JP5719437B2 - 遺伝子組み換えストレプトマイセス株、及びイソバレリルスピラマイシンiの生成方法 - Google Patents
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Description
式中:
図2は、ist-acyB2遺伝子がイソバレリルスピラマイシンIを整合し、細菌染色体を生成したことに用いるPCR証明試験である、其の中に:M-MarkerIII;1−WSJ-2対照菌;2-5−WSJ-IA1-4転換体;
図3 は含ist-acyB2遺伝子組換えプラスミドpSET52-ia菌種WSJ-IAが発酵を通じて生成したイソバレリルスピラマイシン成分IのHPLC分析である、其の中に:A−WSJ-2対照菌; B−WSJ-IA istと調節遺伝子acyB2を含有のストレプロマイセス株;SP−スピラマイシン; ISO-SP−イソバレリルスピラマイシンI。
本実験室がまず構築した組換えプラスミドpSW4[尚広東等、生物工程学報1999,15(2):171 ] 中から、SmaI-BamHIに制限酵素で、含ist完整遺伝子と含acyB2遺伝子上流部分の1820bp断片を獲得し、中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センターから提供された耐熱ストレプトマイセス(Streptomyces thermotolarences CGMCC4.1501)総DNAを鋳型とし、NCBI公布のacyB2配列によって、プライマー
p1:CGCTCAGGGACGCAAGACC とP2:CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTCを設計し 、PCR反応により、反応条件は94℃、 予変性2min;94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min、28循環;72℃ 延伸5minである。acyB2遺伝子下流部分1013bp断片を獲得し、PCRの生産物をBamHI-EcoRI制限酵素で、934bp断片を獲得し、前記SmaI-BamHI(1820bp)、BamHI-EcoRI(934bp)断片をpBluesript II KS(+)ベクター(Merck会社)のSmaI-EcoRI制限酵素部位に接合し、含istと完整acyB2遺伝子組換えプラスミドpBKS-iaを獲得した。XbaI-EcoRI制限酵素部位により大腸桿菌/ストレプトマイセスストレプトマイセス接合転移プラスミド整合型pSET152プラスミド[Bierman M. et al Gene 1992,116,43-49来自遺伝子バンク共享資源www.genecool.com] に結合し、ist-acyB2遺伝子組換えプラスミドpSET52-iaを獲得した(実験方法は宝生物工程(大連)有限公司操作規程に寄った)。構築フロシートは(図1)に示す。
イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2は本実験室にて構築されたのである [Chunyan Ma et al. Current Microbiology, 2011,62:16-20]。前記菌種が斜面培地に[大豆ケーキ粉 2.0%,グルコース1.0%,澱粉3.0%、CaCO3 0.5%,NaCl 0.4%,寒天 2.0%]28℃で7-10日間培養し、文献[D.A.Hopwood等 Genetic manipulation of Streptomyces、A Laboratory Manual、Norwich;John Innes Foundation UK、1985]において説明の方法によって原生質体を製造し,具体的に、菌種を塊堀りし、含ショ糖R2YE培地に接種し28℃で2-4日間培養し、10%接種量にて前記培地に転種し、かつ0.5%グリシン、20時間培養し、遠心で菌糸を収集し、10.3%ショ糖溶液で2-3回洗浄し、含溶菌酵素2mg/mlのP溶液中において37℃で15-60分間溶菌し、綿を通しロ過して原生質体を獲得した。イソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-2が外来遺伝子に対する限制修飾作用を克服するために、本発明にはまず組換えプラスミドpSET52-iaをメチル化欠陥型大腸桿菌E.coli12567 [Mac Neil et al Gene 1992,111,61-68] に転入、遺伝子バンク共同に享受資源からのであるwww.genecool.com。形質転換体からプラスミドDNAを採取し、その後PEGを介し原生質体に転入し,かつR2YE固体培地に塗布し、28℃で24時間培養した後、含アラビア酵素溶液で培養物を被って、アラビア酵素を培地中における最終濃度50μg/mlにせしめ、続いて7-10日間培養し抗性形質転換体を選択した。加薬しない条件下で連続に世代した後、更に加薬検定を通じて、安定表現抗性の組換えプラスミドpSET52-iaを含有したイソバレリルスピラマイシンI生成菌WSJ-IAを獲得した。
本発明は《放線菌分類及び鑑定》[閏孫初監修、1992年]を参照し、WSJ-IA菌株に対し菌株特徴の鑑定と確認を行った。
1、 WSJ-IA培養形態及び生理生化特徴
(1)培養特徴
菌株の異なった培地における気生菌糸、基内菌糸と可溶性色素の色を観察し、結果を表1に示す。
(2)顕著な特徴:
胞子糸柔軟、フック状と螺旋形;胞子柱形と楕円形。
表1 WSJ-IA菌株の培養特徴
注:Czapek-Dox培地: ショ糖30g、NaNO3 3.0g、MgSO4 7H2O 0.5g、KCl 0.5g 、FeSO4 4H2O、K2HPO4 1.0g、寒天 15.0g、 蒸留水1.0リットル,pH6.0-6.5。
グルコースアスパラグス培地:グルコース10g、アスパラグス0.5g、K2HPO4 0.5g、寒天 15.0g、蒸留水1.0リットル,pH7.2-7.4。
グリセリンアスパラグス培地: グリセリン10g、アスパラグス0.5g、K2HPO4 0.5g、寒天 15.0g、蒸留水1.0リットル,pH7.2-7.4。
無機塩澱粉培地: 可溶性澱粉 10.0g、MgSO4 7H2O 1.0g、NaCl 1.0、
(NH4)2SO4 2.0g、CaCO3 2.0gK2HPO4 1.0g、MnCl2 4H2O 10mg、FeSO4 10mg、ZnSO4 7H2O 10mg、寒天15.0g、蒸留水1.0リットル、pH7.2。
ISP-2培地:酵母クリーム 4.0 g、マルトエキスクリーム 10.0g、グルコース 4.0g、寒天20.0g、蒸留水1.0リットル、pH7.2-7.4。
オートミール培地:オートミール20.0g、微量塩溶液1ml、寒天15g、蒸留水 1.0 リットル、pH7.2。注:微量塩液溶液: FeSO4 7H2O 0.1g、MnCl2 4H2O 0.1g、ZnSO4 7H2O 0.1g、100ml蒸留水。
Gause’s一号培地:可溶性澱粉20.0g、KNO3 1.0g、K2HPO40.5g、MgSO4 7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4 7H2O 0.01g 寒天15.0g、蒸留水1.0リットル、pH7.2-7.4。
Santa’s培地:KH2PO4 0.5 g、MgSO4 7H2O 0.5 g、クエン酸2.0g、クエン酸鉄アンモニウム0.05 g、グリセリン 60 ml、アスパラミド 4.0g、寒天15.0g、蒸留水1.0リットル、pH7.4。
(3)生理生化特徴:
A、選択基礎培地上にWSJ-IA菌株の炭源に対する利用を検出
基礎培地:(NH4)2SO4 2.0g、MgSO4 7H2O 0.2g、NaH2PO4 H2O 0.5g、CaCl2 2H2O 0.1g、K2HPO40.5g、蒸留水1.0リットル、測定炭源が0.1%-0.5%で夫夫基礎培地に入った。滅菌後、菌懸濁液を持って接種し、28℃で培養、連続に3代移種、菌体成長情況にてWSJ-IA菌株の炭源に対する利用を確認。
B、マロン酸利用の基礎培地測定: 酵母クリーム1.0g、(NH4)2SO4 2.0g、 K2HPO4 0.6g、KH2PO4 0.4g NaCl 2.0g、マロン酸ナトリウム 3.0g、ブロムチモールブルー0.025g、蒸留水1.0リットル、pH7.0-7.4。滅菌後、菌懸濁液で接種し、28℃1-2日培養、培地がグリーン色からブルー色に変化したものはマロン酸利用とした。
C、酒石酸塩利用の基礎培地測定: 蛋白ゼリー10.0g、NaCl 5.0g、酒石酸ナトリウム10.0g、ブロモチモールブルー(0.2%)12.5ml、蒸留水1.0リットル、滅菌。同時に酢酸鉛飽和溶液を製造した。菌懸濁液接種後14日間、28℃で培養14日間、等体積酢酸鉛試薬を仕込み、溶液が緑黄色に変化し、少量酢酸鉛沈殿のものは酒石酸利用を表した。
D、ゼラチン液化:基礎培地蛋白ゼリー5.0g、ゼラチン100-150g、蒸留水1.0リットル、pH7.2-7.4、滅菌。成長18-24時間の菌培養物を取って、それにゼラチン培地に挿し接種、かつ未接種対照を設け、20℃保温箱中にて培養し、2,7,10,14と30日間、20℃以下室温で菌体成長及びゼラチン液化を観察し、結果、菌が既に成長、ゼラチン表面に凹部なし且つ安定的な凝塊を示せば、ゼラチン液が陰性と認められる。
E、ミルク反応:新鮮ミルク煮沸、冷蔵庫に一晩に放置し、底層脱脂ミルクを取った;リトマス2.5gを100ml蒸留水に一晩に浸漬し、ろ過、2.5%リトマス水溶液4ml、脱脂ミルク100mlを取って、装入試験管の高さが約4cm、滅菌、菌株接種28℃で培養1,3,5,7,14和30日間、観察結果は、ミルク塊ゼリー化を表した。
F、硝酸塩還元:培地肉エキスゼリー培地1.0リットル、KNO3 1.0g、pH7.0-7.6、各管に4-5mlを装入、滅菌。グリース氏(Griess)試薬:a) p−アミノベンゼンスルファニル酸0.5g、希酢酸(10%)150ml;b) -ナフチルアミン 0.1g、蒸留水 20ml、希酢酸(10%)150ml。ジアニリン試薬:ジアニリン0.5gを100ml濃硫酸に溶解し、20ml蒸留水で希釈した。菌種を硝酸塩培地に接種し、28℃で培養1,3,5日間、洗浄管に1,3,5日間の培養液を少量に加入、夫夫一滴a)、b)液を滴下し、溶液は赤色に変化すれば、硝酸塩が亜硝酸塩に還元されたと表示、一滴ジアニリン試薬を加入し、青色反応を呈していない。
G、チロシン酵素:菌種がGause’s一号液体培地に接種され、28℃で7,9,12日間培養、別々に2ml培養液をサンプルし、遠心後に上清液を取り、2mlリン酸緩衝液(pH5.9)と1ml0.04%チロシン溶液を仕込、37℃で5分間保温し、赤色反応を呈しない。
H、澱粉酵素:菌種が肉エキスゼリー中に接種して0.2%可溶性澱粉寒天培地中に加入し、28℃で2-5日間培養し、寒天平板上で明らかにコロニーに形成した後、平板上にヨード液(ヨード1.0g、ヨード化カリウム2.0g、300ml蒸留水)、コロニー周囲に不辺色の透明環を呈すると、澱粉水解を表明した。
WSJ-IA菌株の生理生化特徴は表2に示す。
2、WSJ-IAの分子系統学特徴分析
(1)16S rDNA遺伝子配列:
16SrDNAが細菌リボソームの組成部分で、16SrDNA遺伝子は細菌染色体上にコードrRNA相応的なDNA配列で、それは遺伝学に高度保守性を備えるため、従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。
以下の16SrDNAプライマー:5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’を採用
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96℃予変性1 min;各循環中に、96 ℃で変性30 s、50℃でアニール30 s、72℃で延伸1.5 min、25個循環; 72℃で延伸10 min。1393bp配列表(1)を獲得。
表2 WSJ-IA菌株の生理生化特徴
表3 WSJ-IA 16S rDNA遺伝子配列と既知菌との比較
A.atpD遺伝子配列
atpD遺伝子はATP合成酵素サブユニットで、微生物種属中において高い安定性と普遍性を備え, 種系分類の分子標識とするのは適合である。本発明は以下プライマーを採用:
5’-GTCGGCGACTTCACCAAGGGCAAGGTGTTCAACACC-3’
5’-GTGAACTGCTTGGCGACGTGGGTGTTCTGGGACAGGAA -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96 ℃予変性1 min;各循環中96 ℃で変性30 s、63 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min。680bp配列表(2)を獲得。
GyrBはDNAジャイレース四量体のサブユニットで、原核生物II型DNAトポロジ異性酵素に属され、かれがDNA切断と重複接合作用によってDNAのトポロジ構造を調節し、ある抗生素生成菌の抗性と関わり、微生物種属中において高い安定性と普遍性を備え,種系分類の分子標識とするのは適合である。従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。
本発明は以下プライマーを採用:
5’-GAGGTCGTGCTGACCGTGCTGCACGCGGGCGGCAAGTTCGGC-3’
5’-GTTGATGTGCTGGCCGTCGACGTGAGCGTCCGCCAT -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96 ℃予変性1 min;各循環中96 ℃で変性30 s、65 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min1177bp配列表(3)を獲得。
rpoBはRNAポリメラーゼb-サブユニットで、ストレプトマイセスにおいて広汎に存在している。
本発明は以下プライマーを採用::
5’- GAGCGCATGACCACCCAGGACGTCGAGGC-3’
5’-CCTCGTAGTTGTGACCCTCCCACGGCATGA -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96 ℃予変性1 min;各循環中96 ℃で変性30 s、65 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min870bp配列表(4)を獲得。
RecAは組換え酵素で、DNA同源組換えと損害修復DNAの過程において重要な役割を果たす。RecAの存在は菌株遺伝子グループDNA構造安定性の重要ファクターで、従って、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。
本発明は以下プライマーを採用::
5’- CCGCRCTCGCACAGATTGAACGSCAATTC -3’
5’- GCSAGGTCGGGGTTGTCCTTSAGGAAGTTGCG -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96 ℃予変性1 min;各循環中96 ℃で変性30 s、65 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min701bp配列表(5)を獲得。
trpB遺伝子はコードトリプトファン合成酵素で、ストレプトマイセス初級代謝に参与し、菌株種属特異性を有すると認められ、其の配列が既に細菌分子分類学の特徴の一に公認された。。
本発明は以下プライマーを採用::
5’- GCGCGAGGACCTGAACCACACCGGCTCACACAAGATCAACA -3’
5’- TCGATGGCCGGGATGATGCCCTCGGTGCGCGACAGCAGGC -3’
WSJ-IA菌株総DNAを鋳型にして、PCR反応過程:96 ℃予変性1 min;各循環中96 ℃で変性30 s、66 ℃でアニール30 s、72 ℃延伸1.0 min、28個循環; 72℃延伸10 min611bp配列表(6)を獲得。
表4 WSJ-IA肝心遺伝子配列と既知菌の比較
WSJ-IA菌種が《実施例2》前記斜面培地28℃で培養7-10日間、塊堀りで種子培地(大豆ケーキ粉 1.5%、澱粉 3.0%、NaCl 0.4%、 CaCO3 0.5%、魚蛋白ゼリー 0.3%、 KH2PO4 0.05%)に接種し、一級28℃で48時間培養して、二級種子培養に転入し28℃で24時間培養し、50L種子缶培養に転入し36時間培養し、更に2トン発酵缶に転入し、発酵培地(グルコース 0.5%、澱粉 6.0%、酵母粉0.5%、魚粉2.0%、NH4NO3 0.6%、NaCl 1.0%、CaCO3 0.5% 、KH2PO4 0.05%、MgSO4 0.1%)、28℃で96時間発酵培養した。発酵液から遠心上清液をサンプルし、含3%NaClのpH 7.8~8.0リン酸塩緩衝液で希釈した。胞子桿菌[CGMCC(B)63501]を検出菌とし、培地配合: 蛋白ゼリー 0.6%,牛肉浸漬粉 0.15%,酵母エキスクリーム 0.6%,グルコース 0.2% , 寒天1.5-2.0%, 中国薬典2010版二部附録XI Aによる基準曲線方法に基づき、アセチルスピラマイシンを基準品にして、発酵能力を計算した。本実験に三次重複した後、得られたWSJ-IA菌種発酵能力平均は1160mg/ml、含ist単遺伝子のWSJ-2菌種対照発酵能力の平均が280μg/ml(表5)である。
《実施例3》で獲得発酵液からのサンプルをpH8.5までに調整し、等量酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル抽出液を濃縮し、乾しまでにした後、メタノールに溶解した。以下の条件を採用し: Kromasil C18 カラム(4.5 mm×150 mm、5 μm);流動相:メタノール:リン酸ジヒドロナトリウム溶液(体積比53:47);検出波長:231 nm;流速:1.0 mL・min-1;カラム温度25℃;仕込み量:10-20 μL。HPLCにて産物中におけるイソバレリルスピラマイシンI成分の含有量を検出(図2)、三回実験結果から、WSJ-IA菌種発酵で生成したイソバレリルスピラマイシンI総含有量は平均に12.061%で、含ist単遺伝子のWSJ-2菌種対照生成イソバレリルスピラマイシンI総含有量は7.088%で、《実施例3》により発酵培養を行い、微生物法で二つ菌種発酵能力を測定し、酢酸エチル抽出産物に対しHPLC分析(図3)を行った。HPLC中ピーク面積により両者生成イソバレリルスピラマイシンI成分の情況を比較し、夫夫に両者生成イソバレリルスピラマイシンIがスピラマイシンとの比例を計算し、結果、ist-acyB2遺伝子の導入によって WSJ-IA菌種発酵能力414%を向上し、生成イソバレリルスピラマイシンI含有量も170.2%を向上、相応的にスピラマイシンの生成を下げ、イソバレリルスピラマイシンI成分とスピラマイシン比例が218% を向上した(表5)。
Claims (2)
- WSJ−IAと命名され、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに、受託番号CGMCC 3942で寄託された、イソバレリルスピラマイシンIを生成するための、遺伝子組み換えストレプトマイセス株。
- 請求項1に記載の遺伝子組み換えストレプトマイセス株を培地中で培養することにより生成された発酵液からイソバレリルスピラマイシンIを抽出する工程を含むことを特徴とするイソバレリルスピラマイシンIの生成方法。
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