CN117802168A - 一种生物催化产莽草酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物催化产莽草酸的方法，该方法利用还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为还原剂，莽草酸脱氢酶突变体为催化剂，催化还原3‑脱氢莽草酸生产莽草酸。通过与还原烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法偶联，促进还原剂再生，选择性强化大肠杆菌莽草酸脱氢酶突变体催化还原3‑脱氢莽草酸生产莽草酸的代谢流，实现莽草酸的高效生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及莽草酸的生产方法，具体涉及一种生物催化产莽草酸的方法。
背景技术
莽草酸（shikimic acid），化学名称为3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸，是一种环己烷的羟基化不饱和酸衍生物。作为一种小分子有机酸，莽草酸在自然界中广泛存在。莽草酸在植物和微生物中作为代谢中间体用于合成芳香族氨基酸、生物碱和吩嗪类化合物等多种芳香族代谢产物，在医药方面被用作起始原料来生产具有新型功能的药物分子，如抗流感药物磷酸奥司他韦（商品名：达菲）就是以莽草酸为主要原料生产的。
鉴于莽草酸及其衍生物在代谢、医药及工业生产等方面的重要应用，莽草酸的生产至关重要。传统的莽草酸生产方法主要有植物提取法、化学合成法和微生物发酵法。植物提取法受生产原料、提纯工艺复杂等因素影响，不能满足工业上对莽草酸的大量需求。化学合成法虽然在产率及纯度上较植物提取法有明显优势，但受限于反应条件苛刻、环境污染、成本高等问题；而微生物发酵法具有环境友好、成本低等优势，使其成为优选的莽草酸生产法（张伟东等，莽草酸生物合成进展，化工设计通讯，2019，45，108）。
在植物和微生物中，莽草酸途径是生物合成莽草酸的唯一途径，也是关键芳香族次级代谢产物生物合成的必经途径（Herrmann, K. M., et al. The shikimate pathway-a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry andMolecular Biology, 1999, 50, 473）。在大肠杆菌中，莽草酸途径以经糖酵解途径产生的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸戊糖途径产生的赤藓糖-4-磷酸（E4P）为底物，两者缩合生成芳香族共同前体化合物7-磷酸-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸（DAHP），随后依次通过3-脱氢奎尼酸合成酶和3-脱氢奎尼酸脱水酶的催化作用生成3-脱氢莽草酸，最后经莽草酸脱氢酶催化还原为莽草酸。途径中有两个关键限速步骤，分别为DAHP的合成和3-脱氢莽草酸的还原。SDH依赖于NADPH催化第二个关键限速步骤：3-脱氢莽草酸还原产生莽草酸。由于莽草酸途径的代谢流小，对莽草酸途径进行调控，是生物合成法中调节莽草酸合成效率的关键。目前在微生物中对莽草酸途径的代谢调控主要针对途径中的两个限速步骤，主要策略有三种：加强底物供给、提高酶的表达水平或活性和提高NADPH水平，在许多研究中一般采用两种或三种策略组合的方式来加强莽草酸的合成或提高莽草酸途径的代谢通量（Bilal, M.;et al. Metabolic engineering strategies for enhanced shikimate biosynthesis:current scenario and future developments. Applied Microbiology Biotechnology,2018, 102, 7759）。研究表明，胞内NADPH水平影响莽草酸的合成，通过强化戊糖磷酸途径或在培养基中添加甘油，提高胞内NADPH水平，同时过表达SDH可有效提高莽草酸的合成通量（Rodriguez, A.; et al. Plasmid-encoded biosynthetic genes alleviatemetabolic disadvantages while increasing glucose conversion to shikimate inan engineered Escherichia coli strain. Biotechnology Bioengineering,2017,114, 1319；Bilal, M.; et al. Systematically engineering Escherichia coli forenhanced shikimate biosynthesis co-utilizing glycerol and glucose. Biofuels,Bioproducts and Biorefining-biofpr, 2018, 12, 348）。然而，NAD(H)和NADP(H)等天然辅酶作为能量载体，参与胞内多种氧化还原反应并构成复杂的代谢网络，任何直接改变胞内NAD(P)水平的操作均将对细胞产生全局性的影响，通过提高胞内NADPH水平来提高胞内莽草酸产量的能力有限（Xiao, W.; et al. NAD(H) and NADP(H) redox couples andcellular energy metabolism. Antioxidants and Redox Signaling,2018, 28 (3),251）。因此，通过调节NADPH水平来调控莽草酸途径的策略缺乏途径选择性，利用人工辅酶，能够实现选择性的调控3-脱氢莽草酸到莽草酸的还原反应，可以提高莽草酸的合成效率及产量，具有较好的应用前景。
在已报道的人工辅酶中，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）是一种具有较好生物相容性的NAD类似物（Ji, D., et al. Creation of bioorthogonal redox systemsdepending on nicotinamide flucytosine dinucleotide. Journal of the AmericanChemical Society. 2011, 133, 20857；赵宗保等，一种NAD类似物的还原方法，专利申请号：201410117146.6）。目前，也报道了NCD的生物合成方法，以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，实现在纯酶水平和微生物胞内NCD的生物合成。同时也报道了一些可识别NCD的酶，如苹果酸酶（ME，GenbankP26616）L310R/Q401C突变体、NADH氧化酶（NOX，Genbank S45681）、亚磷酸脱氢酶psPDH（Genbank 069054）L151V/D213Q突变体和rPDH（Genbank AEQ29500）I151R或I151R/E213C突变体、D-乳酸脱氢酶（DLDH，Gnebank CAA47255）V152R突变体以及甲酸脱氢酶（pseFDH，UniProtKB/Swiss-Prot P33160.3）突变体pseFDH-H223S/L257R等。目前，已经实现利用NCD进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，经过rPDH-I151R的催化反应产生还原型的NCDH，ME-L310R/Q401C可利用NCDH将丙酮酸还原为苹果酸，实现了特异性的生物催化调控（Wang L, et al. Synthetic cofactor-linked metabolic circuits for selectiveenergy transfer. ACS Catalysis, 2017, 7, 1977）。过表达ME-L310R/Q401C和NOX的大肠杆菌基因工程菌的细胞裂解液，在NCD存在下，可以高效、选择性将苹果酸转化为丙酮酸；而在NAD存在下，丙酮酸被内源的乳酸脱氢酶进一步还原为乳酸。可见，利用NCD及识别它们的酶，可利用粗酶液进行反应达到纯酶催化的效果，实现在辅酶水平控制复杂生物催化转化体系。
基于以上研发背景和相关技术优势，本发明利用定向进化的方法，以获得特异性以NCDH为还原剂选择性催化3-脱氢莽草酸到莽草酸的莽草酸脱氢酶突变体，从而增加莽草酸的积累。
发明内容
为了解决现有技术中通过调节NADPH水平来调控莽草酸途径的策略缺乏途径选择性差、效率低等缺陷，本发明提供了一种生物催化产莽草酸的方法，该方法利用还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCDH）为还原剂，莽草酸脱氢酶突变体为催化剂，催化还原3-脱氢莽草酸生产莽草酸。通过与还原烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法偶联，促进还原剂再生，选择性强化大肠杆菌莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸生产莽草酸的代谢流，实现莽草酸的高效生产。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案：一种生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：利用还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为还原剂，莽草酸脱氢酶突变体为催化剂，催化还原3-脱氢莽草酸生产莽草酸。
本发明所述莽草酸脱氢酶突变体具有烟酰胺胞嘧啶二核苷酸偏好性，是在来源于大肠杆菌莽草酸脱氢酶（SDH，NCBI参考序列号WP_000451243.1）基础上突变得到的，该莽草酸脱氢酶突变体具体为莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/L135A/N149D/V152F、SDH-N149D/V152F/S131A/L135A/M173L、SDH-N149D/V152F/S131A/L135A或SDH-I125R/S131A/N149D/V152F中的一种或多种，该莽草酸脱氢酶突变体中突变位点用氨基酸序号和突变前后的氨基酸名称表示，如V152F代表第152位氨基酸由V突变成F，其它类同。
本发明所述还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸通过化学方法还原烟酰胺胞嘧啶二核苷酸得到或者由具有辅因子偏好型的氧化还原酶还原烟酰胺胞嘧啶二核苷酸产生，该氧化还原酶为苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C、亚磷酸脱氢酶突变体rPDH-I151R/P176R/M207A或甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R中的一种或多种。
本发明中表达还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸再生的氧化还原酶和莽草酸脱氢酶突变体的基因构建在表达载体上，通过RF克隆的方法构建到载体上。纯酶的表达和纯化参照在大肠杆菌中表达其它氧化还原酶的文献方法进行（Ji DB, et al. Creation ofbioorthogonal redox systems depending on nicotinamide flucytosinedinucleotide. Journal of the American Chemical Society, 2011, 133, 20857）。
本发明所述生物催化产莽草酸的方法在缓冲体系中进行，该缓冲体系为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液或MOPS缓冲液中的一种或多种。
本发明所述生物催化产莽草酸的方法在纯酶体系或粗酶液体系中进行，在纯酶反应体系中，再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的氧化还原酶的使用浓度为4-500μg/mL，莽草酸脱氢酶突变体的使用浓度为5-1000μg/mL；在粗酶液反应体系中，粗酶液通过裂解表达用于再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的氧化还原酶和莽草酸脱氢酶突变体的大肠杆菌工程菌，离心取上清获得；
在纯酶体系或粗酶液体系中，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的使用浓度为0.01-2mM，反应条件为：pH 3.0-9.0，温度20-55℃，时间0.2-30h；
在纯酶体系或粗酶液体系中，再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸时添加氧化还原酶对应的底物：亚磷酸脱氢酶对应的底物为亚磷酸盐，苹果酸酶对应的底物为L-苹果酸盐，甲酸脱氢酶对应的底物为甲酸。
在纯酶体系或粗酶液体系中，再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸添加氧化还原酶对应的反应底物的使用浓度为1-25mM。
本发明所述烟酰胺胞嘧啶二核苷酸通过在微生物中表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体NadD-P22G/Y84A/C132D，以胞内的烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，自主合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。
本发明所述生物催化产莽草酸的方法中还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸驱动莽草酸脱氢酶突变体还原3-脱氢莽草酸产莽草酸的反应在细胞内进行，微生物细胞为原核微生物或真核微生物，其中原核微生物如大肠杆菌等，真核微生物如酿酒酵母等。
本发明与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本发明的方法中生物催化还原条件温和，反应效率较高，产物纯度较高，应用于胞内体系时可利用还原力选择性的驱动还原3-脱氢莽草酸生成莽草酸的反应，有效提高莽草酸途径代谢流量，实现莽草酸的高效生产。
具体实施方式
以下实施例可以进一步阐明本发明，通过参考以下的实施例将更容易理解本发明。这些实施例仅用于示例性说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
本发明中，使用的NCD参照文献方法（Ji DB, et al. Synthesis of NAD analogsto develop bioorthogonal redox system. Sci China Chem, 2013, 56, 296）制备或者参照文献方法（赵宗保等，酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，CN 106884029A）通过表达来源于E. coli的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体NadD-P22G/Y84A/C132D进行酶法合成。
本发明中，大肠杆菌转化的方法参照《分子克隆指南》中电转化的方法，酿酒酵母转化的方法参照文献（Gietz, R. D., et al. Nature Protocols. 2007, 2, 31）中醋酸锂转化方法。
本发明中，莽草酸的检测方法为高效液相色谱，分析条件参照文献（Gu PF, etal. Tunable switch mediated shikimate biosynthesis in an engineered non-auxotrophic Escherichia coli, Scientific Reports, 2016, 6, 29745）中莽草酸的检测方法。
对比例1
无NCDH条件下莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸的反应
将1mM的NCD用两当量的连二亚硫酸钠进行还原，丙酮沉淀后获得NCDH，将NCDH制备成5mM溶液，备用。
将1mM的NCDH和2mM的3-脱氢莽草酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为50μg/mL的莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/L135A/N149D/V152F，混匀，于37℃反应30min，取100μL，加入900μL乙腈/甲醇/水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1，v/v/v）终止反应。
用高效液相色谱检测反应中莽草酸的浓度，没有莽草酸特征峰，仅检测到3-脱氢莽草酸的特征峰。说明在没有NCDH条件下，莽草酸脱氢酶突变体不能还原3-脱氢莽草酸产莽草酸。
对比例2
酶失活条件下莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸的反应
将莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/L135A/N149D/V152F在80℃水浴加热20min，使酶失活后备用。
将1mM的NCDH和2mM的3-脱氢莽草酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为200μg/mL的失活的莽草酸脱氢酶突变体，混匀，于37℃反应2h，取100μL，加入900μL乙腈/甲醇/水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1，v/v/v）终止反应。
用高效液相色谱检测反应中莽草酸的浓度，没有莽草酸特征峰，仅检测到3-脱氢莽草酸的特征峰。说明存在NCDH条件下，加热失活的莽草酸脱氢酶突变体不能还原3-脱氢莽草酸产莽草酸。
对比例3
以NADH为还原剂，莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸
将1mM的NADH和0.5mM的3-脱氢莽草酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为100μg/mL的莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/L135A/N149D/V152F，混匀，于37℃反应2h，取100μL，加入900μL乙腈/甲醇/水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1，v/v/v）终止反应。
用高效液相色谱检测反应中莽草酸和3-脱氢莽草酸的浓度，检测到少量莽草酸，同时也检测到3-脱氢莽草酸的特征峰。对莽草酸和3-脱氢莽草酸定量，反应体系中3.2%的3-脱氢莽草酸被转化为莽草酸，说明在存在NADH条件下，NCD偏好型的莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸的效率极低，几乎不反应。
实施例1
以NCDH为还原剂，莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸
将0.5mM的NCDH和0.1mM的3-脱氢莽草酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的磷酸缓冲液中，加入终浓度为5μg/mL的莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/L135A/N149D/V152F，混匀，于37℃反应0.1 h，取100μL，加入900μL乙腈/甲醇/水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1，v//v/v）终止反应。
用高效液相色谱检测反应中莽草酸和3-脱氢莽草酸的浓度，检测到莽草酸的特征峰，同时也检测到3-脱氢莽草酸的特征峰。对莽草酸和3-脱氢莽草酸定量，反应体系中76%的3-脱氢莽草酸被还原为莽草酸。
实施例1的结果表明，以NCDH为还原剂，莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸。综合实施例1、对比例1、对比例2和对比例3的结果说明，以NCDH为还原剂，NCD偏好型的莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸，并且还原剂NCDH和催化剂NCD偏好型莽草酸脱氢酶突变体起到了不可替代的作用。
实施例2
亚磷酸脱氢酶突变体再生NCDH，催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸的应用
参照文献（Ji DB, et al. Creation of bioorthogonal redox systemsdepending on nicotinamide flucytosine dinucleotide. Journal of the AmericanChemical Society, 2011, 133, 20857）方法纯化制备亚磷酸脱氢酶突变体Pdh-I151R/P176R/M207A（Liu YX, et al. Structural insights into phosphite dehydrogenasevariants favoring a non-natural redox cofactor. ACS Catalysis, 2019, 9, 1883）和莽草酸脱氢酶突变体SDH-N149D/V152F/S131A/L135A/M173L。亚磷酸脱氢酶突变体催化的反应为：亚磷酸+NCD→磷酸+NCDH，产生的NCDH能推动莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸。在该体系中NCD被循环使用，而且反应没有任何副产物，具有一定的潜力。其中具有代表性的实验过程如下：
采用50mM，pH 3.0的MES缓冲体系，100μL的反应体系组成为：1mM亚磷酸、10mM 3-脱氢莽草酸、0.01mM NCD、0.1mg/mL亚磷酸脱氢酶突变体Pdh-I151R/P176R/M207A和0.05mg/mL莽草酸脱氢酶突变体SDH-N149D/V152F/S131A/L135A/M173L。于55℃反应3h，加入900μL乙腈/甲醇/水混合液（乙腈：甲醇：水=4: 4: 1，v/v/v）终止反应。离子色谱检测反应溶液中亚磷酸的浓度，高效液相色谱检测3-脱氢莽草酸和莽草酸的浓度。检测结果表明，反应液中含0.05mM亚磷酸、9.1mM 3-脱氢莽草酸以及0.9mM莽草酸。
在进行上述反应时，设置了另外4组对照实验体系，分别缺少亚磷酸、NCD、亚磷酸脱氢酶突变体或莽草酸脱氢酶突变体中的一种，分析发现这些反应没有产生莽草酸。
实验结果表明，在纯酶反应体系中亚磷酸脱氢酶突变体还原NCD产生了NCDH，NCDH作为还原剂，几乎全部用于推动莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸生产莽草酸。
实施例3
甲酸脱氢酶突变体再生NCDH，催化还原3-脱氢莽草酸生产莽草酸的应用
可以将再生NCDH的氧化还原酶和莽草酸脱氢酶同时在细胞中表达，通过裂解细胞获得混合有两种酶的粗酶液，构建用粗酶液催化生产莽草酸的体系。以在大肠杆菌中表达甲酸脱氢酶和莽草酸脱氢酶为例予以说明。
构建同时表达甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R（专利申请号201711230338.6）和莽草酸脱氢酶突变体SDH-N149D/V152F/S131A/L135A的大肠杆菌pUC表达载体，基因均用PLac启动子启动表达，将载体电转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在LB培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、0.2mM IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养24h。离心收集菌体，用MOPS缓冲液洗涤并重悬菌体，超声裂解细胞，离心取上清，获得含有甲酸脱氢酶突变体和莽草酸脱氢酶突变体的粗酶液，粗酶液中总蛋白浓度为22mg/mL。
采用50mM，pH 9.0的MOPS缓冲体系，100μL的反应体系组成为：10mM甲酸、20mM 3-脱氢莽草酸、2mM NCD、5μL粗酶液。于20℃反应8h，加入900μL乙腈/甲醇/水混合液（乙腈：甲醇：水=4: 4: 1，v/v/v）终止反应。高效液相色谱检测反应溶液中甲酸、3-脱氢莽草酸和莽草酸的浓度。检测结果表明，反应液中含0.3mM甲酸、9.7mM 3-脱氢莽草酸以及9.2mM莽草酸。
在进行上述反应的同时，设置不添加NCD的对照实验，其它成分和条件相同，分析发现反应液中甲酸和3-脱氢莽草酸的浓度没有明显变化，没有检测到莽草酸的生成，说明在偶联体系中没有NCD的条件下，莽草酸脱氢酶突变体不能催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸。
实验结果表明，在反应体系中甲酸脱氢酶突变体还原NCD产生了NCDH，NCDH作为还原剂，几乎全部用于推动莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸。
实施例4
NCDH在真核微生物胞内中选择性推动莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸生产莽草酸
可以将能够合成NCD的NCD合成酶，再生NCDH的氧化还原酶和莽草酸脱氢酶突变体同时在细胞中表达，通过添加相应的底物，在胞内实现NCDH选择性推动莽草酸脱氢酶突变体催化还原3-脱氢莽草酸产莽草酸。以在酿酒酵母BY4741中表达NCD合成酶、甲酸脱氢酶和莽草酸脱氢酶为例予以说明。
构建同时表达NCD合成酶突变体NadD-P22G/Y84A/C132D、甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R和莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/N149D/V152F的酿酒酵母pESC-His表达载体，分别用PTEF1、PTDH3和PTPI组成型启动子启动表达。此外，构建表达NCD合成酶突变体NadD-P22G/Y84A/C132D和莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/N149D/V152F、表达NCD合成酶突变体NadD-P22G/Y84A/C132D和甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R以及表达莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/N149D/V152F和甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R的对照载体，分别用以上相同的组成型启动子启动表达，作为对照载体。分别将4种载体用醋酸锂转化的方法，转化到酿酒酵母BY4741中，构建工程菌株YXL-SA01和对照菌株YXL-SA02、YXL-SA03以及YXL-SA04。将工程菌分别在SD（Leu、Met、Ura）培养基中，以20g/L葡萄糖为碳源，在30℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 5.0的HEPES培养基分别洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600 nm均调整到20。在上述工程菌悬液中分别加入25mM甲酸以及15mM葡萄糖，在30℃ 200rpm摇床中厌氧反应0h、10h、20h和30h后取样，取100μL，加入900μL乙腈/甲醇/水混合液（乙腈：甲醇：水=4: 4: 1，v/v/v）终止反应。
用高效液相色谱分析不同时间点样品中莽草酸的浓度，结果表明工程菌株YXL-SA01在反应0h、10h、20h和30h的样品中，莽草酸的浓度分别为0mM、7.3mM、14.9mM以及19.1mM。对照菌YXL-SA02在反应0h、10h、20h和30h后的样品中，莽草酸的浓度分别为0mM、0.4mM、1.8mM以及6.1mM；对照菌YXL-SA03在反应0h、10h、20h和30h后的样品中，莽草酸的浓度分别为0mM、0.2mM、1.5mM以及5.7mM；而对照菌YXL-SA04在反应0h、10h、20h和30h后的样品中，莽草酸的浓度分别为0mM、0.3mM、1.7mM以及6.3mM。
实施例4的结果表明，在胞内利用自身合成的NCD，在经过类似于及甲酸脱氢酶突变体的氧化还原酶的还原之后，产生的NCDH能够作为还原剂，在胞内选择性的推动莽草酸脱氢酶突变体催化还原内源3-脱氢莽草酸生产莽草酸。
实施例5
NCDH在原核微生物胞内中选择性推动莽草酸脱氢酶突变体催化还原内源3-脱氢莽草酸生产莽草酸
构建同时表达NCD合成酶突变体NadD-P22G/Y84A/C132D、甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R和莽草酸脱氢酶突变体SDH-N149D/V152F/S131A/L135A的大肠杆菌pUC表达载体，基因均用PLac启动子启动表达。同时，构建只表达NCD合成酶突变体NadD-P22G/Y84A/C132D和莽草酸脱氢酶突变体SDH-N149D/V152F/S131A/L135A的表达载体。将两种工程载体分别电转化到敲除内源莽草酸脱氢酶表达基因aroE的大肠杆菌BL21(DE3)中，获得工程菌株YXL-SA05和对照菌株YXL-SA06。在LB培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、0.2mM IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养诱导工程菌株YXL-SA05和对照菌株YXL-SA06 36h。离心收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的HEPES缓冲液洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600 nm调整至20。
在上述工程菌悬液中分别加入15mM苹果酸和10mM葡萄糖，在30℃ 200rpm摇床中厌氧反应0h、6h、12h和24h后取样，取100μL，加入900μL乙腈/甲醇/水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1，v/v/v）终止反应。
用高效液相色谱分析不同时间点样品中莽草酸的浓度。结果表明，工程菌株YXL-SA05在反应0h、6h、12h和24h后的样品中，莽草酸的浓度分别为0.2mM、4.8mM、9.3mM以及12.5mM。而对照菌YXL-SA06在反应0h、6h、12h和24h后的样品中，莽草酸的浓度分别为0.05mM、0.6mM、1.7mM以及2.9mM。
实施例5的结果表明，在原核微生物胞内利用自身合成的NCD，在经过类似于甲酸脱氢酶突变体的氧化还原酶的还原之后，产生的NCDH能够作为还原剂，在胞内选择性的推动莽草酸脱氢酶突变体催化还原内源3-脱氢莽草酸生产莽草酸。
来源于大肠杆菌莽草酸脱氢酶，NCBI参考序列号WP_000451243.1，含1-272为完整氨基酸序列，具体氨基酸序列如下：
METYAVFGNP IAHSKSPFIH QQFAQQLNIE HPYGRVLAPI NDFINTLNAF FSAGGKGANVTVPFKEEAFA RADELTERAA LAGAVNTLMR LEDGRLLGDN TDGVGLLSDL ERLSFIRPGL RILLIGAGGASRGVLLPLLS LDCAVTITNR TVSRAEELAK LFAHTGSIQA LSMDELEGHE FDLIINATSS GISGDIPAIPSSLIHPGIYC YDMFYQKGKT PFLAWCEQRG SKRNADGLGM LVAQAAHAFL LWHGVLPDVE PVIKQLQEELSA
以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。
Claims (9)
1.一种生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：利用还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为还原剂，莽草酸脱氢酶突变体为催化剂，催化还原3-脱氢莽草酸生产莽草酸，所述莽草酸脱氢酶突变体具有烟酰胺胞嘧啶二核苷酸偏好性，是在来源于大肠杆菌莽草酸脱氢酶（SDH，NCBI参考序列号WP_000451243.1）基础上突变得到的，该莽草酸脱氢酶突变体具体为莽草酸脱氢酶突变体SDH-I125R/S131A/L135A/N149D/V152F、SDH-N149D/V152F/S131A/L135A/M173L、SDH-N149D/V152F/S131A/L135A或SDH-I125R/S131A/N149D/V152F中的一种或多种，莽草酸脱氢酶突变体中突变位点用氨基酸序号和突变前后的氨基酸名称表示。
2.根据权利要求1所述的生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：所述还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸通过化学方法还原烟酰胺胞嘧啶二核苷酸得到或者由具有辅因子偏好型的氧化还原酶还原烟酰胺胞嘧啶二核苷酸产生，该氧化还原酶为苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C、亚磷酸脱氢酶突变体rPDH-I151R/P176R/M207A或甲酸脱氢酶突变体pseFDH-H223S/L257R中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：表达还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸再生的氧化还原酶和莽草酸脱氢酶突变体的基因构建在表达载体上，通过RF克隆的方法构建到载体上。
4.根据权利要求1所述的生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：所述生物催化产莽草酸的方法在缓冲体系中进行，该缓冲体系为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液或MOPS缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：所述生物催化产莽草酸的方法在纯酶体系或粗酶液体系中进行，在纯酶反应体系中，再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的氧化还原酶的使用浓度为4-500μg/mL，莽草酸脱氢酶突变体的使用浓度为5-1000μg/mL；在粗酶液反应体系中，粗酶液通过裂解表达用于再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的氧化还原酶和莽草酸脱氢酶突变体的大肠杆菌工程菌，离心取上清获得；
在纯酶体系或粗酶液体系中，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的使用浓度为0.01-2mM，反应条件为：pH 3.0-9.0，温度20-55℃，时间0.2-30h；
在纯酶体系或粗酶液体系中，再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸时添加氧化还原酶对应的底物：亚磷酸脱氢酶对应的底物为亚磷酸盐，苹果酸酶对应的底物为L-苹果酸盐，甲酸脱氢酶对应的底物为甲酸。
6.根据权利要求5所述的生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：在纯酶体系或粗酶液体系中，再生还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸添加氧化还原酶对应的反应底物的使用浓度为1-25mM。
7.根据权利要求1所述的生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：所述烟酰胺胞嘧啶二核苷酸通过在微生物中表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体NadD-P22G/Y84A/C132D，以胞内的烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，自主合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。
8.根据权利要求1所述的生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：所述还原型烟酰胺胞嘧啶二核苷酸驱动莽草酸脱氢酶突变体还原3-脱氢莽草酸产莽草酸的反应在细胞内进行，微生物细胞为原核微生物或真核微生物。
9.根据权利要求8所述的生物催化产莽草酸的方法，其特征在于：所述原核微生物具体为大肠杆菌，真核微生物具体为酿酒酵母。
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