CN112098563B - 一种补肾活血方化学成分的检测方法 - Google Patents

一种补肾活血方化学成分的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112098563B
CN112098563B CN202011094756.9A CN202011094756A CN112098563B CN 112098563 B CN112098563 B CN 112098563B CN 202011094756 A CN202011094756 A CN 202011094756A CN 112098563 B CN112098563 B CN 112098563B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mobile phase
volume percentage
constant speed
water
ethanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011094756.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112098563A (zh
Inventor
朱立国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wangjing Hospital Of China Academy Of Chinese Medical Sciences Institute Of Orthopedics And Traumatology China Academy Of Chinese Medical Sciences
Original Assignee
Wangjing Hospital Of China Academy Of Chinese Medical Sciences Institute Of Orthopedics And Traumatology China Academy Of Chinese Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wangjing Hospital Of China Academy Of Chinese Medical Sciences Institute Of Orthopedics And Traumatology China Academy Of Chinese Medical Sciences filed Critical Wangjing Hospital Of China Academy Of Chinese Medical Sciences Institute Of Orthopedics And Traumatology China Academy Of Chinese Medical Sciences
Priority to CN202011094756.9A priority Critical patent/CN112098563B/zh
Publication of CN112098563A publication Critical patent/CN112098563A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112098563B publication Critical patent/CN112098563B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明提供了一种补肾活血方化学成分的检测方法，涉及中药检测技术领域。本发明提供的检测方法，包括以下步骤：将补肾活血方的中药依次进行水浸泡、提取、浓缩、乙醇萃取、静置、离心分离、除去上清液中的乙醇、乙酸乙酯萃取、将所得水相进行正丁醇萃取、浓缩所得水相，得到待测液，然后采用特定的检测条件进行UPLC‑MS检测，将所得检测结果对照标准色谱图和天然产物数据库，得到待测液中的化学成分。本发明提供的检测方法能够同时定性检测出补肾活血方中的93种有效化学成分，操作简单，为补肾活血方的药用机理以及中药单体治疗下腰痛奠定了基础。

Description

一种补肾活血方化学成分的检测方法
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，具体涉及一种补肾活血方化学成分的检测方法。
背景技术
下腰痛是临床常见病、多发病，其治疗主要以手术和非甾体抗炎西药为主，其中，手术治疗易 发生创口感染、神经损伤、硬膜外血肿等风险，非甾体抗炎西药可产生消化道出血等副作用，且这两种治疗方案价格昂贵。
中药治疗能够解决上述手术风险高、西药副作用大、价格昂贵等问题。例如，展嘉文(展嘉文等.补肾活血方含药血清对离体兔脊柱运动节段压力退变模型的影响.中国骨伤,2018,31(7):627-634.)和朱立国(朱立国等.补肾活血方治疗椎间盘源性腰痛的临床观察.世界中医药,2017,12(3):554-557.) 公开了一种补肾活血方，由杜仲、补骨脂、怀牛膝、丹参、威灵仙和木瓜组成，其中，杜仲15g、补骨脂10g、怀牛膝10g、丹参12g、威灵仙10g和木瓜9g，具有补肾强腰、活血化瘀之功效，该补肾活血方治疗下腰痛总有效率为90.69％，并可有效改善患者VAS及ODI评分。
但目前对上述补肾活血方的药用机理或其主要成分的研究尚不足。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种补肾活血方化学成分的检测方法，本发明提供的检测方法能够检测出补肾活血方中的主成分，操作简单。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种补肾活血方化学成分的检测方法，包括以下步骤：
(1)将补肾活血方的中药置于水中浸泡后回流提取，得到水提取液；所述补肾活血方的中药组分为杜仲、补骨脂、怀牛膝、丹参、威灵仙和木瓜；
(2)将所述水提取液依次进行浓缩、乙醇萃取、静置和离心分离，得到乙醇水上清液；除去所述乙醇水上清液中的乙醇，得到水萃取液；
(3)采用乙酸乙酯萃取所述水萃取液，得到第一水相；
(4)采用正丁醇萃取所述第一水相，得到第二水相；浓缩所述第二水相，得到待测液；
(5)采用高效液相色谱-质谱法对所述待测液进行检测，将所得检测结果对照标准色谱图和天然产物数据库，得到待测液中的化学成分；
所述高效液相色谱-质谱法的高效液相色谱检测条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
柱温：30℃；
洗脱方式：梯度洗脱，流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为 0.1v/v％甲酸乙腈溶液；所述流动相A和流动相B的流速为0.3mL/min；
检测波长：190～500nm；
所述梯度洗脱的程序如下：
0～2min，所述流动相A的体积百分含量为98％，所述流动相B的体积百分含量为2％；
2～7min，所述流动相A的体积百分含量由98％匀速降低到85％，所述流动相B的体积百分含量为由2％匀速增加到15％；
7～14min，所述流动相A的体积百分含量由85％匀速降低到75％，所述流动相B的体积百分含量为由15％匀速增加到25％；
14～21min，所述流动相A的体积百分含量由75％匀速降低到70％，所述流动相B的体积百分含量为由25％匀速增加到30％；
21～25min，所述流动相A的体积百分含量由70％匀速降低到5％，所述流动相B的体积百分含量为由30％匀速增加到95％；
25～29min，所述流动相A的体积百分含量为5％，所述流动相B的体积百分含量为95％；
39～30min，所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到98％，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到2％；
所述高效液相色谱-质谱法的质谱条件为：
离子源：ESI离子源；
离子源温度：150℃；
扫描方式：正负离子扫描；
扫描范围：50～1200Da；
载气：氮气；
脱溶剂气：氮气；
脱溶剂气温度：450℃；
脱溶剂气流量：800L/h；
锥孔气流量：50L/h；
锥孔电压：40V；
毛细管电压：1000V；
碰撞诱导解离气体：氩气；
低碰撞能量：6eV；
高碰撞能：15～45eV。
优选的，步骤(1)中，所述补肾活血方的中药组分和水的质量比为1： (7～9)。
优选的，步骤(1)中，所述浸泡的时间为8～12h。
优选的，所述回流提取的温度为90～100℃，时间为1.5～3h。
优选的，步骤(2)中，所述乙醇萃取时加入乙醇后乙醇的体积分数为 65～75％。
优选的，步骤(2)中，所述静置的温度为3～5℃，时间为23～25h。
优选的，步骤(3)中，所述水萃取液和乙酸乙酯的体积比为1：(6～8)。
优选的，步骤(4)中，所述第一水相和正丁醇的体积比为1：(6～8)。
本发明提供了一种补肾活血方化学成分的检测方法，包括以下步骤：(1) 将补肾活血方的中药置于水中浸泡后回流提取，得到水提取液；所述补肾活血方的中药组分为杜仲、补骨脂、怀牛膝、丹参、威灵仙和木瓜；(2)将所述水提取液依次进行浓缩、乙醇萃取、静置和离心分离，得到乙醇水上清液；除去所述乙醇水上清液中的乙醇，得到水萃取液；(3)采用乙酸乙酯萃取所述水萃取液，得到第一水相；(4)采用正丁醇萃取所述第一水相，得到第二水相；浓缩所述第二水相，得到待测液；(5)采用高效液相色谱- 质谱法对所述待测液进行检测，将所得检测结果对照标准色谱图和天然产物数据库，得到待测液中的化学成分；所述高效液相色谱-质谱法的高效液相色谱检测条件为：色谱柱：C18色谱柱；柱温：30℃；洗脱方式：梯度洗脱，流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为0.1v/v％甲酸乙腈溶液；所述流动相A和流动相B的流速为0.3mL/min；检测波长：190～500nm；所述梯度洗脱的程序如下：0～2min，所述流动相A的体积百分含量为98％，所述流动相B的体积百分含量为2％；2～7min，所述流动相A的体积百分含量由 98％匀速降低到85％，所述流动相B的体积百分含量为由2％匀速增加到 15％；7～14min，所述流动相A的体积百分含量由85％匀速降低到75％，所述流动相B的体积百分含量为由15％匀速增加到25％；14～21min，所述流动相A的体积百分含量由75％匀速降低到70％，所述流动相B的体积百分含量为由25％匀速增加到30％；21～25min，所述流动相A的体积百分含量由70％匀速降低到5％，所述流动相B的体积百分含量为由30％匀速增加到 95％；25～29min，所述流动相A的体积百分含量为5％，所述流动相B的体积百分含量为95％；39～30min，所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到98％，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到2％；所述高效液相色谱-质谱法的质谱条件为：离子源：ESI离子源；离子源温度：150℃；扫描方式：正负离子扫描；扫描范围：50～1200Da；载气：氮气；脱溶剂气：氮气；脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔气流量：50L/h；锥孔电压：40V；毛细管电压：1000V；碰撞诱导解离气体：氩气；低碰撞能量：6eV；高碰撞能：15～45eV。
本发明提供的检测方法，能够同时定性检测出补肾活血方中的原儿茶酸、京尼平苷酸、(-)-橄榄树脂素-4',4”-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、绿原酸、 1,4α,5,7α-四氢-7-羟甲基环戊烯[c]并吡喃-4-羧酸甲酯、丹参素、京尼平苷、 (+)-1-羟基松脂酚-4'-4”-二-O-β-D葡萄吡喃糖苷(松脂醇二葡萄糖苷)、杜仲苷、去氢二松柏醇-4,γ′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、白芷素、哈帕苷乙酸酯、(+)-杜仲树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷、柑属苷B、鹅掌楸苷、大豆黄苷、(+)-1-羟基松脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷(芦丁)、槲皮素-3-O-β-D- 吡喃葡萄糖苷、耳草素C双糖苷、(+)-松脂酚-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、雷扑妥苷、丹酚酸D、车叶草酸、(+)-丁香脂素-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、(+)-杜仲树脂醇-4'-吡喃葡萄糖苷(杜仲素A)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(紫云英苷)、迷迭香酸、(+)-1-羟基松脂酚、丹酚酸G、洋地黄内酯、(+)-环橄榄树脂素、黄芩苷、去乙酰车叶草酸、紫草酸、紫草酸B(丹酚酸B)、紫草酸单甲酯、 (-)-橄榄树脂素-4”-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、汉黄芩素、槲皮素、二氢脱氢二松柏醇、补骨脂内酯(补骨脂素)、白芷素(异补骨脂素)、双羟异补骨脂定、丹酚酸C、拟雌内酯、山柰黄素山柰酚)、(-)-橄榄树脂素、补骨脂异黄酮、旌节花甾酮D、丹参酚醌Ⅱ、PsorachalconeA、桦木酸(白桦酸)、丹参酸甲酯、补骨脂异黄酮醇、人参皂苷Ro、(+)-杜仲树脂醇、牛膝皂苷Ⅰ、去氢白菖蒲烯、BidentatosideⅠ、补骨脂香豆雌烷A、补骨脂异黄酮醛、异补骨脂双氢黄酮、PsorachalconeB(CorylifolB)、竹节参皂苷Ⅳa、羟基丹参酮ⅡA、新异补骨脂异黄酮、丹参酮二酚、补骨脂双氢黄酮(补骨脂甲素)、巴库查尔酮、异补骨脂定、补骨脂定、补骨脂色烯查尔酮、去葡萄糖竹节参皂苷Ⅳa、1,2- 二氢丹参酮Ⅰ、左旋二氢丹参酮Ⅰ、丹参新醌甲、新补骨脂查尔酮、齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、丹参新醌丁、SophoracoumestanA、异欧前胡内酯、补骨脂双氢黄酮甲醚、异丹参酮ⅡA、丹参酚(丹参醇A)、丹参酚醌Ⅰ、丹参酮ⅡB(隐丹参酮)、异隐丹参酮、丹参隐螺内酯、TanshinoneⅡA、丹参新醌丙、补骨脂酚、丹参新酮和鼠尾草酚酮共93种主成分，为补肾活血方的药用机理以及中药单体治疗下腰痛奠定了基础。
附图说明
图1为(-)-橄榄树脂素的UPLC-MS检测结果图；
图2为(-)-橄榄树脂素-4',4”-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的UPLC-MS检测结果图；
图3为(-)-橄榄树脂素-4”-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的UPLC-MS检测结果图；
图4为(+)-1-羟基松脂酚的UPLC-MS检测结果图；
图5为(+)-1-羟基松脂酚-4'-4”-二-O-β-D葡萄吡喃糖苷(松脂醇二葡萄糖苷)的UPLC-MS检测结果图；
图6为(+)-1-羟基松脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的UPLC-MS检测结果图；
图7为(+)-丁香脂素-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的UPLC-MS检测结果图；
图8为(+)-杜仲树脂醇的UPLC-MS检测结果图；
图9为(+)-杜仲树脂醇-4'-吡喃葡萄糖苷(杜仲素A)的UPLC-MS检测结果图；
图10为(+)-杜仲树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷的UPLC-MS检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种补肾活血方化学成分的检测方法，包括以下步骤：
(1)将补肾活血方的中药置于水中浸泡后回流提取，得到水提取液；所述补肾活血方的中药组分为杜仲、补骨脂、怀牛膝、丹参、威灵仙和木瓜；
(2)将所述水提取液依次进行浓缩、乙醇萃取、静置和离心分离，得到乙醇水上清液；除去所述乙醇水上清液中的乙醇，得到水萃取液；
(3)采用乙酸乙酯萃取所述水萃取液，得到第一水相；
(4)采用正丁醇萃取所述第一水相，得到第二水相；浓缩所述第二水相，得到待测液；
(5)采用高效液相色谱-质谱法对所述待测液进行检测；
所述高效液相色谱-质谱法的高效液相色谱检测条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
柱温：30℃；
洗脱方式：梯度洗脱，流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为 0.1v/v％甲酸乙腈溶液；所述流动相A和流动相B的流速为0.3mL/min；
检测波长：190～500nm；
所述梯度洗脱的程序如下：
0～2min，所述流动相A的体积百分含量为98％，所述流动相B的体积百分含量为2％；
2～7min，所述流动相A的体积百分含量由98％匀速降低到85％，所述流动相B的体积百分含量为由2％匀速增加到15％；
7～14min，所述流动相A的体积百分含量由85％匀速降低到75％，所述流动相B的体积百分含量为由15％匀速增加到25％；
14～21min，所述流动相A的体积百分含量由75％匀速降低到70％，所述流动相B的体积百分含量为由25％匀速增加到30％；
21～25min，所述流动相A的体积百分含量由70％匀速降低到5％，所述流动相B的体积百分含量为由30％匀速增加到95％；
25～29min，所述流动相A的体积百分含量为5％，所述流动相B的体积百分含量为95％；
39～30min，所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到98％，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到2％；
所述高效液相色谱-质谱法的质谱条件为：
离子源：ESI离子源；
离子源温度：150℃；
扫描方式：正负离子扫描；
扫描范围：50～1200Da；
载气：氮气；
脱溶剂气：氮气；
脱溶剂气温度：450℃；
脱溶剂气流量：800L/h；
锥孔气流量：50L/h；
锥孔电压：40V；
毛细管电压：1000V；
碰撞诱导解离气体：氩气；
低碰撞能量：6eV；
高碰撞能：15～45eV。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将补肾活血方的中药置于水中浸泡后回流提取，得到水提取液；所述补肾活血方的中药组分为杜仲、补骨脂、怀牛膝、丹参、威灵仙和木瓜。
在本发明中，所述杜仲、补骨脂、怀牛膝、丹参、威灵仙和木瓜的质量比优选为225.2：150.1：150.4：181.0：151.1：135.2。在本发明中，所述补肾活血方的中药组分和水的质量比优选为1：(7～9)，更优选为1：(7.5～8.5)，最优选为1:8。在本发明中，所述水优选为超纯水。
在本发明中，所述浸泡的温度优选为室温；时间优选为8～12h，更优选为9～11h，最优选为10h。
在本发明中，所述回流提取的温度优选为90～100℃，更优选为92～98℃，最优选为95～96h；总时间优选为1.5～3h，更优选为2～2.5h。在本发明中，所述回流提取优选分三次进行，每一次的时间优选为0.5～1h，更优选为1h。
所述提取后本发明优选还包括过滤，所得滤液即为水提取液。
得到水提取液后，本发明将所述水提取液依次进行浓缩、乙醇萃取、静置和离心分离，得到乙醇水上清液；除去所述乙醇水上清液中的乙醇，得到水萃取液。
本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏；本发明对于所述减压蒸馏的条件没有特殊限定，浓缩后的水提取液的浓度为1～1.5g/mL即可。
在本发明中，所述乙醇的体积百分浓度优选为95％；本发明对于所述乙醇的用量没有特殊限定，能够保证所述乙醇提取时加入95％乙醇至乙醇的的体积分数为65～75％即可，更优选为70％。在本发明中，所述乙醇萃取的目的是除去生物碱、极大苷元等亲脂性杂质。
在本发明中，所述静置的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；时间优选为23～25h，更优选为24h。
在本发明中，所述离心分离的转速优选为3500～4500r/min，更优选为 4000r/min；时间优选为9～11min，更优选为10min。
本发明对于所述乙醇的除去方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的乙醇去除方法即可，具体如减压蒸馏；本发明对于所述减压蒸馏的条件没有特殊限定，将乙醇去除干净即可。
得到水萃取液后，本发明采用乙酸乙酯萃取所述水萃取液，得到第一水相。
在本发明中，所述乙酸乙酯萃取优选分5～6次进行，每次乙酸乙酯萃取后，在所得水相中加入乙酸乙酯继续萃取，最终的水相即为第一水相。在本发明中，所述乙酸乙酯萃取的目的是除去能够溶解于乙酸乙酯中的杂质。在本发明中，所述水萃取液和乙酸乙酯总量的体积比优选为1：(6～8)，更优选为1:7。
得到第一水相后，本发明采用正丁醇萃取所述第一水相，得到第二水相；浓缩所述第二水相，得到待测液。
在本发明中，所述正丁醇萃取优选分5～6次进行，每次正丁醇萃取后，在所得水相中加入正丁醇继续萃取，最终的水相即为第二水相。在本发明中，所述正丁醇萃取的目的是除去能够溶解于正丁醇中的杂质。在本发明中，所述第一水相和正丁醇总量的体积比优选为1：(6～8)，更优选为1:7。
本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏；本发明对于所述减压蒸馏的条件没有特殊限定，浓缩至膏状即可。
所述浓缩后，本发明优选还包括将所述浓缩后的产物干燥，加入甲醇混合均匀，得到待测液。在本发明中，所述干燥的温度优选为60～70℃，更优选为65℃；时间优选为1.5～3h，更优选为2～2.5h。在本发明中，所述待测液的浓度优选为0.2g/mL。在本发明中，所述混合优选为超声混合，所述超声混合的时间优选为18～22min，更优选为20min。在本发明中，所述待测液在检测前优选过0.22μm滤膜。
得到待测液后，本发明采用高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS)对所述待测液进行检测，将所得检测结果对照标准色谱图和天然产物数据库，得到待测液中的化学成分。
在本发明中，所述标准色谱图的获取方法优选包括以下步骤：
配制标准品溶液，采用UPLC-MS对所述标准品溶液进行检测，得到标准品的色谱图；
本发明配制标准品溶液，采用UPLC-MS对所述标准品溶液进行检测，得到标准品的色谱图。
在本发明中，所述标准品溶液的配制方法，优选包括以下步骤：将标准品置于甲醇中溶解后转移至容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到标准品溶液。在本发明中，所述标准品优选包括大黄酚、丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参素钠、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、栀子苷、槲皮素-3-O-β-半乳糖苷、紫云英苷、表儿茶素、五味子乙素、儿茶素、松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷、杜仲醇、葛根素、异甘草素、补骨脂酚、补骨脂二氢黄酮、CorylifolA、异补骨脂查尔酮、补骨脂定、补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、异补骨脂素、熊果酸、芦丁、京尼平苷酸、京尼平、槲皮素、木犀草素、原儿茶酸、槲皮苷、竹节参皂苷Iva、齐墩果酸或车叶草苷。在本发明中，每种标准品溶液的浓度优选为0.1mg/mL。在本发明中，所述甲醇优选为色谱级，优选购买于美国Thermo Fisher公司。在本发明中，所述标准品溶液优选过0.22μm的滤膜后进行UPLC-MS检测。
在本发明中，所述高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS)的高效液相色谱检测条件为：
色谱柱：C18色谱柱，优选为Agilent Eclipse XDB C18色谱柱 (2.1×100mm，1.8μm)；
柱温：30℃；
洗脱方式：梯度洗脱，流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为 0.1v/v％甲酸乙腈溶液；所述流动相A和流动相B的流速为0.3mL/min；
检测波长：190～500nm；
在本发明中，所述高效液相色谱检测条件的进样体积优选为2μL；采用的高效液相色谱仪优选为ACQUITYI-class UPLC。
在本发明中，所述梯度洗脱的程序如表1所示：
表1梯度洗脱的程序
Figure BDA0002723360320000101
即，所述梯度洗脱的程序如下：
0～2min，所述流动相A的体积百分含量为98％，所述流动相B的体积百分含量为2％；
2～7min，所述流动相A的体积百分含量由98％匀速降低到85％，所述流动相B的体积百分含量为由2％匀速增加到15％；
7～14min，所述流动相A的体积百分含量由85％匀速降低到75％，所述流动相B的体积百分含量为由15％匀速增加到25％；
14～21min，所述流动相A的体积百分含量由75％匀速降低到70％，所述流动相B的体积百分含量为由25％匀速增加到30％；
21～25min，所述流动相A的体积百分含量由70％匀速降低到5％，所述流动相B的体积百分含量为由30％匀速增加到95％；
25～29min，所述流动相A的体积百分含量为5％，所述流动相B的体积百分含量为95％；
39～30min，所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到98％，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到2％。
在本发明中，所述高效液相色谱-质谱法的质谱条件为：
离子源：ESI离子源；
离子源温度：150℃；
扫描方式：正负离子扫描；
扫描范围：50～1200Da；
载气：氮气；
脱溶剂气：氮气；
脱溶剂气温度：450℃；
脱溶剂气流量：800L/h；
锥孔气流量：50L/h；
锥孔电压：40V；
毛细管电压：1000V；
碰撞诱导解离气体：氩气，所述氩气的纯度优选为99.95％；
低碰撞能量：6eV；
高碰撞能：15～45eV；
在本发明中，所述质谱条件优选还包括：采用Xevog2-XS Q-TOF质谱仪(美国Waters公司)；Leucine enkephalin实时校正分子量为正离子m/z：556.2771，负离子m/z：554.2615，时间间隔：0.2s。
采用UPLC-MS对所述待测液进行检测，得到待测化合物的色谱图。在本发明中，所述UPLC-MS的检测条件优选与上述技术方案中的UPLC-MS 的检测条件相同，在此不再一一赘述。
得到标准品的色谱图和待测化合物的色谱图后，本发明通过比对待测化合物的色谱图、标准品的色谱图和天然产物数据库确定待测液的化学成分。
在本发明中，所述比对优选利用UNIFI软件进行。在本发明中，所述 UNIFI软件的参数设置优选包括：采用MSE数据采集模式，Masslynss 4.1数据采集系统，以UNIFI 1.9软件进行数据分析；待测化合物的峰处置模式为 3D峰，低能量阈值限为500，高能量阈值限为20，绝对保留时间允许偏差为0.1min，待测化合物与化合物标准品质量数偏差范围为±5mDa，匹配碎片离子的最大数量为10。
在本发明中，所述天然产物数据库来源于Waters公司 (www.waters.com)。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)将225.2g杜仲、150.1g补骨脂、150.4g怀牛膝、181.0g丹参、151.1g 威灵仙和135.2g木瓜混合，加入7.944L水浸泡12h，在95℃加热回流提取 3次，每次加热回流时间为1h，合并提取液后过滤，所得滤液即为水提取液；
将所述水提取液减压浓缩至中药浓度为1g/mL后加入体积分数为95％乙醇至混合液中乙醇体积分数为70％进行萃取，在4℃静置24h后以 4000r/min的速度离心分离10min，将得到的乙醇水上清液在35℃减压蒸馏至无醇味，得到水萃取液；
取375mL所述水萃取液，加入乙酸乙酯萃取，在所得水相中加入乙酸乙酯继续下一次的萃取，共萃取5次，每次萃取乙酸乙酯的用量为500mL，最后一次萃取的水相即为第一水相；
在所述第一水相中加入正丁醇萃取，在所得水相中加入正丁醇继续下一次的萃取，共萃取5次，每次萃取正丁醇的用量为500mL，最后一次萃取的水相即为第二水相；将所述第二水相在65℃减压干燥3h，得到待测物固体；在0.5g所述待测物固体中加入色谱级甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为20mg/mL的待测液。
(2)将2.5mg标准品置于甲醇中溶解后转移至25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为0.1mg/mL的标准品溶液；所述标准品为大黄酚、丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参素钠、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、栀子苷、槲皮素-3-O-β-半乳糖苷、紫云英苷、表儿茶素、五味子乙素、儿茶素、松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷、杜仲醇、葛根素、异甘草素、补骨脂酚、补骨脂二氢黄酮、Corylifol A、异补骨脂查尔酮、补骨脂定、补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、异补骨脂素、熊果酸、芦丁、京尼平苷酸、京尼平、槲皮素、木犀草素、原儿茶酸、槲皮苷、竹节参皂苷Iva、齐墩果酸或车叶草苷。
(3)将标准品溶液过0.22μm的滤膜后进行UPLC-MS检测，得到标准品的色谱图。
其中，UPLC-MS检测的高效液相色谱检测条件为：采用ACQUITY I-class UPLC，色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18色谱柱(2.1×100mm， 1.8μm)；柱温为30℃；洗脱方式为梯度洗脱，流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为0.1v/v％甲酸乙腈溶液，流动相的流速为0.3mL/min；检测波长为190～500nm；进样体积为2μL；采用表1所示的梯度洗脱的程序：
表1梯度洗脱的程序
Figure BDA0002723360320000131
Figure BDA0002723360320000141
UPLC-MS检测的质谱检测条件为：采用Xevog2-XS Q-TOF质谱仪(美国Waters公司)；离子源为ESI离子源；离子源温度为150℃；扫描方式为正负离子扫描；扫描范围为50～1200Da；载气为氮气；脱溶剂气为氮气；脱溶剂气温度为450℃；脱溶剂气流量为800L/h；锥孔气流量为50L/h；锥孔电压为40V；毛细管电压为1000V；碰撞诱导解离气体为氩气，所述氩气的纯度优选为99.95％；低碰撞能量为6eV；高碰撞能为15～45eV；Leucine enkephalin实时校正分子量为正离子m/z为556.2771，负离子m/z为554.2615，时间间隔为0.2s。
(4)将待测液液过0.22μm的滤膜后采用步骤(3)的检测条件进行 UPLC-MS检测，得到标准品的色谱图。
(5)通过UNIFI软件比对待测化合物的色谱图、标准品的色谱图和天然产物数据库(Waters公司)确定待测液的化学成分，其中，所述UNIFI 软件的参数设置：采用MSE数据采集模式，Masslynss 4.1数据采集系统，以 UNIFI 1.9软件进行数据分析；待测化合物的峰处置模式为3D峰，低能量阈值限为500，高能量阈值限为20，绝对保留时间允许偏差为0.1min，待测化合物与化合物标准品质量数偏差范围为±5mDa，匹配碎片离子的最大数量为10。检测结果如表2和图1～10所示。
表2补肾活血方化合物UPLC-MS检测结果
Figure BDA0002723360320000142
Figure BDA0002723360320000151
Figure BDA0002723360320000161
Figure BDA0002723360320000171
Figure BDA0002723360320000181
Figure BDA0002723360320000191
Figure BDA0002723360320000201
由表2和图1～10可知，补肾活血方是通过多组分协同作用于机体而起到作用的；补肾活血方在机体中发挥作用的物质主要以本发明中所检测到的 93中化合物为主。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种补肾活血方化学成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将补肾活血方的中药置于水中浸泡后回流提取，得到水提取液；所述补肾活血方的中药组分为杜仲、补骨脂、怀牛膝、丹参、威灵仙和木瓜；
(2)将所述水提取液依次进行浓缩、乙醇萃取、静置和离心分离，得到乙醇水上清液；除去所述乙醇水上清液中的乙醇，得到水萃取液；
(3)采用乙酸乙酯萃取所述水萃取液，得到第一水相；
(4)采用正丁醇萃取所述第一水相，得到第二水相；浓缩所述第二水相，得到待测液；
(5)采用高效液相色谱-质谱法对所述待测液进行检测，将所得检测结果对照标准色谱图和天然产物数据库，得到待测液中的化学成分；
所述高效液相色谱-质谱法的高效液相色谱检测条件为：
色谱柱：C18色谱柱；
柱温：30℃；
洗脱方式：梯度洗脱，流动相A为0.1v/v％甲酸水溶液，流动相B为0.1v/v％甲酸乙腈溶液；所述流动相A和流动相B的流速为0.3mL/min；
检测波长：190～500nm；
所述梯度洗脱的程序如下：
0～2min，所述流动相A的体积百分含量为98％，所述流动相B的体积百分含量为2％；
2～7min，所述流动相A的体积百分含量由98％匀速降低到85％，所述流动相B的体积百分含量为由2％匀速增加到15％；
7～14min，所述流动相A的体积百分含量由85％匀速降低到75％，所述流动相B的体积百分含量为由15％匀速增加到25％；
14～21min，所述流动相A的体积百分含量由75％匀速降低到70％，所述流动相B的体积百分含量为由25％匀速增加到30％；
21～25min，所述流动相A的体积百分含量由70％匀速降低到5％，所述流动相B的体积百分含量为由30％匀速增加到95％；
25～29min，所述流动相A的体积百分含量为5％，所述流动相B的体积百分含量为95％；
39～30min，所述流动相A的体积百分含量由5％匀速增加到98％，所述流动相B的体积百分含量由95％匀速降低到2％；
所述高效液相色谱-质谱法的质谱条件为：
离子源：ESI离子源；
离子源温度：150℃；
扫描方式：正负离子扫描；
扫描范围：50～1200Da；
载气：氮气；
脱溶剂气：氮气；
脱溶剂气温度：450℃；
脱溶剂气流量：800L/h；
锥孔气流量：50L/h；
锥孔电压：40V；
毛细管电压：1000V；
碰撞诱导解离气体：氩气；
低碰撞能量：6eV；
高碰撞能：15～45eV。
2.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述补肾活血方的中药组分和水的质量比为1：(7～9)。
3.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸泡的时间为8～12h。
4.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述回流提取的温度为90～100℃，时间为1.5～3h。
5.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙醇萃取时加入乙醇后乙醇的体积分数为65～75％。
6.根据权利要求1或5所述的的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述静置的温度为3～5℃，时间为23～25h。
7.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述水萃取液和乙酸乙酯的体积比为1：(6～8)。
8.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述第一水相和正丁醇的体积比为1：(6～8)。
CN202011094756.9A 2020-10-14 2020-10-14 一种补肾活血方化学成分的检测方法 Active CN112098563B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011094756.9A CN112098563B (zh) 2020-10-14 2020-10-14 一种补肾活血方化学成分的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011094756.9A CN112098563B (zh) 2020-10-14 2020-10-14 一种补肾活血方化学成分的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112098563A CN112098563A (zh) 2020-12-18
CN112098563B true CN112098563B (zh) 2022-07-15

Family

ID=73783870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011094756.9A Active CN112098563B (zh) 2020-10-14 2020-10-14 一种补肾活血方化学成分的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112098563B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112684053B (zh) * 2020-12-28 2022-09-13 上海中医药大学附属曙光医院 一种同时测定抗慢性心衰药复方中7种成分含量的方法
CN112924600B (zh) * 2021-03-23 2023-11-03 贵州益佰制药股份有限公司 一种治疗风湿痹阻所致关节肿痛制剂的指纹图谱建立方法
CN112986458A (zh) * 2021-03-23 2021-06-18 贵州益佰制药股份有限公司 一种金骨莲制剂的含量测定方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102145106A (zh) * 2011-04-07 2011-08-10 浙江中医药大学 一种治疗骨质疏松症的中药组合物及补肾活血颗粒剂
CN105044223A (zh) * 2015-04-24 2015-11-11 贵州景峰注射剂有限公司 一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法
CN109223904A (zh) * 2018-11-29 2019-01-18 深圳市中医院 一种补肾活血方及其制备方法
CN109265339A (zh) * 2018-10-15 2019-01-25 贵州师范大学 一种头花蓼活性组分、提取方法及应用
CN109828066A (zh) * 2019-03-29 2019-05-31 齐齐哈尔大学 液相色谱质谱联用法测定中药中化学成分的方法及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009309408A1 (en) * 2008-10-28 2010-05-06 Avesthagen Limited A method of characterizing Phytochemicals from Trigonella foenum graceum

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102145106A (zh) * 2011-04-07 2011-08-10 浙江中医药大学 一种治疗骨质疏松症的中药组合物及补肾活血颗粒剂
CN105044223A (zh) * 2015-04-24 2015-11-11 贵州景峰注射剂有限公司 一种参芎葡萄糖注射液的化学成分鉴定及活性成分筛选方法
CN109265339A (zh) * 2018-10-15 2019-01-25 贵州师范大学 一种头花蓼活性组分、提取方法及应用
CN109223904A (zh) * 2018-11-29 2019-01-18 深圳市中医院 一种补肾活血方及其制备方法
CN109828066A (zh) * 2019-03-29 2019-05-31 齐齐哈尔大学 液相色谱质谱联用法测定中药中化学成分的方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于UPLC-Q-TOF-MS/MS快速分析亚大黄中的抗补体活性成分;詹艳芝等;《中国实验方剂学杂志》;20180312;第24卷(第10期);60-66 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112098563A (zh) 2020-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112098563B (zh) 一种补肾活血方化学成分的检测方法
Dashora et al. Antitumor activity of Dendrophthoe falcata against ehrlich ascites carcinoma in swiss albino mice
Zhao et al. Simultaneous determination and pharmacokinetics of sixteen Angelicae dahurica coumarins in vivo by LC–ESI-MS/MS following oral delivery in rats
Ying et al. Identification and analysis of absorbed components and their metabolites in rat plasma and tissues after oral administration of ‘Ershiwuwei Shanhu’pill extracts by UPLC-DAD/Q-TOF-MS
Zhang et al. Bioavailability enhancement of osthole after oral administration of Bushen Yizhi prescription extract to rats followed by Cnidium monnieri (L.) Cusson fruits extract in comparison to pure osthole at different doses
Mao et al. Chemical profiles and pharmacological activities of Chang-Kang-Fang, a multi-herb Chinese medicinal formula, for treating irritable bowel syndrome
CN106967147A (zh) C27螺甾烷型甾体皂苷化合物与其药物组合物和其应用
CN1850095A (zh) 重楼皂苷化合物的应用
CN101209254B (zh) 多羟基没食子酰基-β-D-葡萄糖衍生物的用途
Bai et al. Pharmacokinetic of 5 components after oral administration of Fructus Forsythiae by HPLC-MS/MS and the effects of harvest time and administration times
CN101386613A (zh) 从红车轴草提取异黄酮类物质的工艺
Singh et al. High-performance liquid chromatographic determination of bergenin in different Bergenia species
Luo et al. Advances in traditional Chinese medicine for liver disease therapy in 2021
Liang et al. Determination of oleanolic acid and ursolic acid in Oldenlandia diffusa and its substitute using high performance liquid chromatography
Tao et al. A simple and sensitive LC–MS/MS approach for simultaneous quantification of six bioactive compounds in rats following oral administration of aqueous extract and ultrafine powder of Astragalus propinquus: Application to a comparative pharmacokinetic study
CN100368421C (zh) 委陵菜有效成分黄酮化合物提取分离方法和应用
CN112159451A (zh) 一种绞股蓝皂苷提取物及其制备方法
Bai et al. Advances in the chemical constituents, pharmacological properties and clinical applications of TCM formula Yupingfeng San
CN105233248A (zh) 尿多酸肽在制备治疗瘢痕药物中的应用
Lai et al. Analysis and comparison of baicalin, baicalein and wogonin contents in traditional decoctions and commercial extracts of Scutellariae radix
CN101897873B (zh) 活血化瘀、软解散结提取物的制备方法
Li et al. Identification of chemical components of Qi‐fu‐yin and its prototype components and metabolites in rat plasma and cerebrospinal fluid via UPLC‐Q‐TOF‐MS
Ye et al. Characterization of the multiple absorbed constituents in rats after oral administration of Chai‐Huang decoction by liquid chromatography coupled with electrospray‐ionization mass spectrometry
Jiang et al. An UPLC‐MS/MS method for simultaneous quantification of the components of Shenyanyihao oral solution in rat plasma
Lin et al. Detection and determination of phenformin in Chinese medicinal capsules by GC-MS and HPLC

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant