CN102605027A - 一种氧化型辅酶ii的酶催化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种氧化型辅酶 II 的酶催化制备方法，其以烟酰胺核苷 (NR) 和三磷酸腺苷二钠盐 (ATP-Na 2)为原料，使它们在烟酰胺核苷激酶 (NRK) 、无机焦磷酸酶、 NAD 激酶及多聚焦磷酸激酶四种酶存在下，在 pH 为 4.0~8.5 的缓冲溶液中，以及温度 10 ℃ ~40 ℃下进行一锅煮反应得到氧化型辅酶 II 。本发明解决了目前酶催化制备方法中烟酰胺核苷磷酸成本高且不易得到，反应时间长，工艺成本较高，工艺条件也不适合工业放大的技术难题，能够高效，低成本，且易于工业化放大生产的获得氧化型辅酶 II 。
Description
技术领域
本发明涉及一种氧化型辅酶II的酶催化制备方法。
背景技术
氧化型辅酶II(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，简称：NADP+)是一种极为重要的核苷酸类辅酶，它是氧化型辅酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide, 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸, 简称：NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2'-位的磷酸化衍生物，是生物氧化过程中不可缺少的氢传递体，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成。这些反应中需要NADPH作为还原剂、氢负供体，NADPH是NADP+的还原形式。NADP+是NAD+通过NAD激酶催化磷酸化所产生。NAD+和DPNA+是各种不需氧脱氢酶的辅酶，可以接受底物分子上提供的氢负离子(H
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)而还原为NADH和PNADH。植物叶绿体中，光合作用光反应电子链的最后一步以NADP+为原料，经铁氧还蛋白-NADP+还原酶的催化而产生NADPH。产生的NADPH接下来在)中被用于二氧化碳的同化。对于动物来说，磷酸戊糖途径的氧化相是细胞中NADPH的主要来源，由它可以产生60％的所需NADPH。
目前人类合成NADP+的方法可以分为化学法和生物法。化学法以烟酰胺为原料，经多步反应合成出NADP+，化学法存在反应路线长，反应条件苛刻，选择性差，易生成副产物，产物纯度低，收率低，需用到昂贵的试剂，成本较高等不足；此外，大量有机溶剂的使用还会造成环境污染。因此，该工艺路线不适合于工业化大生产[James Dowden et al, Chemical Synthesis of the Second Messenger Nicotinic Acid Adenine Dinucleotide Phosphate by Total Synthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, [Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 4637–4640]。
传统的生物法是采用发酵或其它微生物培养技术, 并通过对酵母或其它微生物的分离提取得到NADP+。该工艺过程虽然已很成熟，但是原料耗费巨大，劳动强度大，能源消耗大，产量有限，生产成本高，产品价格高，限制了氧化型辅酶II (NADP+)的广泛应用[Sakai, T., Biotech. Bioeng. 1980, 22, Suppl. 1, 143-162; Uchida，T. et al, Agric. Biol. Chem. 1971, 37, 1049-1056; Sakai, T. and Uchida，T. et al, Agric. Biol. Chem. 1973, 37, 1041-1048]。
酶催化转化是一种高选择性反应, 不同种类的酶可作用于不同构型和不同种类的特定底物, 从而达到定向转化的目的, 酶法以其所具有的反应条件温和、立体专一性强、转化率高等特点，被广泛地研究和应用。生物酶法合成NADP+的研究中，Whitesides和其同事构建了聚丙烯酰胺凝胶固定化的NAD焦磷酸化酶和NAD激酶及ATP再生酶催化反应体系, 催化烟酰胺核苷磷酸(简称NMN)合成NADP+的方法[An Efficient Chemical and Enzymatic Synthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) . J. Am. Chem. SOC., 1984, 106, 234-239]。然而，该工艺难于放大，原因在于：一是原料合成烟酰胺核苷磷酸合成收率低，且不易放大，原料来源受到限制；二是酶催化合成NAD+和NADP+只能在克级范围得到高的转化率，但反应时间长达16天，产能低；三是由于采用固定化的NAD焦磷酸化酶和NAD激酶，烟酰胺核苷磷酸和NAD+与固定化NAD焦磷酸化酶和NAD激酶之间的传质受到阻碍，影响了固定化NAD焦磷酸化酶和NAD激酶的催化效率，而且该文作者指出该方法未能放大，因此该工艺路线难于适应放大的要求。有必要进一步开发适应于放大生产需要的新工艺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种易于工业化放大生产的氧化型辅酶II的酶催化制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其以烟酰胺核苷(NR)和三磷酸腺苷二钠盐(ATP-Na
2
)为原料，使它们在烟酰胺核苷激酶(NRK)、无机焦磷酸酶、NAD激酶及多聚磷酸激酶四种酶存在下，在pH为4.0~8.5的缓冲溶液中，以及温度10℃~40℃下进行一锅煮反应得到氧化型辅酶II。
根据本发明，所述缓冲溶液可以为磷酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液或TEA缓冲溶液，缓冲溶液的pH可用无机酸或碱来调节。所述的缓冲溶液的一般浓度为100~500 mM，优选为100~200 mM。
根据本发明的一个优选方面，所述反应开始时，所述的烟酰胺核苷和三磷酸腺苷二钠盐的浓度分别为10~100 mg/ml和20~200 mg/ml。所述烟酰胺核苷激酶、无机焦磷酸酶、NAD激酶及多聚磷酸激酶的加入量分别为分别为5-50mg酶粉/ml缓冲溶液、10-100mg酶粉/ml缓冲溶液、5-50mg酶粉/ml缓冲溶液和10-100mg酶粉/ ml缓冲溶液。
进一步优选地，所述方法还使所述反应在无机盐存在下进行，该无机盐可以为选自钠、钾、镁、锌、锰、钴及铁的金属的硫酸、盐酸或磷酸盐中的一种或多种的混合物，无机盐的加入量为1~50mg/ml缓冲溶液。无机盐的具体实例有例如氯化镁、硫酸镁、氯化钠、二氯化锰、氯化锌、硫酸锌等。
根据本发明的进一步实施方案：所述制备方法的实施过程如下：在反应容器中加入缓冲溶液，然后依次加入烟酰胺核苷、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺核苷激酶、无机焦磷酸酶、NAD激酶、多聚磷酸激酶以及无机盐，控制温度10℃~40℃，搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用监测反应的转化率，至检测到磷酸腺苷消耗完毕，停止反应。
优选地，控制反应在温度20℃~40℃下进行。
在停止反应后，依次经过滤，大孔树脂吸附，冻干，用乙醇和水的混合溶剂重结晶得到氧化型辅酶II。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明是一种利用微生物酶在温和条件下高效制备氧化型辅酶II的方法。与已存在的从酵母中分离提取的方法相比，本方法避免了传统方法的高能耗，高材料消耗和产物价格昂贵等缺点，具备酶催化过程所特有的反应条件温和、立体专一性强、催化效率高等特点。本发明与现有的酶催化技术相比，原料易于大量得到，用多酶偶联一锅法方式进行转化，简单有效，反应周期短，产能大，进一步结合等电点结晶和大孔树脂相结合的方式进行产物分离纯化，使得整个工艺成本较低，有利于大批量地工业化制备氧化型辅酶II。
具体实施方式
本发明采用廉价易得的烟酰胺核苷和ATP二钠盐为起始原料，首先通过烟酰胺核苷激酶和无机焦磷酸酶为催化剂，添加金属离子作为酶活力增强剂，催化烟酰胺核苷和ATP二钠盐偶联转化为NAD+；然后利用NAD激酶和NAD+合成NADP+，反应中通过加入多聚磷酸激酶促进ATP再生。本发明的特征还在于，为了启动酶催化反应,使用对烟酰胺核苷和ATP没有影响的缓冲溶液, 如磷酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液或TEA缓冲溶液中，其中优选磷酸盐缓冲溶液，酶反应适当地在4.0~8.5，更优选地5.0~7.5 pH值范围内进行, 可用无机酸或碱例如氢氧化钾调节pH值；合适的反应温度为10~60℃，优选温度是10~40℃，更优选20~40℃，特别优选30~40℃。保温时间可以根据反应条件来改变，但通常反应时间为30分钟~24小时，更优选地1~18小时，可以实现以70~100%的转化率制备产物氧化型辅酶II。
本发明所述的反应以原料和生物酶催化剂同时加入水相反应体系开始酶促催化反应，中间体无需分离纯化。
停止反应后，可以容易的按照下述的方法回收，例如，反应结束后，反应混合物中的蛋白通过加热、酸、碱或有机溶剂变性沉淀并通过离心除去。为此目的，可以使用一般用于上清液提取某些产物并适合于氧化型辅酶II各种特性的方法，因此例如，用大孔树脂纯化上清中的氧化型辅酶II，进一步利用等电点特性从用乙醇和水的混合溶剂的混合物中重结晶出氧化型辅酶II。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
在20 mL三口烧瓶中加入10 mL 磷酸盐缓冲溶液(100 mM，pH为5.8)，依次加入烟酰胺核苷（J. Med. Chem. 2007, 50，6458-6461）50 mg，三磷酸腺苷二钠盐55 mg，烟酰胺核苷激酶（PLoS Biology, 2007, 5(10), 2220-2230）8 mg，无机焦磷酸酶（9024-82-2 ，EC 3.6.1.1）10 mg，NAD激酶（European Journal of Biochemistry, 2001, 268(15), 4359–4365）5 mg和多聚磷酸激酶（PNAS, 1997, 94(2), 439-442）12 mg, 氯化镁20 mM，于37℃下，200 rpm搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用监测反应的转化率，经过10 小时反应后检测三磷酸腺苷已经消耗完毕，停止反应。通过进一步的过滤，HZ-818型大孔树脂吸附，冻干，用乙醇和水的混合溶剂(15:1) 重结晶即可获得氧化型辅酶II产品，收率55%。
实施例2
在20 mL三口烧瓶中加入10 mL Tris-HCl缓冲溶液(200 mM，pH为7.5)，依次加入烟酰胺核苷（J. Med. Chem. 2007, 50，6458-6461）50 mg，三磷酸腺苷二钠盐55 mg，烟酰胺核苷激酶（PLoS Biology, 2007, 5(10), 2220-2230）12 mg，无机焦磷酸酶（9024-82-2 ，EC 3.6.1.1）15 mg，NAD激酶（European Journal of Biochemistry, 2001, 268(15), 4359–4365）12 mg和多聚磷酸激酶（PNAS, 1997, 94(2), 439-442）20 mg, 氯化锰30 mM，氯化镁20 mM，于37℃下，200 rpm搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用监测反应的转化率，经过12 小时反应后检测三磷酸腺苷已经消耗完毕，停止反应。通过进一步的过滤，D-101型大孔树脂吸附，冻干，用乙醇和水的混合溶剂(20:1) 重结晶即可获得氧化型辅酶II产品，收率65%。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述制备方法以烟酰胺核苷和三磷酸腺苷二钠盐为原料，使它们在烟酰胺核苷激酶、无机焦磷酸酶、NAD激酶及多聚磷酸激酶四种酶存在下，在pH为4.0~8.5的缓冲溶液中，以及温度10℃~40℃下进行一锅煮反应得到氧化型辅酶II。
2.根据权利要求1所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液或TEA缓冲溶液，缓冲溶液的pH用无机酸或碱来调节。
3.根据权利要求1或2所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述的缓冲溶液的浓度为100~500 mM。
4.根据权利要求1所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述反应开始时，所述的烟酰胺核苷和三磷酸腺苷二钠盐的浓度分别为10~100 mg/ml和20~200 mg/ml。
5.根据权利要求1至4中任一项权利要求所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述烟酰胺核苷激酶、无机焦磷酸酶、NAD激酶及多聚磷酸激酶的加入量分别为5-50mg酶粉/ml缓冲溶液、10-100mg酶粉/ml缓冲溶液、5-50mg酶粉/ ml缓冲溶液和10-100mg酶粉/ ml缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述方法还使所述反应在无机盐存在下进行，所述无机盐为选自钠、钾、镁、锌、锰、钴及铁的金属的硫酸、盐酸或磷酸盐中的一种或多种的混合物，所述无机盐的加入量为1-50mg/ml缓冲溶液。
7.根据权利要求6所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述无机盐为氯化镁或氯化锰。
8.根据权利要求6或7所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述制备方法的实施过程如下： 在反应容器中加入缓冲溶液，然后依次加入烟酰胺核苷、三磷酸腺苷二钠盐、烟酰胺核苷激酶、 无机焦磷酸酶、NAD激酶、多聚磷酸激酶以及无机盐，控制温度10℃~40℃，搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用监测反应的转化率，至检测到磷酸腺苷消耗完毕，停止反应。
9.根据权利要求8所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：所述制备方法的实施过程如下：停止反应后，依次经过滤，大孔树脂吸附，冻干，用乙醇和水的混合溶剂重结晶得到所述氧化型辅酶II。
10.据权利要求8所述的氧化型辅酶II的酶催化制备方法，其特征在于：控制反应在温度20℃~40℃下进行。
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