CN115626942A - lobophorins N1-N3及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗生素lobophorin E和lobophorins N1‑N3及其制备方法和应用。本发明构建了工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1，可从该菌株的发酵培养物中大量获得已知化合物lobophorin E(1)和新化合物lobophorins N1‑N3(2‑4)。Lobophorin E具有抗肿瘤活性，为开发抗肿瘤新药提供了候选化合物；lobophorins N1‑N3具有抗菌活性，可用于制备抗菌药物。

Description

lobophorins N1-N3及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，具体涉及新的抗生素lobophorins N1-N3(2-4)和已知抗生素lobophorin E(1)及其制备方法和应用。
背景技术：
Lobophorins为螺环乙酰乙酸内酯类抗生素，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎症等多种生物活性。lobophorin E为已知的lobophorins家族化合物，具有抗菌作用。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供3个新的螺环类抗生素lobophorins N1-N3(2-4)及大量获得已知化合物lobophorin E(1)的方法。
Lobophorins N1-N3是具有新颖结构的lobophorins家族化合物，本研究通过基因敲除的手段对lobophorins生物合成基因簇中P450羟化酶基因lobP1进行敲除获得足量的已知化合物lobophorin E以及三个新的lobophorins家族化合物lobophorins N1-N3，并对这些化合物进行了抗菌和抗肿瘤活性研究。
本发明的3个新的螺环类抗生素lobophorins N1-N3(2-4)和已知化合物lobophorin E(1)，其结构如式(I)所示：
Figure BDA0003939048860000011
本发明的第二个目的是提供一种工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的构建方法，其是将菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127中lobophorin生物合成基因簇中P450羟化酶基因lobP1敲除后得到基因工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1。
本发明的第三个目的是提供一种制备抗生素lobophorins N1-N3和lobophorin E的方法，其特征在于，化合物lobophorins N1-N3和lobophorin E是从工程菌株Streptomyces sp.SCSIO01127/ΔlobP1的发酵培养物中制备分离得到的。
优选，具体步骤为：
a、制备工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的发酵培养物，将发酵培养物的发酵液和菌丝体分开；发酵液经大孔树脂XAD-16吸附，后用丙酮洗脱，减压浓缩回收丙酮，剩余的水相用丁酮萃取，再减压浓缩至干得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，减压浓缩回收丙酮，剩余的水相用丁酮萃取，减压浓缩至干得到浸膏B；将浸膏A和浸膏B合并得到粗提物，由此得到工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的粗提物；
将工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇从体积比为1:0、4:1、2:1和0:1梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比为4:1的馏分Fr.2，馏分Fr.2经Sephdex LH-20凝胶柱分离，以氯仿/甲醇体积比1:1等度洗脱，洗脱馏分经纯化得到化合物lobophorin N1、化合物lobophorin N2、化合物lobophorin N3和化合物lobophorin E。
所述的制备工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的发酵培养物是将活化的工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1直接接入发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：大豆粉3g，酵母提取粉3g，海藻糖10g，L-proline 1g，牛肉膏3g，甘油6g，FeSO4·7H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO4 0.3g，CaCO3 2g，海盐30g，余量为水，pH 7.2-7.4。
本发明的第四个目的是提供上述螺环类抗生素lobophorins N1-N3中的任一化合物在制备抗菌药物中的应用。
所述的抗菌药物优选为抗Bacillus subtilis、Micrococcus luteus、Staphylococcus aureus或MRSA的药物。
本发明的第五个目的是提供上述螺环类抗生素lobophorin N1、lobophorin N3和lobophorin E中的任一化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物优选为抗神经瘤、肝癌、乳腺瘤和\或非小细胞肺癌的药物。
本发明构建了工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1，并从它的发酵培养物分离出具有抗菌和抗肿瘤活性的lobophorins N1-N3和lobophorin E，可以作为抗菌、抗肿瘤化合物的先导化合物。
本发明的野生型菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127于2011年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2011178.其公开于专利号为：ZL201110149558.2，发明名称为：抗生素Lobophorin E和F及其制备方法和在制备抗菌、抗肿瘤药物中的应用的专利中。
附图说明：
图1是Streptomyces sp.SCSIO 01127中lobophorin生物合成基因簇图；
图2是工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的构建过程；
图3是工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1和野生型菌株发酵液HPLC分析检测图及化合物1-4的结构；
高效液相色谱(HPLC)条件：色谱柱为Phenomex Kinetex C18,250×4.6mm,5μm，流动相包括A相和B相，流动相A相：10％(体积分数)的乙腈+0.1％(体积分数)的甲酸，溶剂为水，流动B相：90％(体积分数)的乙腈，溶剂为水；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5-0:100，20-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0:100，30-31min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0:100-95:5，31-35min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5，检测波长265nm，流速1ml min-1，其中1代表化合物1，2代表化合物2，3代表化合物3，4代表化合物4。
图4是化合物2的HRESIMS谱图；
图5是化合物2的1H-NMR谱图；
图6是化合物2的13C-NMR谱图；
图7是化合物2的DEPT135谱图；
图8是化合物2的COSY谱图；
图9是化合物2的HSQC谱图；
图10是化合物2的HMBC谱图；
图11是化合物3的HRESIMS谱图；
图12是化合物3的1H-NMR谱图；
图13是化合物3的13C-NMR谱图；
图14是化合物3的DEPT135谱图；
图15是化合物3的COSY谱图；
图16是化合物3的HSQC谱图；
图17是化合物3的HMBC谱图；
图18是化合物4的HRESIMS谱图；
图19是化合物4的1H-NMR谱图；
图20是化合物4的13C-NMR谱图；
图21是化合物4的DEPT135谱图；
图22是化合物4的COSY谱图；
图23是化合物4的HSQC谱图；
图24是化合物4的HMBC谱图；
图25是化合物4的NOESY谱图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
lobP1敲除菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1突变株的构建和发酵检测
通过PCR-targeting的方法对链霉菌Streptomyces sp.SCSIO 01127中lobophorins生物合成基因簇(图1)中P450羟化酶基因lobP1进行敲除，得到突变株Streptomyces sp.SCSIO01127/ΔlobP1。对比野生型Streptomyces sp.SCSIO 01127的发酵检测图，突变株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1中产生了大量已知的化合物1，此外，还产生了新化合物2-4(图3)，经HRESIMS、1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC和COSY等数据分析，确认这3个新化合物lobophorin N1(2)(图4-10)、lobophorin N2(3)(图11-17)和lobophorin N3(4)(图18-25)的结构。
本发明通过基因敲除的手段成功获得了多个新的lobophorin结构类似物lobophorins N1-N3(2-4)，并获得足量的已知化合物lobophorin E(1)用于抗肿瘤活性测试。
以下进一步提供实施例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限。
实施例1：工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的构建
其构建过程如图2所示，具体步骤如下：
lobophorin生物合成基因簇如图1所示，pCSG517(Li,S.；Xiao,J.；Zhu,Y.；Zhang,G.；Yang,C.；Zhang,H.；Ma,L.；Zhang,C.,Dissecting glycosylation steps inlobophorin biosynthesis implies an iterative glycosyltransferase.Organicletters 2013,15(6),1374-1377.)中lobP1(编码P450羟化酶基因，genbank登录号：AGI99476.1)通过PCR-targeting的方法被抗性盒aac(3)IV和oriT所置换得到lobT1缺失的突变质粒pCSG713。具体的PCR-targeting方法如下：(1)将质粒pCSG517转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得E.coli BW25113/pIJ790/pCSG517，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red工程系统表达，并将其制备成为化转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，回收其中约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用引物lobP1-tarF/R(表1)通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶FastPfu 2μL，10×Buffer 5μL，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO2.5μL，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物化转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，涂布于LB筛选平板(含50μg/mL阿泊拉霉素)上，37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆，用验证引物lobP1-TF/TR(表1)验证，将PCR验证正确的质粒命名为pCSG713。(4)将构建好的质粒pCSG713转化到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG713，作为接合转移的供体菌。
将接合转移的受体菌Streptomyces sp.SCSIO 01127划线于38#(酵母提取粉4g，葡萄糖4g，麦芽提取粉5g，复合维生素500μL，海盐30g，琼脂粉15-20g，水1000mL，pH 7.2-7.4。)平板，在28℃培养5-7天，长出的孢子用无菌棉签收集于TSB培养基中，涡旋振荡，使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子，孢子悬浮于2mL的TSB培养基中，50℃热激10min，然后于28℃萌发2h，作为接合转移的受体菌。
供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG713在50mL含50μg/mL阿泊拉霉素、50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.8。离心收集菌体(4000rpm，10min)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于400μL LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的ISP4固体培养基上，吹干后，于28℃培养18-20h。然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，抗生素终浓度为50μg/mL阿泊拉霉素和100μg/mL甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养5-7天后观察。当接合转移平板上长出菌落后，用无菌牙签将其转接到含有50μg/mL阿泊拉霉素和100μg/mL甲氧苄氨嘧啶的ISP4平板上，28℃培养3天后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物lobP1-TF/TR(表1)通过PCR检测，筛选单交换或者双交换突变株，将突变株划线于无抗ISP4平板，待其长出孢子后将孢子稀释涂布于无抗ISP4平板，将长出来的单克隆分别对点于含Kan抗性的ISP4平板和含Apr抗性的ISP4平板，PCR验证在Apr板上生长而在Kan板上不生长的克隆子，最终得到双交换突变菌株，将该菌株命名为Streptomyces sp.SCSIO01127/ΔlobP1，该突变株中lobP1基因被敲除失活。
表1.本发明中使用的引物
Figure BDA0003939048860000061
实施例2：工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的发酵和产物制备
1、放大发酵培养：
发酵培养基的组分为：大豆粉3g，酵母提取粉3g，海藻糖10g，L-proline 1g，牛肉膏3g，甘油6g，FeSO4·7H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 0.3g，CaCO3 2g，海盐30g，加入到1000mL水中，调pH 7.2-7.4，灭菌制得。
工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1活化后，将孢子直接接入到50mL发酵培养基中(250mL锥形瓶)，共准备14L发酵培养基，28℃，200rpm，培养120h，制得工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的发酵培养物。
2、发酵液的萃取：
发酵培养物先进行离心分离(3500rpm，8min)，得到上清液(发酵液)和菌丝体。发酵液经大孔树脂XAD-16固相萃取，后用丙酮洗脱大孔树脂3次，洗脱液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取3次，丁酮层经蒸馏浓缩后得到上清液提取物-浸膏A；菌丝体用2L丙酮在室温下浸提3次，每次3小时，合并提取液，减压回收丙酮后剩余水混合液用6L丁酮萃取，丁酮层减压蒸馏得菌丝体提取物-浸膏B。
3、化合物的分离：
将工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的发酵培养物得到的浸膏A和浸膏B合并经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇梯度洗脱(体积比为1:0、4:1、2:1和0:1)顺序得到4馏分(Fr.1-Fr.4)；馏分Fr.2经Sephdex LH-20凝胶柱(柱子大小120cm×3cm)分离，以氯仿/甲醇1:1等度洗脱，每15mL接收1瓶，根据TLC检测(展开剂为氯仿/甲醇10:1，v/v)结果，将含有相同Rf值的组分合并得4个亚馏分Fr.1.1-Fr.1.4(其中Fr.1.1由第1-5小瓶合并；Fr.1.2由第6-19小瓶合并；Fr.1.3由第20-29小瓶合并；Fr.1.4由第30-39小瓶合并)；馏分Fr.1.2经中压反相分离(填料为YMC*GEL ODS-A-HG；12nm S-50μm；流动相为：A相为水加0.1％的甲酸，B相为100％乙腈；洗脱程序为：0％ B-85％，0-60min；85％ B-100％ B，60-80min；100％B，80-100min；流速为20mL min-1，检测波长为265nm)得到9个组分(Fr.1.2.1-Fr.1.2.9)。
Fr.1.2.2(55-70min洗脱的组分)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：PhenomenexKinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为水加0.1％的甲酸，B相为90％的乙腈/水，90％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为265nm)得到化合物lobophorin N3(4)(Rt＝23.7min)，lobophorin N2(3)(Rt＝24.0min)和lobophorin N1(2)(Rt＝24.8min)；Fr.1.2.8(80-90min洗脱的馏分)经半制备HPLC纯化(柱子参数为：PhenomenexKinetex C18，250×4.6mm，5μm；流动相为：A相为水加0.1％的甲酸，B相为90％的乙腈/水，95％的B相等度洗脱，流速为2.5mL·min-1；检测波长为265nm)得到化合物lobophorin E(1)(Rt＝27.0min)。
4、化合物的鉴定：
化合物2-4的结构经HRESIMS、1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC和COSY鉴定。其核磁数据归属见表2，化合物lobophorin N1(2)的谱图见图4-10，lobophorin N2(3)的谱图见图11-17，lobophorin N3(4)的谱图见图18-25。
由此确定新化合物2-4的结构式如下所示：
Figure BDA0003939048860000071
表2.化合物2-4的NMR(700MHz)核磁数据归属
Figure BDA0003939048860000081
Figure BDA0003939048860000091
实施例3:化合物1-4抗菌活性的测定
采用微量培养基稀释法测定了化合物1-4对4种指示菌Bacillus subtilis 1064、Micrococcus luteus SCSIO ML01、Staphylococcus aureus ATCC 29213和MRSA shhs-A1(临床样品)的抑制活性。4种指示菌经摇床37℃，200rpm培养16h，用无菌培养基稀释到OD值(600nm)为0.04-0.06，再稀释10倍加入到96孔板中；加入样品后，等倍稀释到终浓度64-0.125μg mL-1，每个浓度3个平行；37℃培养18h，用酶标仪测定各孔的吸收值，并计算各化合物的最小抑菌浓度(MIC)，抑制率(％)＝(1-(A样品-A样品背景)/(A阴性对照-A空白对照))×100％，抑制率>80％为MIC值。其结果见表3。
表3.化合物1-4的抗菌活性(MIC，μg/mL)
Figure BDA0003939048860000092
实施例4:化合物1、2和4的抗肿瘤活性的测定
采用SRB法测定了化合物1、2和4对4种肿瘤细胞株SF-268，HepG2，MCF-7和A549的抑制活性。4种肿瘤细胞株采用RPMI培养基培养，将180μL培养物(浓度为3×104个细胞每mL)加入到96孔板中，37℃，5％ CO2培养18h；将20μL的待测样品(终浓度为1、10和100μM，溶剂为DMSO)加入到96孔板相应的孔中，用DMSO作为阴性对照，每个浓度做3个平行，继续培养72小时；加入50％的三氯乙酸50μL混合，再加入0.4％的SRB(溶解在1％的乙酸中)放置30分钟；去除上清，将与染料结合的蛋白溶解200μL 10mM的Tris缓冲液中，用酶标仪测定各孔的OD值(570nm)，并计算相应的抑制率；以多柔比星作为阳性对照。其结果见表4，结果表明lobophorin E(1)对4种指示细胞株的IC50(采用SigmaPlot 14.0软件中非线性曲线拟合(non-linear curve-fitting)的方法计算相应的IC50)范围为3.11到12.07μM，其抗肝癌细胞的活性与阳性对照多柔比星的活性相当。
表4.化合物1、2和4的的细胞毒活性
Figure BDA0003939048860000101

Claims (9)

1.化合物lobophorins N1-N3，其结构如式(I)所示：
Figure FDA0003939048850000011
2.一种工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1，其特征在于，将菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127中lobophorin生物合成基因簇中P450羟化酶基因lobP1敲除后得到基因工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1。
3.一种制备权利要求1中的lobophorins N1-N3和抗生素lobophorin E的方法，其特征在于，化合物lobophorin E和lobophorins N1-N3是从权利要求2所述的工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的发酵培养物中制备分离得到的。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
a、制备工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的发酵培养物，将发酵培养物的发酵液和菌丝体分开；发酵液经大孔树脂吸附，后用丙酮洗脱，减压浓缩回收丙酮，剩余的水相用丁酮萃取，再减压浓缩至干得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，减压浓缩回收丙酮，剩余的水相用丁酮萃取，减压浓缩至干得到浸膏B；将浸膏A和浸膏B合并得到粗提物，由此得到工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的粗提物；
将工程菌株Streptomyces sp.SCSIO 01127/ΔlobP1的粗提物经正相硅胶柱层析分离，用氯仿/甲醇从体积比为1:0、4:1、2:1和0:1梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比为4:1洗脱的馏分Fr.2，再经Sephdex LH-20凝胶柱分离，以氯仿/甲醇体积比1:1等度洗脱，含目标组分的洗脱馏分合并，经半制备纯化得到化合物lobophorin E、化合物lobophorin N1、化合物lobophorin N2和化合物lobophorin N3。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的工程菌株Streptomycessp.SCSIO 01127/ΔlobP1的发酵培养物是将活化的工程菌株Streptomyces sp.SCSIO01127/ΔlobP1直接接入发酵培养基，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：大豆粉3g，酵母提取粉3g，海藻糖10g，L-proline 1g，牛肉膏3g，甘油6g，FeSO4·7H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 0.3g，CaCO32g，海盐30g，余量为水，pH 7.2-7.4。
6.权利要求1中所述的lobophorins N1-N3中的任一化合物在制备抗菌药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗Bacillus subtilis、Micrococcus luteus或Staphylococcus aureus和MRSA的药物。
8.权利要求1中所述的lobophorin N1、lobophorin N3和lobophorin E中的任一化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗神经瘤、肝癌、乳腺瘤和\或非小细胞肺癌的药物。
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