CN101386613A

CN101386613A - 从红车轴草提取异黄酮类物质的工艺

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Publication number: CN101386613A
Application number: CNA2007101538100A
Authority: CN
Inventors: 赵志光; 周振亚; 白高英; 马晓军
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2007-09-11
Filing date: 2007-09-11
Publication date: 2009-03-18
Anticipated expiration: 2027-09-11
Also published as: CN101386613B

Abstract

本发明为从红车轴草中提取异黄酮类物质的工艺，涉及从植物提取有效物质的领域，异黄酮类物质是一种很有价值的药用原料，但完整的提取工艺还未见报导，本发明公开了的完整的提取工艺包括用乙醇溶液热回流进行初提，得乙醇浸膏，再用氢氧化钠溶液进行水解进行纯化，再用盐酸溶液进行水层处理，经乙酸乙酯萃取，减压蒸馏得到异黄酮类物质的粗产品，本发明具有提取效率高、设备投资少、工程启动快、成本低、易于推广的有益效果。

Description

从红车轴草提取异黄酮类物质的工艺

技术领域

本发明涉及有机物提取工艺，尤其是从植物中提取有效物质的工艺。

背景技术

红三叶也称红车轴草(Trifolium.Pratense.L)，为豆科(Leguminosae)车轴草(Trifolium.L)属多年生草本植物。原产于小亚西亚及欧洲西南部，是欧洲、美国东部、新西兰等海洋性气候地区的最重要的牧草和饲料之一，我国南北各地均有栽培。岷县于1944年由美国引进红三叶，已有60余年的种植历史，经多年的驯化、选育，现已成为当地的优势草种。由于岷山红三叶蛋白质含量高、营养丰富，1987年经全国饲料牧草品种审定委员会审定登记并命名为岷山红三叶，并被誉为中国第一草。

研究表明，岷山红三叶是重要的药材，含丰富的异黄酮类物质，因其独特的药用价值，已由牧草型向药用型发展，该草的主要异黄酮成分为：鹰嘴豆芽素A(bionchanin A)和B(formonetin)、芒柄花素(Formononetin)、刺芒柄花苷(Ononin)、染料木素(genistein)、大豆素(daidzein)、大豆甙元、大豆甙、染料木甙等，其中以鹰嘴豆芽素A和芒柄花素含量最高。

分子式结构如下：

鹰嘴豆芽素A(biochanin A) 芒柄花素(Formononetin)

刺芒柄花苷(Ononin) 异黄酮

异黄酮的主要作用是调节人体的内分泌，防止妇女更年期综合症，降低血脂，减少冠心病的发生、防止骨质疏松症、抗癌、止痛消肿、保护神经系统、抗感染、延缓衰老等。现代药理学研究证明红车轴草的主要药理作用有：

1.选择性抗痉挛、消炎和杀菌作用：红车轴草在体外有抑制草履虫的作用(0.2％醇浸剂可使草履虫于30min内停止活动)；大豆苷及大豆素可以缓解高血压患者的头痛等症状；其花粉对某些革兰氏阴性杆菌有抗菌作用，利用其消炎杀菌作用治疗皮肤病。

2.抗癌作用：红车轴草含高浓度异黄酮等黄酮类物质，实验表明异黄酮类物质为强抗氧化剂，是自由基的强清除剂，故具抗癌效用。乳腺癌病人血浆中雌激素偏高，植物雌性激素对其有拮抗作用，从而抑制乳腺癌；红车轴草对结肠癌也有治疗效果。

3.预防骨质疏松症：骨质疏松症，是指骨骼失去致密性而变得粗疏与脆弱，尤以闭经后的女性最容易患骨质疏松症。这是由于雌性激素的分泌功能随着年龄的增长而降低，防止骨骼钙质溶出的作用逐渐减弱，造成钙质流失。

4.雌激素样作用：红车轴草作为植物雌激素能够分布到人体每个细胞中发挥作用，这是人体自身激素达不到的，并且它们具双调节作用，当人体雌激素水平高时，可抑制激素分泌，当人体雌激素水平低时，它们能够提供额外的雌激素样作用。染料木素、鹰嘴豆芽素A和B及大豆素均有雌性激素样作用，这可能是由于它们与己烯雌酚和雌二醇结构相似的缘故。红三叶中的异黄酮以芒柄花素的含量最高，芒柄花素等异黄酮具有弱的雌激素活性，在动物体内具有多方面的生理作用：可以促进肝脏性激素结合蛋白的合成，提高性激素的生物学半衰期；可以在外周组织(如脂肪组织)抑制芳香化酶的活性，减少睾酮向雌二醇转化；可以在细胞水平上与内源雌二醇竞争雌二醇受体，从而影响包括下丘脑垂体在内的神经内分泌调节过程，使内源激素水平发生变化。

总之，异黄酮类物质在医学上具有多种用途，是一种很有价值的药物原料，但是其提取工艺报导得还很少，尤其是完整的提取工艺还未见到。

发明内容

为了加速开发红车轴草资源，本发明旨在提供一种质量稳定可靠，提取方法简便的红车轴草提取物异黄酮类物质的工艺。

实现上述目的的技术方案如下：

从红车轴草提取异黄酮类物质的工艺，工艺步骤如下：

(1)将红车轴草全草晒干，粉碎；

(2)干粉用50-95％的乙醇回流进行初提，料液比为6-10倍，在50-85℃回流1-2小时，再进行减压蒸馏，压力为0.08Mpa，温度为40-50℃，回收溶剂，得到乙醇浸膏；

(3)乙醇浸膏用NaOH1-5％溶液水解纯化，NaOH溶液用量为乙醇浸膏体的4-6倍，充分溶解后过滤，除去沉淀；

(4)在室温下用石油醚萃取脱色，除去石油醚层；

(5)用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯用量为1:1.5-1:2，萃取5-6次，收集乙酸乙酯层；

(6)加入HCl 3-10％溶液，热回流进行酸解，热回流温度为60-80℃，回流1-2小时；

(7)水层中加入乙酸乙酯提取酸解后水相中的异黄酮类物质，乙酸乙酯用量为1:1.5-1:2，提取5-6次，收集乙酸乙酯提取层；

(8)合并乙酸乙酯提取层，进行减压蒸馏，0.08Mpa，40-50℃，得到异黄酮类物质粗品。

在上述提取工艺中各参数的优选值为：热回流初提用的乙醇浓度为75％。用于水解纯化的氢氧化钠水溶液浓度为2％。酸解时盐酸溶液浓度为3％。初提时乙醇用量料液比为10倍，回流温度为70℃，回流时间1小时。HCl酸解时反应温度为60℃，反应时间为1小时。

上述技术方案包括了三个部分：

1 初提：取岷山红车轴草全草，晒干，粉碎，经乙醇热回流后，收集滤液，进行减压蒸馏，回收溶剂，得乙醇浸膏。为了达到优选效果，考察溶液浓度、料液比、提取时间、提取温度四个因素，从而确定出最佳工艺参数。

2 纯化：用氢氧化钠水溶液将乙醇浸膏充分搅拌溶解，过滤除去沉淀，在适当温度下进行石油醚萃取后，除去石油醚层，再用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层。为了进一步优化，仍然采用正交实验的方法，确定了酸碱浓度、反应时间、反应温度四个因素。

3 水层处理：水层加入HCl，进行热回流，并水解处理，加入乙酸乙酯，萃取数次，收集乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯层，减压蒸馏，可得异黄酮类物质的粗产品。

对异黄酮类物质粗品进行HPLC检测，以十八烷基硅烷键合硅胶柱作为色谱柱，分别取适当浓度的磷酸水溶液及CH₃CN溶液作为流动相，经检测，已划归异黄酮同宗的含量可达20％以上。

I、仪器与试材

1、实验材料

红车轴草：采自甘肃岷山，将红车轴草晒干，粉碎，粉碎粒径为0.6-0.8mm

2、试剂与仪器

标准品鹰嘴豆芽素A(biochaninA，纯度97％，Fluke公司)；芒柄花素(formononetin，98％，Sigma公司)，无水乙醇，石油醚，乙酸乙酯，盐酸，甲醇，氢氧化钠采用分析纯，乙腈为国产色谱纯

SHIMADZU高效液相色谱仪(日本岛津)；UV2100紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-III型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；CU60型电热恒温水箱(上海一恒科技有限公司)；HG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；Sartorius BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；

II、实验方法与结果

1、乙醇提取正交实验

1.1、色谱分析

1.1.1、色谱条件：色谱柱：ODS2-C18(250mm×4.6mm，5um)；进样量：5ul；流量：0.8mL/min；柱温：室温；流动相：乙腈-水(乙腈浓度60min内由15％变为100％)；检测波长：260nm

1.1.2 对照标准品溶液的处理：精密称取标准对照品各5mg，置入100mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得

1.1.3 供试品溶液的处理：取红车轴草提取物粉末0.25g(纯化后0.1g)，精密称定，置100mL容量瓶中，加入约80mL甲醇溶液，超声提取30min后取出，放置至室温，加甲醇溶液至刻度，摇匀。用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液置棕色试样瓶中，即得供试液。

红车轴草提取物中总异黄酮类的含量按式(C.1)计算：

式中：

A_X——供试品溶液色谱图中刺芒柄花苷或印度黄檀苷或刺芒柄花素或鹰嘴豆芽素A的3次进样峰面积的平均值；

A_S——对照品溶液色谱图中相应组分3次进样峰面积的平均值；

c——对照品溶液中相应组分的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

m——试样质量，单位为毫克(mg)。

其中A_X，A_S均为同一样品三次进样后相应峰的平均值

试验结果得出了以下优选的条件：

提取过程：乙醇浓度 75％

料液比 10倍

提取温度 70℃

提取时间 1小时

纯化过程：NaOH浓度 2％

料液化 4倍

盐酸溶液浓度 3％

反应时间 1小时

反应温度 60℃

提取物的验证

对鹰嘴豆芽素A和芒柄花素两种物质测量了液相色谱标准曲线，显示于图1和图2中，图1中表明了在横座标46.274分钟的位置具有鹰嘴豆芽素A的特征峰，图2表明了在横座标40.606分钟的位置具有芒柄花素的特征峰。供试品液相色谱示于图3，在横座标40.616分钟处和46.721分钟处各存在一个峰，供试品中确实具有鹰嘴豆芽素A和芒柄花素两种物质。证明本发明公开的提取工艺是提取异黄酮类物质的有效工艺。

本发明具有以下有益效果：

1、工艺简单，提取效率高；

2、采用通用设备，设资少，工程启动快；

3、成本低、易于推广。

附图说明

图1为鹰嘴豆芽素A的液相色谱标准曲线；

图2为芒柄花素的液相色谱标准曲线；

图3为本发明供试品的液相色谱。

具体实施方式

现通过以下实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

(1)将红车轴草全草晒干，粉碎；

(2)干粉用75％的乙醇回流进行初提，料液比为10倍，在70℃回流1小时，再进行减压蒸馏，压力为0.08Mpa，温度为45℃，回收溶剂，得到乙醇浸膏；

(3)乙醇浸膏用NaOH 3％溶液水解纯化，NaOH溶液用量为乙醇浸膏体积的5倍，充分溶解后过滤，除去沉淀；

(4)在室温下用石油醚萃取脱色，除去石油醚层；

(5)用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯用量为1:1.5，萃取5次，收集乙酸乙酯层；

(6)加入HCL 3％溶液，热回流进行酸解，热回流温度为70℃，回流1小时；

(7)水层中加入乙酸乙酯提取酸解后水相中的异黄酮类物质，乙酸乙酯用量为1:1.5，提取5次，收集乙酸乙酯提取层；

(8)合并乙酸乙酯提取层，进行减压蒸馏，0.08Mpa，45℃，得到异黄酮类物质粗品。

实施例2

(1)将红车轴草全草晒干，粉碎；

(2)干粉用95％的乙醇回流进行初提，料液比为8倍，在85℃回流2小时，再进行减压蒸馏，压力为0.08Mpa，温度为50℃，回收溶剂，得到乙醇浸膏；

(3)乙醇浸膏用NaOH 1％溶液水解纯化，NaOH溶液用量为乙醇浸膏体积的6倍，充分溶解后过滤，除去沉淀；

(4)在室温下用石油醚萃取脱色，除去石油醚层；

(5)用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯用量为1:2，萃取6次，收集乙酸乙酯层；

(6)加入HCL 10％溶液，热回流进行酸解，热回流温度为80℃，回流2小时；

(7)水层中加入乙酸乙酯提取酸解后水相中的异黄酮类物质，乙酸乙酯用量为1:2，提取6次，收集乙酸乙酯提取层；

(8)合并乙酸乙酯提取层，进行减压蒸馏，0.08Mpa，50℃，得到异黄酮类物质粗品。

实施例3

(1)将红车轴草全草晒干，粉碎；

(2)干粉用50％的乙醇回流进行初提，料液比为6倍，在50℃回流1.5小时，再进行减压蒸馏，压力为0.08Mpa，温度为40℃，回收溶剂，得到乙醇浸膏；

(3)乙醇浸膏用NaOH 5％溶液水解纯化，NaOH溶液用量为乙醇浸膏体积的4倍，充分溶解后过滤，除去沉淀；

(4)在室温下用石油醚萃取脱色，除去石油醚层；

(6)加入HCL 5％溶液，热回流进行酸解，热回流温度为60℃，回流1小时；

(8)合并乙酸乙酯提取层，进行减压蒸馏，0.08Mpa，40℃，得到异黄酮类物质粗品。

Claims

1、从红车轴草中提取异黄酮类物质的工艺，其特征为工艺步骤如下：

(1)将红车轴草全草晒干，粉碎；

(3)乙醇浸膏用NaOH 1-5％溶液水解纯化，NaOH溶液用量为乙醇浸膏体的4-6倍，充分溶解后过滤，除去沉淀；

(4)在室温下用石油醚萃取脱色，除去石油醚层；

2、根据权利要求1所述的从红车轴草中提取异黄酮类物质的工艺，其特征为热回流初提用的乙醇浓度为75％。

3、根据权利要求1所述的从红车轴草中提取异黄酮类物质的工艺，其特征为用于水解纯化的氢氧化钠水溶液浓度为2％。

4、根据权利要求1所述的从红车轴草中提取异黄酮类物质的工艺，其特征为酸解时盐酸溶液浓度为3％。

5、根据权利要求1或2所述的从红车轴草中提取异黄酮类物质的工艺，其特征为初提时乙醇用量料液比为10倍，回流温度为70℃，回流时间1小时。

6、根据权利要求1或4所述的从红车轴草中提取异黄酮类物质的工艺，其特征为HCl酸解时反应温度为60℃，反应时间为1小时。