CN104130299A - 金雀花花蕾中鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金雀花花蕾中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法，干燥的金雀花花蕾经粉碎、回流提取、浓缩得提取物粗样；将提取物粗样先经萃取划段，溶剂系统分别为石油醚、乙酸乙酯和正丁醇，含正丁醇萃取部分进一步通过聚酰胺酚树脂柱的分离洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，调节pH为2～3，冷却静置、过滤得到异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖；本发明方法制得的异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖含量>80%，该方法提取率高，设备要求低，易扩大化生产，适用于产业化生产。

Description

金雀花花蕾中鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法

技术领域

本发明涉及天然资源深加工领域，更具体的涉及一种从金雀花花蕾中提取分离鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的方法。 

背景技术

金雀花（Caragana sinica）为豆科锦鸡儿属（Caragana）落叶灌木，别名锦鸡儿、黄雀花、阳雀花、生血草。金雀花分布于我国长江流域及华北地区的丘陵、山区的向阳坡地，我国产40余种，资源较为丰富。在云南，冬尽春来，金雀花遍开山野。其貌不出众，香气独具。人们将它与鸡蛋、腊肉、火腿和鲜肉等爆炒，或者与肉片和豆腐一起煮成三鲜汤，香甜可口。民谚曰：“吃了金雀花，眼睛不眨巴”。张小玲等人（2004）和樊建等人（2006）报道金雀花花蕾具有丰富的营养价值，它的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量高于几种豆科植物的蔬菜（如黄豆芽、绿豆芽、扁豆、刚豆、菜豆），其微量元素如Fe、Zn、Se和Vc的含量高于人们常见的蔬菜，另外它含有17种人体必须的氨基酸。 

   金雀花一身都是宝，其根部具有较好的功效，《植物各实图考》和《上海常用中草药》记载金雀花根滋补强壮，活血调经，祛风利湿。用于高血压病，头昏头晕，耳鸣眼花，体弱乏力，月经不调，白带，乳汁不足，风湿关节痛，跌打损伤。胡昌奇等人从根部分离得到甾醇类、黄酮类、聚苯二烯类和苷类等化合物，报道了一系列新颖的聚苯二烯类化合物及它们抗炎和提高免疫力活性，同时他们还研究了金雀花根部提取物的相关活性，发现它可降低实验家兔的全血粘度、全血还原粘度、血浆粘度，降低纤维蛋白原含量，缩短血小板电泳时间，抑制血小板粘附，改善血液的浓、粘、凝和聚状态，抑制蛋白激酶C活性及癌细胞生长活性，还具有较强刺激成骨细胞增殖的活性。 

《上海常用中草药》记载金雀花花蕾具有活血祛风，止咳，强壮的功效，能用来治疗头晕头痛、耳鸣眼花、肺虚久咳、小儿疳积等疾病。在云南，金雀花花蕾的资源开发情况不容乐观，仅有少量花蕾在其花期被采摘作为菜肴食用或被作为中药原料，而大量花或落地后无人处理，或枯萎后自然失去效用，导致这种天然花卉资源白白浪费。太志刚等人（2010）对云南大理产的金雀花花蕾化学成分和相关活性进行了研究，从中分离得到23个化合物，包括10个黄酮类化合物，8个三萜类化合物，2个甾体类化合物及3个酚酸类化合物，并发现金雀花具有较强的抗氧化活性，通过金雀花HPLC含量测定，发现异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖在金雀花中的含量高达3.94 mg/g。1999年Hideyuki等人报道了异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖具有抗氧化、抗肿瘤、抑制EB 病毒早期抗原活性等多种生物活性。2009年阿吉艾克拜尔·艾萨通过“骆驼刺质量标准”的起草工作，发现异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷是骆驼刺的主要化学成分和标志性成分，初步的药理实验研究表明鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷是骆驼刺的主要有效成分之一，其自身可通过抑制α-淀粉酶降低血糖，并能抑制淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。 

基于以上，提取异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖具有较为实际意义。然而迄今为止，对异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖提取方法的报道较少，至今仅有李坤平等人（2011）采用大孔吸附树脂富集布渣叶中的总黄酮，用Sephadex LH-20 凝胶柱从总黄酮中分离制备纯度大于98 %的异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖苷对照品，方法简便有效，但该方法关键步骤中利用凝胶材料进行纯化，而凝胶存在着市场价格较高，处理量较小的问题，从而导致异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的产量低，不易扩大化生产。 

发明内容

为了开发云南金雀花资源，旨在克服之前提取方法中存在的技术问题，本发明提供了一种提取率高，设备要求低，适合产业化的金雀花花蕾中异鼠李-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法。 

本发明的目的是通过以下具体技术方案实现的： 

1、粉碎和提取

取干燥的金雀花花蕾，粉碎至粒径为1.0~2.0mm，加入金雀花花蕾质量10~15倍的乙醇溶液，回流提取两次，每次1~1.5小时，提取液趁热抽提浓缩，得提取物粗样；

2、萃取、分离和纯化

在提取物粗样中添加提取物粗样质量3~5倍的热水溶解，溶解液先用石油醚萃取2~3次，弃石油醚萃取相，然后用乙酸乙酯萃取2~3次，弃乙酸乙酯萃取相，最后用正丁醇萃取2~3次，合并正丁醇萃取相浓缩至干，浓缩物用浓缩物质量1~2倍的热水溶解后采用聚酰胺酚树脂柱（CXSZ-60）吸附，富集异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖，用质量百分比浓度为0%、25%的乙醇水溶液依次梯度洗脱，取25%乙醇洗脱部分浓缩至无醇味，调节浓缩液pH为2~3，冷却静置10~12小时，过滤，滤渣即为纯度>80 %的异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖。

其中所述提取用的乙醇溶液为质量百分比浓度为70~80%的水溶液。 

所述聚酰胺酚树脂与正丁醇浓缩物的质量比为10~15:1。 

所述热水温度为40~50℃。 

采用质量百分比浓度为10 %的HCl溶液调pH值。 

将所得滤渣置于硅胶柱进行分离，洗脱溶剂为氯仿：甲醇（此二元溶剂的体积比由6:1逐渐变动为3:1），最终分离并鉴定沉淀物中的其他两个化合物，分别是化合物2：芦丁；化合物3：异槲皮苷；化合物1、2、3的结构式如下： 

化合物1结构式如下：

化合物2结构式如下：

化合物3结构式如下：

 。

本发明具有以下优点和技术效果： 

1、金雀花花蕾提取物经过萃取后，异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖富集在正丁醇部分，通过聚酰胺酚树脂选择性吸附黄酮类等化合物，通过25%乙醇溶液洗脱，选择性地将异鼠李素-3-O- β-D-芸香糖分离出来，方法简便可行，易扩大化生产。

2、聚酰胺酚树脂相比其他吸附材料对异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的死吸附较少，从而增加了分离效率，减少了损失量，而且酰胺酚树脂材料易再生，可以反复使用。 

附图说明

图1为本发明中金雀花来源的化合物1、2和3的分析色谱图。 

具体实施方式

    下面通过附图和实施例对本发明方法作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用试剂如无特殊说明均为常规市售试剂。 

实施例1：本金雀花花蕾中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法，具体内容如下： 

（1）粉碎和提取

取阴干的金雀花花蕾10 kg，粉碎（碎片直径约为1.5 mm），加入12倍质量百分比浓度为75%的乙醇水溶液，回流提取两次，每次1.5小时，提取液趁热抽提浓缩，得提取物粗样1.5 kg；

（2）萃取、分离和纯化

在提取物粗样中添加提取物粗样质量3倍的45℃热水溶解，溶解液先用石油醚萃取三次，弃石油醚萃取相，然后用乙酸乙酯萃取三次，弃乙酸乙酯萃取相，最后用正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取相浓缩至干，得正丁醇浓缩物595 g；正丁醇浓缩物用浓缩物质量2倍的45℃热水溶解后采用聚酰胺酚树脂柱吸附（CXSZ-60型聚酰胺酚树脂与正丁醇浓缩物的质量比为15:1），洗脱溶剂系统为0%、25%的乙醇水溶液梯度洗脱，取25%乙醇洗脱部分浓缩至无醇味，用质量百分比浓度为10 %的HCl调节浓缩液pH为2，冷却静置10h，过滤，滤渣为41.5 g异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖粗品；将所得物置于硅胶柱进行分离，洗脱溶剂为氯仿：甲醇，梯度洗脱（氯仿与甲醇的体积比由6:1梯度变为3:1），最后分离并鉴定沉淀物中的其他两个化合物，它们分别是化合物2：芦丁；化合物3：异槲皮苷；

（3）异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的检测

采用HPLC检测金雀花花蕾来源的异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖含量，具体检测方法如下：

1、仪器与试剂

甲醇（HPLC级）购自于Fisher公司（New Jersey, USA），实验用水通过纯水系统得到（成都，中国），冰乙酸等所有试剂为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），本发明中涉及到的标准品购自于北京标准品中心。

2、溶液制备 

（1）标准溶液的制备

分别称量100 mg异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖、芦丁和异槲皮苷，用甲醇（HPLC级）稀释并配制成1.00 mg/mL的标准贮备液，取标准贮备液分别制备为0.01、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00mg/mL标准使用液，备用。

（2）供试品溶液的制备 

称量1.000 g的样品，用甲醇配制成1.00 mg/mL的样品溶液，备用。

3、样品测定 

以上配好的溶液经0.45 μm的过滤膜后注入HPLC系统，流动相由A液(体积百分比浓度为1.0 %的甲酸水溶液)和B液（甲醇和乙腈体积比为1:1）组成，洗脱程序如下： 0~5 min，20-30 %（v/v） B；5~15 min，30 % B；15~20 min， 30%-60% B，流速为0.8 mL/min，柱温为25℃， UV检测波长为280 nm，进样量10 μl，保留时间定性，外标法计算相应结果，实验结果如下：

表1：异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖、芦丁和异槲皮苷的含量

4、  检测方法考察

异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖在4.0 mg/L-150 mg/L在范围内线性关系良好；同一样品重复测定6次，计算RSD为0.23 %，精密度良好；分别取4.0 mg/L，50 mg/L，150 mg/L的异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖溶液进行高效液相色谱分析，外标法计算实测值，与真实值比较，回收率为97.5-103.9%，以上结果表明该方法适用于异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的检测。

 实施例2：本金雀花花蕾中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法，具体内容如下： 

（1）粉碎和提取

取阴干的金雀花花蕾10 kg，粉碎（碎片直径约为1.0mm），加入15倍质量百分比浓度为70%的乙醇水溶液，回流提取两次，每次1.0小时，提取物趁热抽提浓缩，得提取物粗样1.8 kg；

（2）萃取、分离和纯化

在提取物粗样中添加提取物粗样质量4倍的40℃热水溶解，溶解液先用石油醚萃取2次，弃石油醚萃取相，然后用乙酸乙酯萃取2次，弃乙酸乙酯萃取相，最后用正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取相浓缩至干，得正丁醇浓缩物631 g；正丁醇浓缩物用浓缩物质量1倍的40℃热水溶解后采用聚酰胺酚树脂柱吸附（CXSZ-60型聚酰胺酚树脂与正丁醇浓缩物的质量比为10:1），洗脱溶剂系统为0%、25%的乙醇水溶液梯度洗脱，取25%乙醇洗脱部分浓缩至无醇味，用质量百分比浓度为10 %的HCl调节浓缩液pH为2.5，冷却静置12h，过滤，滤渣为49.5 g，其中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖含量为85.3 %，提取率为92.1 %。

 实施例3：本金雀花花蕾中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法，具体内容如下： 

（1）粉碎和提取

取阴干的金雀花花蕾10 kg，粉碎（碎片直径约为2mm），加入15倍质量百分比浓度为80%的乙醇水溶液，回流提取两次，每次1.2小时，提取物趁热抽提浓缩，得提取物粗样2.1kg；

（2）萃取、分离和纯化

在提取物粗样中添加提取物粗样质量5倍的50℃热水溶解，溶解液先用石油醚萃取三次，弃石油醚萃取相，然后用乙酸乙酯萃取3次，弃乙酸乙酯萃取相，最后用正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取相浓缩至干，得正丁醇浓缩物655 g；正丁醇浓缩物用浓缩物质量1.5倍的50℃热水溶解后采用聚酰胺酚树脂柱吸附（CXSZ-60型聚酰胺酚树脂与正丁醇浓缩物的质量比为12:1），洗脱溶剂系统为0%、25%的乙醇水溶液梯度洗脱，取25%乙醇洗脱部分浓缩至无醇味，用质量百分比浓度为10 %的HCl调节浓缩液pH为3，冷却静置11h，过滤，滤渣为51.8 g，其中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖含量为83.7 %，提取率为91.5 %。

Claims (4)

1.一种金雀花花蕾中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）取干燥的金雀花花蕾，粉碎至粒径为1.0~2.0mm，加入金雀花花蕾质量10~15倍的乙醇溶液，回流提取两次，每次1~1.5小时，提取液趁热抽提浓缩，得提取物粗样；

（2）在提取物粗样中添加提取物粗样质量3~5倍的热水稀释，之后用石油醚萃取，弃石油醚萃取相，然后用乙酸乙酯萃取，弃乙酸乙酯萃取相，最后用正丁醇萃取，正丁醇萃取相浓缩至干，正丁醇浓缩物用浓缩物质量1~2倍的热水稀释后用聚酰胺酚树脂柱吸附，富集异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖，用质量百分比浓度为0%、25%的乙醇水溶液依次梯度洗脱，取25%乙醇水溶液洗脱部分浓缩至无醇味，调节浓缩液pH为2~3，冷却静置，过滤，滤渣为异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖。

2.根据权利要求1所述金雀花花蕾中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法，其特征在于：提取用的乙醇溶液为质量百分比浓度为70~80%的水溶液。

3.根据权利要求1所述金雀花花蕾中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法，其特征在于：聚酰胺酚树脂与正丁醇浓缩物的质量比为10~15:1。

4.根据权利要求1所述金雀花花蕾中异鼠李素-3-O-β-D-芸香糖的提取分离方法，其特征在于：热水温度为40~50℃。