CN117701659A - 一种酶催化制备nadp+的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种酶催化制备NADP⁺的方法，所述方法包括以下步骤：在二价金属离子的存在下，以NAD⁺和偏磷酸盐为底物，以NAD激酶和焦磷酸水解酶作为催化剂，反应制备得到NADP⁺。本发明中以NAD激酶和焦磷酸水解酶联合应用作为催化剂，使得能够提高NADP⁺合成的转化率，降低生产成本，并且制备方法简单，无需繁琐的后处理过程。

Description

一种酶催化制备NADP+的方法

技术领域

本发明属于生物材料制备技术领域，涉及一种酶催化制备NADP⁺的方法。

背景技术

氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(简称氧化型辅酶Ⅱ，英文名：Nicotinamideadenine dinucleotide phosphate,NADP⁺)，是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等近百种酶的辅酶，主要是以还原形式存在于生物体内，活性基团是烟酰胺，通过其氧化还原而传递氢原子来进行生理功能。在所有生物的新陈代谢中都发挥着重要的作用，能够参与糖、脂、蛋白质三类物质代谢的绝大多数氧化还原反应。

NADP⁺在生物体内广泛存在，但是含量极低。目前NADP⁺的合成方法可以分为化学法、生物发酵法和生物酶法。其中，化学法以烟酰胺核糖为原料，反应路线长，反应条件苛刻，易生成副产物，收率低，同时需要使用有机溶剂，造成环境污染等问题。生物发酵法工艺技术较为成熟，但是原料耗费巨大，原子利用率低，生产成本较高。而酶催化合成NADP⁺则是一种更为高效的反应，具有反应温和、立体选择性强，转化率高等优点。

NAD⁺磷酸化生成NADP⁺的合成途径中，目前已知唯一酶是NAD激酶(NAD Kinase，NADK)，激酶能够在ATP和底物之间起到催化作用并转移磷酸基团，即NADK将ATP上的磷酸基团转移到NAD⁺上，从而生成NADP⁺。NADK根据磷酰基供体可分为两种，一种是ATP/poly(P)依赖性NADK，可以利用ATP或无机多聚磷酸；一种是ATP依赖性NADK，只能利用核苷三磷酸。

目前，报道的NAD激酶在制备NADP⁺的过程中存在转化率低、底物残留显著等问题，分离纯化困难以及后处理过程复杂，工业化生产成本居高不下。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酶催化制备NADP⁺的方法。本发明的方法克服了现有技术中NADP⁺合成的转化率低、生产成本高，反应步骤复杂以及后处理过程繁琐等不足。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种酶催化制备NADP⁺的方法，所述方法包括以下步骤：

在二价金属离子的存在下，以NAD⁺和偏磷酸盐为底物，以NAD激酶和焦磷酸水解酶作为催化剂，反应制备得到NADP⁺。

本发明中以NAD激酶和焦磷酸水解酶联合应用作为催化剂，NAD激酶和焦磷酸水解酶可发挥协同催化作用，使得能够提高NADP⁺合成的转化率，降低生产成本，并且制备方法简单，无需繁琐的后处理过程。

优选地，所述二价金属离子为Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺或Zn²⁺。

优选地，所述二价金属离子在反应体系中的浓度为5mM-50mM，例如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。

优选地，所述反应体系中NAD⁺的质量百分比浓度为0.5％-10％，例如0.5％、0.8％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

优选地，所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾或六偏磷酸钾中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述偏磷酸盐与NAD⁺的摩尔比为(0.2-1.0):1.0，例如0.2:1.0、0.3:1.0、0.4:1.0、0.4:1.0、0.5:1.0、0.6:1.0、0.7:1.0、0.8:1.0、0.9:1.0或1.0:1.0。

优选地，所述NAD激酶的用量为NAD⁺质量的1％-5％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。

优选地，所述焦磷酸水解酶的用量为NAD⁺质量的1％-5％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。

在本发明中，所述NAD激酶和焦磷酸水解酶的形态包括冻干粉体、菌液或菌泥。

优选地，所述反应体系的溶剂包括Tris·HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液或水。

优选地，所述反应体系的pH为6.0-8.0，例如6.0、6.3、6.5、6.8、7.0、7.4、7.8或8.0。

优选地，所述反应的温度为20-40℃，例如20℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃或40℃，反应的时间为10-20h，例如10h、12h、14h、16h、18h或20h。

作为优选技术方案，本发明所述酶催化制备NADP⁺的方法具体包括以下步骤：

在二价金属离子的存在下，以NAD⁺和偏磷酸盐为底物，以NAD激酶和焦磷酸水解酶作为催化剂，在pH为6.0-8.0下于20-40℃反应10-20h制备得到NADP⁺；

其中所述二价金属离子为Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺或Zn²⁺，所述二价金属离子在反应体系中的浓度为5mM-50mM，反应体系中NAD⁺的质量百分比浓度为0.5％-10％，所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾或六偏磷酸钾中的任意一种或至少两种的组合，所述偏磷酸盐与NAD⁺的摩尔比为(0.2-1.0):1.0，所述NAD激酶的用量为NAD⁺质量的1％-5％，所述焦磷酸水解酶的用量为NAD⁺质量的1％-5％，反应体系的溶剂包括Tris·HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液或水。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明中以NAD激酶和焦磷酸水解酶联合应用作为催化剂，使得能够提高NADP⁺合成的转化率，降低生产成本，并且制备方法简单，无需繁琐的后处理过程。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例用来说明反应温度对酶催化反应生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的影响。

底物NAD⁺0.2g，六偏磷酸钠0.2g，氯化镁浓度为20mM，加入20mL Tris·HCl缓冲溶液，搅拌均匀，调pH至6.0，NAD激酶(西格玛，YT586，下同)和焦磷酸水解酶(西格玛，TG563，下同)的用量分别为底物NAD⁺质量的2％，反应体系温度分别设为10℃，20℃，30℃，40℃，50℃。反应15h时对应的转化率分别为52.37％，86.54％，87.56％，82.24％，65.37％。

实施例2

本实施例用来说明体系pH对酶催化反应生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的影响。

底物NAD⁺0.2g，六偏磷酸钠0.2g，氯化镁浓度为20mM，加入20mL Tris·HCl缓冲溶液，搅拌均匀，反应体系温度设为30℃，NAD激酶和焦磷酸水解酶的用量分别为底物NAD⁺质量的2％，反应体系pH分别控制在5.0，6.0，7.0，8.0，9.0附近。反应15h时对应的转化率分别为13.87％，87.56％，83.52％，78.41％，74.32％。

实施例3

本实施例用来说明酶激活剂种类对酶催化反应生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的影响。

底物NAD⁺0.2g，六偏磷酸钠0.2g，加入20mL Tris·HCl缓冲溶液，搅拌均匀，反应体系温度设为30℃，pH控制在6.0附近。分别向体系中添加20mM的氯化镁，氯化钴，硫酸锰，硫酸锌等金属离子无机盐。NAD激酶和焦磷酸水解酶的用量分别为底物NAD⁺质量的2％。反应15h时对应的转化率分别为87.56％，82.15％，85.71％，81.88％。

实施例4

本实施例用来说明不同量的偏磷酸盐对酶催化反应生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的影响。

底物NAD⁺1.0g，六偏磷酸钠分别为0.05g，0.18g，0.27g，0.37g，0.46g，0.55g，0.74g，1.5g，MnSO₄·H₂O浓度为20mM，加入20mL Tris·HCl缓冲溶液，搅拌均匀，反应体系温度设为30℃，pH控制在6.0附近。NAD激酶和焦磷酸水解酶的用量分别为底物NAD⁺质量的2％，反应15h对应的底物转化率分别为63.21％，85.50％，97.07％，96.95％，97.15％，97.12％，96.11％，96.04％。

实施例5

底物NAD⁺5.0g，六偏磷酸钠1.35g，MnSO₄·H₂O浓度为20mM，加入100mL Tris·HCl缓冲溶液，搅拌均匀，调pH至6.0。在反应体系中加入NAD激酶0.12g和焦磷酸水解酶0.12g，反应期间控制pH保持在6.0附近，反应温度30℃，磁力搅拌反应15h后，HPLC检测，NAD⁺的转化率98.32％。

实施例6

底物NAD⁺1.0g，四偏磷酸钠0.3g，MnSO₄·H₂O浓度为20mM，加入20mL Tris·HCl缓冲溶液，搅拌均匀，调pH至6.0。在反应体系中加入NAD激酶0.04g和焦磷酸水解酶0.04g，反应期间控制pH保持在6.0附近，反应温度30℃，磁力搅拌反应15h后，HPLC检测，NAD⁺的转化率为97.84％。

实施例7

底物NAD⁺100g，六偏磷酸钠27g，MnSO₄·H₂O浓度为20mM，加入2L去离子水，搅拌均匀，调pH至6.0。在反应体系中加入NAD激酶4g和焦磷酸水解酶4g，反应期间控制pH保持在6.0附近，反应温度30℃，磁力搅拌反应15h后，HPLC检测，NAD⁺的转化率为98.15％。

实施例8

底物NAD⁺5.0g，六偏磷酸钾1.5g，MnSO₄·H₂O浓度为20mM，加入100mL PBS缓冲溶液，搅拌均匀，调pH至8.0。在反应体系中加入NAD激酶0.05g和焦磷酸水解酶0.05g，反应期间控制pH保持在8.0附近，反应温度25℃，磁力搅拌反应10h后，HPLC检测，NAD⁺的转化率95.04％。

实施例9

底物NAD⁺5.0g，六偏磷酸钠1.35g，MnSO₄·H₂O浓度为20mM，加入100mL PBS缓冲溶液，搅拌均匀，调pH至7.0。在反应体系中加入NAD激酶0.25g和焦磷酸水解酶0.1g，反应期间控制pH保持在7.0附近，反应温度40℃，磁力搅拌反应18h后，HPLC检测，NAD⁺的转化率97.96％。

实施例10

底物NAD⁺5.0g，六偏磷酸钠1.35g，MnSO₄·H₂O浓度为20mM，加入100mL PBS缓冲溶液，搅拌均匀，调pH至7.4。在反应体系中加入NAD激酶0.15g和焦磷酸水解酶0.25g，反应期间控制pH保持在7.4附近，反应温度20℃，磁力搅拌反应20h后，HPLC检测，NAD⁺的转化率97.14％。

对比例1

反应过程中不添加焦磷酸水解酶，其余反应条件与实施例5一致，反应15h后，HPLC检测，NAD⁺的转化率为64.34％。

对比例2

将实施例5中的0.12g焦磷酸水解酶置换为1.0g醋酸钙固体，反应15h后，HPLC检测，NAD⁺的转化率为67.87％。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的酶催化制备NADP⁺的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种酶催化制备NADP⁺的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

在二价金属离子的存在下，以NAD⁺和偏磷酸盐为底物，以NAD激酶和焦磷酸水解酶作为催化剂，反应制备得到NADP⁺。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二价金属离子为Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺或Zn²⁺。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述二价金属离子在反应体系中的浓度为5mM-50mM。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系中NAD⁺的质量百分比浓度为0.5％-10％。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾或六偏磷酸钾中的任意一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述偏磷酸盐与NAD⁺的摩尔比为(0.2-1.0):1.0。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述NAD激酶的用量为NAD⁺质量的1％-5％。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述焦磷酸水解酶的用量为NAD⁺质量的1％-5％；

优选地，所述NAD激酶和焦磷酸水解酶的形态包括冻干粉体、菌液或菌泥。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系的溶剂包括Tris·HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液或水；

优选地，所述反应体系的pH为6.0-8.0；

优选地，所述反应的温度为20-40℃，反应的时间为10-20h。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

在二价金属离子的存在下，以NAD⁺和偏磷酸盐为底物，以NAD激酶和焦磷酸水解酶作为催化剂，在pH为6.0-8.0下于20-40℃反应10-20h制备得到NADP⁺；

其中所述二价金属离子为Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺或Zn²⁺，所述二价金属离子在反应体系中的浓度为5mM-50mM，反应体系中NAD⁺的质量百分比浓度为0.5％-10％，所述偏磷酸盐包括三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、六偏磷酸钠、三偏磷酸钾、四偏磷酸钾或六偏磷酸钾中的任意一种或至少两种的组合，所述偏磷酸盐与NAD⁺的摩尔比为(0.2-1.0):1.0，所述NAD激酶的用量为NAD⁺质量的1％-5％，所述焦磷酸水解酶的用量为NAD⁺质量的1％-5％，反应体系的溶剂包括Tris·HCl缓冲溶液、PBS缓冲溶液或水。