MX2013000944A - Cepa wsj-ia manipulada geneticamente para producir isovaleril espiramicina i. - Google Patents

Cepa wsj-ia manipulada geneticamente para producir isovaleril espiramicina i.

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Abstract

Cepa WSJ-IA manipulada genéticamente para producir isovaleril espiramicina I. También se proporciona un método para preparar la cepa, que consta de los siguientes pasos: (a) construir un plásmido recombinante que comprende un gen doble ist-acyB2; (b) transformar el plásmido en una cepa productora de isovaleril espiramicina I para obtener la cepa WSJ-IA. El nivel de isovaleril espiramicina I producida por fermentación de la cepa WSJ-IA se incrernentó 1.7 veces y la potencia de fermentación de la misma aumentó 4.14 veces en comparación con la cepa que contiene exclusivamente el gen ist solo.

Description

CEPA WSJ-IA MANIPULADA GENÉTICAMENTE PARA PRODUCIR ISOVALERIL ESPIRAMICINA I CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención comprende la adquisición de una cepa bacteriana que produce alto contenido y alto rendimiento de un solo componente antibiótico por construcción con tecnología de regulación génica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La bitespiramicina (nombre original: shengj imicina) [patente no.: ZL97104440.6] es un derivado de la espiramicina obtenido por la isovalerilación del grupo hidroxilo en posición 4" de la entidad micarosa de la molécula de espiramicina. Se produce por medio de ingeniería genética generándose una combinación genómica bacteriana entre el gen ist de isovaleril espiramicina de streptomyces resistente al calor y la espiramicina. La bitespiramicina tiene actividad relativamente potente frente a bacterias Gram-positivas, en especial Streptococcus pneumonía, Mycoplasma pneumonía y clamidia, presenta actividad antibacteriana contra bacterias resistentes a los antibióticos eritromicina y ß-lactama como influenza bacíllus, Legíonella, Clostridium perfríngens; no exhibe resistencia cruzada total con principios activos similares. La bitespiramicina presenta lipofilicidad relativamente elevada, su absorción oral es rápida con alta permeabilidad en los tejidos, amplia distribución en el organismo y tiempo de permanencia prolongado. Por lo tanto, manifiesta buen efecto antibiótico después de la administración. Los estudios clínicos de Fase III para la bitespiramicina producida mediante ingeniería genética ya se han concluido, los resultados mostraron buen efecto terapéutico y seguridad. Para este principio activo se ha presentado la solicitud de certificado de medicamento nuevo Clase I.
La investigación clínica muestra que la bitespiramicina es un antibiótico seguro y eficaz. Su efecto terapéutico es comparable al del antibiótico azitromicina, en general aceptado como el mejor macrólido actual. Sin embargo, por el hecho de que la bitespiramicina es un medicamento multicomponente, aun con todos los intentos para establecer un proceso de producción de tabletas capaz de obtener productos con proporciones controlables de sus componentes y calidad estable, las exigencias respecto al control de la extracción así como los procesos de purificación todavía son relativamente rigurosos y el proceso de inspección de calidad es complejo. Por otro lado, para mejorar sus efectos terapéuticos, es necesario desarrollar la formulación inyectable. Es bien sabido que las inyecciones ejercen sus efectos terapéuticos con mucha rapidez y son aplicables sobre todo a pacientes en estado critico o pacientes que no son aptos para ingerir medicamentos por vía oral. También es cierto que las inyecciones son más demandantes en términos de control de calidad.
La producción de bitespiramicina multicomponente por medio de las bacterias correspondientes, se deriva de las características multicomponente de la espiramicina . al ser un homólogo de la platenomicina, es un antibiótico macrólido, su núcleo principal es un anillo lactona de 16 miembros. Contiene tres moléculas de azúcar: forosamina, micaminosa y micarosa, mientras que el componente principal de la bitespiramicina es un derivado de la isovalerilación del grupo hidroxilo en posición 4" en la entidad micarosa de la molécula de espiramicina. Debido a la existencia del gen de aciltransferasa en las bacterias que producen espiramicina, la posición 3 del anillo lactona en la molécula de espiramicina se puede acevilar para formar el componente II de la espiramicina II; propionilar para formar el componente III de la espiramicina III; y al desacetilar la posición 3 del anillo lactona, se forma el componente I de la espiramicina. Por lo tanto, la bitespiramicina también es una mezcla de al menos tres componentes: isovaleril espiramicinas I, II, III. Las estructuras de los tres componentes principales de la bitespiramicina son los siguientes: en donde: Isovaleril espiramicina III Ri=COCH2CH3 R2=COCH2CH (CH3) 2 Isovaleril espiramicina II Ri=COCH3 R2=COCH2CH (CH3) 2 Isovaleril espiramicina I R=H R2=COCH2CH (CH3) 2 Las investigaciones muestran que cada uno de los componentes de isovaleril espiramicina I, II y III tiene actividad antibiótica, sin diferencias significativas en cuanto a sus actividades [solicitud de patente número: 201010119745.1], Según el actual conjunto de normas de calidad para la bitespiramicina, el contenido de isovaleril espiramicinas (I+II+III) no debe ser menor de 60%. Por lo tanto, se puede utilizar un solo componente (contenido mayor de 60%) para sustituir la mezcla multicomponente . Con el fin de reducir la producción de multicomponentes , este laboratorio construyó la cepa bacteriana WSJ-2 por bloqueo del gen 3-O-acil transferasa utilizando en la bitespiramicina tecnología de recombinación génica mediante la cual se generó la bacteria WSJ-1. La cepa WSJ-2 produjo sólo la isovaleril espiramicina I [Chunyan Ma et al. Current Microbiology, 2011, 62:16-20]. Sin embargo, esta cepa mostró una unidad de fermentación muy baja, que no es propia para la producción a gran escala. La intención de esta invención es regular el gen acyB2 para modificar la cepa WSJ-2 y asi aumentar el rendimiento del componente individual isovaleril espiramicina I y su contenido en la mezcla. Esto servirá de base para el desarrollo de un nuevo medicamento: homólogo monocomponente de la bitespiramicina, la isovaleril espiramicina I para uso clínico.
Es sabido que el gen ist de isovaleriltransferasa de streptomyces resistente al calor se vincula con el gen regulador acyB2, la presencia del gen regulador puede activar la expresión del gen ist. El modelo de cepa streptomyces: Variable Lead Green Streptomyces que contiene completos el gen ist así como el gen regulador acyB2 pudo convertir 67-79% de tirosina, adicionada de manera exógena, a 4 "-isovaleril tilosina, mientras que la misma cepa de Streptomyces que contenía sólo el gen ist o el gen ist con el gen acyB2 incompleto, convirtió sólo 0-2.4% de la tilosina añadida [Arisawa A et al: Biosci Biotechnol Biochem 1993, 57(12): 2020-2025]. Al transferir plásmido recombinante de replicación autónoma (vectores pIJ702 o pIJ943) que contiene los genes ist- y acyB2 a la bacteria productora de tilosina ( Streptomyces fradiae) , a condición de que se lleve a cabo la adición exógena de un medicamento (tiopeptina) , el transformante produjo principalmente tilosina en la fermentación y se pudo detectar una cantidad minoritaria de 4"-isovaleriltilosina (aproximadamente 56 g/mL) [Arisawa A. et al: J Antibiotics 1996, 9 ( 4 ) : 349-35 ] . Sin embargo, hasta ahora no se ha reportado en la literatura publicada el aumento en el rendimiento de 4"-isovaleriltilosina o el mayor contenido de un componente individual en la mezcla, al transferir genes ist- y acyB a la bacteria productora de tilosina.
El gen regulador acyB2 y la proteina reguladora transcripcional Srm28c en la bacteria productora de espiramicina {Streptomyces ambofaciens) , son homólogos [Fatma Karray et al Microbiology 2007,153,4111- 122], su grado de identidad es de 69%, el grado de identidad del gen acyB2 y la proteina reguladora tylR en la bacteria productora de tilosina (Streptomyces fradiae) es de 41%, la tylR es la proteina reguladora positiva de la biosintesis en la bacteria productora de tilosina, regula la expresión de un módulo policétido sintasa (tylGI) en la bacteria productora de tilosina y desempeña una función reguladora en la síntesis de glucosil tilosina y también en la oxidación del anillo policetona. La expresión elevada del gen tylR en la bacteria productora de tilosina puede aumentar el rendimiento de tilosina [George S. et al., Mol. Microbiology 2004, 54 (5) : 1326-1334] . Sin embargo, el método de integración del gen ist en la bacteria productora de espiramicina , homólogo del acyB2, por medio de tecnología de recombinación de ADN homólogo con plásmido recombinante en cromosoma, dio como resultado sólo la producción de una mezcla de isovaleril espiramicina, con un rendimiento tan alto como 800mg/mL [Shang Guangdong et al. Chínese Journal of Biotechnology, 1999, 15 (2) : 171] . Esto demostró que transferir sólo el gen ist a una cepa que contenga un gen regulador similar al acyB2 no sería suficiente para aumentar de manera significativa el rendimiento y el contenido del componente del producto seleccionado como obj etivo .
Este laboratorio demostró que por concatenación del gen ist mediante técnicas de ingeniería genética, con el fin aumentar el número de copias del gen ist en la bacteria productora de espiramicina y aumentar así la dosis de gen ist, también se elevó la capacidad de la bacteria para isovalerilar ; también se demostró que al sustituir la secuencia promotora del gen ist original con un promotor con actividad intensa, como la secuencia promotora del gen ermE de resistencia a eritromicina , se podría aumentar la expresión del gen ist. Esto incrementa la producción de isovaleril espiramicina en 62% con la bacteria manipulada genéticamente [Solicitud de patente No. 200910148767.8 ].
El objetivo de esta invención es obtener cepas bacterianas que produzcan alto contenido de bitespiramicina monocomponente , isovaleril espiramicina I y también alta productividad, por medio de la expresión del gen ist ligado al gen regulador acyB2 en una cepa, que ya haya sido obtenida, que sea capaz de producir sólo el componente isovaleril espiramicina I, utilizando un sistema de expresión muy estable y eficiente. Para lograr este objetivo, es necesario superar los obstáculos de tipo práctico relacionados con la restricción de la bacteria productora del antibiótico en cuanto a la modificación genética mediante el gen exógeno, mejorando asi la tasa de conversión del ADN exógeno. Por otra parte, es necesario seleccionar sistemas vectoriales de expresión estable, de tal manera que la bacteria manipulada genéticamente sea apta para la producción industrial a gran escala. Esta invención propone adoptar un vector integrado de replicación no autónoma en Streptomyces , este vector contiene la enzima integrasa del fago de Streptomyces y también sitios de unión y contiene sólo el replicón de E. coli para facilitar la preparación en E. coli; por otro lado, el vector carece del replicón de Streptomyces. Al entrar a las células de Streptomyces, la integración tiene como base los sitios de unión (attP) en el portador y los sitios de unión específicos de la bacteria hospedera. Por lo tanto, el gen exógeno puede expresarse de manera estable en la producción a gran escala. A la fecha, no se han encontrado reportadas ni en el país ni en el extranjero investigaciones sobre la coexpresión del gen ist de isovaleril acilasa y el gen regulador acyB2 en la bacteria productora de isovaleril espiramicina I, para aumentar el rendimiento y contenido de isovaleril espiramicina I, ni estudios de producción experimental a escala piloto.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN 1. - Esta invención proporciona una cepa manipulada genéticamente de una bacteria que produce el componente isovaleril espiramicina I con alto rendimiento y en alto contenido, la bacteria manipulada genéticamente es una cepa clonal con el gen ist de isovaleril transferasa unido al gen regulador acyB2 coexpresado en la bacteria WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I. 2. - Esta invención proporciona la construcción de la cepa de la bacteria manipulada genéticamente productora del componente isovaleril espiramicina I con alto rendimiento y en alto contenido, la construcción consiste en utilizar como molde ADN total de Streptomyces resistente al calor (Streptomyces thermotolarences CGMCC .1501 ) , diseñar los cebadores según las secuencias ist-acyB2 anunciadas por NCBI y para obtener el fragmento génico ist-acyB2 ligado por medio de PCR (polymerase chain reaction - reacción en cadena de la polimerasa) , insertar sitios de escisión adecuados; también se propone ligar los fragmentos génicos ist y acyB2, respectivamente, con el vector integrador transferible a la cepa bacteriana productora de isovaleril espiramicina I en los sitios de escisión correspondientes, para construir el plásmido recombinante génico ist-acyB2. El plásmido recombinante génico ist-acyB2 se inserta luego en la cepa bacteriana WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I, después de lo cual se aplica la técnica de PCR para verificar que el gen ist-acyB2 está integrado en el genoma transformante para obtener WSJ-IA. 3.- Esta invención propone identificar las características de la cepa Streptomyces WSJ-IA según las normas de clasificación e identificación de Streptomyces. 4.- Utilizando la bacteria WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I que contiene el monogen ist como control, esta invención evaluó el desempeño de fermentación de la cepa WSJ-IA, incluyendo la medición del título de fermentación de la cepa WSJ-IA por el método microbiológico y el contenido de isovaleril espiramicina I en el caldo de fermentación por medio de análisis cuantitativo HPLC {high performance liquid chromatography - cromatografía de líquidos de alta resolución) . Los resultados mostraron que la introducción del gen regulador acyB2 en la cepa puede mejorar de manera significativa el contenido y el rendimiento del componente isovaleril espiramicina I.
Efecto de esta invención: El efecto positivo de la invención es demostrar que la introducción del gen regulador acyB2 en la cepa bacteriana WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I puede aumentar el título de fermentación en 414% y aumentar el contenido del componente isovaleril espiramicina I en 170.2%. La cepa productora de alto contenido de isovaleril espiramicina I construida en esta invención se ha evaluado a escala piloto en un tanque de fermentación de 2 toneladas, las muestras acumuladas de isovaleril espiramicina I se han utilizado en estudios farmacodinámicos . La aplicación de esta cepa en la producción industrial de este componente antibiótico no sólo simplifica el control de calidad y el estándar de prueba del producto sino que también ofrece condiciones para la preparación de la formulación inyectable de isovaleril espiramicina.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS O FIGURAS La Figura 1 es la construcción del plásmido recombinante pSET52-ia del gen ist-acyB2; La Figura 2 es el resultado PCR del cromosoma de 52-859 la cepa bacteriana productora de isovaleril espiramicina y contiene el gen ist-acyB2 en donde M: Marcador III de ADN; 1- bacteria control SJ-2; 2-5: transformantes SJ-IA 1-4; La Figura 3 es el resultado de HPLC del componente isovaleril espiramicina en el producto de fermentación derivado de la cepa bacteriana WSJ-IA que contiene el plésmido recombinante pSET52-ia del gen ist-acyB2; en donde A: bacteria control WSJ-2; B: bacteria WSJ-IA, manipulada genéticamente que contiene el gen ist y el gen regulador acyB2; SP - espiramicina; ISO-SP isovaleril espiramicina I.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos sólo tienen como fin ayudar a los técnicos de este campo a entender mejor esta invención y de ninguna manera significan restricciones para esta invención.
Ejemplo 1: Construcción de plásmido recombinante pSET52-ia que contiene el gen doble ist-acyB2 El plásmido recombinante pSW4 construido previamente en este laboratorio [Shang Guangdong et al., Chínese Journal of Biotechnology, 1999, 15 (2) : 171] se sometió a digestión con la enzima Smal-BamHI a fin de obtener el gen completo ist y el segmento 1820 que contiene la fracción en dirección 5' del gen acyB2, utilizando como 52-859 molde ADN total de Streptomyces resistente al calor obtenido en el centro recolector de cultivos China General Microbiological Culture Collection Center (Streptomyces thermotolarences CGMCC4.1501 ) , para diseñar cebadores según la secuencia acyB2 anunciada por NCBI . pl: CGCTCAGGGACGCAAGACC y P2: CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTC, temperatura PCR: 94°C antes de la a desnaturalización, durante 2 min.; 94°C durante 30s, 60°C durante 30s, 72°C durante 1 min., 28 ciclos; ampliando a 72°C durante 5 min., para obtener el segmento 1013bp de la fracción en dirección 3' del gen acyB2. Se utilizó la enzima BamHI-EcoRI para digerir el producto de PCR y obtener el segmento 934bp, los segmentos anteriormente mencionados sometidos a digestión con Smal-BamHI (1820bp) y BamHI-EcoRI ( 934bp) se ligaron en el vector pBluesript II KS( + ) (E 'Merck) mediante los sitios de restricción enzimática Smal-EcoRI, para obtener el plásmido recombinante génico pBKS-ia que contiene el gen ist y el gen acyB2 completo. El plásmido pSET152, se unió al plásmido de transferencia integrado del conjugado E. coli/Streptomyces a través de los sitios de restricción mediante la enzima Xbal-EcoRI [Bierman M. et al Gene 1992,116,43-49, de la genoteca compartida, www.genecool.com], para obtener el plásmido recombinante pSET52-ia del gen ist-acyB2 (el método experimental se 52-859 realizó según los procedimientos de operación, TAKARA Biotechnology (Dalian) Co., Ltd.)- El proceso de construcción se muestra en la Figura 1.
Ejemplo 2: Conversión del plásmido recombinante pSET52-de la bacteria WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I La bacteria WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I se construyó en este laboratorio [Chunyan Ma et al. Current Microbiology, 2011,62:16-20]. La cepa se cultivó en medio para cultivo inclinado [pasta de soya 2.0%, glucosa 1.0%, almidón 3.0%, CaC03, 0.5%, NaCl, 0.4%, agar 2.0%] a 28°C durante 7-10 días, para preparar protoplasto según los procedimientos descritos en la literatura [D.A.Hopwood et al. Genetic manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, Norwich; John Innes Foundation UK, 1985] . De manera especifica, se tomó una parte del cultivo de la cepa para inocularla en medio R2YE que contenia sacarosa, se cultivó a 28°C durante 2-4 días, el mismo medio se inoculó transfiriendo 10% del cultivo mencionado y la adición de 0.5% de glicina y se cultivó durante 20 horas. El micelio se recolectó por centrifugación, se lavó 2-3 veces con solución de sacarosa al 10.3%, el micelio se sometió a bacteriólisis a 37°C en la solución P que contenia 2 mg/ml de lisozima, durante 15- 60 min., se filtró a través de algodón para obtener los 52-859 protoplastos . Para superar la restricción de la bacteria WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I frente a la modificación génica exógena, primero, el plásmido recombinante pSET52-ia se transfirió a E. coli 12567 deficiente en metilación [Mac Neil et al Gene 1992, 111, 61-68, proveniente de la genoteca compartida, www.genecool.com] . Se extrajo el ADN del plásmido del transformante, después se transfirió al protoplasto por medio de PEG (polietilenglicol ) , depositado en medio R2YE sólido. Después de cultivar durante 24 h a 28°C, el cultivo se recubrió con solución que contenia apramicina para obtener en el medio una concentración final de apramicina de 50 pg/mL y se cultivó durante 7-10 días, para seleccionar los transformantes resistentes. Los transformantes se subcultivaron en forma continua sin dosificar y luego se analizaron después de dosificarlos para obtener la bacteria WSJ-IA productora de isovaleril espiramicina I con expresión estable del plásmido pSET52-ia recombinante resistente.
Se diseñaron los cebadores para la fracción en dirección 5' del gen ist y la fracción en dirección 3' del gen acyB2, P3: GAGGTAGAAGGCGAAGGT y P : CGTCAGATGCCAGTTCAC, se llevó a cabo la PCR para el ADN total de la bacteria control WSJ-2 y el transformante (4) de WSJ-IA expuesto en la presente invención como moldes, el procedimiento PCR se 52-859 realizó en las siguientes condiciones: 94°C antes de la desnaturalización, durante 2 min.; 94°C durante 30 seg., 60°C durante 30 seg., 72°C durante 2 min., 28 ciclos; continuar a 72°C durante 5 min. (Figura 2). Los resultados obtenidos mostraron que el producto de PCR 1733bp se pudo obtener a partir del genoma WSJ-IA, mientras que no se pudo obtener producto PCR a partir de la cepa control, esto significa que el gen ist-acyB2 se ha integrado satisfactoriamente al genoma de la cepa seleccionada como objetivo. La cepa se envió para su conservación al centro de recolección de cultivos China General Microbiological Culture Collection Center, No. 1, 3rd Bldg., Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, el 25 de junio de 2010. Número de acceso: No.CGMCC 3942, nombre de la categoría: Streptomyces spiramyceticus .
Ejemplo 3: Identificación y confirmación de las características de la cepa WSJ-IA Con relación a la "clasificación e identificación de actinomycetes" [Yan Xunchu ed., 1992], esta invención identificó y confirmó las características de la cepa WSJ-IA. 1. Morfología y características fisiológicas y bioquímicas del cultivo WSJ-IA (1) Características del cultivo Se observaron el micelio aéreo, el micelio en 52-859 sustrato y el color del pigmento soluble de la cepa cultivada en diferentes medios, los resultados se presentan en la Tabla 1. (2) Características microscópicas Las fibrillas de las esporas eran suaves y enrolladas, tipo gancho y espiral; las esporas cilindricas y ovaladas.
Tabla. 1 Morfología del cultivo de la cepa WSJ-IA Nota: Medio Czapek: Azúcar de caña: 30 g, NaN03 MgS04-7H20 0.5 g, KC1 0.5 g, FeS04'4H20, K2HP04 1.0 g, agar 15.0 g, agua destilada 1.0 L, pH 6.0-6.5.
Medio glucosa asparagina: Glucosa 10 52-859 asparagina 0.5 g, K2HP04 0.5 g, agar 15.0 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.2-7.4.
Medio glicerol asparagina: Glicerol 10 g, asparagina 0.5 g, K2HP04 0.5 g, agar 15.0 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.2-7.4.
Medio de sal inorgánica y almidón: Almidón soluble 10.0 g, MgS04 ·7?20 1.0 g, NaCl 1.0 g, (NH4)2S04 2.0 g, CaC03 2.0 g, K2HP0 1.0 g, MnCl2-4H20 10 mg, FeSO, 10 mg, ZnS04 -7H20 10 mg,. agar 15.0 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.2. Medio ISP-2: Extracto de levadura 4.0 g, extracto de malta 10.0 g, glucosa 4.0 g, agar 20.0 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.2-7.4.
Medio de harina de avena: Harina de avena 20.0 g, solución de sal de microelementos 1 mL, agar 15 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.2, en donde la solución de sales de microelementos es: FeS04 -7H20 0.1 g, MnCl2-4H20 0.1 g, ZnS04 ·7?20 0.1 g, agua destilada 100 mL.
Medio de Gause No. 1: Almidón soluble 20.0 g, KNO3 1.0 g, K2HPO4 0.5 g, MgS04 ·7?20 0.5 g, NaCl 0.5 g, FeS04-7H20 0.01 g, agar 15.0 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.2-7.4.
Medio de Santa: KH2P04 0.5 g, MgS04 ·7?20 0.5 g, ácido cítrico 2.0 g, citrato férrico amónico 0.05 g, glicerol 60 mL, asparagina 4.0 g, agar 15.0 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.4. 52-859 (3) Características fisiológicas y bioquímicas A. Detección de la utilización de una fuente de carbono por parte de la cepa WSJ-IA en el medio basal seleccionado .
Medio basal: (NH4)2S04 2.0 g, MgS04 ·7?20 0.2 g, NaH2P04 ·?20 0.5 g, CaCl2 ·2?20 0.1 g, K2HP04 0.5 g, agua destilada 1.0 L. Adicionar 0.1%-0.5% de la fuente de carbono que se medirá en el medio base. Después de esterilizar, inocular el medio con suspensión bacteriana, cultivar a 28°C, transplantar durante tres generaciones consecutivas. Determinar la utilización de la cepa WSJ-IA en la fuente de carbono según el estado de proliferación celular .
B. Medición de la utilización de ácido malónico en el medio basal: Medio basal: Extracto de levadura 1.0 g, (NH4)2S04 2.0 g, K2HP04 0.6 g, KH2P04 0.4 g, NaCl 2.0 g, malonato de sodio 3.0 g, azul bromotimol 0.025 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.0-7.4. Después de esterilizar, inocular el medio con suspensión bacteriana, cultivar a 28°C durante 1-2 días, la utilización de ácido malónico por la bacteria se indica cuando- el medio cambia su color de verde a azul.
C. Medición de la utilización de ácido tartárico en el medio basal: Medio basal: peptona 10.0 g, NaCl 5.0 g, tartrato de sodio 10.0 g, azul bromotimol 52-859 (0.2%) 12.5 mL, agua destilada 1.0 L, esterilizar el medio antes del uso. Preparar al mismo tiempo solución saturada de acetato de plomo. Inocular el medio con suspensión bacteriana, cultivar a 28°C durante 14 días. Adicionar solución de isométrica de acetato de plomo, la utilización de ácido tartárico por la bacteria se indica cuando el color del medio cambia de verde a amarillo con una pequeña cantidad de acetato de plomo precipitado.
D. Licuefacción de gelatina: Medio basal: peptona 5.0 g, gelatina 100-150 g, agua destilada 1.0 L, pH 7.2-7.4 y esterilizada. Después de cultivar la bacteria durante 18-24 horas, inocular por punción la suspensión en el medio de gelatina, al mismo tiempo aplicar el control sin inocular. Cultivar las muestras a 20°C en un incubador durante 2, 7, 10, 14 y 30 días, observar la proliferación celular y la licuefacción de la gelatina a temperatura ambiente de 20°C. Si los resultados muestran la proliferación de bacterias y no se observa depresión en la superficie de la gelatina y el coágulo o consistencia de la gelatina es estable, esto se interpreta como licuefacción negativa .
E. Reacción con leche: Hervir leche fresca y colocarla en el refrigerador durante la noche. Utilizar la leche desprovista de la grasa, adicionar 4 mi de una solución acuosa al 2.5% obtenida a partir de papel tornasol 52-859 (litmus) (2.5 g de papel tornasol sumergido durante la noche en 100 mi de agua destilada y después filtrado) a 100 mi de leche desnatada, adicionar la mezcla en tubos de ensaye a una altura aproximada de 4 cm, respectivamente. Esterilizar los tubos de ensaye e inocular con la cepa, cultivar a 28° C durante 1, 3, 5, 7, 14 y 30 dias. Los resultados muestran que la leche se peptonizó y formó tortas .
F. Reducción de nitratos: Medio nutriente de agar 1.0 litros, KN03 1.0 g, pH 7.0-7.6. Adicionar 4-5 mL del medio anterior en cada uno de los tubos de ensaye, luego esterilizar. Reactivos de Griess: a) disolver 0.5 g de ácido sulfanílico en 150 mi de ácido acético diluido (10%); b) disolver 0.1 g de naftilamina en 20 mi de agua destilada y 150 mi de ácido acético diluido (10%) . Reactivo de difenilamina : disolver 0.5 g de difenilamina en 100 mi de ácido sulfúrico concentrado, diluir con 20 mi de agua destilada. Inocular la cepa en medio de nitrato, cultivar a 28°C durante 1, 3, 5 dias, adicionar una pequeña cantidad de cultivo de 1, 3 y 5 dias en tubos de ensaye limpios, adicionar una gota de reactivos a) y b) , respectivamente, el color de la solución cambia a rojo red demostrando la reducción de nitrato a nitrito; adicionar una gota de reactivo de difenilamina, no se puede observar reacción azul. 52-859 G. Prueba de tirosinasa: Inocular la cepa en el medio liquido de Gause No.l a 28°C durante 7, 9, 12 días, respectivamente, muestrear 2 mi de caldo de cultivo, centrifugar y extraer el sobrenadante, adicionar 2 mL de amortiguador de fosfato (pH 5.9) y 1 mi de solución de tirosina al 0.04%, mantener la temperatura a 37°C, incubar durante 5 minutos, no se observa reacción con coloración roj a .
H. Prueba de amilasa: Inocular la cepa en medio BPA, con 0.2% de agar almidón soluble, cultivar durante 2-5 días a 28°C. Después de la formación evidente de colonias en las placas de agar, adicionar gotas de solución de yodo (yodo 1.0 g, KI 2.0 g, 300 mL de agua destilada) en la placa. La formación de un circulo transparente alrededor de las colonias, sin cambio de color, indica hidrólisis del almidón .
Las características fisiológicas y bioquímicas de la cepa WSJ-IA se muestran en la Tabla 2. 2. Análisis de las características sistemáticas moleculares de la cepa WSJ-IA (1) Secuencia del gen 16S rDNA: El gen 15SrDNA es una parte del ribosoma bacteriano, es la secuencia de ADN en el cromosoma de una bacteria, la cual es responsable del rRNA codificante. Gracias a su genética muy conservada, su secuencia se ha 52-859 reconocido, en general, como una de las características de la taxonomía molecular bacteriana.
Se usaron los siguientes promotores del gen 16SrDNA: 5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' , 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ' .
Se utilizó como molde el ADN total de la cepa bacteriana WSJ-IA para llevar a cabo la PCR, los procedimientos son: 96 °C antes de la desnaturalización, durante 1 min.; en cada uno de los 25 ciclos, desnaturalizar a 96 °C durante 30 seg. , aparear a 50°C durante 30 seg., continuar a 72°C durante 1.5 min.; después, continuar a 72°C durante 10 min. para obtener la secuencia 1393 bp (SEQ ID NO. 1), véase la Tabla 1.
Tabla 2. Características fisiológicas y bioquímicas de 52-859 Tabla 3 Comparación de la secuencia génica WSJ-IA 16S rDNA con bacterias conocidas Por otra parte, esta invención determinó las secuencias de los siguientes cinco genes de mantenimiento utilizados comúnmente en taxonomía molecular de Streptomyces, atpD gyrB, rpoB, recA y trpB en la cepa WSJ- IA. Estos son genes de copia única y genes que codifican para proteínas. Son estables desde el punto de vista estructural y no tienen espacios ni están apilados. Por lo tanto, los resultados, de secuenciación se pueden usar directamente para realizar comparación interespecífica de 52-859 las cepas respecto al nivel de nucleótidos y aminoácidos y determinar después la condición taxonómica de la cepa WSJ-IA. ( 2 ) Gen de mantenimiento A. - Secuencia del ge atpD El gen atpD es una subunidad de la ATP sintasa. Es bastante estable y común en especies microbianas, por lo cual es adecuado como marcador molecular para la categorización de la linea germinal. En esta invención se usaron los siguientes cebadores : 5 ' -GTCGGCGACTTCACCAAGGGCAAGGTGTTCAACACC-3 ' 5 ' -GTGAACTGCTTGGCGACGTGGGTGTTCTGGGACAGGAA -3' Se utilizó como molde el ADN total de la cepa bacteriana WSJ-IA para llevar a cabo la PCR, los procedimientos son: 96°C antes de la desnaturalización, durante 1 min . ; en cada uno de los 28 ciclos, desnaturalizar a 96°C durante 30 segundos, aparear a 63°C durante 30 segundos, continuar a 72°C durante 1.0 min.; después, continuar a 72°C durante 10 min. para obtener una secuencia 680 bp ( SEQ ID NO. 2), véase la Tabla 2.
B. - Secuencia del gen gyrB El gyrB es una subunidad del tetrámero de girasa de ADN, pertenece a la topoisomerasa de ADN tipo II de procariotas . Regula la topología de ADN por sus efectos de corte y ligación de ADN, tiene cierta relación con la 52-859 resistencia de algunas cepas bacterianas productoras de antibióticos y posee gran estabilidad y universalidad en las especies microbianas, en consecuencia, es adecuada como marcador molecular de clasificación filogenética . Por lo tanto, su secuencia se ha reconocido, en general, como una de las características de la taxonomía molecular bacteriana .
En esta invención se usaron los siguientes cebadores : Se utilizó como molde el ADN total de la cepa bacteriana SJ-IA para llevar a cabo la PCR, los procedimientos son: 96°C antes de la desnaturalización, durante 1 min.; en cada uno de los 28 ciclos, desnaturalizar a 96 °C durante 30 segundos, aparear a 65°C durante 30 segundos, continuar a 72°C durante 1.5 min.; después, continuar a 72°C durante 10 min. para obtener la secuencia 1177 bp (SEQ ID NO. 3), véase Tabla 3.
C- Secuencia del gen rpoB El gen rpoB es una subunidad de la ARN polimerasa, se encuentra presente ampliamente en Streptomyces .
En esta invención se utilizaron los siguientes cebadores : 5 ' - GAGCGCATGACCACCCAGGACGTCGAGGC-3 ' 5' -CCTCGTAGTTGTGACCCTCCCACGGCATGA -3' 52-859 Se utilizó como molde el ADN total de la cepa bacteriana WSJ-IA para llevar a cabo la PCR, los procedimientos son: 96°C antes de la desnaturalización, durante 1 min . ; en cada uno de los 28 ciclos, desnaturalizar a 96 °C durante 30 segundos, aparear a 65°C durante 30 segundos, continuar a 72°C durante 1.3 min.; después, continuar a 72°C durante 10 min. para obtener la secuencia 870bp ( SEQ ID NO. 4), véase la Tabla 4.
D.- Secuencia del gen recA El gen RecA es una recombinasa, desempeña una importante función en los procesos de recombinación homologa de ADN y reparación del ADN dañado. La presencia del RecA es un factor muy importante para asegurar la estabilidad del ADN genómico de la cepa, por lo tanto, su secuencia se ha reconocido, en general, como una de las características de la taxonomía molecular bacteriana.
En esta invención se utilizaron los siguientes cebadores : 5'- CCGCRCTCGCACAGATTGAACGSCAATTC -3' 5'- GCSAGGTCGGGGTTGTCCTTSAGGAAGTTGCG -3' Se utilizó como molde el ADN total de la cepa bacteriana WSJ-IA para llevar a cabo la PCR, los procedimientos son: 96°C antes de la desnaturalización, durante 1 min.; en cada uno de los 28 ciclos, desnaturalizar a 96 °C durante 30 segundos, aparear a 60°C durante 30 segundos, continuar a 72°C durante 1.0 min.; después, continuar a 72°C durante 10 min. para obtener la secuencia 701bp (SEQ ID NO. 5), véase la Tabla 5.
E.- Secuencia del gen trpB: El gen trpB codifica para la triptófano sintasa que participa en el metabolismo primario de Streptomyces , se considera que este gen tiene especificidad respecto a especies de cepas, su secuencia se ha reconocido, en general, como una de las características de la taxonomía molecular bacteriana.
En esta invención se utilizaron los siguientes cebadores : 5'- GCGCGAGGACCTGAACCACACCGGCTCACACAAGATCAACA -3' 5'- TCGATGGCCGGGATGATGCCCTCGGTGCGCGACAGCAGGC -3' Se utilizó como molde el ADN total de la cepa bacteriana WSJ-IA para llevar a cabo la PCR, los procedimientos son: 96°C antes de la desnaturalización, durante 1 min.; en cada uno de los 28 ciclos, desnaturalizar a 96 °C durante 30 segundos, aparear a 66°C durante 30 segundos, continuar a 72°C durante 1.0 min.; después, continuar a 72°C durante 10 min. para obtener la secuencia 611bp (SEQ ID NO. 6), véase la Tabla 6.
Los resultados en las tablas 3 y 4 muestran que no hay concordancia total entre la secuencia 16SrDNA y cinco secuencias de genes de mantenimiento de la cepa bacteriana WSJ-IA y las secuencias génicas de cepas conocidas, por lo que se puede decidir que la cepa WSJ-IA podría ser una nueva especie de Streptomyces .
Tabla 4. Comparación entre las secuencias de genes de mantenimiento de la cepa WSJ-IA y bacterias conocidas Nota: S: Streptomyces Ejemplo 3: Determinación a escala piloto del título de fermentación de la cepa bacteriana WSJ-IA.
La cepa WSJ-IA se cultivó en el medio para cultivo inclinado descrito en el Ejemplo 2, a 28°C durante 7-10 días, se extrajo una porción del cultivo anterior para inocularla en el medio de siembra (pasta de soya 1.5%, almidón 3.0%, NaCl 0.4%, CaC03 0.5%, peptona de pescado 0.3%, KH2P0 0.05%), se cultivó a 28°C durante 48 horas en la etapa A, después se transfirió a la etapa B para su cultivo a 28°C durante 24 horas, luego se transfirió a un tanque de siembra de 50 L, se cultivó durante 36 horas y luego se transfirió a un tanque de fermentación de 2 toneladas para su cultivo en el medio de siembra (medio de cultivo: glucosa 0.5%, almidón 6.0%, polvo de levadura 0.5%, harina de pescado 2.0%, NH4N03 ¾.6%, NaCl 1.0%, CaC03 0.5%, KH2P04 0.05%, MgS0 0.1%), la fermentación se llevó a cabo a 28°C y se cultivó durante 96 horas. Se muestreó el sobrenadante del caldo de fermentación, se diluyó con amortiguador de fosfato pH 7.8-8.0 que contenia 3% de NaCl. Como bacteria se prueba se utilizó bacillus [CGMCC (B) 63501] para determinar el titulo de fermentación aplicando el método de la curva estándar según la farmacopea china, Chínese Pharmacopoeia 2010 ed. II, Apéndice XI, en el medio siguiente: polipeptona 0.6%, polvo de extracto de carne 0.15%, pasta de extracto de levadura 0.6%, glucosa 0.2%, agar 1.5-2.0%, con acetil espiramicina como control. El experimento se repitió tres veces para obtener un título de fermentación promedio para WSJ-IA de 1160 yg/ml, en comparación la fermentación con la cepa SJ-2 que contiene el gen ist único dio como resultado un título promedio de 280 pg/ml (Tabla 5) .
Ejemplo 4: Determinación del rendimiento del 52-859 componente isovaleril espiramicina I como producto de fermentación con la cepa SJ-IA El caldo de fermentación obtenido en el Ejemplo 3 se muestreó, el pH del caldo se ajustó a 8.5, se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo y el extracto de acetato de etilo se concentró hasta sequedad y se disolvió en metanol. La "solución se separó en columna de Kromasil C18 (4.5 mmxl50 mm, 5 m) ; fase móvil: solución de metanol : fosfato dibásico de sodio (53:47 v/v) ; longitud de onda de detección: 231 nm; velocidad de flujo: 1.0 mL'min"1; temperatura de la columna 25°C; tamaño de la muestra: 10-20 \x . El contenido del componente isovaleril espiramicina I en el caldo se calculó mediante los resultados de HPLC (Figura 3) . Los resultados de 3 experimentos demostraron que, la fermentación con la cepa WSJ-IA y la cepa WSJ-2 que contiene en monogen ist, el contenido total promedio del componente isovaleril espiramicina I fue de 12.061% y 7.088%, respectivamente. Después de la fermentación según el Ejemplo 3, se determinaron los títulos de fermentación de las dos cepas mediante ensayo microbiológico y los productos se analizaron por HPLC (Figura 3) . Considerando las áreas de los picos de HPLC obtenidos, se comparó el componente isovaleril espiramicina I producido con las dos cepas, se calculó la relación entre isovaleril espiramicina y espiramicina producidas con las dos cepas, 52-859 respectivamente. Los resultados mostraron que la introducción del gen ist-acyB2 incrementó el titulo de fermentación de la cepa WSJ-IA en 414%, el contenido de isovaleril espiramicina I producida aumento en 170.2%, mientras que la producción de espiramicina disminuyó. Esto aumentó la relación entre el contenido de isovaleril espiramicina I y el contenido de espiramicina en 218% (Tabla 5) .
Esta invención proporciona una cepa capaz de producir isovaleril espiramicina I que contiene el gen ist- acyB2, en ciertas condiciones de fermentación, esta cepa aumenta la producción de isovaleril espiramicina I por un factor de 1.7 y aumenta el titulo de fermentación por un factor de 4.14 en comparación con la cepa que sólo contiene el gen ist.
Tabla 5. Comparación del titulo de fermentación con las cepas WSJ-IA y WSJ-2 y contenido del componente 52-859

Claims (4)

REIVINDICACIONES :
1. Una cepa de bacteria manipulada genéticamente que produce alto contenido de componente isovaleril espiramicina I con alta productividad, en donde la bacteria manipulada genéticamente es una cepa clonal con el gen ist de isovaleril transferasa unido al gen regulador acyB2 coexpresado en la bacteria WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I.
2. El método para construir la bacteria manipulada genéticamente según la reivindicación 1, en donde : A) Se usa como molde el ADN total de Streptomyces resistente al calo {Streptomyces thermotolarences CGMCC4.1501) , para diseñar cebadores según la secuencia ist-acyB2 anunciada por NCBI, realizar PCR para obtener el segmento de genes ligados ist-acyB2, insertar sitios de escisión adecuados; o también, ligar los fragmentos génicos ist y acyB2, respectivamente, con el vector de integración transferible a la cepa bacteriana productora de isovaleril espiramicina I, para obtener el plásmido recombinante que contiene el gen ist-acyB2; B) Se transfiere el plásmido recombinante que contiene el gen ist-acyB2 a la bacteria WSJ-2 productora de isovaleril espiramicina I, por medio de tamizaje de resistencia para obtener el transformante, después de 52-859 continuos subcultivos sin dosificación y de evaluación con dosificación para obtener la expresión estable de la bacteria productora de isovaleril espiramicina I que contiene el plásmido recombinante , se genera una cepa que se denomina WSJ-IA, Núm. de colección de cultivo CGMCC No.3942.
3. El método de construcción de la bacteria manipulada genéticamente según la reivindicación 2, en donde la cepa WSJ-IA obtenida, se valida por medio de PCR para confirmar que contiene la secuencia ist-acyB2 al nivel de gen.
4. El método de construcción de la bacteria manipulada genéticamente según la reivindicación 2, en donde la cepa construida, después de cultivo y fermentación, da como resultado un titulo de fermentación no menor de 1160 g/mL y una producción total de isovaleril eespiramicina I no menor de 12.061%. 52-859
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