分析
分别将野生型Streptomyces laurentii ATCC31255和突变株SL1102进行发酵,发酵条件如下:
野生型Streptomyces laurentii ATCC31255发酵;突变株SL1102不加4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸发酵;和突变株SL1102用4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸饲喂发酵。
发酵产物分别用HPLC进行分析,结果如下:
图17表示通过喂养突变株SL1102获得氟代硫链丝菌素的HPLC分析。图17A为野生型Streptomyces laurentii ATCC31255的发酵结果;图17B为突变株SL1102的负对照(无4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸)的发酵结果;图17C为突变株SL 1102与4-乙酰-6-氟-喹啉-2-羧酸共同发酵产生6’-氟硫链丝菌素的发酵结果。
结果表明,野生型菌株能够正常产生TSR,不加突变合成元的突变株既不产TSR,也不产6’-氟硫链丝菌素;而用突变合成元饲喂的突变株具有合成6’-氟硫链丝菌素的能力。
实施例5
氟代硫链丝菌素的抗菌活性
对6’-氟硫链丝菌素和硫链丝菌素进行抗菌活性的测定,方法如下:在96孔板中,将溶于四氢呋喃的6’-氟硫链丝菌素和硫链丝菌素分别加入培养基至0.256μg/mL并逐级稀释至0.00025μg/mL。将测试菌加入培养基至107-108cfu/mL(根据0.5McFarland标准)并培养过夜。测试菌不能生长所对应的最小浓度为MIC。
最小抑制浓度(MIC)测试结果显示,6’-氟硫链丝菌素的MIC值为0.005μg/mL,而硫链丝菌素的MIC值为0.020μg/mL,这表明,6’-氟硫链丝菌素具有更高的抗菌活性,其抗革兰氏阳性菌Bacillus subtilis的活性比硫链丝菌素的活性提高3倍(表3)。
表3
实施例6
氟代硫链丝菌素钠盐的制备
将向50毫升的1mg/l的氟代硫链丝菌素溶液中,滴加1毫升饱和氨水,从而获得羧酸硫链丝菌素铵盐。
实施例7
药物组合物
化合物 | 20g |
淀粉 | 140g |
微晶纤维素 | 60g |
按常规方法,将上述物质混合均匀后,装入普通明胶胶囊,得到1000颗胶囊。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
2.一种药物组合物,其特征在于,含有权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐的用途,其特征在于,所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐被
(a)用于制备抗菌的组合物;
(b)用于抑制微生物生长的组合物;
(c)用于制备治疗微生物或细菌感染的组合物;或
(d)用作饲料添加剂。
4.一种体外非治疗性地抑制微生物生长或者杀灭微生物的方法,其特征在于,包括步骤:在需要处理的场所施用权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐。
5.一种制备药物组合物的方法,其特征在于,包括步骤:将权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体进行混合,从而形成药物组合物。
6.一种制备饲料组合物的方法,其特征在于,包括步骤:将权利要求1所述的硫链丝菌素类似物或其药学上可接受的盐作为饲料添加剂和饲料原料进行混合,从而形成含有硫链丝菌素类似物或其盐的饲料组合物。
7.一种可用于产生权利要求1所述的硫链丝菌素类似物的劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)突变菌株,其特征在于,所述的菌株中硫腺苷甲硫氨酸转移酶基因(tsrT)被失活或敲除。
8.一种制备权利要求1所述的硫链丝菌素类似物的方法,其特征在于,包括步骤:
(a)用突变合成元饲喂权利要求7所述的劳伦链霉菌(Streptomyces laurentii)突变菌株,从而产生权利要求1所述的硫链丝菌素类似物;和
(b)从发酵产物中分离出所述的硫链丝菌素类似物。
11.一种具有式Ⅱa或式Ⅱb所示突变合成元的用途,其特征在于,所述突变合成元用于制备权利要求1所述的硫链丝菌素衍生物其药学上可接受的盐。
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